DK165075B - Fremgangsmaade til bestemmelse af en analyt som er et antibiotikum af vancomycinklassen og som binder sig til en molekylaer receptor repraesenteret af et d-alanyl-d-alanin-dipeptid eller et d-alanyl-d-alanin-karboxyterminalt oligopeptid, samt analysesaet til anvendelse ved fremgangsmaaden - Google Patents
Fremgangsmaade til bestemmelse af en analyt som er et antibiotikum af vancomycinklassen og som binder sig til en molekylaer receptor repraesenteret af et d-alanyl-d-alanin-dipeptid eller et d-alanyl-d-alanin-karboxyterminalt oligopeptid, samt analysesaet til anvendelse ved fremgangsmaaden Download PDFInfo
- Publication number
- DK165075B DK165075B DK429386A DK429386A DK165075B DK 165075 B DK165075 B DK 165075B DK 429386 A DK429386 A DK 429386A DK 429386 A DK429386 A DK 429386A DK 165075 B DK165075 B DK 165075B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- alanyl
- antibiotic
- antibody
- alanine
- analyte
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical class O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims description 26
- -1 D-ALANYL Chemical class 0.000 title claims description 7
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229960001608 teicoplanin Drugs 0.000 claims description 33
- 108010053950 Teicoplanin Proteins 0.000 claims description 28
- DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N chembl2367892 Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(O)C=C(C=4)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CC=4C=C(Cl)C(O5)=CC=4)C(=O)N3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1Cl)=CC=C1OC1=C(O[C@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)NC(C)=O)C5=CC2=C1 DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N 0.000 claims description 28
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 21
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 21
- DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N D-alanyl-D-alanine Chemical compound C[C@@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C)C([O-])=O DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 20
- DEFJQIDDEAULHB-UHFFFAOYSA-N N-D-alanyl-D-alanine Natural products CC(N)C(=O)NC(C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 20
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 9
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 claims description 8
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 claims description 8
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- YRMCBQLZVBXOSJ-PCFSSPOYSA-N (e)-3-[(6r,6as)-4-hydroxy-6-methoxy-3-methyl-11-oxo-5,6,6a,7-tetrahydropyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-yl]prop-2-enamide Chemical compound CO[C@H]1NC2=C(O)C(C)=CC=C2C(=O)N2C=C(\C=C\C(N)=O)C[C@@H]12 YRMCBQLZVBXOSJ-PCFSSPOYSA-N 0.000 claims description 5
- KJTFTWQSEBLIPM-UHFFFAOYSA-N Antibiotic A 41030A Natural products N1C(=O)C(NC(C(N)C=2C=C(O3)C(O)=CC=2)=O)CC(C=C2Cl)=CC=C2OC(C=2O)=CC4=CC=2OC(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=C(Cl)C=C5C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C5NC(=O)C4NC(=O)C1C1=CC3=CC(O)=C1 KJTFTWQSEBLIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004184 Avoparcin Substances 0.000 claims description 5
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 claims description 5
- 108010020588 actaplanin Proteins 0.000 claims description 5
- BDNDRNLSLGGULA-UHFFFAOYSA-N actaplanin Chemical compound C=1C2=CC=C(O)C=1C1=C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C=C(O)C=C1C(C(=O)OC)NC(=O)C1NC(=O)C2NC(=O)C2NC(=O)C(C=3C=C(C(=C(O)C=3)C)OC=3C(O)=CC=C(C=3)C(N)C(=O)N3)NC(=O)C3CC(C=C3)=CC=C3OC(C=3OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)=CC2=CC=3OC(C(=C2)Cl)=CC=C2C1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 BDNDRNLSLGGULA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229950002379 actaplanin Drugs 0.000 claims description 5
- 108700023904 antibiotic A 47934 Proteins 0.000 claims description 5
- HRGFAEUWEMDRRZ-QLRHZSCISA-N antibiotic a 47934 Chemical compound N([C@H](C(N[C@@H](C1=CC(O)=CC(O)=C1C=1C(O)=C(Cl)C=C2C=1)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)OC=1C=C3C=C(C=1O)OC1=CC=C(C=C1Cl)C[C@H](C(=O)N1)NC([C@H](N)C=4C=C(O5)C(OS(O)(=O)=O)=CC=4)=O)C(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3NC(=O)[C@@H]1C1=CC5=CC(O)=C1 HRGFAEUWEMDRRZ-QLRHZSCISA-N 0.000 claims description 5
- 108010053278 avoparcin Proteins 0.000 claims description 5
- JWFVWARSGMYXRN-HTQQBIQNSA-N avoparcin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@H]2C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C4=CC(O)=CC(O)=C4C=4C(O)=CC=C3C=4)C(O)=O)=O)CC3=C(O[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](N)C4)C=C(C(=C3)Cl)OC=3C=C2C=C(C=3O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](N)C2)OC2=CC=C1C=C2)C=1C=CC(O)=CC=1)=O)NC(=O)[C@@H](NC)C=1C=CC(O[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)=CC=1)[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O JWFVWARSGMYXRN-HTQQBIQNSA-N 0.000 claims description 5
- 229950001335 avoparcin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019377 avoparcin Nutrition 0.000 claims description 5
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 claims description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 5
- RXKCHPQFBWGDEU-UHFFFAOYSA-N Antibiotic A 35512B Natural products C=1C2=CC=C(O)C=1C1=C(O)C=C(O)C=C1C(C(=O)OC)NC(=O)C(C(C1=CC=C(C=C1)OC=1C=C3C=C(C=1O)OC1=CC=C(C=C1)C(O)C(NC(=O)C(N)C=1C=C(O4)C(O)=CC=1)C(=O)N1)O)NC(=O)C2NC(=O)C3NC(=O)C1C1=CC4=CC(O)=C1Cl RXKCHPQFBWGDEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 4
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 3
- ALAZZUSERSVRER-RKDXNWHRSA-N (2r)-2-[[(2r)-2-(6-aminohexanoylamino)propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)CCCCCN ALAZZUSERSVRER-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 2
- ZHRODENVJFUAFN-PNKCYDOPSA-N aad 216 Chemical compound CCC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O.N1C(=O)C(NC(C(NC)C=2C=C(O3)C(O)=CC=2)=O)C(O)C(C=C2Cl)=CC=C2OC(C=2O)=CC4=CC=2OC(C(=C2)Cl)=C(Cl)C=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C5C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C5NC(=O)C4NC(=O)C1C1=CC3=CC(O)=C1Cl ZHRODENVJFUAFN-PNKCYDOPSA-N 0.000 claims description 2
- FHIABUHDBXFQIT-JSNQUVIDSA-N actinoidin Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](OC)[C@@H](N)C[C@@H]1OC(C1C(NC(C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)C(NC(=O)C2NC(=O)C(CC=3C=CC=CC=3)NC(=O)C(NC(=O)C(N)C=3C=CC(O)=CC=3)C(O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1Cl)=CC=C1OC1=C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](N)C3)C4=CC2=C1 FHIABUHDBXFQIT-JSNQUVIDSA-N 0.000 claims description 2
- 108700031667 actinoidins Proteins 0.000 claims description 2
- BTKFIPKSQSQNOY-UHFFFAOYSA-N antibiotic oa 7653 Chemical compound C=1C2=CC=C(O)C=1C1=C(O)C=C(O)C=C1C(C(O)=O)NC(=O)C1NC(=O)C2NC(=O)C2NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N(C)C)C)CC(C=C3Cl)=CC=C3OC(C=3O)=CC2=CC=3OC(C(=C2)Cl)=CC=C2C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O BTKFIPKSQSQNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 37
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 26
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 25
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 15
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 15
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical group O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VUOPFFVAZTUEGW-SRXUPNLNSA-N 32p08cbb99 Chemical compound C=1C([C@@H]2C(=O)N[C@@H]([C@@H](C3=CC=C(C=C3)OC=3C=C4C=C(C=3O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]5[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)CO3)O)OC3=CC=C(C=C3)[C@@H](O)[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C=5C=C(C(=C(O)C=5)C)OC=5C(O)=CC=C(C=5)[C@@H](N)C(=O)N3)C(=O)N[C@H]4C(=O)N2)O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@H](N)C2)C(=O)N[C@@H](C2=CC(O)=C3)C(=O)OC)=CC=C(O)C=1C2=C3O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O VUOPFFVAZTUEGW-SRXUPNLNSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N chembl3301825 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)C(O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108010062729 ristocetin A Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- KWIBRHGQCHIETC-CWSFPBCASA-N (7s)-3-[(3s)-3-[[(2r)-2-acetamido-4-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-amino-2-[[[[(2r,3s,4r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]oxymethyl]-3,6-dihydroxyoxan-4-yl]oxy-2-methyl-3-oxopentanoyl]amino]-4-[[(2 Chemical compound O[C@H]1[C@H](OC(C)C(=O)[C@@](C)(NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(C(N)C(O)=O)C(=O)CC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](C)C(O)=O)[C@@H](N)[C@@H](O)O[C@@H]1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 KWIBRHGQCHIETC-CWSFPBCASA-N 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101000930463 Sus scrofa Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 150000001989 diazonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9446—Antibacterials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/545—Synthetic resin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials Using Thermal Means (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 165075B
ι
Den foreliggende opfindelse angår en ny "sandwich"-prøve til bestemmelse af en analyt som er et antibiotikum af vancomycinklassen og som har evne til at binde sig til en molekylær receptor repræsenteret af et D-alanyl-D-5 alanin-dipeptid eller et D-alanyl-D-alanin-karboxytermi-nalt oligopeptid. Fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del angivne og har ikke blot anvendelse til bestemmelse af glykopeptidiske antibiotika af vancomycinklassen men også derivater og aglyko-10 ner deraf. Prøven forbinder den høje selektivitet af et passende D-alanyl-D-alanin-derivat til antibiotika af vancomycinklassen og specifiteten af antistof som er rettet mod det antibiotikum tilhørende klassen, der er genstand for bestemmelsen. Opfindelsen angår også et analysesæt 15 til brug ved fremgangsmåden.
Ifølge opfindelsen kan analytten være udvalgt blandt især vancomycin, teicoplanin, actaplanin, ristocetin, avoparcin, actinoidin, antibiotikum LL-AM-374, antibiotikum A 477, antibiotikum OA 7653, antibiotikum A 20 35512 B, antibiotikum A 515668, antibiotikum AAD 216, antibiotikum A 41030, antibiotikum A 47934 såvel som de enkelte faktorer, derivater og aglykoner deraf, fortrinsvis teicoplanin eller en enkelt faktor, et derivat eller en aglykon deraf.
25 Det er kendt at vancomycin og ristocetin A griber ind i syntesen af peptidoglykan, der er den vigtigste strukturkomponent i bakteriecellevæggen. Det formodes at denne indgriben, der fører til inhibering af cellevæksten og til sidst til ødelæggelse af cellen ved lysis, skyldes 30 en specifik binding mellem disse antibiotika og pentapep-tid-prekusoren med en D-Ala-D-Ala-rest ved karboxylenden (UDP-N-Acetylmuramylpentapeptid) (H.R. Perkins, Biochem.J. 111, 195, 1969).
Det blev opdaget for nyligt at også teicoplanin 35 virker gennem den samme mekanisme ved at binde sig til det voksende peptidoglykan i følsomme bakterier. Nærmere betegnet viste det sig at teicoplanin ligesom vancomycin og 2
DK 165075 B
ristocetin A og lignende antibiotika binder sig til pep-tidoglykaner indeholdende et D-Ala-D-Ala-dipeptid i kar-boxyenden. Ved at gøre det inhiberer de sandsynligvis den bakterielle transpeptidase og forhindrer tværbindingen af 5 cellevækst-peptidoglykan. Disse antibiotika binder også et D-alanyl-D-alanin-dipeptid eller et D-alanyl-D-alanin-kar-boxyterminalt oligopeptid. Også de andre antibiotika af van-comycinklassen har vist sig eller formodes at virke ved den samme virkningsmekanisme, og de er derfor i stand til 10 at binde sig til et D-alanyl-D-alanin-dipeptid eller D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid, og de kan fremkalde dannelse af'antistoffer mod dem i en egnet vært.
Hidtil kendte fremgangsmåder til bestemmelse af antibiotiske stoffer, navnlig teicoplanin og de andre anti-15 biotika af vancomycinklassen, er hovedsagelig baseret på TLC, HPLC og biobestemmelser på følsomme mikroorganismer.
I betragtning af den for tiden foregående terapeutiske anvendelse eller avancerede kliniske undersøgelser af nogle af disse antibiotika, består der behov for bestemmelses-20 metoder til bestemmelse af dem i væsker, navnlig biologiske væsker, som er specifikke, hurtige, lette, pålidelige og egnet til automatisering.
Navnlig er detekteringen af disse stoffer i legems-ekssudater, bronkie-ekspektorater, pus, hudprøver fra brand-25 sårspatienter og lignende biologiske kilder særlig vanskelig med kendte teknikker eftersom der ofte fås falsk-positive resultater. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er i modsætning hertil nøjagtig og pålidelig også på sådanne prøver.
30
Det D-alanyl-D-alanin-karboxyterminale oligopeptid kan være et tri-, tetra-, penta-, hexa- eller heptapeptid hvor det karboxyterminale dipeptid er repræsenteret af D-alanyl-D-alanin. Det foretrukne D-alanyl-D-alanin-karboxy-35 terminale oligopeptid ifølge opfindelsen er tripeptidet 33£-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin (i det følgende betegnet ε-Aca-D-Ala-D-Ala).
3
DK 165075 B
Det D-alanyl-D-alanin-karboxyterminale oligopeptid er konjugeret med en passende bærer for at gøre det adsor-berbart på en fast fase-overflade. En hensigtsmæssig bærer kan i dette tilfælde være et hvilket som helst protein el-5 ler andet højmolekylært stof med evne til at blive kovalent koblet til D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid til dannelse af et konjugat som har evne til at ad-sorbere (dvs. i stand til at indgå i fysiske bindinger) med den valgte fast fase-overflade. Et foretrukket eksempel på en 10 sådan bærer er albumin, navnlig oksealbumin. Imidlertid er også æg-, humant eller svinealbumin brugbare.
Den fast fase-overflade til hvilken den D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid-bærende bærer er ad-sorberet, er fortrinsvis overfladen af en analytisk bærer.
15 I nærværende beskrivelse sigter udtrykket "analytisk bærer" til et hvilket som helst analysemiddel som kan indeholde eller i det mindste eksponeres til flydende reagenser og som derfor kan bruges som overflade der bærer et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid konjugeret 20 med en passende makromolekylær bærer. Foretrukne eksempler herpå er mikrotiterplader af glas eller plast eller reagensglas eller plastark. Den mest foretrukne "analytisk bærer" er repræsenteret af rummene i en polyætylen- eller polystyren-mikrotiterplade.
25 Følgelig er den mest foretrukne "overtrukne analy tiske bærer" (dvs. overflade med oligopeptidet båret derpå) ifølge opfindelsen plastrum eller -rør overtrukket med fra 0,025 pg til 1 pm, fortrinsvis 0,1-0,2 pg (mikrogram) BSA-e-Aca-D-Ala-D-Ala.
30 Som allerede nævnt er den analyt der formodes at være til stede i "testopløsningen" et antibiotikum af van-comycinklassen eller, mere generelt, et passende emne til at binde sig til D-alanyl-D-alanin-dipeptidet eller D-ala-nyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid.
4
DK 165075B
"Antistoffer specifikt rettet mod det til bestemmelse værende stof" er antistoffer der frembringes i et dyr ved injektion af et passende konjugat af det til prøvning værende stof. Disse antistoffer kan være konventio-5 nelle antisera, der vindes ved immunisering af et dyr såsom en kanin, en rotte eller et andet pattedyr som ikke er et menneske, eller det kan være monokloneale antistoffer mod disse stoffer, fremstillet i det væsentlige ved at følge den af C. Milstein og G. Koheler (Nature 256, 10 495-497 (1975)) angivne cellefusionsteknik.
Eftersom analytterne er haptener (dvs. at de ikke er i stand til som sådanne af bevirke dannelse af antistoffer mod sig når de injiceres i et fra mennesket forskelligt pattedyr, men har immunogene egenskaber der kan ud-15 trykkes (expressed) når de kobles til en passende molekylærbærer af høj molekylvægt såsan et protein) konjugeres til en passende bærer, der i almindelighed er et protein såsom okseserumal-bumin forud for immuniseringen af det valgte værtsdyr.
Et hensigtsmæssigt værtsdyr til fremstilling af et 20 konventionelt antiserum, der derefter kan renses eller fraktioneres til isolering af vedkommende IgG, er kaninen. I modsætning hertil fremstilles monokloneale antistoffer konventionelt ved hjælp af hybridomer vundet ved fusion af rottemiltceller og homologe myelomceller i nærværelse af 25 et fusionsfremmende middel ved at man i det væsentlige følger ovennævnte fremgangsmåde ifølge Milstein og Koheler.
Til hensigtsmæssig anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen må hverken en signifikant andel af de polyklo-neale anstistoffer i det konventionelle antisera eller de 30 monokloneale antistoffer, som kan repræsentere de "antistoffer som er specifikt rettet mod det til bestemmelse værende stof", indgribe i bindingen af analytten (dvs. det til bestemmelse værende antibiotikum) med dens "molekylære receptor" (dvs. D-Ala-D-Ala-oligopeptidet adsorberet 35 på vedkommende overflade), og må selvsagt ikke krydsreagere med andre antibiotika tilhørende klassen, der måtte i
DK 165075 B
være til stede i prøven og samtidig binde sig til den molekylære receptor.
De "anti-anstistof-antisera", der bruges ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er konventionelle antistof-5 præparater mod immonuglobuliner G (IgG'er) fra en given dyreart, som er den dyreart til hvilken det "første" antistof (dvs. det der er rettet mod analytten) hører. Præparater af disse antistoffer såsom gede-antiserum til kanin og gede-anti-rotte-antistoffer vindes ved konventionel-10 le teknikker og er også tilgængelige i handelen.
Den detekterbare markør som kobles med dette anti- antistof-antiserum er en af de sædvanlige "markører" som bruges i immunobestemmelser såsom et enzym, en radioisotop eller et fluorescerende farvestof. Et foretrukket en-15 zym er en peroxidase såsom peberrods-peroxidase, der afsløres og bestemmes kvantitativt kolorimetrisk ved hjælp af et af dets kromogene substrater såsom ortofenylendiamin i nærværelse af hydrogenperoxid. Også de anti-antistof-antisera, som er koblet til den detekterbare markør, er 20 tilgængelige i handelen eller kan fremstilles ved konventionelle fremgangsmåder.
Som det forstås af de sagkyndige kan koblingsn af det D-alanyl-D-alanin-karboxyterminale oligopeptid med den ønskede bærer opnås ved hjælp af i og for sig kendte tek-25 nikker. Hensigtsmæssigt bruges der et koblingsmiddel; et foretrukket koblingsmiddel er glutaraldehyd. Eksempler på andre kendte koblingsmidler er karbodiimider, diisocyana-ter, anhydrider, diazoniumforbindelser, azider og cyano-genbromid. Tilsvarende kan der bruges kendte koblingsme-30 toder og -reagenser til kobling af anti-antistof-antiserum-met til den detekterbare markør. Disse fremgangsmåder afhænger i hovedsagen af den valgte detekterbare markørs egenskaber. Når den detekterbare markør er et enzym kan der bruges koblingsprocedurer som de ovenfor omtalte. Også i 35 dette tilfælde er glutaraldehyd det foretrukne koblingsmiddel. Ved disse koblingsreaktioner kan mængdeforholdene mellem reaktanterne varieres signifikant, selv om der i * mange tilfælde foretrækkes et forhold på ca. 1:1 mellem 6
DK 165075B
reagenserne. Desuden gælder det i tilfælde af koblingsreaktionen mellem et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oli-gopeptid, som er ε-Aca-D-Ala-D-Ala, og en makromolekylær bærer som er okseserumalbumin (BSA) at molforholdet mel-5 lem disse to reagenser kan variere fra 1:1 til 10:1.
Beskrevet mere udførligt er en foretrukken udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen som følger: (a) Fremstilling af en stardardkurve med kendte mæng- 10 der af analytten i en passende fortyndingspuffer, (b) fremstilling af prøverne*og derefter fortynding af dem i samme fortyndingspuffer som ovenfor, (c) særskilt tilsætning af standard fortyndingen og prøverne til den foran definerede overtrukne ana- 15 lytiske bærer, (d) efter inkubering ved stuetemperatur i en fugtig, dækket kasse, vask af den overtrukne analytiske bærer og tilsætning af et præparat af det "første" antistof (anti-analyt-antistof), hensigtmæssigt 20 fortyndet i ovennævnte fortyndingspuffer, (e) efter fornyet vask af den overtrukne analytiske bærer og tørring, tilsætning af det "andet" antistofpræparat (anti-antistof-præparat) hvori det arts-specifikke antistof er koblet til en detek- 25 terbar markør og til slut (f) ved bestemmelse af den "detekterbare markør” bundet til det overtrukne analytiske system, evaluering af koncentrationen af analytten i prøven under sammenligning med værdierne i standardkurven.
30
Den ovennævnte fortyndingspuffer er en vandig puffer og fortrinsvis fosfatpufret saltopløsning ved en pH-værdi mellem 7,0 og 7,5. Når prøven er serum, bronkial ekspektorater, pus eller hud, indeholder fortyndingspuf-35 feren fortrinsvis 10-30 rumfangs% og navnlig ca. 20 rumfangsi serum eller et serumproteinpræparat.
7
DK 165075 B
En fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at det nu er muligt let og hurtigt at bestemme et antibiotikum af vancomycinklassen i nærværelse af en anden forbindelse hørende til samme klasse. Mens faktisk al-5 le antibiotika af vancomycinklassen kobles selektivt, omend i forskelligt omfang, til et D-Ala-D-Ala-karboxytermi-nalt peptid, vil kun det til prøvning værende antibiotikum reagere med det specifikke antistof. Ved bestemmelse af en biologisk væske, der fx indeholder to antibiotika af 10 vancomycinklassen (fx vancomycin og teicoplanin) ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, vil begge antibiotika blive selektivt bundet til den analytiske bærer hvortil der er adsorberet til overfladen et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid som er konjugeret med vedkom-15 mende makromolekylære bærer, mens alle de andre stoffer som er til stede i prøven og sædvanligvis vil forstyrre, vil blive vasket bort. Derefter vil det specifikke antistof (fx et antistof rettet mod teicoplanin) kun binde sig til det relevante antibiotikum (fx teicoplanin) bun-20 det til det adsorberede D-alanyl-D-alanin-peptid, men ikke tildet andet tilsvarende bundne antibiotikum (fx vancomycin) .
Det species-specifikke anti-antistof-antiserum koblet med den detekterbare markør, vil, når det først er til-25 sæt, derfor binde sig specifikt til anti-analytten (i dette tilfælde anti-teicoplanin)-antistof der for sit vedkommende er bundet til den "stationære fase" i kraft af bindingen af det specifikke antigen (i dette tilfælde teicoplanin). Den påfølgende evaluering af det "bundne" species 30 specifikke anti-antistof-antiserum ved hjælp af detekteringen af den koblede "markør" er derfor kun korreleret til det specifikke antibiotikum af klassen, som er den valgte genstand for bestemmelsen (i dette tilfælde teicoplanin), selv i nærværelse af andre antibiotika af samme 35 klasse (i dette tilfælde vancomycin).
DK 165075 B
'8
En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden i-følge opfindelsen er en fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, hvor den analytiske bærer på overfladen bære et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid konjugeret 5 med en passende makromolekylær bærer med evne til at ad-sorbere til nævnte overflade, er rummene (wells) i en plast-mikroplade overtrukket med BSA-e-Aca-D-Ala-D-Ala, hvorhos de antistoffer som er rettet mod det til detektering værende stof er kanin-antisera mod et antibiotikum 10 af vancomycinklassen, og det med en detekterbar markør koblet anti-antistof-antiserum er gede-antiserum for kanin-IgG koblet med en peroxidase.
Kanin-antisera mod et forud bestemt antibiotikum af vancomycinklassen ("forud bestemt antibiotikum") vin-15 des ved at man gentagne gange (fx hver tredje uge i tre måneder) i kaniner injicerer et effektivt anti-"forudbestemt antibiotikum"-antistof som bevirker dannelse af et "forudbestemt antibiotikum"-albuminkonjugat frembragt ved kobling af det "forudbestemte antibiotikum" og okse-20 serumalbumin ved hjælp af i og for sig kendte metoder, fx ved at anvende omkring 1-10 vægtdele af det "forudbestemte antibiotikum" per vægtdel okseserumalbumin.
Der udtages blod ugentligt fra dyrene og anti-"forudbestemt antibiotikum"-antistof“titere bestemmes ved en 25 analysemetode, fx en ELISA-metode under anvendelse af en analytisk bærer overtrukket med samme "forudbestemte antibiotikum" og en passende detekterbar sonde (probe), fx gede-antiserum til kanin-IgG koblet med peroxidase. Når der er opnået en analytisk effektiv antistofproduktion ud-30 tages der blod fra dyrene og antiserummet udvindes, hvorefter det eventuelt underkastes yderligere rensning i hovedsagen til fjernelse af anti-okse-serumalbumin immuno-globuliner. Denne rensning kan indebære absorptionskroma-tografering ved en modificeret matrix, fx en matrix frem-35 stillet ved kobling af okseserumalbumin med en agarosegel (fx "Sepharose"^) aktiveret på i og for sig kendt måde.
Med betegnelsen "analytisk bærer" anvendt her menes det samme som foran. Særlig er PVC-mikroplader, reagensglas 9
DK 165075 B
eller plastark med evne til på overfladen at få absorberet analytisk detekterbare mængder af det "forudbestemte antibiotikum" egnede midler til anvendelse ved analysemetoden .
5 Foruden at være nyttig til specifikt, hurtigt og let at detektere og bestemme analytten i opløsninger såsom opløsninger fra gæringssupper eller ekstrakter, er den foreliggende fremgangsmåde også anvendelig til detektering og bestemmelse af biologiske væsker såsom blod og TO fraktioner deraf, urin, legemsekssudater, pus, bronkie ekspektorater og hud.
For at anvende den foreliggende fremgangsmåde på en biologisk væske er det i almindelighed ikke nødvendigt at foretage en særlig forbehandling af prøven, men som regel 15 vil fortyndingen med puffer (og, sjældent, koncentrering af prøven), så den kommer ind i det særlige anvendelsesområde for fremgangsmåden under de valgte betingelser, være tilstrækkelig.
Fortrinsvis opnås kalibreringskurven med et standard-20 præparat af analytten opløst i samme biologiske væske som den til bestemmelse værende prøve.
I tilfælde af bronkieekspektorater, ekssudater, pus og hud er det i almindelighed nødvendigt at homogenisere prøven før analysen på sædvanlig måde. Prøven fortyn-25 det som regel med en puffer, normalt før homogenisering.
Fortrinsvis sættes der til pufferen, der er en vandig puffer med en pH fra 7 til 7,5, serum eller serumproteiner, omkring 10-30% af det samlede rumfang og fortrinsvis ca. 20% af det samlede rumfang af fortyndingspufferen.
30 En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden i- følge opfindelsen består i anvendelse af anti-teicoplanin-antiserum som ikke krydsreagerer med vancomycin, avoparcin, ristocetin, antibiotikum A 35512 B, actaplanin, antibiotikum A 41030, antibiotikum A 47934 og de andre antibiotika 35 af vancomycinklassen.
Det foretrukne anvendelsesområde for den foreliggende fremgangsmåde er 10-1000 ng/ml analyt og det mest .10
DK 165075B
foretrukne område er 10-100 ng/ml. Præcisionen (inter as-say precision; CV) er i almindelighed mellem 10 og 15%.
Nøjagtigheden og præcisionen af fremgangsmåden kan forbedres yderligere ved en god forsøgsudformning som sig-5 ter til at bringe fejlene til et minimum/ ved hjælp af kendte statistiske fordelingsmetoder.
Den "analytiske bærer" å<e egnet til anvendelse i såvel manuelle som automatiserede prøveprocedurer. Denne fleksibilitet er af særlig betydning for 10 at tilfredsstillé den endelige brugers behov. Faktisk kan en automatiseret fremgangsmåde være yderst nyttig i klinisk overvågning af mange patienter under behandling, fx til at føre kontrol med den terapeutiske dosis og for at studere lægemidlets fordeling i de biologiske væsker, mens 15 en manuel fremgangsmåde kan være tilstrækkelig til analyse i laboratoriemålestok.
Den foreliggende opfindelse angår også et analyse-!sæt til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til let, hurtig, pålidelig og nøjagtig bestemmelse af en 20 analyt af vancomycinklassen som har den egenskab at kunne binde sig til en "molekylær receptor" repræsenteret af et D-alanyl-D-alanin-dipeptid eller et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid. Dette analysesæt er ifølge opfindelsen ejendommeligt ved det i krav 6 *s kendetegnende 25 del angivne og kan desuden med fordel være udformet som angivet i krav 7's kendetegnende del.
Som allerede nævnt repræsenteres en foretrukken "analytisk bærer med en overflade som understøttet et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid konjugeret 30 med en passende makromolekylær bærer med evne til at ad-sorbere til nævnte overflade" (den overtrukne analytiske bærer) af'plastrum (plastic wells) i plader til mikroti-treringer, reagensglas eller plastark overtrukket med fra 0,025 mikrogram til 1 mikrogram og fortrinsvis 0,1-0,2 mi-35 krogram BSA-e-Aca-D-Ala-D-Ala.
11
DK 165075 B
Den mængde antistof, der er specifikt fra analyt-ten i det første antistofpræparat, må overstige mængden af den analyt der skal detekteres. Det repræsenteres af et monoklonealt antistof eller af et polyklonealt antistof, 5 fortrinsvis vundet ved immunisering af kaniner med en hø- -4 jere antistoftiter end 10 på tidspunktet for blødningen.
Det er klart koncentrationen af det "andet” antistofpræparat, dvs. det species-specifikke antistofpræparat, står i relation til koncentrationen af det "første" anti-10 stof som skal bindes til analytten på den bærende faste overflade og bør være i ækvimolært forhold eller i passende overskud.
Det vil forstås for de sagkyndige at ikke blot kan der om ønsket være andre komponenter til stede i reagens-15 sættet såsom pufferopløsningerne, detekteringsmidler etc., men eventuelt kan nogle af sættets komponenter foreligge i særskilt form, men til samme anvendelse.
De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.
Eksempel 1 12
DK 165075B
Fremstilling af BSA-e-ACA-D-Ala-D-Ala a) Konjugering af ε-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin (ε-Aca-D-Ala-D-Ala) til okseserumalbumin (BSA) 5 ε-Aca-D-Ala-D-Ala konjugeres til BSA ved en "to trinsmetode" under anvendelse af glutaraldehyd som det bifunktionelle koblingsreagens: 250 mg BSA opløses i 4,5 ml 0,1 M Na-karbonat/bikarbonat-puffer ved pH 9,5. Der tilsættes 0,5 ml 25%s vandig opløsning af glutaraldehyd og man 10 lader blandingen reagere i 1 time ved stuetemperatur. Reaktionsmassen dialyseres derefter natten over mod 0,9%s NaCl.
125 mg ε-Aca-D-Ala-D-Ala opløses i 0,5 ml 0,5 M Na-karbonatpuffer ved pH 9,5, sættes til den dialyserede 15 reaktionsmasse og omrøres i 6 timer ved stuetemperatur.
Derpå tilsættes der 0,5 ml 1M lysin og blandingen holdes på stuetemperatur i 2 timer for at blokere de ikke-reage-rede aktive grupper. Konjugatet dialyseres derefter mod 0,05 M K-fosfat indeholdende 0,15 M NaCl, pH 7,3.
20 b) Gelfiltrering af konjugatet
For at rense konjugatet fra overskydende ikke-rea-geret materiale eller lavmolekylære biprodukter, føres den 25 på den ovenfor beskrevne måde dialyserede blanding gennem en køleskabskølet "Sephacryl"®S-200 kolonne (kovalent tværbundet'alkyldextran og N,Ν'-metylen-bis-akrylamid med kontrolleret porestørrelse; Pharmacia Fine Chemicals) med en størrelse på 0,8 cm x 100 cm hvorved det bringes i kon-30 takt og elueres med PBS pH 10,4 (strømningshastighed 10 ml/time). Elueringen overvåges spektrofotometrisk ved registrering af transmissionen ved 280 nm. Fraktioner svarende til den top der elueres med kolonnens mellemi^Lims-rumfang forenes (samlet rumfang 15 ml), neutraliseres med 35 1 M HC1 og fortyndes fire gange med PBS pH 7,3. Prøver på 0,5 ml af denne blanding fordeles i ampuller, frysetørres og opbevares ved -80°C.
Eksempel 2 13
DK 165075B
Overtrækning af mikroplader med BSA-s-ACA-D-ALA-D-ALA
En stamopløsning til ugentlig fremstilling af mikroplader fremstilles ved opløsning af en ampuls indhold 5 af frysetørret BSA-s-Aca-D-Ala-D-Ala (blev fremstillet som beskrevet i det foregående eksempel) i PBS pH 7,3 (0,5 ml); denne opløsning kan opbevares i uger uden tab af aktivitet og egner sig derfor til anvendelse som stamopløsning til ugentlige anvendelser.
10 Rummene (wells) af mikroplader ("Falcon"^ Micro- test III, Flexible Assay Plate; Becton Dickinson and Co., Oxnard, California 93030) fyldes med 100 mikroliter pr. rum af en 1/200 fortynding af denne stamopløsning, bortset fra at en lodret række rum (hensigtsmæssigt den sidste), 15 der holdes som en prøve. Disse blindprøverum fyldes med 100 mikroliter PBS pH 7,3. Mikropladerne inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur i en tildækket kasse og vaskes derefter fem gange ved tømning og genfyldning med destilleret vand. Der tilsattes 200 mikroliter/rum 3%s BSA i PBS pH 20 7,3 og det henstod til adsorbering i 2 timer ved stuetem peratur for at blokere uovertrukket plastoverflade. Pladerne vaskedes på ny med destilleret vand, rystedes tørre og opbevaredes ved 4°C indtil anvendelsen.
25 Eksempel 3
Fremstilling af anti-teicoplanin-antiserum
Der bruges et teicoplanin-albumin-konjugat (T-BSA) til immunisering af kaniner for at bevirke dannelse af an-2Q ti-teicoplanin-antistoffer.
T-BSA fremstilles ved kobling af 200 mg teicopla-nin til 50 mg BSA under anvendelse af 300 mg l-ætyl-3-(3-metylaminopropyD-karbodiimid-hydroklorid som koblingsmiddel i 5 ml vand ved pH 5,5 ifølge Goodfriend et al. (T.L.
25 Goodfriend, C. Levine og G.D. Fasman, 1964, Science 144, 1344). Det vundne T-BSA dialyseres natten over, frysetørres og suspenderes derefter i en koncentration på 1 mg/ml 14
DK 165075 B
i en fysiologisk opløsning indeholdende 50 rumfangs% af Freunds adjuvant. Fem sunde hvide hun-kaniner af stammen New Zealand får hver subkutant injiceret 1,2 ml af ovennævnte opløsning. Der foretages forstærkningsinjektioner 5 i hver kanin med 0,5 ml af samme antigen-opløsning hver 3. uge i tre måneder. I løbet af denne periode udtages der ugentlig blod fra dyrene og anti-teicoplanin-titere bestemmes ved hjælp af en ELISA-metode med teicoplanin-overtrukne mikroplader under anvendelse af peberrodsper-10 oxidase-mærket gede-antiserum til kanin IgG som den afslørende sonde.
Den ovennævnte ELISA-metode udføres på følgende måde: PVC-mikroplader ("Falcon"® Microtest III Flexible 15 Assay Plate) fyldes med 0,1 ml/rum af en opløsning indeholdende 0,4 g/1 teicoplanin og 58 g/1 NaCl. Mikroplader-ne inkuberes i 3 timer ved 37°C i en tildækket kasse og vaskes derefter tre gange ved tømning og genfyldning med fosfatpufret saltvand pH 7,3 (0,15 M NaCl, 0,05 M natrium-20 fosfat).
En opløsning af BSA (30 g/1) i fosfatpufret saltvand pH 7,3 (0,15 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat) indføres i rummene (0,2 ml/rum) og får lov til at adsorbere i 2 timer ved stuetemperatur for at blokere den uovertrukne plast-25 plade. Pladerne vaskes på ny tre gange med fosfatpufret saltvand pH 7,3 (0,15 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat) hvorefter dertilsættes kånin-antiserum til testopløsning (0,1 ml/ rum) ved forskellige fortyndinger i logaritmisk skala g (fra 1:10 til 1:10 ) og får lov til at reagere med de sen-30 sitiverede rum i 2 timer ved 37°C. Efter grundig vask med fosfatpufret saltvand pH 7,3 (0,15 M NaCl, 0,05 M natriumfosfat) sættes der et gede-antiserum til kanin-IgG, mærket med peberrodsperoxidase, til rummene (0,1 ml/rum) og får lov til at reagere i 1 time ved 37°C. Efter grundig 35 vask med fosfatpufret saltvand pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid) indeholdende 0,01 rumfangs% "Tween'® 20, rystes mikropladerne tørre og til hver mikro-titer-rum sættes der 0,2 ml af den peroxidasesubstrat-kro- 15
DK 165075 B
mogene opløsning (1 mg/ml o-fenylendiamin, 5 mM hydrogen-peroxid i 0,1 M natriumcitratpuffer pH 5) til hvert mikro-titerrum.
Man lader farven blive fremkaldt i 30 minutter ved 5 stuetemperatur og farveudviklingen standses ved tilsætning af 4,5 M svolvsyre i en mængde på 0,05 ml pr. rum.
Efter 15 minutter måles absorptionen ved 492 nm. Antistoftiteren udtrykkes som den fortyndingsfaktor der giver 0,2 optiske tæthedsenheder.
10 Når antistoftiteren er mindst 1:10^ er der opnået analytisk effektiv antistofproduktion, og dyrene tømmes helt for blod og det ønskede antiserum udvindes og opbevares ved -20°C indtil brugen.
15 Eksempel 4
Rensning af antiteicoplanin kanin-antiserum på BSA-agarose
Der fremstilles en modificeret matrix ved kobling af 80 mg okseserumalbumin (BSA) med CNBr-aktiveret "Sepha-2o rose"® (10 ml kvældet harpiks) under anvendelse af 0,1 M natriumkarbonatpuffer pH 8,3 som koblingspuffer. Denne BSA-agarosematrix bruges derefter til at fjerne anti-BSA-immunoglobuliner fra det antiserum,der er vundet i henhold til det foregående eksempel 3 ved portionsvis adsorptions-25 kromatografering ved at 2 ml af nævnte kanin-antiserum bringes i kontakt med den sedimenterede BSA-agarosematrix. Denne blanding får lov til at stå i kontakt i 1 time ved stuetemperatur og udhældes derefter på et glasfilter under vask tre gange med 6 ml fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 2Q M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid) indeholdende 3% v/r (vægt/rumfang, dvs. forhold mellem fast stof og væske som mellem gram og ml) BSA og 0,05 rumfangs% "Tween"® 20. Det udvundne filtrat svarer til en tiganges opløsning af det oprindelige antiserum, hvorfra anti-BSA-antistofferne er 25 blevet fjernet.
16
DK 165075 B
Eksempel 5
Bestemmelse af teicoplaninholdige opløsninger
Der fremstilles en standardkurve ved scalære fortyndinger af teicoplanin til koncentrationer på fra 0,001 5 til 1 mikrogram/ml i fosfatpufret saltvand pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid) indeholdende 3% v/r BSA og 0,05 rumfangs% "Tween"® 20 (0,1 ml). Af disse opløsninger såvel som af de prøver der er blevet fortyndet ti gange i serumpufferen sættes der særskilt in triplo til 10 rummene i BSA-s-Aca-D-Ala-D-Ala-overtrukne fleksible plader tilberedt i overensstemmelse med den i foran stående eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde. Opløsningen med den højeste koncentration sættes også til "blindrummene" (dvs. de rum som ikke er overtrukket med den specifikke D-Ala-15 D-Ala-binder) for at bedømme den uspecifikke binding. Hver af mikropladerne inkuberes derefter i 2 timer ved stuetemperatur i en fugtig, dækket kasse og vaskes otte gange ved tømning og genfyldning med fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid inde-20 holdende 0,05 rumfangs% "Tween'® 20) og rystes tør.
Renset kanin-antiserum mod teicoplanin, tilberedt i overensstemmelse med foran stående eksempler 3 og 4, fortyndes derefter 50 gange med fosfatpufret saltopløsning (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid, pH 7,3, inde-25 holdende 3% v/r BSA og 0,05% rumfangs% "Tween1® 20); 100 mikroliter af denne opløsning sættes til hver rum og får lov til at reagere i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask otte gange med fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid indeholdende 0,05 rum-30 fangs% "Tween20) og rystning til tørhed som beskrevet ovenfor, sættes der til hvert rum 100 mikroliter af en 1 til 500 ganges fortynding i fosfatpufret saltopløsning af peberrodsperoxidase-konjugeret gede-antiserum til kanin-IgG (Bionetics Inc.), og det hele henstår i 1 time ved 35 stuetemperatur. Derefter vaskes hvert rum på ny med fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid indeholdnde 0,05 rumfangs% "Tween® 20),
DK 165075B
17 og der rystes til tørhed som beskrevet ovenfor hvorpå der til hvert rum sættes 200 mikroliter/rum af en opløsning af peroxidase-kromogent substrat (1 mg/ml o-fenylen-diamin, 5 mM hydrogenperoxid i 0,1 M natriumcitratpuffer, 5 pH 5), og man lader farven blive fremkaldt i 30 minutter ved stuetemperatur. Farveudviklingsreaktionen standses derefter ved tilsætning af 4,5 M svovlsyre i en mængde på 50 mikroliter/rum og efter 15 minutter måles absorptionen ved-492 nm i et "Titertek'® Multiscan-fotometer (Flow Lab. Inc.). 10 Der opnås bindingskurver ved at man stiller værdierne for absorptionen op som en funktion af koncentrationen af tei-coplanin på et semi-log papir. Der opnås en dosis-respons-kurve med teicoplanin i området fra 0,01 mikrogram/ml til 1 mikrogram/ml, og koncentrationen i prøven bestemmes ved 15 interpolation på standardkurven.
Den gentagne bestemmelse af opløsninger indeholdende kendte mængder teicoplanin på den ovenfor beskrevne måde viser at denne metode tilfredsstiller de analytiske fordringer med hensyn til følsomhed, præcision og nøjagtighed.
20 Der blev ikke iagttaget nogen binding ved gentagel se af den foran beskrevne metode under anvendelse af opløsninger af avoparcin, ristocetin, actaplanin, antibiotikum A 35512 B, antibiotikum A 41030, antibiotikum A 47934 og vancomycin.
25
Eksempel 6
Bestemmelse af teicoplanin indeholdende serumprøver
Der fremstilles en standardkurve med scalære for-30 tyndinger af teicoplanin i koncentrationer på fra 0,001 til 1 mikrogram/ml i fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid) indeholdende 3% v/r BSA, 0,05 rumfangs% "Tween,,w 20 og 20% menneskeserum.
35 Prøverne fortyndes 5 gange i serumpufferen og 0,1 ml af disse opløsninger sættes in triplo til rummene i BSA-ε-ACA-D-Ala-D-Ala-overtrukne fleksible plader fremstillet i overensstemmelse med den i foranstående eksempel 2 be- 18
DK 165075 B
skrevne fremgangsmåde. Opløsningen med den højeste koncentration sættes også til "blindrummene" (dvs. de rum som ikke er overtrukket med den specifikke binder D-Ala-D-Ala) for at bedømme den uspecifikke binding. Hver af mikropla-5 derne indkuberes derefter i 2 timer ved stuetemperatur i en fugtig dækket kasse og vaskes otte gange ved tømning og genfyldning med fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M
natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid indeholdende 0,05 rum- <S) fangs% "Tween 20) og rystes tør.
10 Renset kanin-antiserum mod teicoplanin, fremstil let i overensstemmelse med foranstående eksempler 3 og 4, fortyndes derefter 50 gange med fosfatpufret saltopløsning (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid, pH 7,3, indeholdende 3% v/r BSA, 0,05 rumfangs% "Tween20 og 20% 15 menneskeserum).
100 Mikroliter af denne opløsning sættes til hvert rum og får lov til at reagere i 1 time ved stuetemperatur.
Efter vask otte gange med fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid indeholdende Æ) 20 0,05 rurafangs% "Tween20) og rystning til tørhed som be skrevet foran, sættes der til hvert rum 100 mikroliter af en 1 til 500 ganges fortynding, i fosfatpufret saltopløsning indeholdende 20% menneskeserum, af peberrodsperoxida-se-konjugeret gede-antiserum mod kanin-IgG (Bionetics Inc.), 25 og det hele henstår i 1 time ved stuetemperatur. Derpå vaskes hvert af rummene på ny med fosfatpufret saltopløsning pH 7,3 (0,05 M natriumfosfat, 0,15 M natriumklorid in-deholdende 0,05 rumfangs% "Tween,My 20) og rystes tør som beskrevet ovenfor, og til hvert rum sættes der 200 mikro-30 liter/rum af en opløsning af peroxidase-kromogent substrat (1 mg/ml o-fenylendiamin, 5 mM hydrogenperoxid i 0,1 M na-triumcitratpuffer, pH 5), og man lader farven fremkalde i 30 minutter ved stuetemperatur. Farveudviklingsreaktionen standses derefter ved tilsætning af 4,5 M svovlsyre i en 35 mængde på 50 mikroliter/rum og efter 15 minutter måles absorptionen ved 492 nm i et "Titertek"® Multiscan-fotome-ter. Der opnås bindingskurver ved at man opstiller værdierne for absorptionen som en funktion af koncentrationen 19
DK 165075 B
af teicoplanin på et semi-log papir. Der opnås en dosis-respons-kurve med teicoplanin i området 0,01 mikrogram/ ml til 1 mikrogram/ml, og koncentrationen i prøven bestemmes ved interpolation på standardkuven.
5 Den gentagne bestemmelse af opløsninger indeholden de kendte mængder teicoplanin på den ovenfor beskrevne måde viser at denne metode tilfredsstiller de analytiske fordringer med hensyn til følsomhed, præcision og nøjagtighed.
10 I det ovenfor eksemplificerede tilfælde opnås der følgende resultater, der også gælder alment for enhver anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen:
Anvendelsesområde (på basis af gentagne forsøg): 15 fra 10 ng/ml foretrukket anvendelsesområde fra 10 ng/ml til 1 mg/1 teicoplanin.
Præcision: 20 - inden for den enkelte bestemmelse: CV% lig med 10,5 - mellem prøverne: CV% lig med 13,2.
Der . iagttoges ingen binding ved gentagelse af den ovenfor beskrevne metode og anvendelse af opløsninger af 25 avoparcin, ristocetin, actaplanin, antibiotikum A 35512 B, antibiotikum A 41030, antibiotikum A 47934 og vancomycin.
Under anvendelse af i det væsentlige samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 6 på pus, bronkial ekspekto-30 rater og forbrændte hudprøver fra patienter behandlet med teicoplanin, er koncentrationen af dette antibiotiske stof bestemt efter homogenisering af prøven i den 20%s serumpuf ret opløsning som er beskrevet i ovenstående eksempel. Metoden opretholdte også på disse prøver samme niveau med 35 hensyn til følsomhed, nøjagtighed og præcision som er rapporteret ovenfor.
Claims (8)
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en analyt som 10 er et antibiotikum af vancomycinklassen og binder sig til en molekylær receptor repræsenteret af et D-alanyl-D-alanin-dipeptid eller et D-alanyl-D-alanin-karboxy-terminalt oligopeptid, kendetegnet ved at man 15 bringer en testopløsning i kontakt med en overflade som understøtter et D-alanyl-D-alanin-karboxtermi-nalt oligopeptid, fortrinsvis ε-aminokaproyl-D-ala-nyl-D-alanin, konjugeret med en passende makromole-kylær bærer, fortrinsvis et protein, især et albu-20 min, med evne til at adsorbere til nævnte overflade, efter skylning tilsætter, antistoffer som er specifikt rettet mod det stof som skal detekteres, og afslører disse antistoffer bundet til antigenet på den stationære fase ved hjælp af et antispeci-25 fikt anti-igG-antistof rettet mod disse bundne antistoffer (anti-antistof-antiserum) koblet til en detekterbar markør.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at analytten er udvalgt blandt vancomycin, teicoplanin, 30 actaplanin, ristocetin, avoparcin, actinoidin, antibiotikum LIr-AM-374, antibiotikum A 477, antibiotikum OA 7653, antibiotikum A 35512 B, antibiotikum A 515668, antibiotikum AAD 216, antibiotikum A 41030, antibiotikum A 47934 eller en individuel faktor, et derivat eller en aglycon deraf, for-35 trinsvis teicoplanin eller en individuel faktor, et derivat eller en aglycon deraf. DK 165075 B
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at bæresubstratet er rum i mikrotiterplader eller reagensglas eller plastark, fortrinsvis rum i polyætylen- eller polystyren-mikrotiterplader. 5
4 .Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at det specifikke antistof er et kanin-antistof og at det arts-specifikke-anti-antistof-antiserum er et gede-antiserum mod kanin-IgG.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved at det specifikke antistof er et monoklonealt antistof som ikke svækker bindingen af analytten til den adsorbere-de molekylære receptor.
6. Analysesæt til anvendelse ved den i krav 1 angivne fremgangsmåde, kendetegnet ved at det indehol- 15 der a) en analytisk bærer hvor en overflade understøtter et D-alanyl-D-alanin-karboxyterminalt oligopeptid, fortrinsvis ε-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin, kon- 20 -jugeret med en makromolekylær bærer, fortrinsvis et protein og navnlig albumin, med evne til at adsor-bere på nævnte overflade, og b) et antistofpræparat indeholdende antistoffer specifikt rettet mod den analyt som er det stof der skal 25 detekteres, og eventuelt
7. Analysesæt ifølge krav 6, kendetegnet ved at det tillige indeholder c) et arts-specifikt anti-antistof-præparat indeholdende antistoffer specifikt rettet mod immunoglobu- 30 liner hos den dyreart hvorfra de "første" antistof fer rettet mod analyttens stammer og som er koblet med en detekterbar markør.
8. Analysesæt ifølge krav 6, kendetegnet ved at den analytiske bærer er rummene i mikrotiterplader, 35 reagensglas, eller plastark, fortrinsvis rummene i polyætylen- eller polystyren-mikrotiterplader.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8522388 | 1985-09-10 | ||
| GB858522388A GB8522388D0 (en) | 1985-09-10 | 1985-09-10 | Receptor-antibody sandwich assay |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK429386D0 DK429386D0 (da) | 1986-09-09 |
| DK429386A DK429386A (da) | 1987-03-11 |
| DK165075B true DK165075B (da) | 1992-10-05 |
| DK165075C DK165075C (da) | 1993-02-22 |
Family
ID=10584952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK429386A DK165075C (da) | 1985-09-10 | 1986-09-09 | Fremgangsmaade til bestemmelse af en analyt som er et antibiotikum af vancomycinklassen og som binder sig til en molekylaer receptor repraesenteret af et d-alanyl-d-alanin-dipeptid eller et d-alanyl-d-alanin-karboxyterminalt oligopeptid, samt analysesaet til anvendelse ved fremgangsmaaden |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0221282B1 (da) |
| JP (1) | JPS6271860A (da) |
| KR (1) | KR870003386A (da) |
| CN (1) | CN86105930A (da) |
| AT (1) | ATE64997T1 (da) |
| AU (1) | AU600446B2 (da) |
| CA (1) | CA1276880C (da) |
| DE (1) | DE3680072D1 (da) |
| DK (1) | DK165075C (da) |
| ES (1) | ES2001636A6 (da) |
| FI (1) | FI82987C (da) |
| GB (1) | GB8522388D0 (da) |
| GR (1) | GR862271B (da) |
| HU (1) | HU201608B (da) |
| IL (1) | IL79924A0 (da) |
| NO (1) | NO167421C (da) |
| NZ (1) | NZ217502A (da) |
| PH (1) | PH26235A (da) |
| PT (1) | PT83299B (da) |
| ZA (1) | ZA866643B (da) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5198340A (en) * | 1991-01-17 | 1993-03-30 | Genentech, Inc. | Assay for free igf-i, igf-ii, and gh levels in body fluids |
| JP3879866B2 (ja) * | 1995-04-04 | 2007-02-14 | アボット・ラボラトリーズ | 生物体液中のバンコマイシンの検出および定量化用試薬および方法 |
| US6797479B2 (en) | 1995-04-04 | 2004-09-28 | Abbott Laboratories | Reagents and methods for the detection and quantification of vancomycin in biological fluids |
| KR100505783B1 (ko) * | 2001-12-27 | 2005-08-03 | 근화제약주식회사 | 항생제 테이코플라닌의 면역분석 방법 |
| EP1806150A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-11 | NEED PHARMA S.r.l. | Teicoplanin composition |
| US10627393B2 (en) | 2012-07-31 | 2020-04-21 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Latex agglutination inhibition immunoassay |
| WO2020171158A1 (ja) * | 2019-02-20 | 2020-08-27 | 株式会社パートナーファーム | 固相反応チップ及びこれを用いた測定方法 |
| CN116396401B (zh) * | 2023-03-07 | 2025-09-26 | 浙江准策生物技术有限公司 | 替考拉宁完全抗原和抗体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4034074A (en) * | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
| US4410634A (en) * | 1979-10-26 | 1983-10-18 | Dynasciences Corporation | Method of passively adsorbing immuno-reactive haptens to solid phases |
| US4606855A (en) * | 1982-07-26 | 1986-08-19 | Mex Research Associates C/O Leon Reimer | Monoclonal antibody to digoxin |
| US4558009A (en) * | 1982-12-20 | 1985-12-10 | Eli Lilly And Company | Process for producing antibiotic A-51568 by fermentation and microorganism |
| GB8311136D0 (en) * | 1983-04-25 | 1983-06-02 | Lepetit Spa | Immobilised oligopeptides |
| GB8427436D0 (en) * | 1984-10-30 | 1984-12-05 | Lepetit Spa | Receptor assay |
-
1985
- 1985-09-10 GB GB858522388A patent/GB8522388D0/en active Pending
-
1986
- 1986-09-01 NO NO863493A patent/NO167421C/no unknown
- 1986-09-02 IL IL79924A patent/IL79924A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-09-02 ZA ZA866643A patent/ZA866643B/xx unknown
- 1986-09-02 ES ES8601560A patent/ES2001636A6/es not_active Expired
- 1986-09-03 DE DE8686112170T patent/DE3680072D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-03 EP EP86112170A patent/EP0221282B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-03 PT PT83299A patent/PT83299B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-09-03 CN CN198686105930A patent/CN86105930A/zh active Pending
- 1986-09-03 PH PH34214A patent/PH26235A/en unknown
- 1986-09-03 AT AT86112170T patent/ATE64997T1/de active
- 1986-09-03 AU AU62321/86A patent/AU600446B2/en not_active Ceased
- 1986-09-04 GR GR862271A patent/GR862271B/el unknown
- 1986-09-05 CA CA000517532A patent/CA1276880C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-09-08 JP JP61209760A patent/JPS6271860A/ja active Pending
- 1986-09-09 HU HU863894A patent/HU201608B/hu unknown
- 1986-09-09 KR KR1019860007523A patent/KR870003386A/ko not_active Ceased
- 1986-09-09 DK DK429386A patent/DK165075C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-09-09 NZ NZ217502A patent/NZ217502A/xx unknown
- 1986-09-10 FI FI863637A patent/FI82987C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI82987B (fi) | 1991-01-31 |
| NO167421B (no) | 1991-07-22 |
| EP0221282A3 (en) | 1987-08-05 |
| ATE64997T1 (de) | 1991-07-15 |
| HUT41904A (en) | 1987-05-28 |
| CA1276880C (en) | 1990-11-27 |
| ES2001636A6 (es) | 1988-06-01 |
| IL79924A0 (en) | 1986-12-31 |
| NO863493D0 (no) | 1986-09-01 |
| NO167421C (no) | 1991-10-30 |
| DK165075C (da) | 1993-02-22 |
| CN86105930A (zh) | 1987-03-11 |
| NZ217502A (en) | 1989-08-29 |
| DK429386A (da) | 1987-03-11 |
| HU201608B (en) | 1990-11-28 |
| PT83299B (pt) | 1988-07-29 |
| EP0221282A2 (en) | 1987-05-13 |
| PH26235A (en) | 1992-04-01 |
| AU600446B2 (en) | 1990-08-16 |
| GB8522388D0 (en) | 1985-10-16 |
| FI863637A0 (fi) | 1986-09-10 |
| DE3680072D1 (de) | 1991-08-08 |
| DK429386D0 (da) | 1986-09-09 |
| ZA866643B (en) | 1987-04-29 |
| AU6232186A (en) | 1987-03-12 |
| GR862271B (en) | 1986-12-31 |
| PT83299A (pt) | 1986-10-01 |
| FI863637L (fi) | 1987-03-11 |
| KR870003386A (ko) | 1987-04-17 |
| JPS6271860A (ja) | 1987-04-02 |
| NO863493L (no) | 1987-03-11 |
| EP0221282B1 (en) | 1991-07-03 |
| FI82987C (fi) | 1991-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4410660A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
| US4239743A (en) | Carrier-bound immunoglobulin fission product and its use in immunologic analyses | |
| US4575484A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
| US20070184504A1 (en) | Assay for anti-INGAP antibodies | |
| US4489158A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
| EP0221282B1 (en) | Receptor-antibody sandwich assay | |
| WO1996030494A1 (en) | Method of purification of clostridium difficile toxin a and production of mono-specific antibodies | |
| EP0514509B1 (en) | Composition and its preparation process using antigen conjugated to enzymatic activity for immunological diagnosis and chagas' disease immunological diagnosis kits, for individual and epidemiological application, based on that composition | |
| US5525476A (en) | Immunoassay, monoclonal antibody, and hybridoma | |
| US7179611B2 (en) | Mono-specific polyclonal antibodies and methods for detecting Clostridium difficile Toxin A | |
| US5958785A (en) | Detection of a carbohydrate biomarker directly associated with chronic alcoholism | |
| JPWO1993003365A1 (ja) | 下痢性貝毒に特異的なモノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び下痢性貝毒の検出方法 | |
| WO1991019982A1 (en) | Determination of polypeptides and proteins in solutions and biological fluids | |
| EP0184615B1 (en) | Solid phase receptor assay for antibiotics of the vancomycin class | |
| FI104219B (fi) | Diagnostinen menetelmä ja testaustarvikesarja multippeliskleroosin määrittämiseksi | |
| AU2007244153B2 (en) | Prostasin partial peptide and anti-prostasin antibody | |
| JPH0688824A (ja) | 黄色ブドウ球菌感染の検査方法 | |
| LAURITZEN et al. | Dot immunobinding (DIB), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and radioimmunoassay (RIA) for detecting peptide antigens and specific antibodies | |
| CN119246855A (zh) | 一种检测尿液中梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其制备方法 | |
| MILIUKIENĖ et al. | Dot-immunoperoxidase assay for the demonstration of soluble Fcg receptors | |
| JPH032564A (ja) | 生物学的活性タンパク質の新規定量方法 | |
| JPH05296999A (ja) | グルココルチコイドの効果判定マーカーとしてのヒトリポコルチンｉ及びその定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |