DK164987B - Anvendelse af spergualin eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf til fremstilling af et laegemiddel med transplantationsimmunitetsinhiberende og antiallergisk aktivitet - Google Patents

Description

i

DK 164987 B

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af sper-gualin eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf til fremstilling af et lægemiddel med transplantationsimmuni-tetsinhiberende og antiallergisk aktivitet.

5 Forskellige immunoinhiberende midler anvendes for tiden til inhibering af afstødning og andre transplantations-immunitetsreaktioner, som kan forekomme ved organtransplantation, og blandt sådanne undertrykkende midler skal nævnes steroidhormoner, antimetaboliter, alkyleringsmidler og an-10 tibiostatika. Steroidhormoner er virksomme over for mange forskellige allergisygdomme, hvorimod ikke-steroide, antiin-flammatoriske midler og antiinflammatoriske enzymer sædvanligvis anvendes ved symptomatisk terapi af inflammationer, der ledsager allergiske reaktioner. Guldforbindelser og 15 chloroquiner anvendes specielt mod rheumatisk arthritis.

Til behandling af bronchial astma og urticaria anvendes antihistaminer.

Spergualin er en forbindelse, som er blevet isoleret af Umezawa et al. fra filtratet af et kuturnæringsmedium af 20 en spergualinproducerende mikroorganisme af slægten Bacillus (se JP-OS nr. 48957/1982).

Eksisterende immunoinhiberende midler forårsager almindeligvis alvorlige bivirkninger, når de indgives til mennesker. Det er derfor ønskeligt at udvikle immunoinhibe-25 rende lægemidler, som virker selektivt på lymphocyter og andre celler af immunologisk betydning, medens de forårsager minimale bivirkninger.

På den anden side er udviklingen af effektive antial-lergiske midler ønskelig til afhjælpning af det stigende 30 antal tilfælde af allergisygdomme, såsom allergisk astma, allergisk rhinitis og pollinosis.

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af spergualin med formel (I)

DK 164987 B

2

NH

II

NH2-C-NH-(CH2)4-CH-CH2C0NH-CH-C0NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 (I)

5 OH OH

eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf til fremstilling af et lægemiddel med transplantationsimmunitetsinhiberende og antiallergisk aktivitet, hvilket lægemiddel er i stand 10 til at inhibere afstødning og andre transplantationsimmun-reaktioner, som kan forekomme ved transplantationer af organer og andre væv.

Spergualin har strukturformlen (I) og kan fremstilles ved en kendt metode (se JP-OS nr. 48957/1982) 15

NH

II

nh2-c-nh-(CH2)4-ch-ch2conh-ch-conh-(CH2)4-nh-(CH2)3-NH2 (I)

20 OH OH

Forbindelsen med formel (I) danner salte med syrer, og ud fra et stabilitetssynspunkt anvendes forbindelsen faktisk i form af sine salte. Saltdannende syrer kan være 25 uorganiske eller organiske, hvis de er farmaceutisk acceptable. Foretrukne uorganiske salte er saltsyre, svovlsyre, salpetersyre og phosphorsyre, foretrukne organiske syrer er eddikesyre, propionsyre, ravsyre, fumarsyre, maleinsyre, æblesyre, vinsyre, glutarsyre, citronsyre, benzensulfonsyre, 30 toluensulfonsyre, methansulfonsyre, ethansylfonsyre, pro-pansulfonsyre, asparaginsyre, glutaminsyre og sulfaminsyre.

Spergualin kan anvendes direkte som immunoinhiberende eller antiallergisk middel, men det indgives sædvanligvis i blanding med excipienter eller bærestoffer. Farmaceutisk 35 acceptable excipienter og bærestoffer bør udvælges og deres type og sammensætning bestemmes af indgiftsvejen og -metoden. Flydende bærestoffer, der er egnet til fremstilling af injektioner, omfatter vand, alkoholer samt animalske, vegetabilske og syntetiske olier, såsom sojabønneolie, jordnødde-

DK 164987 B

3 olie, sesamolie og mineralolie. De følgende flydende bærestoffer foretrækkes almindeligvis: en fysiologisk saltopløsning, pufferopløsninger, sukkerarter, såsom glucose, mannose og mannitol, vandige opløsninger indeholdende cyclitoler, 5 såsom sukkeralkohol og inositol, og glycoler, såsom ethylen-glycol, propylenglycol og polyethylenglycol. Alternativt kan spergualin frysetørres sammen med excipienter, såsom sukkerarter, f.eks. glucose, maltose, saccharose, mannose og mannitol, cyclitoler, f.eks. sukkeralkohol og inositol, 10 og aminosyrer, f.eks. phenylalanin. Før intravenøs injektion opløses en sådan frysetørret forbindelse i et egnet opløsningsmiddel, såsom steriliseret vand, en fysiologisk saltopløsning, glucoseopløsning, elektrolytopløsning og amino-syreopløsning. I injektioner andrager indholdet af effektiv 15 ingrediens almindeligvis fra 0,1-30 vægt%, fortrinsvis fra 1-10 vægt%. Til oral indgift kan spergualin anvendes i form af tabletter, kapsler, pulvere, granuler, flydende eller faste sirupper. Ved kapsler, tabletter og pulvere er indholdet af effektiv ingrediens i området fra 5 til 100 vægt%, 20 fortrinsvis fra 25 til 100 vægt%.

Dosen af lægemidlet indeholdende spergualin som virksom ingrediens bør fastsættes på passende måde afhængigt af patientens alder og legemsvægt samt alvoren og typen af sygdom. Den virksomme dosis andrager sædvanligvis fra 1 til 25 100 mg/kg/dag ved parenteral indgift og fra 5 til 500 mg/kg/dag ved oral indgift.

Akuttoksicitetsforsøg hos mus viser, at LD50 for spergualin er ca. 150 mg/kg ved intraperitoneal indgift, og at den gradvise intravenøse indgift af 80 mg/kg ikke er 30 dødelig. Der iagttages ingen kumulativ toksicitet. Når disse dta betragtes sammen, anses spergualin for at være et meget sikkert lægemiddel (Takeuchi et al., Journal of Antibiotics, bind 34, nr. 12, side 1619-1621, 1981).

Der er blevet udført forsøg til vurdering af virknin-35 gerne af spergualin over for reaktionen af lymphocytblast-genese i overensstemmelse med metoden ifølge Waithe et al.

DK 164987B

4 (Handbook of Experimental Immunology, side 26.1, 1978).

Forsøgene afslører, at spergualin mærkbart inhiberer T-lym-phocytblastgenese stimuleret af concanavalin A (ConA) og reaktion af B-lymphocytblastgenese stimuleret af lipopoly-5 saccharid (LPS) (forsøg 1 og 2).

I overensstemmelse med metoden ifølge Jerne et al.. Cell-bound Antibodies, side 109-122, 1963, undersøges endvidere den inhiberende virkning af spergualin på humoral immunitet, som primært er B-lymphocyternes domæne. Forsøget 10 udføres ved tælling af antallet af miltceller, som ekstra-heres fra mus, der er sensibiliseret med antigene, røde blodceller fra får, og som danner immunoglobulin M-plader (IgM) . Som opsummeret i forsøg 3 udviser spergualin kraftige inhiberende virkninger. Tilskyndet af disse resultater, som 15 antyder den mulighed, at spergualin inhiberer almindelig antistofdannelse af B-lymphocyter, er der blevet foretaget fortsatte undersøgelser af inhiberingen af B-lymphocytevnen til produktion af IgG- og IgE-antistoffer. Som opsummeret i forsøg 4 og 5 inhiberer spergualin produktionen af IgG og 20 IgE.

Ovennævnte resultater afslører, at spergualin har evnen til at inhibere funktionen af B-lymphocyter, som følge deraf humoral immunitet.

Spergualin kan derfor anvendes som den virksomme 25 ingrediens i et transplantationsimmunoinhiberende og antial-lergisk middel til inhibering af afstødning og andre transplantat ions immunologe reaktioner, som kan forekomme ved organtransplantation. Til påvisning af muligheden for anvendelse af spergualin i transplantationsimmunoinhiberende 30 middel indgives spergualin til mus, der har fået transplanteret P815-mastromytoma som allopodning, og som er blevet undersøgt for inhibering af fremkomsten af allodræbende T-lymphocyter som reaktion på podningen. Hvis spergualin indgives i 9 efterfølgende dage, begyndende på dagen efter 35 transplantation, er aktiviteten af allodræberen i miltcellerne inhiberet signifikant, således som det er vist i forsøg

DK 164987 B

5 6. Derefter udføres et hudpodeforsøg med rotter. I overensstemmelse med metoden ifølge Denham et al., International Archives of Allergy and Applied Immunology, bind 62, side 443-458, 1980, tages huden af halen på SHR-rotter og al-5 lopodes over på Fischer-rotter. Hvis spergualin dagligt indgives intraperitonealt til recipient-rotter, begyndende på dagen efter transplantation, udvides podeaccept-perioden for de behandlede rotter signifikant i sammenligning med den ubehandlede gruppe, og følgeligt viser spergualin sig 10 at have en uventet stor evne til at inhibere afstødning på grund af transplantationsimmunitet (se forsøg 7). Der iagttages ingen bivirkninger, såsom knoglemarvsinhibering. Disse resultater viser kun ét eksempel på spergualins anvendelighed ved organtransplantation. Den inhiberende virkning af sper-15 gulain på vævsafstødninger forventes ikke kun at manifestere sig ved hudtransplantation, men også ved transplantation af sådanne organer som nyrer, hjerte, milt, lunger, lever og knoglemarvsudskillende organer. Graden af afvisning varierer afhængigt af typen af transplantation, isogen, allogen 20 eller heterogen. Spergualin forventes imidlertid at udvise sine virkninger i alle disse tilfælde og afviger kun med hensyn til styrke.

På grundlag af data opnået i forsøg 3, 4 og 5, som viser evnen hos spergualin til at inhibere antistofproduk-25 tion, kan det konkluderes, at spergualin vil være værdifuld ved behandling af mange allergisygdomme, især dem, er er forbundet med humoral immunitet. Den direkte årsag til allergisygdomme afviger med den specifikke type af allergi, men bortset fra forsinket hypersensitivitet formidlet af 30 sensibiliserede lympheceller afhænger alle allergiske reaktioner af antistofproduktionen som reaktion på exogene og endogene antigener og af den resulterende vekselvirkning mellem antigen og antistof. Atopisk dermatitis, pollinosis, bronchial astma og allergisk rhinitis forårsages f.eks. af 35 den umiddelbare hypersensitivitet, der er forbundet med humoral immunitet, og IgE antages at spille en rolle ved

DK 164987 B

6 denne umiddelbare form for hypersensitivitet. Når spergualin indgives dagligt til mus, der er sensibiliseret med ægalbumin, forbliver dannelsen af anti-ægalbumin-IgE-antistoffer i blodet på signifikant lave niveauer gennem hele behandlin-5 gen, således som det er vist i forsøg 5. Det har også vist sig, at den inhiberende virkning af forbindelsen varer i et vist tidsrum, efter at indgiften af forbindelsen er ophørt.

Disse data viser, at spergualin har en kraftig inhiberende virkning på IgE-forbundne allergiske reaktioner af type I, 10 og at forbindelsen derfor vil give et antiallergisk lægemiddel, der er anvendeligt ved behandling af disse allergisygdomme, hvor IgE er opløst. Som vist i forsøg 4 og 5 har spergualin også evnen til at inhibere produktionen af IgM og IgG, og derefter vil dets anvendelighed udvides til at 15 omfatte behandling af allergisygdomme, er er forårsaget af en hypersensitivitetsreaktion af type II eller III, såsom serumsygdomme og hemolytiske sygdomme hos nyfødte på grund af Rh-uforenelighed.

De følgende forsøgseksempler er tilvejebragt til 20 yderligere illustration af aktiviteterne af spergualin.

Forsøg 1: Inhibering af ConA-fremkaldt reaktion af T-lym-phocytblastgenese af spergualin (trihydrochlorid) 25 Miltceller fra BALB/c-mus fordeles i huller i en mikroplade, således at hvert hul indeholder 2 x 105 celler/0,2 ml. Spergualin sættes til alle huller undtagen et, der anvendes som kontrol. 4 ^g/ml ConA sættes til alle huller, og de således fremstillede cellesuspensioner dyrkes 30 i en inkubator med 5% C02 i 72 timer ved 37°C. 8 timer før afslutning af inkubationen sættes 1 μΟί 3H-thymidin til hvert hul, og de dyrkede cellers optagelse af thymidin måles ved hjælp af en væskescintillationstæller til bestemmelse af fremskriden af reaktionen af T-lymphocytblastgenese. Den 35 procentvise inhibering af denne genese med forsøgsforbindelsen beregnes som (1 - Bdpm/Adpm) x 100, hvor Adpm angiver optagelsestællingen for tilsætning af kun ConA, og Bdpm

DK 164987 B

7 angiver tællingen for tilsætning af både ConA og forsøgsforbindelsen.

Som vist i tabel I viser spergualin en stærk evne til at kunne inhibere den ConA-fremkaldte reaktion af T-lym-5 phocytblastgenese.

Tabel I

Inhibering af ConA-fremkaldt reaktion af T-lymphocytblast- genese med spergualin (trihydrochlorid) 3.0 -

Koncentration Optagelse af Inhibering (jtig/ml) 3H-thymidin % (dpm ± M.A.) 15 Kontrol (0) 129.616 ± 35.477 0

Spergualin (10) 30.124 ± 25.033 76,7

Spergualin (100) 788 ± 182 99,4 20 Forsøg 2r Inhibering f LPS-fremkaldt reaktion af B-lympho-cytblastgenese med spergualin (trihydrochlorid)

Optagelse af 3H-thymidin af B-celleblast måles i overensstemmelse med metoden anvendt i forsøg 1, bortset 25 fra at fremkalderen ConA erstattes med 100 μg/ml LPS fra E. coli. Den procentvise inhibering af blastgenese med forsøgsforbindelsen bestemmes også med samme metode som i forsøg 1.

Som vist i tabel II er spergualin meget effektivt til inhibering af LPS-fremkaldt genese af B-lkymphocytblast.

30

Tabel II

Inhibering af LPS-fremkaldt reaktion af B-lymphocytblastge- nese med spergualin (trihydrochlorid)

DK 164987 B

8 5 Koncentration Optagelse af Inhibering (/xg/ml) 8H-thymidin % (dpm ± M.A.)

Kontrol (0) 234.356 ± 61.436 0 10 Spergualin (10) 38.842 ± 21.573 83,4

Spergualin (100) 396 ± 216 99,8

Forsøg 3: Inhibering af produktion af IgM-antistoffer imod 15 røde blodlegemer fra får med spergualin (trihydrochlorid) CDF l-mus (6-10 uger gamle, hunner) immuniseres ved intravenøs injektion af 1 - 108 røde blodlegemer fra får.

Til musene indgives intraperitonealt forskellige doser (se 20 tabel III nedenfor) af forsøgsforbindelsen i en periode på 3 dage begyndende med dagen efter den intravenøse injektion.

4 dage senere isoleres miltceller fra musene, og antallet af IgM-pladedannende celler tælles ved hjælp af en kendt metode (Yata et al.: Gan to Kagaku Ryoho (Cancer and 25 Chemotherapy), bind 2, side 903-908, 1975). Den procentvise inhibering af IgM-antistofproduktion beregnes som (1 - B/A) x 100, hvor A er tællingen for en kontrolgruppe (der er tilført en fysiologisk saltopløsning), og B er tællingen for den behandlede gruppe.

30 Som vist i tabel III inhiberer spergualin kraftigt produktionen af IgM-antistoffer.

Tabel III

Inhibering af IgM-antistofproduktion imod røde blodlegemer fra får med spergualin (trihydrochlorid) 9 5 Dosis Tælling af IgM-plade-dannende Inhibering (mg/kg/dag) celler (celler/106 miltceller % x 100 ± 100 ± M.A.) 0 (kontrol) 1.454 ± 197 0 10 1 1.304 ± 188 10,3 5 632 ± 87* 56,5 10 392 ± 87* 73,0 25 149 ± 53* 89,7 50 64 ± 24* 95,5 15 * signifikant (P 0,001).

Forsøg 4: Inhibering af IgM-antistofproduktion imod røde 20 blodlegemer fra får med spergualin (trihydrochlorid) CDF 1-mus (6-10 uger gamle, hunner) immuniseres ved intravenøs injektion af 1 x 108 røde blodlegemer fra får. Til musene indgives intraperitonealt 50 mg/kg/dag af forsøgsfor-25 bindeisen i en periode på 4 dage begyndende med dagen efter immuniseringen eller 3 dage efter denne dag. 7 dage efter sensibiliseringen isoleres miltceller, og antallet af IgM--pladedannende celler tælles ved hjælp af en kendt metode (Yata et al., supra). Som i forsøg 3 bestemmes den. procent-30 vise inhibering af IgG-antistofproduktionen. Resultaterne er vist i tabel IV, hvoraf det fremgår, at spergualin ved begge affinitetsmetoder udviser kraftig inhiberende aktivitet over for IgG-antistofproduktionen.

Tabel IV

Inhibering af IgM-antistofproduktion over for røde blodle gemer fra får med spergualin (trihydrochlorid)

DK 164987 B

10 5 Dosis Indgiftsmetode Tælling af Inhibering (mg/kg/dag) dage efter IgG-pladedan- % sensibilisering nende celler (celler/106 miltceller 10 ± M.A.)

Kontrol(0) - 508 ±89 0

Spergualin (50) 1-4 17 ± 16* 96.7

Spergualin (50) 3-6 19 ± 15* 96,3 15 *: signifikant (P 0,0001).

Forsøg 5; Inhibering af IgE-antistofproduktionen imod ægal-20 bumin med spergualin (trihydrochlorid) BALB/c-mus (7 uger gamle, hunner) inficeres ved in-traperitoneal indgift af 10 jug ægalbumin sammen med 4 g alu-miniumhydroxidgel. Til musene indgives derefter intrape-25 ritonealt 50 mg/kg/dag af forsøgsforbindelsen i overensstemmelse med skemaerne vist i tabel V. Efter infektion udtages blod fra fundus hos hver mus med 10 dages mellemrum til serumopsamling. Antistoftiteren af IgE i serumet bestemmes ved passiv kutan anaphylaxe på følgende måde. Fischer 344-30 -rotter (hunner, 10 uger gamle) får indsprøjtet 0,05 ml fortyndet serum i ryghuden. 4 timer senere indgives 1 ml ægalbumin og 0,5 ml af 1%'s Evans blue i halevenen, og den sluttelige serumfortynding, der frembringer en blå plet med en diameter på mindst 5 mm 30 minutter efter den intravenøse 35 indgift, anvendes som et mål for antistoftiter.

Resultaterne er vist i tabel V, hvoraf fremgår, at spergualin inhiberer IgE-produktionen kraftigt, hvis det indgives lige efter den antigene infektion.

DK 164987 B

11

Tabel V

Inhibering af IgE-antistofprodukter imod ægalbumin med spergualin (trihydrochlorid) 5 Indgiftsskema Antal (dage efter indgi- fektion) velser 10 dage 20 dage 30 dage 40 dage (ubeh. kontrol) 0 110 ± 85 230 + 234 440 ± 339 680 ± 497 10 1-8 8 13 ± 33 60 ± 31 320 ± 0 320 ± 0 9-16 8 120 ± 98 110 + 106 320 ± 0 480 ± 392 1-16 16 0 ± 0 8 ± 9 80 ± 120 200 ± 131

Dosis: 50 mg/kg/dag (i/p).

15 -— -——

Forsøg 6: Inhibering af allodræber T-lymphocytgenese med spergualin (trihydrochlorid) 20 3 x 107 P815-mastocytomaceller indgives intraperitonealt til 10 uger gamle c 57 BL/b-mus. 12 dage senere isoleres miltceller og anvendes som effektorceller (E) . Målceller (T), som er 51Cr-mærkede P815-mastrocytomaceller, inficeres med effektorcellerne ved forskellige E/T-forhold, og allo-25 dræberaktiviteten bestemmes i form af den procentvise frigivelse af 51Cr. Spergualin indgives i 9 efterfølgende dage begyndende med dagen efter transplantationen, eller en enkelt indgivelse foretages den 9. dag. Som vist i tabel VI in-hiberer spergualin i væsentlig grad allodræberaktiviteten 30 imod podningen.

Tabel VI

Inhibering af allodræber T-lymphocytgenese med spergualin (trihydrochlorid) 12

DK 164987 B

5 Dosis af Indgiftsskema Procentvis frigivelse af 51Cr spergualin (dage efter E/T-forhold (mg/kg/dag) transplantation) 5 10 20 0 10 (kontrol) - 34 48 68 5 1-9 6 8 17 50 1-9 0 0 1 50 9 21 30 51 15 E/T-forhold: effektorcelle (miltcelle)/målcelle (51Cr-mastrocytoma).

Forsøg 7: Inhibering af afstødning ved hudtransplantation med spergualin (trihydrochlorid) 20 - 5 x 10 mm store hudstykker pilles af halen på SHR- -rotter (hunner, 10 uger gamle) og transplanteres over på ryggen af Fischer-rotter (hunner, 10 uger gamle) . Forskellige doser af spergualin indgives intraperitonealt i en efterføl- 25 gende periode på 10 eller 20 dage begyndende på dagen efter transplantation. Fuldstændig nekrose af podningen anvendes som et mål for afstødning, og forbindelsens inhiberende virkning vurderes ved, hvor længe afstødningen blev udskudt.

Som vist i tabel Vil er den inhiberende virkning af forbin- 30 delsen dosis-afhængig. Jo længere indgiftsperiode, jo større inhiberende virkning. Fuldstændig inhibering af afstødning sikres under hele indgiftsperioden. Der iagttages ingen inhibering af knoglemarven.

DK 164987 B

13

Tabel VII

Dosis Indgifts- Antal Gennemsnitligt (mg/kg/dag) periode rotter antal dage før (dage efter i en afstødning 5 transplan- gruppe (dage ± M.A.) tation)

Kontrol - 24 7,4 ± 1,3 (ubehandlet) 10 6,25 1-10 6 10,2 ± 2,6

Forsøg 1 12,5 1-10 9 13,0 ± 4,2 25.0 1-10 14 14,9 ± 6,9 50.0 1-10 12 17,0 ± 3,2

Kontrol 15 (ubehandlet) - 6,6 ± 1,8

Forsøg 2 25,0 1-10 15,0 ± 5,2 25.0 1-20 31,0 ± 1,9 20 Som det er klart af ovenstående data, har spergualin kraftig inhiberende virkning på transplantationsimmunreak-tioner uden at forårsage nogen som helst bivirkninger på knoglemarven. Forbindelsen udviser altså kraftig inhiberende virkning både på IgE-, IgM- og IgG-antistofproduktionen og 25 på allergier, især dem, der er forbundet med humoral immunitet.

De følgende eksempler er tilvejebragt til yderligere illustration af den foreliggende opfindelse.

30 Eksempel 1 30 vægtdele spergualin-hydrochlorid blandes med renset vand til at udgøre en samlet mængde på 2000 dele. Opløsningen ledes gennem et "Millipore"®-filter af GS-typen til sterilisationsformål. 2 g af filtratet hældes i 10 ml hætteglas 35 og frysetørres til fremstilling af injektioner, der hver især indeholder 30 mg af spergualin-hydrochlorid pr. hætteglas.

DK 164987 B

14

Eksempel 2. Granuler

En inderlig blanding af 50 vægtdele spergualin-hy-drochlorid, 600 dele lactose, 330 dele krystallinsk cellulose og 20 dele hydroxypropylcellulose presses sammen med en 5 "Roller Compactor"® og formales til partikler, som sigtes til tilvejebringelse af granuler med en størrelse mellem 1,19 og 0,250 mm.

Eksempel 3. Tabletter 10 En blanding af 30 vægtdele spergualin-hydrochlorid, 120 dele krystallinsk lactose, 147 dele krystallinsk cellulose og 3 dele magnesiumstearat bearbejdes med en tabletteringsmaskine af V-typen til fremstilling af tabletter, der hver især vejer 300 mg.

Claims (1)

1. 5 NH II nh2-c-nh- (ch2) 4-ch-ch2conh-ch-conh- (ch2) 4-nh- (CH2)3-NH2 (I) OH OH 10 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf til fremstilling af et lægemiddel med transplantationsimmunitetsinhiberende og antiallergisk aktivitet.