DK164085B

DK164085B - Membranstruktur med kontinuerlige porer, fremgangsmaade til fremstilling af membranstruktur med kontinuerlige porer samt anvendelse af samme

Info

Publication number: DK164085B
Application number: DK517485A
Authority: DK
Inventors: Uwe B Sleytr; Margit Sara
Original assignee: Uwe B Sleytr; Margit Sara
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1985-11-08
Publication date: 1992-05-11
Also published as: CA1286065C; WO1985004111A3; US5028335A; ATE65716T1; JPH0454485B2; DD237793A5; DK164085C; HU200704B; IL74530A0; WO1985004111A2; EP0154620A3; HUT43501A; AT381463B; DK517485A; DK517485D0; ATA79784A; ZA851706B; US4752395A; EP0154620B1; IL74530A

Description

DK 164085 B

Den foreliggende opfindelse angår en struktur, der omfatter mindst én membran med kontinuerlige porer, eller som er dannet af mindst én sådan membran, idet porerne især ligger i diameterområdet fra 2 til 200 nm (nanometer). Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til 5 fremstilling af strukturen såvel som adskillige fordelagtige anvendelser af strukturen.

Strukturer med membraner, der har kontinuerlige porer inden for et diameterområde på fra 2 til 200 nm er fx ultrafiltreringsmembraner, der anvendes ved fremgangsmåder til fraktionering eller koncentrering 10 af blandinger af højmolekylære organiske stoffer med forskellig molekylvægt. Asymmetriske ultrafiltreringsmembraner anvendes nu i mange tilfælde til industrielle og semiindustrielle formål; de består af en meget tynd separationsfilm, der er bestemmende for masseoverførselen gennem membranen og for separationsselektiviteten, og som i alminde-15 lighed er mellem 100 og 200 nm tyk, samt af et grovporøst støttelag. Separationsfilmene består af forskellige polymerer, fortrinsvis cellulosederivater eller polysulfoner. Sådanne ultrafiltreringsmembraner er enten faseomdannelsesmembraner eller kompositmembraner. I faseomdannelsesmembraner bringes en homogen polymeropløsning i kon-20 takt med et bundfældningsmiddel, hvorefter membranen dannes ved kontaktfladen mellem polymeropløsning og bundfældningsmiddel, ved hvilken den grovporøse støttefilm sluttes til den finporøse film. I kompositmembraner fremstilles separationsfilmen og støttefilmen adskilt og føjes først derefter sammen.

25 I de kendte ultrafiltreringsmembraner har porediameteren ikke nogen fast størrelse, men diameteren af porerne varierer tilfældigt fordelt omkring en middelværdi. Ultrafiltreringsmembranens opførsel afspejler sig ved dens retentionskurve. For at bestemme denne retentionskurve bestemmes retentionsgraden (R) i procent for ultrafiltreringsmembra-30 nen under filtrering for forskellige ideelle testmolekyler (disse er sfæriske molekyler i uladet tilstand) med varierende molekylvægte (MW) . Retentionskurven selv repræsenterer en interpolation af disse testværdier og viser sammenhængen mellem retentionsgraden (R) og logaritmen til molekylvægten [log(MW)].

DK 164085 B

2

Fig. 1 viser et diagram med retentionskurverne for tre kommercielt tilgængelige ultrafiltreringsmembraner, nemlig:

Kurve A for PSED-membranen (Millipore) fra Millipore, Bedford,

Ma, U.S.A., 5 - kurve B for PSVP 1000-membranen (Millipore) fra samme firma, og kurve C for PM 30-membranen (Amicon) fra Amicon, Danvers, MA, U.S.A.

Som det kan ses af disse retentionskurver, er det ikke muligt ved hjælp af disse ultrafiltreringsmembraner at foretage nogen skarp 10 adskillelse af molekyler med lidt forskellige molekylvægte.

En yderligere karakteristisk værdi for en ultrafiltreringsmembrans funktion er den såkaldte strømningshastighed. Dette er den mængde Λ vand, der strømmer gennem membranen pr. nr· og time ved en fast trykforskel mellem membranens to sider. Ved de kendte faseomdannelsesmem-15 braner, hvis separationsfilm er ca. 100-200 nm tykke, udvikler membranen betragtelig modstand mod vandets gennemstrømning. Gennemstrømningshastigheden er højere, jo højere antallet af porer pr. arealenhed af membranen er, eller jo mindre den effektive poredybde er, dvs. længden af de kanaler, der danner porerne. Andre vigtige kvalitets-20 kendetegn ved ultrafiltreringsmembraner er også deres kemiske og/el-ler termiske stabilitet.

Den foreliggende opfindelse har til formål at afgrænse en struktur, der omfatter mindst én membran med kontinuerlige porer eller er dannet af mindst én sådan membran, i hvilken membran porerne er inden 25 for et diameterområde på 1-8 nm og hvor der ved anvendelse som ultrafiltreringsmembran kan foretages en skarp adskillelse mellem molekyler med lidt forskellige molekylvægte, og ved hjælp af hvilken ultrafiltreringsmembran det endvidere er muligt at opnå en højere strømningshastighed end med kendte ultrafiltreringsmembraner, og som har 30 god kemisk og termisk stabilitet.

DK 164085 B

3

Opfindelsens formål opfyldes i strukturen ifølge opfindelsen ved, at membranen eller membranerne, der udstrækker sig langs plane, kurvede, cylindriske eller vesikelformede overflader, i hvert tilfælde består af mindst ét lag af sammenhængende molekyler, der er bundet sammen og 5 derved er arrangeret som et krystalgitter, nemlig proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, hvorved kontinuerlige porer, der er arrangeret som et gitter, i disse lag forbliver frie mellem molekylerne, og hvori membranerne er bundet til eller forenede inden for en passende porøs bærer eller er bundet til en uunderstøttet film. I 10 disse membraner er proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler med fordel bundet sammen i et enkelt lag eller i flere sammenhængende lag og i hvert tilfælde arrangeret som et gitter, idet de sammenhængende proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i disse lag fortrinsvis er bundet til hinanden ved ikke-covalente 15 bindinger.

Ifølge en fordelagtig udførelsesform for opfindelsen er strukturen ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at mono- eller bifunktionelle fremmede molekyler er bundet til reaktive grupper på proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler, som hensigtsmæssigt kan være 20 carboxygrupper og/eller aminogrupper og/eller sulfhydrylgrupper og/eller hydroxygrupper, idet strukturen med fordel indeholder membraner med lag af proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, inden for hvilke fremmede molekyler er bundet til i det væsentlige alle disse molekyler på de samme reaktive steder.

25 Ifølge en yderligere fordelagtig udførelsesform for strukturen ifølge opfindelsen er denne ejendommelig ved, at proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i membranerne er intramolekylært covalent tværbundne gennem bifunktionelle fremmede molekyler og/eller ved, at den har membraner, på hvilke sammenhængende eller nabostillede pro-30 teinmolekyler eller proteinholdige molekyler, der hører til samme membran eller til to sammenhængende eller nabostillede membraner, er covalent tværbundet til hinanden - hensigtsmæssigt gennem bifunktionelle fremmede molekyler, og/eller hvor proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler er tværbundet med bærematerialet - hensigts-35 mæssigt gennem bifunktionelle fremmede molekyler.

DK 164085 B

4 I endnu en fordelagtig udførelsesform for strukturen ifølge opfindelsen er denne ejendommelig ved, at de fremmede molekyler når ind i membranporezonen, der ligger mellem proteinmolekylerne eller de proteiriholdige molekyler.

5 Ifølge en sidste fordelagtig udførelsesform er strukturen ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at den har membraner, hvis proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler og/eller fremmede molekyler, der er bundet dertil, har dissocierbare grupper, som dissocierer under strukturens arbejdsbetingelser og derved kan modtage forudbe-10 stemte elektriske ladninger afhængig af arbejdsbetingelserne. For så vidt angår typen og/eller fordelingen af disse dissocierbare grupper på membranen, er disse membraner med fordel konstrueret asymmetrisk med hensyn til hver overflade, der er parallel med membranens udstrækning.

15 Opfindelsen har det yderligere formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en struktur, der omfatter mindst én membran med kontinuerlige porer, og især en fremgangsmåde til fremstilling af strukturen ifølge opfindelsen.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen løses dette problem ved, at 20 proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, der hensigtsmæssigt er vundet fra cellekapper, især cellekapper fra prokaryote celler, eller fragmenter af lag af sådanne molekyler, der er s ammenhængende bundet til hinanden i disse lag, bringes i henholdsvis opløsning eller suspension i en væske, hensigtsmæssigt et vandigt medium, der 25 hensigtsmæssigt indeholder chaotropiske midler såsom guanidin-hydro-chlorid eller urinstof og/eller overfladeaktive midler, og hvor der derefter, hensigtsmæssigt ved en reduktion af koncentrationen af de chaotropiske midler og/eller overfladeaktive midler og/eller ved ændring af pH-værdien, skabes betingelser i mediet, ved hvilke prote-30 inmolekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller lagfragmen-teme derefter ved selvorganisering forenes til membraner, i hvilke proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler er arrangeret sammenhængende som et krystalgitter, i hvilket kontinuerlige porer, der er arrangeret mellem molekylerne som et gitter, forbliver frie, 35 og hvori de således dannede membraner er anbragt i, henholdsvis på en

DK 164085 B

5 bærer, og hvori proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i membranerne, hensigtsmæssigt ved behandling med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler, er substituerede på deres reaktive grupper og/eller er tværbundet gennem disse reaktive grupper intra-5 molekylært og/eller med hinanden og/eller med bæreren. For at fremstille henholdsvis opløsningen eller suspensionen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller lagfragmenter op-bygget af sådanne molekyler fremstilles en hensigtsmæssig vandig suspension med fordel af cellekapper af en sådan type, som har eks-10 terne lag opbygget af sammenhængende proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, der er bundet til hinanden og arrangeret som et krystalgitter, idet kontinuerlige porer arrangeret som et gitter mellem molekylerne i disse lag forbliver frie, hvorefter proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler eller fragmenter af 15 lagene bestående af disse molekyler skilles fra cellekapperne, hensigtsmæssigt ved tilsætning af chaotropiske midler og/eller overfladeaktive midler og/eller ved modificering af mediets pH-værdi, og hvor cellekapperesterne skilles fra mediet.

Ifølge fordelagtige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfin-20 delsen udføres separationen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler hensigtsmæssigt ved at forøge pH-værdien fra ca.

7,0 til en værdi mindre end eller lig med 13,0, men især til en værdi mindre end eller lig med 9,5, eller ved at reducere pH-værdien fra ca. 7,0 til en værdi større end eller lig med 1,0, men især til en 25 værdi større end eller lig med 2,5.

Ved en anden fordelagtig udførelsesform går fremgangsmåden ifølge opfindelsen ud på, at reduktionen af koncentrationen af chaotropiske midler og/eller overfladeaktive midler og/eller ændringen af pH-værdien, der udføres for at inducere selv-organiseringen af protein-30 molekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller de adskilte lagfragmenter til membraner, finder sted ved hjælp af dialyse.

Ved en yderligere fordelagtig udførelsesform går fremgangsmåden ifølge opfindelsen ud på, at de mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler har grupper, der reagerer med carboxygrupper, amino-

DK 164085 B

6 grupper, sulfhydrylgrupper eller hydroxygrupper på proteinmolekyleme eller de proteinholdige molekyler.

Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen finder selv-organiseringen af proteinmolekylerne eller de 5 proteinholdige molekyler og/eller lagfragmenteme til membraner sted ved en faststof/væske-fasegrænse.

Ved en yderligere fordelagtig udførelsesform går fremgangsmåden ifølge opfindelsen ud på, at membraner, der er dannet ved selv-organiseringen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler 10 og/eller lagfragmenterne, praktisk talt alle har maksimumdimensioner i området mindre end 100 μτα, dog fortrinsvis mindre end 15 μτα.

Ved en sidste fordelagtig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres placeringen af membranerne henholdsvis på eller i en porøs bærer ved afsætning på bæreren.

15 Endelig omfatter opfindelsen følgende anvendelser ifølge opfindelsen af strukturen ifølge opfindelsen eller af strukturen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, nemlig anvendelse af strukturen som et ultrafilter eller som et separationsorgan for en gasseparation eller som separationsorgan for 20 en ionbytningproces; anvendelse af strukturen som bærer for andre semipermeable membraner, som udstrækker sig over porer i strukturens membraner, idet disse andre semipermeable membraner hensigtsmæssigt er tværbundet med proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i 25 strukturens membraner via carboxygrupper og/eller aminogrupper og/eller sulfhydrylgrupper og/eller hydroxygrupper, enten direkte eller via bifunktionelle fremmede molekyler. Disse andre semipermeable membraner kan med fordel være: hyperfiltrerings-membraner, hensigtsmæssigt overfladeaktive eller overfladeakti-30 ve-lignende lipoide hyperfiltreringsmembraner, eller separa tionsorganer for en ionbytningsproces, eller separationsorganer

DK 164085 B

7 for en pervaporeringsproces, eller opløsningsdiffusionsmembraner; anvendelse som en separationssøjle til søjlechromatografi, idet membranerne hensigtsmæssigt er formet som vesikler; 5 - anvendelse som indpakningsmateriale for stoffer, idet indpak ningsmaterialet hensigtsmæssigt kan anvendes som et biologisk nedbrydeligt indpakningsmateriale, eller som kapselhylster for farmaceutiske præparater, der skal administreres oralt.

Visse prokaryote cellers cellekapper, især hos visse Bacillaceae, har 10 et ydre lag, hvis massefordeling, bestemt ved elektronmikroskopi, har en periodicitet, der tillader den konklusion, at laget har en krystallinsk struktur. Dette ydre lag, i det følgende kaldet S-laget (overfladelaget) kan i et vandigt medium ved tilsætning af chaotropi-ske midler adskilles fra det underliggende peptidoclycanholdige lag i 15 cellekappen og bringes i opløsning. Som det kan bestemmes ved biokemiske metoder, består disse S-lag i de fleste tilfælde af identiske molekyler, nemlig proteinmolekyler eller proteihholdige molekyler. Hvis koncentrationen af de chaotropiske midler i opløsningen nedsættes, fx ved dialyse, vil der ved selvorganisering blive dannet 20 små membranfragmenter ud fra disse molekyler, idet membranfragmenterne har overfladedimensioner på op til ca. 10-15 μια og udviser den samme massefordeling som det oprindelige S-lag. Disse membranfragmenter kaldes i det følgende P-membraner. Eftersom sådanne P-membraner ved en yderligere forøgelse af koncentrationen af de chaotropiske 25 midler vil sønderdeles igen og igen vil dannes som P-membraner ved en fornyet reduktion af koncentrationen, antages det endvidere, at P-membranerne er opbygget af lag af sammenhængende, med hinanden sammenføjede proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler arrangeret som et krystalgitter, og at den reversibelt opløselige og rekonstitu-30 erbare arrangering af molekylerne i P-membranerne finder sted via ikke-covalente bindinger mellem disse molekyler.

Ud fra den tidligere bestemte massefordeling er det muligt at genkende gittertypen, som kan være kvadratisk, hexagonal eller skrå. Fig.

2-4 viser tre typer gitre, i hvilke man kan forestille sig hvordan

DK 164085B

8 henholdsvis S-lagene og P-membranerne af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler, her angivet ved 1, 1' og 1", skal konstrueres. Fig. 2 viser et kvadratisk gitter med p4-symmetri, fig. 3 et hexagonalt gitter med p6-symmetri og fig. 4 et skråt gitter med p2-5 symmetri. Baseret på information om massefordelingen i S-lagene og/eller P-membranerne bestemt ved elektronmikroskopi har man antaget, som illustreret skematisk i fig. 2-4, at der mellem molekylerne, der udgør disse S-lag og/eller P-membraner, er kontinuerlige porer af karakteristisk form og størrelse til stede. Denne antagelse 10 er blevet bekræftet, men vil blive beskrevet yderligere i det følgende.

Ved hjælp af fig. 5-7 beskrives i det følgende fremstilling af en struktur som beskrevet i et første eksempel, til hvis oprettelse der anvendes sådanne P-membraner, og som fordelagtigt kan anvendes som 15 ultrafilter.

EKSEMPEL 1 I dette eksempel begyndes der med celler af Bacillus stearothermophi-lus 3c/NRS 1536, hvis cellekapper er opbygget af en cytoplasmisk membran, et peptidoglycanholdigt lag og S-laget. Som det er alminde-20 ligt anvendt inden for mikrobiologien, sprænges cellerne først ved ultrasonisk behandling, de cytoplasmiske memibranfragmenter sønderdeles ved hjælp af detergenter, og de tilbageværende cellemembranfragmenter renses ved vaskning for de komponenter, der er indeholdt i cellen. S-Lagene skilles derefter fra det peptidoglycariholdige lag i 25 et vandigt medium ved tilsætning af 5M guanidin-hydrochlorid som chaotropisk middel og bringes i opløsning. Denne opløsning skilles derefter fra peptidoglycanfragmenterne ved centrifugering, og den klare opløsning dialyseres mod en neutral pufferopløsning indeholdende 10 mM CaCl2. Under denne dialyse, hvor koncentrationen af guani-30 din-hydrochlorid i opløsningen reduceres til praktisk talt nul, og

CaC^-koncentrationen øges, dannes P-membranerne ved selvorganisering og har en kvadratisk gitterstruktur (p4-symmetri) med en periodicitet på 14 nm, og hvis maksimumdimensioner er i området ca. 15 μχα, og som holdes i suspension i det vandige medium ved omrøring.

DK 164085 B

9

Til fremstilling af ultrafilteret anvendes en trykenhed 2 som vist i snit i fig. 5. Den består af en bunddel 3, der har en cylindrisk udskæring 4 med en ribbet bund, og i hvilken der er anbragt en porøs sintret plade 5; rummet under den sintrede plade 5 er forbundet med 5 et udløbsrør 7 gennem en udløbskanal 6. En cylindrisk vægdel 9 af plexiglas er anbragt på denne bunddel 3 ved hjælp af en forseglings -O-ring 8, hvilken vægdel igen er forbundet med en dækseldel 11 gennem en anden forseglings-O-ring 10. I dækseldelen 11 findes en tilførselskanal 12 med forbindelser 13 og 14 til henholdsvis et indløbsrør 10 eller en trykgaskilde. En magnetisk omrørerenhed 15 er anbragt på undersiden af dækseldelen 11; med sin omrører 16 når den ned til den nederste kant af den cylindriske vægdel 9. Under drift af trykenheden er bund- og dækseldelene holdt sammen ved hjælp af en sammenspændingsindretning, der virker ved 17 og 17'.

15 Til fremstilling af ultrafilteret anbringes et skiveformet mikrofil-ter 18, fremstillet af Nucleopore, Tubingen, Vesttyskland, på den sintrede plade 5 i trykenheden for at tjene som bæremateriale for det ultrafilter, der skal fremstilles. Dette mikrofilter 18 består af en ca. 10 yum tyk polycarbonatfilm med porer af samme størrelse og en 20 porediameter på 0,1 μιη. Den ovenfor beskrevne P-membransuspension hældes derefter ned i dækseldelen 11 gennem forbindelsen 13 i en sådan mængde, at der er indeholdt 25 μg P-membran i suspensionen pr. cm^ mikrofilterareal. Derefter ledes nitrogen med et overtryk på 0,5 x 105 Pa som trykgas gennem forbindelsen 14, hvorved suspensio-25 nens væskefase presses gennem mikrofilteret 18 og den porøse sintrede plade 5, og P-membranerne afsættes på mikrofilteret 18. Dernæst påføres 3 ml af en 2,0 volumenprocent opløsning af glutardialdehyd (i 0,1M natriumcacodylatpuffer, pH-værdi 7,2) på de afsatte P-membraner gennem forbindelsen 13. Derefter etableres et overtryk på 2 x 10^ 30 Pa, hvilket forårsager, at glutardialdehydopløsningen presses gennem de afsatte P-membraner og mikrofilteret 18 i 20 minutter ved 20eC. Glutardialdehyd har en carbonylgruppe i begge ender og reagerer derved som et bifunktionelt tværbindingsmiddel med to c-aminogrupper i lysin i de proteinholdige molekyler i P-membranerne, nemlig enten 35 intramolekylært, når begge e-aminogrupper stammer fra samme protein-

DK 164085 B

10 holdige molekyle, eller intermolekylært, når de to e-aminogrupper stammer fra to forskellige proteinholdige molekyler i P-membranerne.

Efter gentagen vaskning er ultrafiltreringsmembranen bestående af mikrofilteret 18 og de afsatte og tværbundne P-membraner derefter i 5 det væsentlige færdig og kan fjernes fra trykenheden 2. Imidlertid kan trykenheden 2 med den således fremstillede ultrafiltreringsmembran også anvendes direkte som ultrafiltreringsehhed.

Med henblik på at bestemme den fremstillede ultrafiltreringsmembrans retentionsegenskaber blev der udført filtreringstests på denne ultra-10 filtreringsenhed ved et overtryk på 2 x 10^ Pa, der var etableret ved hjælp af tilført nitrogen, for en serie testmolekyler ved pH-værdier, ved hvilke hver af testmolekylerne ikke var elektrisk ladede, dvs. ved deres isoelektriske punkt (IEP). Som teststoffer blev der anvendt følgende proteiner:

15 Nr. Protein Molekylvægt IEP

1 Myoglobin 17.000 6,6 2 Subtilisin 27.000 9,4 3 Ovalbumin 43.000 4,6 20 4 Bovint serumalbumin 67.000 4,7 5 Ferritin 440.000 4,3

Fig. 6 viser et diagram med retentionskurven interpoleret ud fra testværdierne for disse teststoffers retentionsgrad. Retentionskurven 25 udviser en skarp molekylvægtsafskæring mellem retentionsgraderne for subtilisin og ovalbumin. Denne retentionskurve beviser også, at P-membranerne har kontinuerlige porer af jævn størrelse; baseret på retentionskurvens form antages porediameteren at være 4-5 nm.

Strømningshastigheden bestemt på denne ultrafiltreringsmembran ved et 30 membranovertryk på 2 x 10^ Pa er ca. 480 1/time.m^. Imidlertid afhænger strømningshastigheden af mængden af afsatte P-membraner.

Således falder den til en værdi på 220 1/time.m^ med en afsat P-mem-branmængde på 50 /ig/cm^ membranoverflade.

DK 164085 B

11

Den på denne måde fremstillede ultrafiltreringsmembran har en yderligere fordelagtig egenskab, som er forklaret i detaljer i det følgende:

De frie aminogrupper og carboxygrupper bidrager på forskellig måde 5 til den elektriske nettoladning i henholdsvis S-lagfragmenterne eller de ikke-tværbundne P-membraner afhængig af pH-værdien i det vandige medium, der omgiver dem. Op til en pH-værdi på under 9 giver amino-grupperne positive ladninger, og carboxygrupperne giver negative ladninger i området over pH-værdi 2,0. Ved en vis pH-værdi, dvs. ved 10 deres isoelektriske punkt (CIEP), udligner de negative og positive ladninger hinanden, således at S-lagfragmenterne og P-membranerne udadtil vil synes elektrisk neutrale. I det foreliggende eksempel mistes potentielt positivt ladede grupper i P-membranerne ved glutar-dialdehydets reaktion med lysinets c-aminogrupper i P-membranernes 15 proteinholdige molekyler, hvorved de tværbundne P-membraners IEP forrykkes ned i det sure område og har en værdi på mindre end pH-værdi 2,0. De tværbundne P-membraners negative nettoladning er i mange tilfælde en effektiv beskyttelse mod tilstopning af membranporerne ved filtrering under fysiologiske betingelser.

20 Fig. 7 viser i delvis gengivelse og i skematisk snit den ved dette eksempel fremstillede ultrafiltreringsmembran. På overfladen af mikrofilteret 18, der er forsynet med kontinuerlige porer 19, er de med tallet 20 viste P-membraner afsat og fikseret ved tværbinding. De påføres derved i en sådan mængde, at den samlede overflade af P-mem-25 branmængden er lig med ca. 2-3 gange arealet af ultrafiltrerings- membranerne, således at P-membranerne i gennemsnit vil være lagt oven på hinanden i ca. to lag og derved vil delvis overlappe.

EKSEMPEL 2 I modsætning til fremgangsmåden ifølge eksempel 1 gås der i dette 30 eksempel ud fra celler af Bacillus stearothermophilus pV 72. Også her består cellekapperne af en cytoplasmisk membran, et peptidoglycanhol-digt lag og et S-lag af proteinholdige molekyler. I lighed med det,

DK 164085 B

12 der er beskrevet i eksempel 1, fremstilles der ud fra cellekapperne en suspension af P-membraner. S-Laget og P-membranerne fra denne bakteries cellekapper udviser en hexagonal gitterstruktur (p6-symmetri) med en periodicitet på 18 nm.

5 Til fremstilling af en struktur, der kan anvendes som ultrafiltreringsmembran, anbringes et skiveformet nylonmikrofilter af typen Ultipor n^g T fra firmaet Pall, Cortland, U.S.A. og med en tykkelse på 150 μιη i trykenheden 2 for at tjene som barer. Dette mikrofilter har frie amino- og carboxygrupper i et forhold på 1:1. I lighed med 10 fremgangsmåden ifølge eksempel 1 påføres P-membransuspensionen på mikrof ilteret i en sådan mængde, at der i suspensionen er indeholdt 30 /ig P-membraner pr. cm^ mikrof ilterareal, og P-membranerne afsættes på og i mikrof ilterets svampede struktur ved påføring af et membranovertryk på 2 x 105 Pa.

15 Fig. 8 viser i delvis snit et mikrofilter 21, der har en uregelmæssig svampestruktur, hvor porernes dimensioner ligger frit i en tilfældig fordeling omkring en middelværdi. De afsatte P-membraner 20 er også vist. Ved et overtryk på 2 x 10^ Pa presses derefter 1 ml af en 0,1%'s dimethylsuberimidatopløsning (1M triethanolaminpuffer, pH-vær-20 di 9,5) gennem P-membranerne 20 og mikrofilteret 21 i 60 minutter ved 4°C. Dimethylsuberimidatet reagerer derved i egenskab af bifunktionel imidoester ligesom et aldehyd intra- og intermolekylært primært med lysinets e-aminogrupper i P-membranernes proteinholdige molekyler samt med nylonmikrofiltermaterialets aminogrupper. Efter gentagen 25 vaskning er ultrafiltreringsmembranen derefter klar til brug.

Fig. 9 viser et diagram med ultrafiltreringsmembranens retentionskurve. Den udviser en skarp molekylvægtsafskæring i lighed med den i eksempel 1 beskrevne membran.

De amidiner, der dannes under omsætningen mellem dimethylsuberimi-30 datet og e-aminogrupperne, giver en positiv ladning på en måde i lighed med lysinets e-aminogruppe, således at P-membranernes naturlige nettoladning næppe ændres ved tværbindingen.

DK 164085 B

13

De P-membranstrukturer, der er beskrevet i de foregående eksempler 1 og 2, og som fordelagtigt kan anvendes som ultrafiltreringsmembraner, har en høj kemisk, termisk og mekanisk stabilitet på grund af tværbindingen med bifunktionelle fremmede molekyler. De er især stabile 5 mod proteolytisk nedbrydning, de er autoclaverbare og kan også anvendes i et surt og alkalisk medium (pH-værdi 1-13) såvel som sammen med stærkt koncentrerede chaotropiske midler (5M guanidin- hydroch-lorid, 8M urinstof). En anden vigtig egenskab hos strukturerne med P-membraner er deres modstandsdygtighed mod organiske væsker såsom 10 ketoner, alkoholer og chlorerede carbonhydrider.

Ultrafiltreringsmembranernes ønskede porediameter opnås i det væsentlige ved udvælgelse af den anvendte mikroorganisme, hvis celle-kapper har S-lag med porer med omtrent den porediameter, der stræbes efter. Den ønskede porediameter kan derefter varieres ved tilsætning 15 af fremmede molekyler, der rækker ind i P-membranernes poreområder.

Dette vil blive diskuteret yderligere i det følgende.

P-Membraner bestående af ét molekyllag har lagtykkelser på ca. 5-20 nm og porediametre i området mellem 1 og 8 run.

Med hensyn til fremstillingen af P-membransuspensionen bør det be-20 mærkes, at det ved udvælgelse af henholdsvis de chaotropiske midler og de overfladeaktive midler er muligt at opnå, at S-lagfragmenterne kun adskilles fra cellekappefragmenternes peptidoglycanholdige lag, eller at S-lagfragmenterne i sig selv sønderdeles og bringes i opløsning. Fx ved behandling med 2,5M guanidin-hydrochlorid fås der kun 25 en adskillelse af S-lagfragmenterne, hvorimod en sønderdeling af S-laget opnås med 5M guanidin-hydrochlorid ved overrivning af bindingerne mellem de individuelle proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler. En sønderdeling af S-laget kan også forårsages af en væsentlig ændring af pH-værdien af den opløsning, der indeholder 30 S-lagene; fx ved sænkning af pH-værdien fra ca. 7,0 til 2,5 eller i visse tilfælde ved at hæve den fra 7,0 til 9,5.

Overfladerne af de P-membraner, der dannes ved selvorganisering, kan være plane, kurvede, cylindriske eller vesikelformede. I overens-

DK 164085 B

14 stemmelse med eksemplerne 1 og 2 anvendtes der P-membraner, hvis overflade var i det væsentlige plane.

Fig. 10 og 11 viser varianter af de i eksemplerne 1 og 2 beskrevne strukturer, hvor P-membranerne 20' er vesikelformede.

5 Fig. 12 viser en yderligere variant af strukturen ifølge eksempel 2, hvor der ved fremstillingen deraf blev anvendt henholdsvis vesikelformede og plane P-membraner 20 og 20'. De vesikelformede P-membraner blev fortrinsvis afsat i porerne, medens de plane P-membraner for det meste blev afsat på overfladen af mikrofilteret 21.

10 Der er i det følgende beskevet nogle få yderligere eksempler på tværbinding af P-membraner.

Hexamethylendiisocyanat reagerer i P-membranerne fortrinsvis med aminogrupperne og, efter at de er mættede, med hydroxy-grupperne, således at en intermolekylær tværbinding kan finde 15 sted via begge funktionelle grupper. Fx anvendes hexamethylen diisocyanat i en 1%'s opløsning med 5% tetrahydrofuran (triet-hanolamin-hydrochlorid, pH-værdi 8,0). Reaktionstiden er fx 4 timer ved 20°C.

N, N' -Diiodacetyl-hexamethylendiamin angriber sulfhydrylgrupper 20 i P-membranerne, hvilket også gælder andre bifunktionelle alkylhalogenider, idet det dog under passende reaktionsbetingelser også vil angribe aminogrupperne. I et neutralt eller svagt alkalisk medium er dette tværbindingsmiddel imidlertid specifikt over for sulfhydrylgrupperne. Til tværbinding an-25 vendes N,N'-diiodacetyl- hexamethylendiamin fortrinsvis i en O, 5%'s opløsning (0,1M natriumacetatpuffer, pH-værdi 7,2). Reaktionstiden er 3 timer ved 4°C.

1 - Ethyl - 3 - ( 3 - dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlor id (EDC). Carbodiimider såsom EDC reagerer i surt medium med 30 carboxy-, sulfhydryl- og hydroxygrupperne i P-membranerne.

Hvis sulfhydrylgrupperne ikke skal tage del i reaktionen, må de maskeres på forhånd. Ved at blokere carboxygrupperne med

DK 164085 B

15 EDC forrykkes P-membranernes pH-værdi til det alkaliske område. 0,1M EDC i destilleret vand (0,02M NaOH, pH-værdi 8,0) lades fx reagere i 18 timer ved stuetemperatur.

Der er i det følgende givet flere eksempler på tilsætning af fremmede 5 molekyler til proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler i P-membranerne, idet disse fremmede molekyler på passende måde påvirker de tværbundne P-membraners porestørrelse: P-Membranerne afsat på en porøs bærer, fx et mikrofilter, overtrækkes med en opløsning af polykationiseret ferritin (5 10 /ig polykationiseret ferritin i 1 ml H2O) og inkuberes i 5 minutter ved 20°C. Som det kan bestemmes elektronmikroskopisk, kædes ét ferritinmolekyle under disse betingelser sammen med hvert proteinmolekyle eller proteinholdigt molekyle gennem elektrostatiske interaktioner. Ved en efterfølgende tværbin-15 ding med glutardialdehyd analogt med den i eksempel 1 beskrev ne fremgangsmåde bindes ferritinmolekylerne derefter covalent til P-membranerne.

P-Membraner anbragt på en bærer overtrækkes med en 1%'s opløsning af osmiumtetraoxid og inkuberes i 30 minutter ved 20°C.

20 Efter at den overskydende opløsning er vasket ud, kan det til P-membranerne kemisk bundne osmium fastslås ved elektronmikroskopi og ved hjælp af røntgenmikroanalyse. Tværbindingen af P-membranerne finder derefter sted i overensstemmelse med eksempel 1.

25 - P-Membraner anbragt på en bærer behandles med et bifunktionelt tværbindingsmiddel, hvis brolængde er tæt ved P-membranens porediameter. Følgende stoffer kan betragtes som bifunktionelle tværbindingsmidler med varierende brolængde:

Tartryl-di-(glycylazid) (TDGA): 1,3 nm brolængde, 30 tartryl-di-(e-aminocaproylazid) (TDCA): 2,3 nm brolængde, bis-methyl-3,8-diazo-4,7-dioxo-5,6-dihydroxydecan-bisimidat (DEBE): 1,4 nm brolængde,

DK 164085 B

16 bis-methyl-4,9-diazo-5,8-dioxo-6,7-dihydroxydodecan-bisimidat (DOBE): 1,7 nm brolængde.

Reaktionen af TDGA eller TDCA, DEBE eller DOBE (0,01M i destilleret vand med 1M triethanolamin, pH-værdi 8,0) finder sted 5 il time ved 4°C eller i 30 minutter ved 20°C, hvorefter tværbinding kan finde sted i overensstemmelse med eksempel 1.

EKSEMPEL 3 I dette eksempel beskrives en variant af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved hvilken der fremstilles et lag ud fra P-membraner, som 10 kan have store overfladestørrelser, især dimensioner på op til 100 μηι, og som består af en enkelt-lags P-membran. Til det formål fremstilles som beskrevet i eksempel 1 en suspension af P-membraner, som var vundet ud fra cellekapper fra Bacillus stearothermophilus 3c/NRS 1536. S-Lagene i denne bakteries cellekapper er elektrisk neutrale 15 ved de overflader, der støder op til cellens yderside, .hvor carbonhy-dratresten af de proteinholdige molekyler (glycoproteiner), der danner disse S-lag, er blotlagt, medens de har en negativ nettoladning på deres anden overflade. Den førnævnte P-membranopløsning indeholder endvidere også frie proteinholdige molekyler fra de opløste lag. Et 20 mikrofilter med en særlig glat overflade, fx som den, der blev an vendt i eksempel 1, behandles på sin ene overflade med en opløsning af Alcian Blue (0,1% i destilleret vand) og tørres derefter. Alcian blue giver i et neutralt medium en positiv overfladeladning på mikro-filteroverfladen. P-Membranopløsningen påføres derefter på mikrofil-25 teret under svag omrøring. Induceret af den positive overfladeladning finder der derefter ved nogle områder af mikrofilteroverfladen en selvorganisering sted til P-membraner af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler, der stadig er i opløsning, hvorved på den ene side P-membranernes negativt ladede side støder op imod den 30 positivt ladede mikrofilteroverflade, medens P-membranerne i suspensionen, der sædvanligvis har maksimale overfladedimensioner på op til 10 pm, på den anden side fortrinsvis med deres negativt ladede side støder op imod mikrofilteroverfladens stadig frie områder. For at 17 stabilisere det således dannede P-membranlag tværbindes det på en måde analogt med den i eksempel 1 beskrevne.

Fig. 13 viser i delvis snit den således dannede struktur, som også med fordel kan anvendes som ultrafiltreringsmembran, med mikrofilte-5 ret 21 og en P-membran dannet ved faststof/væske-fasegrænsen via selvorganisering til større overfladeudstrækning. Ved anvendelse som ultrafiltreringsmembran har den således fremstillede struktur den samme skarpe molekylvægtsafskæring og de samme retentionsegenskaber som strukturen fremstillet ifølge eksempel 1.

10 Helt generelt og delvis afvigende fra de i eksemplerne 1-3 beskrevne fremgangsmåder er det også muligt som støtteoverflader, ved hvilke et P-membranlag dannes, at anvende andre lag, fx peptidoglycanholdige lag, pseudomureinlag, lipidlag, polymerlag, geler og lignende. Hvis disse lag har kontinuerlige porer, hvis størrelse er større end 15 P-membranernes porer, kan de tjene som permanente bærere for P-mem- branlagene, eller de kan være hjælpelag, som fjernes efter dannelsen af P-membranlaget, fx ved hjælp af organiske opløsningsmidler. P-Membranlagene adskilt fra hjælpelagene kan, hensigtsmæssigt efter covalent tværbinding, anbringes på en endelig bærer, der er bedre tilpas-20 set kravene til den tiltænkte anvendelse af strukturen ifølge opfindelsen, og med hvilken bærer de derefter også hensigtsmæssigt kan tværbindes covalent.

"Støtteoverfladens" overfladeegenskaber såsom dens hydrofile eller hydrofobe natur og/eller dens specifikke nettoladning og "støtteover-25 fladens" ladningsfordeling tillader - i lighed med fremgangsmåden ifølge eksempel 3 - en orienteret binding af P-membranerne og/eller proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler til "støttela-get" og fremmer derved dannelsen af P-membranlaget. Disse overfladeegenskaber bør blandt andet være sådan, at bindingsstyrken mellem 30 "støtteoverfladen" og proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler er tilstrækkelig svag til ikke at forhindre den selvorganisering af disse molekyler til P-membraner, som finder sted på denne "støtteoverflade" . Dette er vigtigt for dannelsen af P-membraner med få forstyrrelser i krystalgitteret.

DK 164085 B

18

De ovenfor beskrevne eksempler og deres varianter beskæftiger sig med strukturer med P-membraner, i hvilke proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler er bundet til hinanden i et enkelt lag. Fig.

14 viser skematisk i delvis snit en yderligere variant af strukturen 5 ifølge opfindelsen, i hvilken der på et porøst mikrofilter, således som det også blev anvendt ifølge eksempel 2, er anbragt et P-membran-lag bestående af P-membraner 22 opbygget på spejlvendt måde af to lag 23 og 23' af proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler.

Hvert af disse to lag af molekyler 23 og 23' har en forskellig over-10 fladetopografi på henholdsvis sin inderside og yderside, og de to lag 23 og 23' er hensigtsmæssigt bundet til hinanden i et arrangement med lav fri energi. De to lag 23 og 23' kan endvidere være covalent tværbundne med hinanden, ligesom henholdsvis P-membranen 22 og mikro-filteret 21 kan være covalent tværbundne med hinanden.

15 I det følgende beskrives flere yderligere fordelagtige anvendelser af strukturen ifølge opfindelsen, som er kommercielt betydningsfulde.

Ud over anvendelse som ultrafiltreringsmembran kan strukturen ifølge opfindelsen også fordelagtigt anvendes som separationsorgan for en gasseparation eller som separationsorgan for en ioribytningsproces.

20 I yderligere fordelagtige anvendelser tjener strukturen ifølge opfindelsen som bærer for andre semipermeable membraner, der strækker sig over porerne i strukturens P-membraner. Disse andre semipermeable membraner kan være hyperfiltreringsmembraner, især mono- eller bimolekylære hyperfiltreringsmembraner. Sådanne hyperfiltreringsmem-25 braner, især overfladeaktive eller overfladeaktiv-lignende lipoide hyperfiltreringsmembraner, er i almindelighed kun 2-6 nm tykke og er særlig skrøbelige. Hyperfiltreringsmembraner anvendes især ved af-saltning af havvand, spildevandsbehandling, adskillelse af blandinger af organiske væsker, især til carborihydridadskillelse ved pervapore-30 ring, eller til adskillelse af optiske antipoder ved hjælp af chirale separationslag.

Fig. 15 viser i delvis snit en struktur ifølge opfindelsen, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 2 (jfr. fig. 8), på hvis P-mem-branlag 24 en hyperfiltreringsmembran 25 er blevet anbragt. Ved

DK 164085 B

19 anvendelsen af strukturerne ifølge opfindelsen som bærere for hyperfiltreringsmembraner bestemmes henholdsvis filtrerings- eller adskillelsesevnen i det væsentlige af hyperfiltreringsmembranen. Defekter såsom små huller eller lignende i P-membranlaget 24 er ikke nødven-5 digvis skadelige. Det tværbundne P-membranlag er særlig egnet som bærer for hyperfiltreringsmembraner, eftersom de har tilstrækkelig mekanisk stabilitet til at strække sig over eller opfylde porer og grove overflader på de sædvanlige bærelag til ultrafiltreringsmembraner, således at de skrøbelige hyperfiltreringsmembraner, især 10 tværbundne monolag, kan anbringes eller adskilles ensartet. Endvidere er P-membranlagene tilstrækkelig tynde og har en høj porøsitet til at sikre en tilstrækkelig høj strømningshastighed i kombination med hyperfiltreringsmembranerne.

En særlig glat overflade på P-membranlaget fås især ved hjælp af 15 følgende fremgangsmåde. I lighed med det, der er beskrevet i eksempel 1, fremstilles og tværbindes et P-membranlag på en polycarbonatbærer med en meget glat overflade. Polycarbonatbæreren opløses derefter i chloroform, hvorefter der efterlades et sammenhængende P-membranlag med en tykkelse på 5-100 nm, som derefter afsættes med sin oprinde-20 ligt meget glatte underside opad på en anden porøs bærer. På denne meget glatte blotlagte overflade på P-membranlaget afsættes hyperfiltreringsmembranen derefter og tværbindes hensigtsmæssigt med P-membranlaget .

Der kan også fremstilles blandinger af et P-membranlag og en hyper-25 filtreringsmembran, idet der på en hyperfiltreringsmembran, der har en veldefineret overfladenettoladning, som tjener som "støtteoverflade1’ - fx analogt med det, der er beskrevet ved hjælp af eksempel 3 -dannes et P-membranlag, og sidstnævnte tværbindes på passende måde med hyperfiltreringsmembranen.

30 Med henblik på en covalent tværbinding mellem hyperfiltreringsmembranen og P-merabranlagene kommer de reaktioner først og fremmest i betragtning, hvor carboxy-, hydroxy-, amino- og sulfydrylgrupper deltager. Med P-membraner af glycoprotein og enkelt-lags hyperfiltreringsmembraner med sukkerrester kan der også anvendes carbonhydrat-35 kemiske reaktioner.

DK 164085 B

20

Blandinger mellem et P-membranlag og en hyperfiltreringsmembran kan endvidere i sig selv tjene som bærer eller ''støtteoverflade" for yderligere hyperfiltreringsmembraner eller P-membranlag. Sådanne multilagsblandinger kan også tværbindes i enkeltlagsplanerne eller 5 også mellem de enkelte lag ved hjælp af covalente bindinger. Dannelsen af en sandwichforbindelse bestående af to hyperfiltreringsmembraner på hver side af et P-membranlag tillader indfletning af fremmede molekyler såsom enzymer eller ladningsbærere, som i væsentlig grad kan påvirke opførslen af en sådan sandwichforbindelse.

10 De ovennævnte forbindelser eller multilagsforbindelser kan fordelagtigt også have form af lukkede vesikler, ved fremstilling af hvilke man kan begynde med en "udgangsvesikel" bestående af en hyperfiltreringsmembran eller af et P-membranlag.

I en yderligere fordelagtig anvendelse anvendes strukturen ifølge 15 opfindelsen som separationssøjle til søjlechromatografi. Fig. 16 viser skematisk og i delvis snit en sådan chromatografisøj le 26, hvori der er fyldt vesikelformede, hensigtsmæssigt intra- eller intermolekylært tværbundne P-membraner 20' med en indre diameter d i området 1-3 μια. De stoffer, der skal adskilles, føres ind i søjlens 20 top. Efter at stofferne er passeret gennem og er elueret, kommer de store molekyler hurtigere ud af chromatografisøj lens nedre ende end de små molekyler, idet chromatografien udviser en skarp fraktionering i P-membranernes porestørrelsesområde.

Ifølge en fordelagtig variant kan strømningshastighederne gennem 25 separationssøjlen forøges ved, at P-membranvesiklerne 20' forenes covalent tværbundet i morfologisk definerede og mekanisk stabile aggregater. Til fremstilling af disse aggregater hurtigfryses en tæt pellet (sediment) af P-membranvesikler i et tyndt lag, pulveriseres til små fragmenter under flydende nitrogen og frysesubstitueres 30 derefter i en blanding af methanol og glutardialdehyd ved fx -80°C, hvorved tværbindingen finder sted ved hjælp af glutardialdehydet. De således vundne aggregater kan fragmenteres yderligere og sigtes efter størrelse, idet der kun anvendes specifikke størrelseskategorier af aggregaterne til fyldning af separationssøjlen. Enten før eller efter

Claims

1. Struktur omfattende mindst én membran med kontinuerlige porer, eller som er dannet af mindst én sådan membran, 25 kendetegnet ved, at membranen eller membranerne, der strækker sig langs plane, kurvede, cylindriske eller vesikelformede overflader, i hvert tilfælde består af mindst ét lag af sammenhængende molekyler, der er bundet sammen og derved er arrangeret som et krystalgitter, nemlig proteinmolekyler eller proteinholdige moleky-30 ler, idet kontinuerlige porer, der er arrangeret som et gitter, i disse lag forbliver frie mellem molekylerne, og hvor membranerne er bundet til eller forenede inden for en passende porøs bærer eller er bundet sammen til en ustøttet film. DK 164085 B

2. Struktur ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har membraner, i hvilke proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler er arrangeret som et krystalgitter i et enkelt lag, sammenhængende og bundet til hinanden, 5 eller i hvilke proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler er arrangeret i flere sammenhængende lag, hver som et krystalgitter, og er bundet til hinanden.

3. Struktur ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at de sammenhængende proteinmolekyler 10 eller proteinholdige molekyler i lagene er bundet til hinanden ved ikke-covalente b indinger.

4. Struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at mono- eller bifunktionelle fremmede molekyler er bundet til reaktive grupper på proteinmolekylerne eller 15 de proteinholdige molekyler.

5. Struktur ifølge krav 4, kendetegnet ved, at de reaktive grupper er carboxygrupper og/eller aminogrupper og/eller sulfyhydrylgrupper og/eller hydroxy-grupper.

6. Struktur ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at den har membraner med lag af proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, inden for hvilke fremmede molekyler er bundet til i det væsentlige alle disse molekyler på de samme reaktive steder.

7. Struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 4-6, kendetegnet ved, at proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i membranerne er intramolekylært covalent tværbundet ved hjælp af bifunktionelle fremmede molekyler.

8. Struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, 30 kendetegnet ved, at den har membraner, på hvilke sammenhængende eller nabostillede proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, der hører til samme membran eller til to sammenhængende DK 164085B eller nabostillede membraner, er tværbundet covalent med hinanden, om ønsket ved hjælp af bifunktionelle fremmede molekyler.

9. Struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at den har membraner, på hvilke prote- 5 inmolekyler eller proteiriholdige molekyler er tværbundet med bærematerialet, om ønsket ved hjælp af bifunktionelle fremmede molekyler.

10. Struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 5-9, kendetegnet ved, at de fremmede molekyler strækker sig ind i membranporezonerne, der er anbragt mellem proteinmolekylerne eller 10 de proteinholdige molekyler.

11. Struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, kendetegnet ved, at den har membraner, hvis proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler og/eller fremmede molekyler, der er bundet til dem, har dissocierbare grupper, som dissocierer under 15 strukturens arbejdsbetingelser og derved kan modtage forudbestemte elektriske ladninger afhængig af disse arbejdsbetingelser.

12. Struktur ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den har membraner, der, for så vidt angår arten og/eller fordelingen af disse dissocierbare grupper på 20 membranen, er konstrueret asymmetrisk med hensyn til hver overflade, der er parallel med membranens udstrækning.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af en struktur, især en struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12, kendetegnet ved, at proteinmolekyler eller proteinholdige 25 molekyler, hensigtsmæssigt vundet fra cellekapper, især cellekapper fra prokaryote celler, eller fragmenter af lag af sådanne molekyler, der er bundet sammenhængende til hinanden i disse lag, bringes i henholdsvis opløsning eller suspension i en væske, hensigtsmæssigt et vandigt medium, der hensigtsmæssigt indeholder chaotropiske midler 30 såsom guanidin-hydrochlorid eller urinstof og/eller overfladeaktive midler, og hvor der derefter, hensigtsmæssigt ved en reduktion af koncentrationen af de chaotropiske midler og/eller overfladeaktive midler og/eller ved ændring af pH-værdien, skabes betingelser i DK 164085 B mediet, ved hvilke proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller lagfragmenterne derefter ved selvorganisering forenes til membraner, i hvilke proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler er arrangeret sammenhængende som et krystalgitter, i hvil-5 ket kontinuerlige porer, der er arrangeret mellem molekylerne som et gitter, forbliver frie, og hvori de således dannede membraner er anbragt i, henholdsvis på en bærer, og hvori proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler i membranerne, hensigtsmæssigt ved behandling med mono- og/eller bifunktionelle fremmede molekyler, er substi-10 tueret på deres reaktive grupper og/eller er tværbundet gennem disse reaktive grupper intramolekylært og/eller med hinanden og/eller med bæreren.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at der til fremstilling af henholdsvis 15 opløsningen eller suspensionen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller lagfragmenterne opbygget af sådanne molekyler fremstilles en hensigtsmæssig vandig suspension af cellekapper af en sådan type, som har eksterne lag opbygget af sammenhængende proteinmolekyler eller proteinholdige molekyler, der er 20 bundet til hinanden og arrangeret som et krystalgitter, idet kontinuerlige porer arrangeret som et gitter mellem molekylerne i disse lag forbliver frie, hvorefter proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler eller fragmenter af lagene bestående af disse molekyler skilles fra cellekapperne, hensigtsmæssigt ved tilsætning af chaotro-25 piske midler og/eller overfladeaktive midler og/eller ved modificering af mediets pH-værdi, og hvor resterne af cellekapperne skilles fra mediet.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at adskillelsen af proteinmolekylerne 30 eller de proteinholdige molekyler eller af fragmenterne af lag bestående af disse molekyler udføres ved en forøgelse af pH-værdien fra ca. 7,0 til en værdi mindre end eller lig med 13,0, fortrinsvis mindre end eller lig med 9,5. DK 164085 B

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at adskillelsen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler eller af fragmenterne af lag bestående af disse molekyler udføres ved at sænke pH-værdien til en 5 værdi større end eller lig med 1,0, fortrinsvis større end eller lig med 2,5.

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-16, kendetegnet ved, at reduktionen af koncentrationen af de chaotropiske midler og/eller overfladeaktive midler og/eller ændrin- 10 gen af pH-værdien, der udføres for at inducere selvorganiseringen af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller de adskilte lagfragmenter til membraner, finder sted ved hjælp af dialyse.

18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-17, kendetegnet ved, at de mono- og/eller bifunktionelle frem- 15 mede molekyler har grupper, der reagerer med carboxygrupper, amino-grupper, sulfhydrylgrupper eller hydroxygrupper på proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler.

19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-18, kendetegnet ved, at selvorganiseringen af proteinmoleky- 20 lerne eller de proteinholdige molekyler og/eller lagfragmenterne til membraner finder sted ved en faststof/væske-fasegrænse.

20. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-19, kendetegnet ved, at de ved selvorganisering af proteinmolekylerne eller de proteinholdige molekyler og/eller lagfragmenterne 25 dannede membraner praktisk talt alle har maksimumdimensioner i området under 100 μιη, fortrinsvis under 15 μτα.

21. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-20, kendetegnet ved, at placeringen af membranerne henholdsvis på eller i bæreren udføres ved afsætning på en porøs bærer. DK 164085 B

22. Anvendelse af strukturen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12 eller af en struktur fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-21, kendetegnet ved, at den anvendes som ultrafilter eller som 5 separationsorgan for en gasseparation eller som separationsorgan for en ionbytningsproces.

23. Anvendelse af strukturen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12 eller af en struktur fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-21, 10 kendetegnet ved, at den anvendes som bærer for andre semipermeable membraner, der strækker sig over porer i strukturmembranerne, idet disse andre semipermeable membraner hensigtsmæssigt er tværbundet med proteinmolekyler eller proteiriholdige molekyler i strukturens membraner ved hjælp af carboxygrupper og/eller aminogrup-15 per og/eller sulfhydrylgrupper og/eller hydroxygrupper enten direkte eller ved hjælp af bifunktionelle fremmede molekyler.

24. Anvendelse ifølge krav 23, kendetegnet ved, at de andre semipermeable membraner er hyperfiltreringsmembraner, hensigtsmæssigt overfladeaktivt stof-20 eller overfladeaktivt stof-lignende lipoide hyperfiltreringsmembraner.

25. Anvendelse ifølge krav 23, kendetegnet ved, at de andre semipermeable membraner er separationsorganer for en gasseparation, en ionbytningsproces eller 25 en pervaporeringsproces, eller er opløsningsdiffusionsmembraner.

26. Anvendelse af strukturen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12 eller af en struktur fremstillet ifølge en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 13-21, kendetegnet ved, at den anvendes som separationssøjle til 30 søjlechromatografi, hvor membranerne hensigtsmæssigt er vesikelfor-mede.

27. Anvendelse af en struktur ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12 i form af en film, DK 164085 B kendetegnet ved, at den anvendes som indkapslingsmateriale for stoffer.

28. Anvendelse ifølge krav 27, kendetegnet ved, at strukturen anvendes som biologisk 5 nedbrydeligt indpakningsmateriale eller som indkapslingshylster for farmaceutiske præparater til oral administration.