JPH032564A - 生物学的活性タンパク質の新規定量方法 - Google Patents
生物学的活性タンパク質の新規定量方法Info
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- JPH032564A JPH032564A JP21201989A JP21201989A JPH032564A JP H032564 A JPH032564 A JP H032564A JP 21201989 A JP21201989 A JP 21201989A JP 21201989 A JP21201989 A JP 21201989A JP H032564 A JPH032564 A JP H032564A
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物学的流体または実験試ｖｌ中の生物学的活
性タンパク質およびポリペプチドの生物活性を定量する
ための新規な免疫バイオアッゼイに関する。
性タンパク質およびポリペプチドの生物活性を定量する
ための新規な免疫バイオアッゼイに関する。
天然源または組換えＤＮＡ技術の応用から多くの生物学
的活性タンパク質およびポリペプチドが利用できるよう
になり、人間および動物の医療においで新しい治療手段
が導かれている。このようなタンパク質およびポリペプ
チドを適当に臨床的に評価するには、内在レベルおよび
これらを投与した後に得られるレベルを精確に定ｍ−す
ることが要求される。このようなタンパク質およびポリ
ペプチドの単離工程中にはまた、種々の精製段階および
最終生成物における生物活性を定量するための信頼でき
る方法が必要である。
的活性タンパク質およびポリペプチドが利用できるよう
になり、人間および動物の医療においで新しい治療手段
が導かれている。このようなタンパク質およびポリペプ
チドを適当に臨床的に評価するには、内在レベルおよび
これらを投与した後に得られるレベルを精確に定ｍ−す
ることが要求される。このようなタンパク質およびポリ
ペプチドの単離工程中にはまた、種々の精製段階および
最終生成物における生物活性を定量するための信頼でき
る方法が必要である。
多くの場合に、人間または動物の対象から採取された生
物学的流体中の生物学的活性のタンパク質およびポリペ
プチドのレベルはバイオアッセイ（生物学的検定法）に
よって評価される。たとえば、Ｇｉ ｌ ｌ ｉｓ等は
−［−細胞増殖因子（Ｉ Ｌ−２）に対するバイオアッ
セイを開発した［ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
物学的流体中の生物学的活性のタンパク質およびポリペ
プチドのレベルはバイオアッセイ（生物学的検定法）に
よって評価される。たとえば、Ｇｉ ｌ ｌ ｉｓ等は
−［−細胞増殖因子（Ｉ Ｌ−２）に対するバイオアッ
セイを開発した［ Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
１２０：２０２７ （１９７８）］。この方法はマウス
細胞障害リンパ球ライン（Ｃ−ＩＬＬ）にお【プる、１
＋−２による増殖刺激に対する応答としての、３１」−
チミジンのＤＮＡ中への取り込みを定量する方法である
。さらに最近、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ等はこのＧｉ ｌ
ｌ ｉｓ等の検定法の比色による変法を開示したく米
国特許出願５ｃｒｉａｌ Ｎｏ０６／６７６、４５３
）。この方法はＣＴ Ｌ Ｌ細胞による乳酸の生成を増
殖刺激の指標として評価する方法である。
細胞障害リンパ球ライン（Ｃ−ＩＬＬ）にお【プる、１
＋−２による増殖刺激に対する応答としての、３１」−
チミジンのＤＮＡ中への取り込みを定量する方法である
。さらに最近、Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ等はこのＧｉ ｌ
ｌ ｉｓ等の検定法の比色による変法を開示したく米
国特許出願５ｃｒｉａｌ Ｎｏ０６／６７６、４５３
）。この方法はＣＴ Ｌ Ｌ細胞による乳酸の生成を増
殖刺激の指標として評価する方法である。
不幸なことに、血清およびその伯の生物学的流体は、し
ばしば、バイオアッセイに有害に作用することができ、
測定値を低く過ぎるか、あるいは高過ぎるものにする物
質を含有する。このような物質には、たとえば真正値を
低小させる阻害物質がある。これとは逆に、検定細胞に
おいて、対象のタンパク質またはポリペプチドを適磨に
反映することができるよりも大ぎい応答を生じさせる類
似の生物学的活性を有Ｊる、他の因子がまた存在する可
能性がある。
ばしば、バイオアッセイに有害に作用することができ、
測定値を低く過ぎるか、あるいは高過ぎるものにする物
質を含有する。このような物質には、たとえば真正値を
低小させる阻害物質がある。これとは逆に、検定細胞に
おいて、対象のタンパク質またはポリペプチドを適磨に
反映することができるよりも大ぎい応答を生じさせる類
似の生物学的活性を有Ｊる、他の因子がまた存在する可
能性がある。
実験試料でさえも、精確なバイオアッセイ測定を妨害で
きる物質を含有することができる。たとえば、０ｒｏｓ
ｚ等により細胞培養においてリンフ才力イン産生を誘発
さゼるために使用されるホルボールミリステートアセテ
ート（ＰＭＡ）＋１５よびその他の助剤がＩＬ−１、Ｉ
Ｌ −２およびＩｔ−−３のようなリンフ才力インの
定量に使用される種々のバイオアッセイを干渉覆ること
ができることが報告された［Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ１１３
０ ： １７６４ （１９８３）］。
きる物質を含有することができる。たとえば、０ｒｏｓ
ｚ等により細胞培養においてリンフ才力イン産生を誘発
さゼるために使用されるホルボールミリステートアセテ
ート（ＰＭＡ）＋１５よびその他の助剤がＩＬ−１、Ｉ
Ｌ −２およびＩｔ−−３のようなリンフ才力インの
定量に使用される種々のバイオアッセイを干渉覆ること
ができることが報告された［Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ１１３
０ ： １７６４ （１９８３）］。
これらの試料物質に対する干渉作用を回避Ｊる研究にお
いて、かなりの研究者はバイオアッセイから免疫検定法
に戻った。たとえば、Ｇｅｈｍａｎ等は人間１ｍ−２定
量用の酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＩ ｌ５Ａ）を
開発した［Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｈｅｔｈ７４、
： ３９ （１９８４，） ］。Ｐ Ｍ Ａおよびライ
１〜ヘマグルチニンのような、人間の血清およびマイト
ジェン中の物質はこの検定によってなされた測定値を干
渉しないものと言われている。同様に、Ｂｕｄｄ等はＩ
Ｌ −２に対するラジオイムノアッセイ（放射線免疫
検定法）およびモノクローナル抗体にｂとず＜ Ｅ ｌ
−Ｉ ＳＡを開発した。
いて、かなりの研究者はバイオアッセイから免疫検定法
に戻った。たとえば、Ｇｅｈｍａｎ等は人間１ｍ−２定
量用の酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＩ ｌ５Ａ）を
開発した［Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｈｅｔｈ７４、
： ３９ （１９８４，） ］。Ｐ Ｍ Ａおよびライ
１〜ヘマグルチニンのような、人間の血清およびマイト
ジェン中の物質はこの検定によってなされた測定値を干
渉しないものと言われている。同様に、Ｂｕｄｄ等はＩ
Ｌ −２に対するラジオイムノアッセイ（放射線免疫
検定法）およびモノクローナル抗体にｂとず＜ Ｅ ｌ
−Ｉ ＳＡを開発した。
しかしながら、免疫検定法が伴なう問題に、これらが真
正な生体活性を常に反映しないといつ問題がある。抗体
はこれらが対応するエピトープに対して簡単に結合し、
これはこれらのエピトープが全体的に変性された不活性
のタンパク質またはポリペプチド中に、あるいは活性分
子の小さい分解断片中に含有されている場合でも簡単に
結合する。
正な生体活性を常に反映しないといつ問題がある。抗体
はこれらが対応するエピトープに対して簡単に結合し、
これはこれらのエピトープが全体的に変性された不活性
のタンパク質またはポリペプチド中に、あるいは活性分
子の小さい分解断片中に含有されている場合でも簡単に
結合する。
本発明は高庶に特異性で、また感受性が高く、また生物
学的流体および実験試料中の干渉物質によって生じる問
題が回避される、生物学的活性のポリペプチドおよびタ
ンパク質（以下の記載において、総称して１−タンパク
質」と記Ｊる）の検定方法を提供する。
学的流体および実験試料中の干渉物質によって生じる問
題が回避される、生物学的活性のポリペプチドおよびタ
ンパク質（以下の記載において、総称して１−タンパク
質」と記Ｊる）の検定方法を提供する。
さらに特に、本発明は試料中の生物学的活性タンパク質
の量の定量方法を提供し、この方法は：（２） 生物学
的活性タンパク質を含有する疑いのある生物学的流体ま
たは実験試料を、当該タンパク質に対して特異性の、不
動化した抗体と、該抗体が該タンパク質の活性を害さな
い部位で該タンパク質に特異的に結合Ｊる条件の下に接
触させ、抗体−タンパク質複合体を生成させ、 （ｂ） この抗体−タンパク質複合体と溶液で洗浄し、
試料中に存在づ−る干渉物質を除去し、（ｃ）洗浄した
抗体−タンパク質複合体を当該生物学的活性タンパク質
に対して応答可能な細胞と接触させ、測定可能な応答を
生じさせ、次いで（ｄ） 生じた応答を測定する、 ことからなり、このようにして、生物学的活性タンパク
質の石を定量する方法である。
の量の定量方法を提供し、この方法は：（２） 生物学
的活性タンパク質を含有する疑いのある生物学的流体ま
たは実験試料を、当該タンパク質に対して特異性の、不
動化した抗体と、該抗体が該タンパク質の活性を害さな
い部位で該タンパク質に特異的に結合Ｊる条件の下に接
触させ、抗体−タンパク質複合体を生成させ、 （ｂ） この抗体−タンパク質複合体と溶液で洗浄し、
試料中に存在づ−る干渉物質を除去し、（ｃ）洗浄した
抗体−タンパク質複合体を当該生物学的活性タンパク質
に対して応答可能な細胞と接触させ、測定可能な応答を
生じさせ、次いで（ｄ） 生じた応答を測定する、 ことからなり、このようにして、生物学的活性タンパク
質の石を定量する方法である。
本発明の方法は広く種々の生物学的流体および実験試料
中の生物学的活性のタンパク質の検出および定量に使用
することができる。検定することができる生物学的流体
は、たとえば、血液、血清、白血球、精液、乳、唾液、
およびその他の分泌流体を包含する。検定できる実験試
料は、たとえば、種々の第一次体外培養の培養物および
第二次培養物からのならし培地、あるいは烏、マウス、
人間またはその他の動物起源の確立されたセルラインお
よびこのような培地からの、あるいは上記生物学的流体
の−・種からの精製−Ｆ程フラクシ］ンを包含する。
中の生物学的活性のタンパク質の検出および定量に使用
することができる。検定することができる生物学的流体
は、たとえば、血液、血清、白血球、精液、乳、唾液、
およびその他の分泌流体を包含する。検定できる実験試
料は、たとえば、種々の第一次体外培養の培養物および
第二次培養物からのならし培地、あるいは烏、マウス、
人間またはその他の動物起源の確立されたセルラインお
よびこのような培地からの、あるいは上記生物学的流体
の−・種からの精製−Ｆ程フラクシ］ンを包含する。
本発明の方法は基本的に２工程プロセスを包含する。第
一に、生物学的流体または実験試料からの一定量中の生
物学的活性タンパク質を抗体によって「捕獲」し、次い
でタンパク質の活性を増大または阻害することができる
異質の物質を洗浄により除去する。本明細書で使用する
ものとして、１−一定量」の用飴は、試料の、典型的に
は約２５〜約１００μＡ容量の代表的小量を意味するも
のとする。次いで、抗体に依然として結合しているタン
パク質を、このタンパク質に対して応答可能な細胞と接
触させる。
一に、生物学的流体または実験試料からの一定量中の生
物学的活性タンパク質を抗体によって「捕獲」し、次い
でタンパク質の活性を増大または阻害することができる
異質の物質を洗浄により除去する。本明細書で使用する
ものとして、１−一定量」の用飴は、試料の、典型的に
は約２５〜約１００μＡ容量の代表的小量を意味するも
のとする。次いで、抗体に依然として結合しているタン
パク質を、このタンパク質に対して応答可能な細胞と接
触させる。
適当な抗体は、対象のタンパク質に結合することができ
るポリクローナルおよびモノクローナルの抗体を包含す
る。生物学的活性タンパク質に対する抗体を生成するた
めには、タンパク質を先ず、生物学的流体、組織、細胞
培養ならし培地または組換え発現系のような慣用の原料
から、標準的方法を使用して単離し、次いで好ましくは
、これらに制限されないが、ゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィ、分取ディスク−ゲルまたはカーテン電気
泳動、等電点電気泳動、低温有機溶剤分留、塩沈殿（硫
酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどを使用する）
、あるいは向流分配を包含する慣用のタンパク質精製技
法を使用して精製する。
るポリクローナルおよびモノクローナルの抗体を包含す
る。生物学的活性タンパク質に対する抗体を生成するた
めには、タンパク質を先ず、生物学的流体、組織、細胞
培養ならし培地または組換え発現系のような慣用の原料
から、標準的方法を使用して単離し、次いで好ましくは
、これらに制限されないが、ゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィ、分取ディスク−ゲルまたはカーテン電気
泳動、等電点電気泳動、低温有機溶剤分留、塩沈殿（硫
酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムなどを使用する）
、あるいは向流分配を包含する慣用のタンパク質精製技
法を使用して精製する。
精製後に、タンパク質は、このタンパク質の有効量を注
入することによって、吐乳動物または鳥で、抗体の産生
を引き出すために、ワクチンとして直接に使用すること
ができる。タンパク質の必要とされる適量は慣用の実験
によって、当業者が容易に決定することができることが
知られている。
入することによって、吐乳動物または鳥で、抗体の産生
を引き出すために、ワクチンとして直接に使用すること
ができる。タンパク質の必要とされる適量は慣用の実験
によって、当業者が容易に決定することができることが
知られている。
別法として、そして好ましくは、タンパク質を先ず、変
性さｕ１免疫原性を増大させる。
性さｕ１免疫原性を増大させる。
免疫性の増大は２種の方法のうちの一つによって生じさ
せることができる。第一の方法では、アジュバントまた
は免疫強化剤をワクチンに加えることができる。第二の
方法では、タンパク質を、キャリヤ分子に共有結合させ
、あるいは交叉結合複合体どして、大ぎくした形態で、
免疫イ」与しよつとする動物に与えることができる。
せることができる。第一の方法では、アジュバントまた
は免疫強化剤をワクチンに加えることができる。第二の
方法では、タンパク質を、キャリヤ分子に共有結合させ
、あるいは交叉結合複合体どして、大ぎくした形態で、
免疫イ」与しよつとする動物に与えることができる。
動物の免疫接種に適当なアジュバントは、これらに制限
されないが、フロイントの完全または不完全アジュバン
［−（これは人間または肝臓保存物には適さなイ） 、
Ａｄｊｕｖａｎｔ６５ （これは落花性油、マンニドモ
ノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含
有する）、ミネラルゲル、ＩＣとえば水酸化アルミニウ
ム、リン酸アルミニウムおよびアルム、界面活性剤、た
とえば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リ
ソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロ
マイド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’ 、Ｎ’ −ビ
ス（２ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシ
ヘキサデシルグリセロールおにびプルロニックポリオー
ル、ポリアニオン類、たとえばピラン、デキストリンス
ルフェート、ポリ■Ｃ１ポリアクリル酸およびカルボボ
ール、ペプチド類、たとえばムラミルジペプチド、ジメ
チルグリシンおよびタフトシン、ならびにオイルエマル
ジョンを包含する。タンパク質はまた、投与して、その
後でリポソームまたはその伯の巨大キャリヤに組入れる
こともできる。リポソームまたはその他の巨大キャリヤ
に組入れられると、延長された期間にわたって持続する
ことができるワクチンの放出手段が提供される。
されないが、フロイントの完全または不完全アジュバン
［−（これは人間または肝臓保存物には適さなイ） 、
Ａｄｊｕｖａｎｔ６５ （これは落花性油、マンニドモ
ノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含
有する）、ミネラルゲル、ＩＣとえば水酸化アルミニウ
ム、リン酸アルミニウムおよびアルム、界面活性剤、た
とえば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リ
ソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロ
マイド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’ 、Ｎ’ −ビ
ス（２ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシ
ヘキサデシルグリセロールおにびプルロニックポリオー
ル、ポリアニオン類、たとえばピラン、デキストリンス
ルフェート、ポリ■Ｃ１ポリアクリル酸およびカルボボ
ール、ペプチド類、たとえばムラミルジペプチド、ジメ
チルグリシンおよびタフトシン、ならびにオイルエマル
ジョンを包含する。タンパク質はまた、投与して、その
後でリポソームまたはその伯の巨大キャリヤに組入れる
こともできる。リポソームまたはその他の巨大キャリヤ
に組入れられると、延長された期間にわたって持続する
ことができるワクチンの放出手段が提供される。
タンパク質、特に小ざいタンパク質の免疫原生は免疫原
生キャリヤ分子（すなわち、ホスト動物において免疫原
生応答を固有に引き出Ｊ性質を有する巨大分子、タンパ
ク質はこの巨大分子に共有結合されることができる）に
、交叉結合またはカップリングさせることによって増大
させることができる。キャリヤ分子への交叉結合または
共有結合は、小さいタンパク質がハプテン（抗体に特異
的に結合することができるが、抗体産生を引き出すこと
はできない分子、すなわち、免疫原生ではない分子）と
して作用覆ることから、時には、必要であることがある
。このような小さいタンパク質の免疫原生キャリヤ分子
への共有結合は、「キャリヤ効果」として一般に知られ
ているように、これらのタンパク質を免疫原生にする。
生キャリヤ分子（すなわち、ホスト動物において免疫原
生応答を固有に引き出Ｊ性質を有する巨大分子、タンパ
ク質はこの巨大分子に共有結合されることができる）に
、交叉結合またはカップリングさせることによって増大
させることができる。キャリヤ分子への交叉結合または
共有結合は、小さいタンパク質がハプテン（抗体に特異
的に結合することができるが、抗体産生を引き出すこと
はできない分子、すなわち、免疫原生ではない分子）と
して作用覆ることから、時には、必要であることがある
。このような小さいタンパク質の免疫原生キャリヤ分子
への共有結合は、「キャリヤ効果」として一般に知られ
ているように、これらのタンパク質を免疫原生にする。
適当なギヤ９１フ分子は、たとえば、タンパク質および
天然または合成の重合体系化合物、たとえばポリペプチ
ド、多糖類、リポ多糖類などを包含する。有用なキャリ
ヤはＱｕｉｌ八と称されるグリコシドであり、これはＨ
ｏｒｃｉ’ｎ等にｊ；り教示されているｌ’、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ３０８ ： ４５７ （１９８４） ］ 。タ
ンパク質キャリヤ分子は特に好ましくは、これらに制限
されないが、キイホール（にｅｙｂｏｌｅ ）リンペッ
トヘモシアニン、人間または牛のガンマグロブリン、人
間、牛またはウサギの血清アルブミン、あるいはこのよ
うなタンパク質のメチル化またはその他の誘導体が包含
される。その伯のタンパク質キャリヤは当業者にとって
明らかである。好ましくは、必要不可欠ではないが、タ
ンパク質キャリヤは、タンパク質に対する抗体の誘発に
用いられるホスト動物に対して、異質のものである。
天然または合成の重合体系化合物、たとえばポリペプチ
ド、多糖類、リポ多糖類などを包含する。有用なキャリ
ヤはＱｕｉｌ八と称されるグリコシドであり、これはＨ
ｏｒｃｉ’ｎ等にｊ；り教示されているｌ’、Ｎａｔｕ
ｒｅ、 ３０８ ： ４５７ （１９８４） ］ 。タ
ンパク質キャリヤ分子は特に好ましくは、これらに制限
されないが、キイホール（にｅｙｂｏｌｅ ）リンペッ
トヘモシアニン、人間または牛のガンマグロブリン、人
間、牛またはウサギの血清アルブミン、あるいはこのよ
うなタンパク質のメチル化またはその他の誘導体が包含
される。その伯のタンパク質キャリヤは当業者にとって
明らかである。好ましくは、必要不可欠ではないが、タ
ンパク質キャリヤは、タンパク質に対する抗体の誘発に
用いられるホスト動物に対して、異質のものである。
キャリヤ分子に対する共有カップリングは当業者に周知
の方法を使用しで行なうことができ、この方法の正しい
選択は使用するキャリヤ効果の種類によって指示される
。免疫原生キャリヤ分子がタンパク質である揚台に、本
発明の生物学的活性タンパク質は、たとえばジシクロへ
ギシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドのよう
な水溶性カルボジイミド化合物を使用しτ、カップリン
グさせることができる。
の方法を使用しで行なうことができ、この方法の正しい
選択は使用するキャリヤ効果の種類によって指示される
。免疫原生キャリヤ分子がタンパク質である揚台に、本
発明の生物学的活性タンパク質は、たとえばジシクロへ
ギシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒドのよう
な水溶性カルボジイミド化合物を使用しτ、カップリン
グさせることができる。
これらのようなカップリング剤はまた、タンパク質それ
ら自体を、別のキャリヤ分子を使用することなく、交叉
結合させるために、使用することができる。このような
タンパク質凝集体へのカップリングはまた、免疫原生を
高めることができる。
ら自体を、別のキャリヤ分子を使用することなく、交叉
結合させるために、使用することができる。このような
タンパク質凝集体へのカップリングはまた、免疫原生を
高めることができる。
初期の免疫接種に引続いて、好ましくは１週間〜数週間
後に、ブースター免疫接種を行なう。多数回のブースタ
ーを投与することができる。使用することができる標準
的投与経路としては、皮下、皮肉、腹腔内または筋肉内
投与のような注射による全ての投与方法を使用すること
ができる。
後に、ブースター免疫接種を行なう。多数回のブースタ
ーを投与することができる。使用することができる標準
的投与経路としては、皮下、皮肉、腹腔内または筋肉内
投与のような注射による全ての投与方法を使用すること
ができる。
免疫接種に適当な動物は、たとえば山羊、乳牛、畜生、
羊または馬のにうな大型Ｍｊ乳動物種、ウサギ、モルモ
ット、またはその他のげつ菌目のような小型咄乳類動物
種、あるいは鳥類を包含する。
羊または馬のにうな大型Ｍｊ乳動物種、ウサギ、モルモ
ット、またはその他のげつ菌目のような小型咄乳類動物
種、あるいは鳥類を包含する。
抗体価を発現さけることができる時開の後に、血清を標
準方法により申頗し、次いでＩｇＧフラクションを好ま
しくは、プラズマボレシイス（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ）あるいはその他の慣用の方法によって単離する
。
準方法により申頗し、次いでＩｇＧフラクションを好ま
しくは、プラズマボレシイス（ｐｌａｓｍａｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ）あるいはその他の慣用の方法によって単離する
。
好適には、本発明では、モノクローナル抗体を使用する
。モノクローナル抗体を産生ずるには、対象の生物学的
活性タンパク質を使用し、上記のように、動物を免疫感
作し、ミニ１］−マ細胞に融合させるための抗体産生性
細胞を得る。
。モノクローナル抗体を産生ずるには、対象の生物学的
活性タンパク質を使用し、上記のように、動物を免疫感
作し、ミニ１］−マ細胞に融合させるための抗体産生性
細胞を得る。
抗体産生に対する潜在能力を有する体細胞、特にＢ細胞
はミエローマセルラインとの融合に適している。これら
の体細胞はプライムされた動物のリンパ節、牌臓ｄ３よ
び末梢血液から得ることができる。好ましくは、マウス
の牌臓細胞を使用するが、この理由の−・部は、これら
の細胞がマウスミエローマラインと比較的高比率で安定
な融合を生じることにある。しかしながら、ラッ１〜、
ウサギ、カエルまたはその他の細胞を代りに使用するこ
ともできる。
はミエローマセルラインとの融合に適している。これら
の体細胞はプライムされた動物のリンパ節、牌臓ｄ３よ
び末梢血液から得ることができる。好ましくは、マウス
の牌臓細胞を使用するが、この理由の−・部は、これら
の細胞がマウスミエローマラインと比較的高比率で安定
な融合を生じることにある。しかしながら、ラッ１〜、
ウサギ、カエルまたはその他の細胞を代りに使用するこ
ともできる。
特殊化されたミエローマセルラインは、パイプ１／！４
リド−マー産生融合法で使用されるリンパ球腫瘍から発
現されている［にｏｈｌｃｒおよびＨｉｌＳｔＱｉｎに
よる［ｕｒ、 Ｊ、 Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．、６ ： ５
１１ （１９７６） ：ｓｈｕ ｔｍａｎ等によるＮａ
ｔｕｒｅ ２７６ ： ２６９ （１９７３）；Ｖｏ
ｌｋ等によるＪ、 Ｖｉｒｏｌ 生２．２２０（１９
８２）］。これらのセルラインは少なくとも二つの理由
で発現された。第一の理由は、未融合の、類似の不明確
な自己増殖性ミエローマ細胞の中からの融合ハイブリド
ーマの選択を容易にすることにある。通常、これはミエ
ローマを増殖不可能にする酵素を欠失しているミエロー
マを、ハイブリドーマの増殖を支持する成る種の選択培
地中で使用することによって達成される。第二の理由は
、リンパ球腫瘍細胞がそれら自体の抗体を産生する固有
の能力を有Ｊることにある。モノクロナル技法を使用す
る目的はハイブリドーマの体細胞部分の遺伝子制御の下
に、所望の一つだけの抗体を産生する、無制限の寿命を
有Ｊる融合したハイブリッドセルラインを得るＩＣめで
ある。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生を排除
づ一６だめに、短いか、または長い、免疫グロブリン鎖
を生成Ｊることができないか、あるいは抗体分泌メカニ
ズムが欠落しているミエローマセルラインを使用すると
好ましい。これらのセルラインを選択する第三の理由は
、融合に対するそれらの適合性および効率にある。
現されている［にｏｈｌｃｒおよびＨｉｌＳｔＱｉｎに
よる［ｕｒ、 Ｊ、 Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．、６ ： ５
１１ （１９７６） ：ｓｈｕ ｔｍａｎ等によるＮａ
ｔｕｒｅ ２７６ ： ２６９ （１９７３）；Ｖｏ
ｌｋ等によるＪ、 Ｖｉｒｏｌ 生２．２２０（１９
８２）］。これらのセルラインは少なくとも二つの理由
で発現された。第一の理由は、未融合の、類似の不明確
な自己増殖性ミエローマ細胞の中からの融合ハイブリド
ーマの選択を容易にすることにある。通常、これはミエ
ローマを増殖不可能にする酵素を欠失しているミエロー
マを、ハイブリドーマの増殖を支持する成る種の選択培
地中で使用することによって達成される。第二の理由は
、リンパ球腫瘍細胞がそれら自体の抗体を産生する固有
の能力を有Ｊることにある。モノクロナル技法を使用す
る目的はハイブリドーマの体細胞部分の遺伝子制御の下
に、所望の一つだけの抗体を産生する、無制限の寿命を
有Ｊる融合したハイブリッドセルラインを得るＩＣめで
ある。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生を排除
づ一６だめに、短いか、または長い、免疫グロブリン鎖
を生成Ｊることができないか、あるいは抗体分泌メカニ
ズムが欠落しているミエローマセルラインを使用すると
好ましい。これらのセルラインを選択する第三の理由は
、融合に対するそれらの適合性および効率にある。
かなりのミエローマセルラインを融合細胞ハイブリッド
の形成に使用することができ、これらには、たとえばＰ
３／Ｘ６３−ＡＣ＋８、Ｐ３／ＮＳＩ／１−／’１４−
１．５Ｐ２１０−Ａｏ−１４および５１９４１５．ＸＸ
Ｏ，ＢＵ、１が含まれる。Ｐ３／Ｘ６３−／’１８およ
びＰ３／ＮＳ Ｉ／１−ＡＣ＋４−１セルラインはにｏ
ｈｌｅｒおよびＨｉｌＳｔｅｉｎにより記載されている
［Ｅｕｒ、 ＪＩｍｍｕｎｏｌ、６ ： ５１１ （１
９７６） ］ 。Ｓｈｕ１ｍａｎ等はＳｐ２１０−Ａｇ
１４ミセローマラインを開発し ／ｊ［Ｎａｔｕｒｅ２
７６：２６９ （１９７８） コ 。
の形成に使用することができ、これらには、たとえばＰ
３／Ｘ６３−ＡＣ＋８、Ｐ３／ＮＳＩ／１−／’１４−
１．５Ｐ２１０−Ａｏ−１４および５１９４１５．ＸＸ
Ｏ，ＢＵ、１が含まれる。Ｐ３／Ｘ６３−／’１８およ
びＰ３／ＮＳ Ｉ／１−ＡＣ＋４−１セルラインはにｏ
ｈｌｅｒおよびＨｉｌＳｔｅｉｎにより記載されている
［Ｅｕｒ、 ＪＩｍｍｕｎｏｌ、６ ： ５１１ （１
９７６） ］ 。Ｓｈｕ１ｍａｎ等はＳｐ２１０−Ａｇ
１４ミセローマラインを開発し ／ｊ［Ｎａｔｕｒｅ２
７６：２６９ （１９７８） コ 。
５１９４１５．ＸＸＯ，ＢＵ、１．はＴｒｏｗｂｒｉｄ
ｇｅによ）７報告された［Ｊ、 ［Ｘ１１． Ｈｅｄ、
１４８ ： ３１３ （１９７９） コ 。
ｇｅによ）７報告された［Ｊ、 ［Ｘ１１． Ｈｅｄ、
１４８ ： ３１３ （１９７９） コ 。
抗体産生性の腺腫細胞またはリンパ節細胞ならびにミエ
ローマ細胞のハイブリッドを形成する方法は通常、体細
胞とミエローマ細胞とを１０：１の割合くしかし、この
割合は約２０：１〜約１：１の範囲で変えることができ
る）で、細胞膜の融合を促進する助剤（一種または二種
以上）（これは化学的、ウィルス的または電気的なもの
であることができる）の存在の下に混合することを包含
する。この融合プロセスに使用する体細胞原およびミエ
ローマ細胞膜としては、同一種の動物を用いると好まし
い。融合方法はにｏｈｌｅｒおよびＨｉｌｓｔｅｉｎに
より［Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５ （１９７５）およ
びＥｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、６ ： ５１１
（１９７６） ］ 、Ｇｅｆｔｅｒ等により［Ｓｏｍａ
ｔｉｃ Ｃｅ１ｌ Ｇｅｎｃｔ、３：２３１ （１９７
７）１、おヨヒＶｏｌｋ等ニヨリ［、Ｊ、Ｖｉｖｏｌ、
４２：２２０（１９８２）’Ｉｔ、開示されている。こ
れらの研究者にＪ、り使用されている融合促進剤は５ｃ
ｎｄａ ｉウィルスおよびポリ］ニチレングリコールで
ある。
ローマ細胞のハイブリッドを形成する方法は通常、体細
胞とミエローマ細胞とを１０：１の割合くしかし、この
割合は約２０：１〜約１：１の範囲で変えることができ
る）で、細胞膜の融合を促進する助剤（一種または二種
以上）（これは化学的、ウィルス的または電気的なもの
であることができる）の存在の下に混合することを包含
する。この融合プロセスに使用する体細胞原およびミエ
ローマ細胞膜としては、同一種の動物を用いると好まし
い。融合方法はにｏｈｌｅｒおよびＨｉｌｓｔｅｉｎに
より［Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５ （１９７５）およ
びＥｕｒ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、６ ： ５１１
（１９７６） ］ 、Ｇｅｆｔｅｒ等により［Ｓｏｍａ
ｔｉｃ Ｃｅ１ｌ Ｇｅｎｃｔ、３：２３１ （１９７
７）１、おヨヒＶｏｌｋ等ニヨリ［、Ｊ、Ｖｉｖｏｌ、
４２：２２０（１９８２）’Ｉｔ、開示されている。こ
れらの研究者にＪ、り使用されている融合促進剤は５ｃ
ｎｄａ ｉウィルスおよびポリ］ニチレングリコールで
ある。
融合法は非常に低い頻度で生存可能なハイブリラドを生
成するので（たとえば体細胞原として腺腫を使用する場
合に、一種だ【プのハイブリッドがはどんど旬回、１×
１０５牌臓細胞に対して得られる）、残りの未融合細胞
、特に未融合ミエローマ細胞から、融合細胞ハイブリッ
ドを選択する手段を講じることが必須である。所望の抗
体−産生性ハイブリドーマを他の生成する融合細胞ハイ
ブリッドの中から検出するための手段がまた必要である
。
成するので（たとえば体細胞原として腺腫を使用する場
合に、一種だ【プのハイブリッドがはどんど旬回、１×
１０５牌臓細胞に対して得られる）、残りの未融合細胞
、特に未融合ミエローマ細胞から、融合細胞ハイブリッ
ドを選択する手段を講じることが必須である。所望の抗
体−産生性ハイブリドーマを他の生成する融合細胞ハイ
ブリッドの中から検出するための手段がまた必要である
。
一般に、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドー
マの増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を防止す
る培地において、細胞を培養することによって達成され
る。ミエローマ細胞は正常では、不明確に分割される。
マの増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を防止す
る培地において、細胞を培養することによって達成され
る。ミエローマ細胞は正常では、不明確に分割される。
（融合に使用される体細胞はインビトロ培地中で長期間
生存可能なものとして保持できないので問題を提起しな
い）。
生存可能なものとして保持できないので問題を提起しな
い）。
ヒボキザンチンホスボリボシルトランスフエラーゼが欠
落している（ １−Ｉ Ｐ Ｐ Ｔ−陰性）ミエローマ
細胞を都合良く、使用することができる。これらの細胞
に対覆る選択はヒポキサンヂン／アミツブテリン／チミ
ジン（１−Ｉ Ａ Ｔ ＞培地中でなされ、この培地中
で、融合細胞ハイブリッドは腺腫ｌｌｌ胞のＩＩ Ｐ
Ｒ１’−陽性遺伝子型によって生き残る。遺伝子型上で
有能なハイブリッドの増殖を支持する培地中で対立して
選択することができる異なる遺伝子欠失（薬物感受性な
どの）を有するミニｒコーマ細胞を使用することもでき
る。
落している（ １−Ｉ Ｐ Ｐ Ｔ−陰性）ミエローマ
細胞を都合良く、使用することができる。これらの細胞
に対覆る選択はヒポキサンヂン／アミツブテリン／チミ
ジン（１−Ｉ Ａ Ｔ ＞培地中でなされ、この培地中
で、融合細胞ハイブリッドは腺腫ｌｌｌ胞のＩＩ Ｐ
Ｒ１’−陽性遺伝子型によって生き残る。遺伝子型上で
有能なハイブリッドの増殖を支持する培地中で対立して
選択することができる異なる遺伝子欠失（薬物感受性な
どの）を有するミニｒコーマ細胞を使用することもでき
る。
融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するには数週間が
通常、必要である。この時間内の初期に、所望の抗体を
産生するハイブリッドを同定することが必要であり、こ
れらは引続いて、クローン化し、次いで増殖させる。一
般に、４！！られたハイブリッドのうちのほぼ１０％が
所望の抗体を産生Ｊ−るが、１−３０％の範ｔｉｌｌも
まれではない３．抗体産生ハイブリッドの検出は文献［
たとえば、にｅｎｎｅｔ等（編集）によるＨｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄｌｌｙｂｒｉ
ｄｏＩｌｌａｓ ：＾Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉ
ｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＾ｎａｌｙｓｅｓ、 ３７６
〜３８４負、Ｐ ｌ ｅｎｕｍ出版社、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ （１９８０）参照］に記載されている酵素結合イム
ノアッセイおよびラジオイムノアツセ１つ イ技法を含むいくつかの標準的検定法によって達成刃る
ことができる。
通常、必要である。この時間内の初期に、所望の抗体を
産生するハイブリッドを同定することが必要であり、こ
れらは引続いて、クローン化し、次いで増殖させる。一
般に、４！！られたハイブリッドのうちのほぼ１０％が
所望の抗体を産生Ｊ−るが、１−３０％の範ｔｉｌｌも
まれではない３．抗体産生ハイブリッドの検出は文献［
たとえば、にｅｎｎｅｔ等（編集）によるＨｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄｌｌｙｂｒｉ
ｄｏＩｌｌａｓ ：＾Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉ
ｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ＾ｎａｌｙｓｅｓ、 ３７６
〜３８４負、Ｐ ｌ ｅｎｕｍ出版社、Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ （１９８０）参照］に記載されている酵素結合イム
ノアッセイおよびラジオイムノアツセ１つ イ技法を含むいくつかの標準的検定法によって達成刃る
ことができる。
所望の融合細胞ハイブリッドを選択し、各抗体産生性セ
ルラインにそれぞれ、クローン化したならば、各セルラ
インは２種の標準法のどちらかによって増殖させること
ができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液は組織適合性動
物中に注入することができる。注入された動物は次いで
、融合細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノ
クローナル抗体を分泌する腫瘍を発現する。血清または
腹水のような動物の体液を採取し、モノクローナル抗体
を高濃度で得ることができる。別法として、各セルライ
ンをそれぞれ、インビトロで実験培養容器中で増殖させ
ることもできる。単一の特異的モノクロ−プール抗体を
高濃度で含有する培養培地をデカンテーション、濾過ま
たは遠心分離により採取することができる。
ルラインにそれぞれ、クローン化したならば、各セルラ
インは２種の標準法のどちらかによって増殖させること
ができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液は組織適合性動
物中に注入することができる。注入された動物は次いで
、融合細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノ
クローナル抗体を分泌する腫瘍を発現する。血清または
腹水のような動物の体液を採取し、モノクローナル抗体
を高濃度で得ることができる。別法として、各セルライ
ンをそれぞれ、インビトロで実験培養容器中で増殖させ
ることもできる。単一の特異的モノクロ−プール抗体を
高濃度で含有する培養培地をデカンテーション、濾過ま
たは遠心分離により採取することができる。
本発明で使用する抗体は、これらを微量滴定または酵素
イミノアッセイ用プレートの凹部のような適当な基体に
単純にコートすることにより不動化することかできる。
イミノアッセイ用プレートの凹部のような適当な基体に
単純にコートすることにより不動化することかできる。
別法として、これらは、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、シリカゲル、寒天またはデキストラン支持体のよう
な不溶性支持体に、標準的方法を用いて共有的にカップ
リングさせることができる。Ｐｈａｒａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ ＣｈｅｍｉｃａｌｓまたはＢｉｏｒａｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓにより製造されている支持体のよう
なビーズ状支持体（これらのうちのかなりはタンパク質
のカップリングに対して、すでに活性な形態で人手する
ことができる）は特に好ましい。
ド、シリカゲル、寒天またはデキストラン支持体のよう
な不溶性支持体に、標準的方法を用いて共有的にカップ
リングさせることができる。Ｐｈａｒａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ ＣｈｅｍｉｃａｌｓまたはＢｉｏｒａｄ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓにより製造されている支持体のよう
なビーズ状支持体（これらのうちのかなりはタンパク質
のカップリングに対して、すでに活性な形態で人手する
ことができる）は特に好ましい。
本発明の免疫バイオアッセイにおいて、生物学的活性タ
ンパク質の抗体への結合は特異的結合が生じる標準的条
件の下で行なう。これらの条件は、好ましくはこれらが
生理学的条件の下で示すものに近似したアミノ酸残基帯
電および抗体とタンパク質との高次構造を示すような条
件であるべきである。好適には、不動化した抗体は先ず
、溶液で処理し、抗体および抗体が結合している基体を
非特異性結合に対して防護する。これは検定試料中に存
在する刺激性物質または■害性物質の望ましくない結合
を防止する。
ンパク質の抗体への結合は特異的結合が生じる標準的条
件の下で行なう。これらの条件は、好ましくはこれらが
生理学的条件の下で示すものに近似したアミノ酸残基帯
電および抗体とタンパク質との高次構造を示すような条
件であるべきである。好適には、不動化した抗体は先ず
、溶液で処理し、抗体および抗体が結合している基体を
非特異性結合に対して防護する。これは検定試料中に存
在する刺激性物質または■害性物質の望ましくない結合
を防止する。
本発明を説明するために以下に示す例において、この目
的には牛胎児血清、生血清アルブミンおよびぜラチンを
含有する溶液を使用した。この代りに使用できる他の阻
止剤には、これらに制限されないが、オボアルブミンお
よび脱脂乾燥乳が含まれる。
的には牛胎児血清、生血清アルブミンおよびぜラチンを
含有する溶液を使用した。この代りに使用できる他の阻
止剤には、これらに制限されないが、オボアルブミンお
よび脱脂乾燥乳が含まれる。
対象のタンパク質が相補的抗体に一度、結合したならば
、この抗体−タンパク質複合体を洗浄し、干渉物質を除
去する。広範囲の洗浄溶液、たとえば蒸留水、リン酸塩
緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）またはその伯の緩衝溶液を使用
することができる。
、この抗体−タンパク質複合体を洗浄し、干渉物質を除
去する。広範囲の洗浄溶液、たとえば蒸留水、リン酸塩
緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）またはその伯の緩衝溶液を使用
することができる。
本発明の方法では、不動化した抗体はタンパク質の相応
する細胞における応答能力を実質的に害さない部位でタ
ンパク質に特異的に結合する必要がある。
する細胞における応答能力を実質的に害さない部位でタ
ンパク質に特異的に結合する必要がある。
本発明に従い、応答性細胞を、洗浄した抗体タンパク質
複合体とともに容器に移す。これにより、本方法の全工
程を同一容器内で行なうことかの能になる。
複合体とともに容器に移す。これにより、本方法の全工
程を同一容器内で行なうことかの能になる。
本発明では、多くの生物学的活性タンパク質と応答性細
胞とを使用することができる。たとえば、このイムノア
ッセイはＤａｕｄ ｉ細胞に対するその抗増殖能作用を
評価づ−ることによって、白血球インターフェロンに対
して行なうことができる［ Ｆｖｉｎｇｅｒ等によるＪ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５６ ： ２１１３（
１９８０）］。ＩＩｌ−−１は種々の培養セルラインの
増殖を刺激覆るその能力を評価り−ることによって定量
することができる［ Ｓｃｈｍｉｄｔ等によルＪ、Ｉｍ
ｍｕｎｏ１．１２８ ： ２１７７ （１９８２） ］
。
胞とを使用することができる。たとえば、このイムノア
ッセイはＤａｕｄ ｉ細胞に対するその抗増殖能作用を
評価づ−ることによって、白血球インターフェロンに対
して行なうことができる［ Ｆｖｉｎｇｅｒ等によるＪ
、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５６ ： ２１１３（
１９８０）］。ＩＩｌ−−１は種々の培養セルラインの
増殖を刺激覆るその能力を評価り−ることによって定量
することができる［ Ｓｃｈｍｉｄｔ等によルＪ、Ｉｍ
ｍｕｎｏ１．１２８ ： ２１７７ （１９８２） ］
。
以下の例に示すように、Ｉ Ｌ−２はＣＴ ｌ−１−細
胞などにおける増殖刺激を評価することによって検定す
ることかできる。天然原からのタンパク質ｄ５よび原核
細胞発現系または真核細胞発現系におりる絹換えＤＮＡ
技術により製造されたタンパク質はいずれも免疫バイオ
アッセイで検定することができる。
胞などにおける増殖刺激を評価することによって検定す
ることかできる。天然原からのタンパク質ｄ５よび原核
細胞発現系または真核細胞発現系におりる絹換えＤＮＡ
技術により製造されたタンパク質はいずれも免疫バイオ
アッセイで検定することができる。
ｖＡｌｌＩｌされる生物学的応答はいずれも、同一培地
（たとえば、血清または血清を含有しない培養培地）で
調製された、既知量のタンパク質の順次稀釈法による測
定によって作成された標準曲線に対して比較することに
より定石される。
（たとえば、血清または血清を含有しない培養培地）で
調製された、既知量のタンパク質の順次稀釈法による測
定によって作成された標準曲線に対して比較することに
より定石される。
手記の非制限的例は本発明をさらに充分に説明するもの
である。
である。
例
材Ｆｌ：
１、ヒト血清、ｌｌｕｍａｎ Ａ Ｂ血清はＧＩＢＣＯ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａｎｄ
、 Ｎ、Ｙ、）から入手し１こ 。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａｎｄ
、 Ｎ、Ｙ、）から入手し１こ 。
２ ５Ｂ１抗体、１し−２の非グリコジル化形体に対す
る、精製モノクローナル抗体はＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ
Ｒｏｃｈｅ ＩｎｃのＲｉｃｈａｒｄ Ｃｈｉｚｚｏ
ｎｉｔｅ （ＮｕｔｌｅｙＮ、Ｊ、 ）から入手した。
る、精製モノクローナル抗体はＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ
Ｒｏｃｈｅ ＩｎｃのＲｉｃｈａｒｄ Ｃｈｉｚｚｏ
ｎｉｔｅ （ＮｕｔｌｅｙＮ、Ｊ、 ）から入手した。
３、 ｒｌＬ−２、精製ｒＩｌ−２は１ｌｏｆｆｌ
ＩｌａｎｎＬａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ、 （Ｎｕｔｌ
ｅｙ、 Ｎ、Ｊ、）から入手した。
ＩｌａｎｎＬａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ、 （Ｎｕｔｌ
ｅｙ、 Ｎ、Ｊ、）から入手した。
４、 ＨＢ１０１検定培地、血清不含検定培地トｌＢ
１０１ は１ｌａｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ
（Ａｌａｍｅｄａ 、 ＣＡ）から入手し、指示
どおりに調製した。
１０１ は１ｌａｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ
（Ａｌａｍｅｄａ 、 ＣＡ）から入手し、指示
どおりに調製した。
５、 ＲＰＭ１１６４０細胞維持培地、Ｃ−ｒ Ｌ
Ｌ細胞はＧ Ｔ Ｂ ＣＯ（Ｇｒａｎｄ Ｔｓｌａｎｄ
、 Ｎ、’／、 ）から入手したＲＰＭ１１６４０中で
維持した。
Ｌ細胞はＧ Ｔ Ｂ ＣＯ（Ｇｒａｎｄ Ｔｓｌａｎｄ
、 Ｎ、’／、 ）から入手したＲＰＭ１１６４０中で
維持した。
６、 ＣＴＩ−Ｌ細胞、この検定に使用したＣ Ｔ
Ｌ Ｌ細胞はＡｍｅｒｉＣａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕ＋ｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
Ｌ Ｌ細胞はＡｍｅｒｉＣａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕ＋ｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
７、 Ｉｎ＋ｍ１ｏｎ ＩＩ Ｅ Ｉ Ａプレート、
この検定に使用したＥＩＡプレー１へはＤｙｎａｔｅｃ
ｈ Ｃｏｒｐ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、 Ｖａ、）から入
手した。
この検定に使用したＥＩＡプレー１へはＤｙｎａｔｅｃ
ｈ Ｃｏｒｐ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、 Ｖａ、）から入
手した。
８、 ＦＬＩＳＡプレートリーダー、光学濃度の測定
にはＡｎ Ａｒｔｅｋ垂直ビーム分光光度訂を使用した
。
にはＡｎ Ａｒｔｅｋ垂直ビーム分光光度訂を使用した
。
９、 Ｃｅｔｕｓ Ｐｒｏｐｅｔｌｅ、全てのプレー
１−充填、連続稀釈およびプレートからプレー１〜への
移送はＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ、 （Ｅｍｅｒｙｖｉｌ
ｌｅ、 Ｃａ）から入手した自動ピペッティング装置を
用いて行なった。
１−充填、連続稀釈およびプレートからプレー１〜への
移送はＣｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ、 （Ｅｍｅｒｙｖｉｌ
ｌｅ、 Ｃａ）から入手した自動ピペッティング装置を
用いて行なった。
方法：
１、 １Ｌ−２捕獲法、１三ＬＩＳＡプレートにＩ Ｌ
−２に対する抗体を被覆した。これは５１３１抗体を５
０ｍＨＴｒ ｉ ｓ、２５０１１１８ ＮａＣｊ！、
ｐＨ８，０（フィルター殺菌したもの）中で２０μｑ／
ｒｔｄｌの最終濃度に先ず、稀釈することによつて行な
う。この稀釈した抗体１００μ夕を９６個の四部を有す
るＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＥＴ八へレー１−の各四部に
加えた。このプレートを接着性裏材を有するプレートシ
ーラ〜でシールし、室温で一夜にわたりインキュベート
した。次の日に、プレートを蒸留したｄｌ」２０で、３
［１洗浄した。洗浄後に、プレートを１％４胎児血清、
１％ＢＳＡ、０．３％ゼラチン、２５ｍＨＮａＰＯ４１
００μＡを加えることによりブロックし、フィルター殺
菌し、次いで３７℃に予備加温した。このプレー１〜を
次いで、３７°Ｃで３０分間、インキュベ−１へし、次
いで無菌ＰＢＳで３回、洗浄した。プレー１〜に牛胎児
血清１００μｌ／凹部を充填し、次いで試料を加える準
備をした。三種の試料を、臨床血清試料を刺激するため
に調製した。３つの一定量の正常人間自消に精製された
組換えＩＬ−２を最終濃度がＰＯ０単位／ｄに達するま
で加えた。試料１００Ｉｌｐを８△プレー１〜上の各列
の第一凹部に加えた。各列の第一四部中の最終容量は２
００μＡであった。各試料を加え、プレートを各列の１
２個の四部の全部にわたって各移送間で４回混合して順
次稀釈した。各移送物は１００μｐを含有し、１：２の
稀釈を示した。■し−２を上記の被覆したプレー１−に
、旋回（ｏｒｂｉｔａｌ ）シェーカー−にで室温にお
いて２時間、結合させた。この結合］−程に引続き、プ
レートを無菌ＰＢＳで５回洗浄した。
−２に対する抗体を被覆した。これは５１３１抗体を５
０ｍＨＴｒ ｉ ｓ、２５０１１１８ ＮａＣｊ！、
ｐＨ８，０（フィルター殺菌したもの）中で２０μｑ／
ｒｔｄｌの最終濃度に先ず、稀釈することによつて行な
う。この稀釈した抗体１００μ夕を９６個の四部を有す
るＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩ ＥＴ八へレー１−の各四部に
加えた。このプレートを接着性裏材を有するプレートシ
ーラ〜でシールし、室温で一夜にわたりインキュベート
した。次の日に、プレートを蒸留したｄｌ」２０で、３
［１洗浄した。洗浄後に、プレートを１％４胎児血清、
１％ＢＳＡ、０．３％ゼラチン、２５ｍＨＮａＰＯ４１
００μＡを加えることによりブロックし、フィルター殺
菌し、次いで３７℃に予備加温した。このプレー１〜を
次いで、３７°Ｃで３０分間、インキュベ−１へし、次
いで無菌ＰＢＳで３回、洗浄した。プレー１〜に牛胎児
血清１００μｌ／凹部を充填し、次いで試料を加える準
備をした。三種の試料を、臨床血清試料を刺激するため
に調製した。３つの一定量の正常人間自消に精製された
組換えＩＬ−２を最終濃度がＰＯ０単位／ｄに達するま
で加えた。試料１００Ｉｌｐを８△プレー１〜上の各列
の第一凹部に加えた。各列の第一四部中の最終容量は２
００μＡであった。各試料を加え、プレートを各列の１
２個の四部の全部にわたって各移送間で４回混合して順
次稀釈した。各移送物は１００μｐを含有し、１：２の
稀釈を示した。■し−２を上記の被覆したプレー１−に
、旋回（ｏｒｂｉｔａｌ ）シェーカー−にで室温にお
いて２時間、結合させた。この結合］−程に引続き、プ
レートを無菌ＰＢＳで５回洗浄した。
２、 ＩＬ−２バイオアツセイ、ＣＴ Ｌ Ｌ細胞
を５ｏｏｘｑで遠心分離することにより残留１１゜２お
よび血清含有増殖培地を除去Ｊることによって、ＣＴＬ
Ｌ細胞を調製した。この細胞ペレットをＨＢ １０１検
定培地に再懸濁し、前と同様に遠心分離した。３回洗浄
した少に、この細胞ペレツ１−を１×１０５細胞／ｄの
濃度でＩ−Ｉ Ｂ ｉ Ｏｌ中に再懸濁した。この細胞
懸濁液２００μ夕を洗浄したＥＩＡプレートに加えた。
を５ｏｏｘｑで遠心分離することにより残留１１゜２お
よび血清含有増殖培地を除去Ｊることによって、ＣＴＬ
Ｌ細胞を調製した。この細胞ペレットをＨＢ １０１検
定培地に再懸濁し、前と同様に遠心分離した。３回洗浄
した少に、この細胞ペレツ１−を１×１０５細胞／ｄの
濃度でＩ−Ｉ Ｂ ｉ Ｏｌ中に再懸濁した。この細胞
懸濁液２００μ夕を洗浄したＥＩＡプレートに加えた。
このプレートを非気密性カバーでおおい、５％ＣＯ２イ
ンキュベーター内で３７℃において、Ｉ！１．８時間イ
ンキュベートし １こ 。
ンキュベーター内で３７℃において、Ｉ！１．８時間イ
ンキュベートし １こ 。
３、 １１−２依存細胞増殖の評価、Ｉ ｌ−−２依
存増殖は乳酸産生の比色分析によって定量した。
存増殖は乳酸産生の比色分析によって定量した。
乳酸はグルコース消費の第二次代謝物であり、ＩＬ−２
依存細胞増殖の精確な指示体である。この比色反応のた
めに、新鮮なＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩプレートの各四部に
溶液Ａ５０μｌを加えることによって、プレートを調製
した。溶液Ａ６ｍｆｆｉはＮＡＤ（３ｉ０＋１１８ ＃
２６０−１１０） １０１ＦＪをグリセリンＩＩ液（Ｓ
ｉｇｍａ ＃８２６−３）２．０戒、１％ゼラヂン０．
２ｍｌおよび無菌蒸留ｄｌ−１２０４，，０蛇に再懸濁
することによって調製した。パイオアツレイブレートの
各凹部からの試＄３１１５μ夕を次いで比色反応プレー
１−（溶液Ａを含有り“る）の対応する凹部に移した。
依存細胞増殖の精確な指示体である。この比色反応のた
めに、新鮮なＩｍｍｕｌｏｎ ＩＩプレートの各四部に
溶液Ａ５０μｌを加えることによって、プレートを調製
した。溶液Ａ６ｍｆｆｉはＮＡＤ（３ｉ０＋１１８ ＃
２６０−１１０） １０１ＦＪをグリセリンＩＩ液（Ｓ
ｉｇｍａ ＃８２６−３）２．０戒、１％ゼラヂン０．
２ｍｌおよび無菌蒸留ｄｌ−１２０４，，０蛇に再懸濁
することによって調製した。パイオアツレイブレートの
各凹部からの試＄３１１５μ夕を次いで比色反応プレー
１−（溶液Ａを含有り“る）の対応する凹部に移した。
時期が定められている呈色反応は呈色反応プレートの各
凹部に溶液３５０μｋを加えることによって１ｔｔｌ始
さＶた。溶液Ｂはこの添加の直前に、ｐ−ヨードニトロ
テトラゾリウムバイオレット５． Ｏｒｄ （Ｉ ＮＴ
、 Ｓｉｇｍａ ＃９Ａ、 Ｏ−５）をノエナジンメ１
へスルノェート１．０ｄ ＣＰＭＳ、ｌ−１２０中０．
０２ＦＪｇ／ｍｌ！、Ｓｉｇｍａ＃ Ｐ’ ９６２５
）おにび乳酸デヒドロゲナーゼ０．１ｍｅ（Ｌｌ：）ト
１、Ｓｉｇｍａ ＃８２６−６）と配合することにより
調製した。呈色反応は室温で１０分間インキュベートし
た後に、０．３５ＭＨ（１５０μｍ／凹部の添加にＪ−
り止めた。光学濃度は５５０ｎｍフィルターを備えたＥ
、 Ｌ Ｉ Ｓ Ａプレートリーダーを用いて測定した
。
凹部に溶液３５０μｋを加えることによって１ｔｔｌ始
さＶた。溶液Ｂはこの添加の直前に、ｐ−ヨードニトロ
テトラゾリウムバイオレット５． Ｏｒｄ （Ｉ ＮＴ
、 Ｓｉｇｍａ ＃９Ａ、 Ｏ−５）をノエナジンメ１
へスルノェート１．０ｄ ＣＰＭＳ、ｌ−１２０中０．
０２ＦＪｇ／ｍｌ！、Ｓｉｇｍａ＃ Ｐ’ ９６２５
）おにび乳酸デヒドロゲナーゼ０．１ｍｅ（Ｌｌ：）ト
１、Ｓｉｇｍａ ＃８２６−６）と配合することにより
調製した。呈色反応は室温で１０分間インキュベートし
た後に、０．３５ＭＨ（１５０μｍ／凹部の添加にＪ−
り止めた。光学濃度は５５０ｎｍフィルターを備えたＥ
、 Ｌ Ｉ Ｓ Ａプレートリーダーを用いて測定した
。
結果：
三種の擬似臨床試料から得られた０、Ｄ、５５０をグラ
フに描き入れ、第１図に示す。第１図にはまた、Ｎ Ｈ
８を含有するがＩＬ−２は含有しないブランク試料から
得られたＯ、Ｄ、５５０のグラフを示す。これらのグラ
フによってボされているように、５Ｂ１抗体により捕獲
されたｌｍ−２を定量することができる。人間血清１１
ｄ、当りで２単位のような少量の１１−２をこの検定で
検出することができた。
フに描き入れ、第１図に示す。第１図にはまた、Ｎ Ｈ
８を含有するがＩＬ−２は含有しないブランク試料から
得られたＯ、Ｄ、５５０のグラフを示す。これらのグラ
フによってボされているように、５Ｂ１抗体により捕獲
されたｌｍ−２を定量することができる。人間血清１１
ｄ、当りで２単位のような少量の１１−２をこの検定で
検出することができた。
第１図は指示試料に対する試料稀釈度の関数として、５
５０ｎｍにおける吸収を示す、組換えヒト１ｍ−２の免
疫バイオアッセイの結果を示タグラフである（直接バイ
ブリド検定法）。 手 続 ネ甫 正 書（方式） 事件の表示 平成０１ 年 特許願第２１２０１、 発明の名称 生物学的活性タンパク質の新規定量方法エフ、ホフマン フ ロシュ アーゲー を覧 理 人 乎…正命令の日イ寸 平成１年１１月２８補正により増
加する請求項の数 補正の対象 図面 Ｃうｐｕ’Ａ）
５０ｎｍにおける吸収を示す、組換えヒト１ｍ−２の免
疫バイオアッセイの結果を示タグラフである（直接バイ
ブリド検定法）。 手 続 ネ甫 正 書（方式） 事件の表示 平成０１ 年 特許願第２１２０１、 発明の名称 生物学的活性タンパク質の新規定量方法エフ、ホフマン フ ロシュ アーゲー を覧 理 人 乎…正命令の日イ寸 平成１年１１月２８補正により増
加する請求項の数 補正の対象 図面 Ｃうｐｕ’Ａ）
Claims (7)
- （１）試料中の生物学的活性タンパク質の量の定量方法
であつて、 （ａ）生物学的活性タンパク質を含有すると思われる生
物学的流体または実験試料を当該タンパク質に対して特
異性である不動化された抗体と、この抗体が該タンパク
質の生物活性を実質的に害しない部位で該タンパク質に
特異的に結合する条件の下に接触させ、抗体−タンパク
質複合体を形成させ、 （ｂ）この抗体−タンパク質複合体を溶液で洗浄し、試
料中に存在する干渉性物質を除去し、 （ｃ）洗浄した抗体−タンパク質を複合体を、該生物学
的活性タンパク質に対して応答可能な細胞と接触させ、 測定可能な応答を生じさせ、次いで （ｄ）生じた応答を測定する、 ことからなり、このようにして、生物学的活性タンパク
質の量を定量する方法。 - （２）抗体が抗血清に由来するものである、請求項１に
記載の方法。 - （３）抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記
載の方法。 - （４）生物学的活性タンパク質がＩＬ−２であり、そし
て応答細胞がＣＴＬＬ細胞である、請求項１〜３のいず
れか一項に記載の方法。 - （５）ＣＴＬＬ細胞の応答を乳酸生成の比色測定によつ
てはかる、請求項４に記載の方法。 - （６）ＣＴＬＬ細胞の応答を＾３Ｈ−チミジンのＤＮＡ
中への取り込みの測定によつてはかる、請求項４に記載
の方法。 - （７）全工程を同一容器内で行なう、請求項１〜６のい
ずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US23610988A | 1988-08-18 | 1988-08-18 | |
| US236109 | 1988-08-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH032564A true JPH032564A (ja) | 1991-01-08 |
Family
ID=22888169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21201989A Pending JPH032564A (ja) | 1988-08-18 | 1989-08-17 | 生物学的活性タンパク質の新規定量方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0355013A3 (ja) |
| JP (1) | JPH032564A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7227757B2 (en) | 2003-04-14 | 2007-06-05 | Denso Corporation | Electronic control unit |
| JP2008171754A (ja) * | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Fujikura Ltd | 防水コネクタ及びその製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK134487A (da) * | 1986-03-17 | 1987-09-18 | Hoffmann La Roche | Monoklonalt antistof med affinitet for humant interleukin-2 |
-
1989
- 1989-08-10 EP EP19890114783 patent/EP0355013A3/en not_active Withdrawn
- 1989-08-17 JP JP21201989A patent/JPH032564A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7227757B2 (en) | 2003-04-14 | 2007-06-05 | Denso Corporation | Electronic control unit |
| JP2008171754A (ja) * | 2007-01-15 | 2008-07-24 | Fujikura Ltd | 防水コネクタ及びその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0355013A3 (en) | 1990-11-14 |
| EP0355013A2 (en) | 1990-02-21 |
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