DK164466B - Fremgangsmaade og reagenssaet til bestemmelse af digoxinindhold i en biologisk proeve - Google Patents

Description

i

DK 164466 B

For at en analyse, hvor koncentrationen af analyten aflæses på en standardkurve, skal være præcis, må standarderne og patientprøverne opføre sig identisk under analysen. En af de mest kritiske faktorer mellem standarderne og patientprøverne er måske, at udvindingen af 5 analyten fra standarderne må være identisk med udvindingen af analyten fra patientprøverne, idet der ellers vil fremkomme fejlagtige værdier. Dette er specielt relevant, hvis den totale mængde af analyt i patientprøven måles.

Ved fluorescenspolarisationsassays af analyter i serum er et af de 10 uønskede kendetegn ved denne metode serummets høje fluorescensbaggrund. Dette bliver især besværligt, når der måles lave niveauer af analyter såsom digoxin. I dette tilfælde er analysen ikke gennemførlig under direkte anvendelse af serum direkte med en fluorescein-mærket digoxintracer eftersom serumbaggrundsfluorescensen langt 15 overstiger det fluorescenssignal, der udsendes af den fluoresceinmær-kede -digoxintracer.

Med henblik på at overvinde den høje baggrundsfluorescens fra serummet er proteinfrie filtrater typisk blevet fremstillet under anvendelse af perchlorsyre eller trichloreddikesyre. Selv om metoder-20 ne er effektive til at fremstille et proteinfrit filtrat, der er relativt fri for baggrundsfluorescens, lider de af andre ulemper. I tilfældet digoxin fås der en relativt dårlig udvinding i supematan-ten, og endvidere er udvindingen afhængig af prøvens proteinkoncentration. Jfr. fx Porter et al., Clin. Chem. 30, s. 1826-1829 (1984).

25 Anvendelse af ultrafiltrering til fremstilling af proteinfrie filtrater er også kendt inden for teknikken. I et sådant system bliver protein selektivt holdt tilbage i en fraktion af prøvevolumenet (retentatet), medens fri ligand i det væsentlige uhindret passerer gennem membranen sammen med solvent over i ultrafiltratet. Systemer 30 til udførelse af sådan ultrafiltrering er kommercielt tilgængelige.

Et sådant system er Centrifree™ mikrodelingssystemet, der forhandles af Amicon Corporation, Danvers, Massachusetts. Dette system er i grunden en selvstændig filterindretning med en filtermembran med en sådan porøsitet, at ca. 99,9% af proteinerne i serum forhindres i at 35 passere gennem ved centrifugalfiltrering. Den med filtrene følgende

DK 164466 B

2 reklamelitteratur antyder, at de skal anvendes til at separere "frie" serumanalyter, især lægemidler, fra den proteinbundne fraktion. I fraværelse af et dissocieringsmiddel til at frigøre lægemiddel, der er bundet til protein, vil således kun det frie lægemiddel i serum 5 tillades at passere gennem filteret og således måles ved en analyse.

Rapporter i litteraturen antyder, at ca. 20-30% digoxin i serum er bundet til serumproteiner. Jfr. Pribor et al., Drug Monitoring and Pharmokinetic Data, Pathotex Publishers, Park Forrest South, 111.,

O

s. 57 (1980). Hvis -Έ-digoxin således blev sat til humant serum, 10 ville ca. 70-80% af mærkningen kunne forventes at blive genvundet i filtratet. Ved anvendelse af 10 normale humane serumprøver, til hvilke der var sat %-digoxin, efterfulgt af centrifugalfiltrering gennem ul traf il trene, blev det fundet, at 15-25% af digoxinet i disse sera ikke kunne udvindes i filtratet og således formodentlig var 15 proteinbundet.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til måling af totalt serumdigoxin under anvendelse af en kombination af centrifugalultrafiltrering og dissocieringsmidler, der anvendes til at dissociere det til serumproteinerne bundne digoxin. En række forbindel-20 ser har vist sig at være virksomme enten alene eller i kombination til at dissociere proteinbundet digoxin fra serumproteinerne. Eksemplerne på sådanne virksomme dissocieringsmidler omfatter quindin,

Vitamin E (a-tocopherol), lavere alkanoler og 2g~fe<itsyrer1 især langkædede mættede og umættede fedtsyrer. Virksomme koncentrationsom-25 råder blev fundet at være ca. 2-50 mg pr. 500 μΐ serum for fedtsyrerne og e-tocopherol, 50-500 /ig pr. 500 μΐ serum for quindin, og 3-100 mg for en lavere (mættet eller umættet) alkanol (C^ j) såsom isopro-pylalkohol.

O

Resultater opnået ved eksperimenter omfattende tilsætning af JH-digo-30 xin til normalt humant serum efterfulgt af tilsætning af et dossocie-ringsmiddel og centrifugalfiltrering er opsummeret nedenfor i tabel I.

DK 164466 B

3

Tabel I

Dissocieringsmiddel mg tilsat/500 μΐ serum % -digoxin-udvinding i filtrater 5 1. H20 10 81 2. Arachidonsyre 10 104 3. Linolensyre 10 96 4. Vitamin E 20 91 5. Quinidin (200 μg) 87 10 6. Linolensyre 10 103 7. Oliesyre 10 91 8. Isopropanol 25 93 9. Linolensyre (16 mg) og

Isopropanol (9 mg) 25 98

15 EKSEMPEL

Anvendelse af et dissocieringsmiddel og centrifugalultrafiltrering eksemplificeres under anvendelse af et fluorescenspolarisationsassay for digoxin på COBAS BIO.

Reagenser: 20 1) Antistofreagens - 0,2 mol tris(hydroxymethyl)aminome- than/1, pH 8,0, indeholdende kanin-antidigoxin-serum, 0,01% bovint gammaglobulin, 0,1% natriumazid og overfladeaktivt middel.

2) Tracerreagens - 0,05 mol tris (hydroxymethyl)aminomethan/1, 25 pH 8,0, indeholdende 0,01% bovint gammaglobulin, 0,1% na triumazid og overfladeaktivt middel.

3) Digoxindissocieringsmiddel - 67% (volumen/volumen) linolensyre i isopropanol.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af totale digoxinniveauer i en biologisk væskeprøve, kendetegnet ved, at digoxin-protein-complexet sprænges ved at behandle prøveopløsningen med en effektiv mængde af et dissoci-25 eringsmiddel valgt blandt ét eller flere medlemmer af klassen bestående af en 2g"mætt:et eller umættet fedtsyre, en ^-lavere al-kanol, quinidin og a-tocopherol for at frigøre det bundne digoxin fra serumprotein, den behandlede prøveopløsning passeres gennem et cen-trifugalultrafilter for selektivt at passere digoxinholdig prøveop- DK 164466 B løsning gennem filteret og tilbageholde serumproteinerne, og digoxi-nindholdet i prøveopløsningen bestemmes ved en fluorescenspolarisationsmetode.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 kendetegnet ved, at dissocieringsmidlet er linolensyre.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dissocieringsmidlet er arachidonsyre.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dissocieringsmidlet er linolsyre.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dissocieringsmidlet er isopropylalko-hol.

5 Analysen udføres på følgende måde: a) 500 μΐ prøve (serum, plasma, spyt, urin) sættes til et Amicon Centrifree™ mikrodelingssystemfilter (en anisotro-pisk, hydrofil YMT-ultrafiltreringsmembran). b) 25 μΐ af digoxindissocieringsmidlet sættes til, og ind- 10 holdet af filteret hvirvelblandes eller mixes. c) Efter anbringelse af en opsamlingskop i bunden af filteret anbringes delene fortrinsvis i en centrifuge med fast-vinklet rotor (35®-45°) og centrifugeres ved 2000 x g i 20 minutter. 15 d) Efter centrifugering fjernes filteret og opsamlingskoppen fra centrifugen, og ultrafiltratet, der indeholder digoxi-net, analyseres ved et fluorescenspolarisationsassay for at måle digoxinkoncentrationen. Et eksempel på en typisk kalibreringskurve er vist i fig. 1.

20 PATENTKRAV

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dissocieringsmidlet er en blanding af 15 isopropylalkohol og linolensyre.

7. Reagenssæt til bestemmelse af totale digoxinniveauer i en biologisk væskeprøve, kendetegnet ved, at det omfatter en flaske af hver af følgende reagenser i mængder, der er tilstrækkelige til at udføre flere 20 analyser: (1) anti-digoxin-antistofreagensopløsning; (2) tracerreagensopløsning; og (3) digoxindissocieringsmiddelopløsning.

8. Reagenssæt ifølge krav 6, 25 kendetegnet ved, at anti-digoxin-antistoffet er kanin-anti-digoxinserum.

9. Reagenssæt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at digoxindissocieringsmidlet er en blanding af linolensyre i isopropanol. DK 164466 B

10. Reagenssæt Ifølge krav 6, kendetegnet ved, at traceropløsningen er et fluorescein -digoxin-konjugat.

11. Reagenssæt ifølge krav 6, 5 kendetegnet ved, at (1) anti-digoxin-antistoffet er kanin-anti-digoxinserum; (2) digoxindissocieringsmidlet er valgt fra klassen bestående af linolensyre, arachidonsyre og linolsyre; og (3) digoxintracerreagensopløsningen er et fluoresceindigoxin- 10 konjugat.