DK165216B

DK165216B - Et polyetherderivatholdigt vaekstfremmende middel til droevtyggere samt fremgangsmaade til fremstilling heraf

Info

Publication number: DK165216B
Application number: DK025086A
Authority: DK
Inventors: Chao-Min Liu; Barbara Prosser; John Westley
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1980-01-30
Filing date: 1986-01-17
Publication date: 1992-10-26
Also published as: DK165216C; DK25086A; DK25086D0

Description

DK 165216 B

i

Den foreliggende opfindelse angår et polyetherderivatholdigt vækstfremmende middel til drøvtyggere indeholdende en hidtil ukendt poly-etherforbindelse, nemlig forbindelsen X-14868A med formlen I

OMe

XspMe

L _ vJi'uiMe T

OMe OH l rVTrt0 C02H Me Me H -Me H H H 0h 5 og farmaceutisk tolerable salte deraf.

Denne forbindelse fås ved dyrkning af en underkultur af stammen Nocardia X-14868 ATCC 31585 i en vandig carbonhydratopløsning, som indeholder et nitrogenholdigt næringsmiddel, under submerse aerobe betingelser, hvorefter slutproduktet fraskilles og isoleres fra denne 10 opløsning.

Den organisme, der producerer den omhandlede forbindelse, er en hidtil ukendt art, der kaldes Nocardia sp. X-14868. En kultur af den levende organisme, som har fået laboratoriebetegnelsen X-14868, er deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Mary-15 land, USA i den permanente samling af mikroorganismer under nr. ATCC 31585. Kulturen er blevet identificeret som en stamme af Nocardia.

Den hidtil ukendte mikroorganisme er blevet isoleret fra en prøve, der er opsamlet fra strandsandet i Colloroy, Australien. En repræsentativ stamme af Nocardia sp. X-14868 har følgende karakteristika: 20 Generelle træk:

Nocardia sp. X-14868 er karakteristisk ved sin mangel på luftsporedannelse, ved fragmentering af det grampositive substratmycelium efter flere dages inkubering og ved sin cellevægssammensætning af meso-diaminopimelinsyre, galactose, arabinose og ribose.

DK 165216B

2 Vækstkarakteristika:

Organismen blev dyrket på standard ISP-medier "Difco"™, der er beskrevet af Shirling og Gottlieb "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. System. Bacteriol., 16, side 313--5 340, 1066, og forskellige andre medier er anvendt til at karakteri sere strukturen: Gærekstrakt: 1,0% gærekstrakt, 1,0% glucose, 1,5% agar, pH-værdi 6,8.

Glucose - gæreks trakt-pepton: 10 0,3% glucose, 0,5% gærekstrakt, 0,5% pepton, 0,75% CaC03, 1,5% agar, pH-værdi 7,0.

Glucose-asparagin: 1,0% glucose, 0,05% asparagin, 0,05% K2HPO4, 1,5% agar, pH-værdi 6,8.

15 Saccharose-nitrat: 1,0% saccharose, 0,2% NaN03, 0,1% K2HP04, 0,05% MgSO^^O, 0,05% KC1, 1,5% agar.

De medier, der blev anvendt i andre tests, var fra følgende referencer: 20 Test Reference A. Natriumchloridtolerance Gordon and Smith, "Rapidly

Growing Acid Fast Bacteria", B. Caseinhydrolyse J. Bacteriol., 66:41-48, 1953 C. Reduktion af nitrat 25 D. Gelatine (modificeret med Actino- Skerman, "A Guide to the myces-væske "Difco"® plus 2,0% Identification of the Genera of agar i kødinfusionsagar) Bacteria", Williams and Williams

Co., Baltimore, 1967 E. Stivelse (Actinomyces-væske 30 "Difco"® plus 0,25% opløselig stivelse og 2,0% agar)

DK 165216B

3 F. Virkning på lakmus-mælk "Difco"® G. Modstandsdygtighed over for Gordon, "Some Criteria for the lysozym Recognition of Nocardia", J. Gen.

5 Microbiol., 45:355-364, 1966 H. Følsomhed over for penicillin (10 enhedsplader).

Der blev foretaget tests ved 28°C og 37°C for næsten alle medier. Farvestemmelser blev udført 2 og 4 uger efter inkubering.

10 Carbonudnyttelsen blev bestemt ved Shirling og Gottliebs metode (jfr. ovenfor) under anvendelse af ISP-9 "Difco"^-medium.

• En 48 timer gammel ISP-1 væskekultur af X-14868 blev centrifugeret og homogeniseret til opnåelse af en vasket suspension til podning.

Organismernes evne til at vokse ved 10, 28, 36, 45 og 50®C blev 15 undersøgt ved at pode væske af ISP-1 "Difco"®-medium. Cellevægsanalyse af isomeren af diaminopimelinsyre blev udført ved Becker et al.'s metode, Appl. Microbiol., 12, 421-423, 1964. Til bestemmelse af sukkerindholdet i cellevæggen blev Lechevalier og Lechevalier's metode, Actinomycetales, Ed. H. Prauser, Gustav Fischer, Jena, side 20 311-316, 1970, benyttet. Nocardomycolsyreanalyse blev udført ved en let modificering af Lechevalier, Lechevalier og Horan's metode, Can.

J. Microbiol. 19:965-972, 1973.

Resultater:

Mikroskopisk undersøgelse. Stammen X-14868 producerer et substrat-25 mycelium, som fragmenterer efter flere dage og tillader ekstensiv mycelial udvikling. Den producerer et luftmycelium, der består af snorelignende duske, men der er ikke fundet sporer.

Cellevægsanalyse. Cellevæggen indeholder mesoisomeren af diaminopimelinsyre samt galactose og arabinose (cellevægtype IV ifølge Le-30 chevalier et al.'s klassificering, Adv. Appl. Microbiol., 14, 47-72, 1971). Organismen synes at producere nocardomycolinsyrer. Disse

DK 165216B

4 morfologiske og kemiske kriterier henfører X-14868 til arten Nocar- * dia.

Makroskopisk undersøgelse. I tabel 1 er sammenfattet størrelsen af vakst, graden af sporedannelse, luftmassefarve, farve på bagsiden af 5 substratmyceliet og eventuel forekomst af opløseligt pigment, der er dannet af stammen X-14868, på forskellige faste medier efter 4 uger med inkubering ved 28°G.

Tabel I

Kulturkarakteristikum for Nocardia X-14868.

10 Agarmedium Størrelse af vækst Luftmyceliets Farven på bag og luftmycelium farvea) siden af sub stratmycelium3 Gær-maltek- moderat til rigelig b (oyster white) 2 ie (It. mus-15 strakt vækst; noget luft- tard tan) (ISP-2) mycelium i isolerede kanter, læderagtig vækst

Havremel moderat vækst; b (oyster white) 3 dc (natural) 20 (ISP-3) moderat luftmycelium

Uorganiske sparsom vækst; b (oyster white) 2 dc (natural, salte-sti- sparsomt luftmyce- string) velse (ISP-4) lium

Glycerol- ringe vækst; næsten b (oyster white) 2 ge (covert 25 asparagin intet luftmycelium; tan) (ISP-5) substratmycelium Gærek- rigelig vækst; spar b (oyster white) 3 ge (beige) strakt somt luftmycelium; læderagtig vækst 30 Glucose- moderat vækst; b (oyster white) i 3 ge (beige) gærek- sparsomt luftmyeeli- kanten strakt-pep um i kanten; læderton agtig vækst, brunt opløseligt pigment 35 Glucose-as moderat vækst; noget 2 dc (natural, string) 3 ge (beige) paragin luftmycelium; læder agtig vækst

Saccharose- sparsom vækst; mode b (oyster white) gennemsigtig nitrat rat luftmycelium c (It. gray) 40_______

DK 165216B

5 NB: Der blev ikke fundet sporer i luftmyceliet i nogen af medierne, da de blev undersøgt efter 4 ugers inkubering.

a) Det anvendte farveskema var Color Harmony Manual, 4. udgave, 1958 (Container Corporation of America, Chicago).

5 Fysiologiske egenskaber. Stammen X-14868 hydrolyserede gelatine og casein, men ikke stivelse. Kulturen var modstandsdygtig over for en 10 enheders penicillinplade samt 0,005% lysozym opløst i dyrknings -væske, når den blev testet ved Gordon's metode, J. Gen. Microbiol., 45, 355-364, 1966. Stammen peptoniserede lakmus-mælk fuldstændigt.

10 Der kunne ikke påvises melanindannelse på ISP 1, 6 eller 7.

I tabel II er angivet resultaterne af carbonudnyttelse på ISP 9

A

"Difco" af stammen X-14868 ved 28°C efter 1 måneds inkubering.

Tabel II

Carbonudnyttelse af stammen X-14868.

15 Carbonkilde Reaktion a

Intet carbon/kontrol D-Glucose ++ D-Xylose L-Arabinose 20 L-Khamnose D-Fructose ± D-Galactose +

Raffinose D-Mannitol 25 i-Inositol -

Salicin ±

Saccharose

Cellulose 30 a - - negativt respons; ± = tvivlsomt respons; + - mere vækst end på carbonkontrolprøven, men mindre end på glucose; ++ = positivt respons, der svarer til størrelsen af væksten på glucose.

*

DK 165216B

6 I tabel III gives en liste over diagnostisk vigtige, hovedsagelig metaboliske , egenskaber.

Tabel III

Egenskaber ved X-14868.

5 Test Resultat IS? 1, mørkning ISP 6, mørkning ISP 7, melanin

Caseinhydrolyse ++ 10 Gelatinehydrolyse ++

Stivelseshydrolyse

NaCl (%) tolerance 5%

Temperatur, ved hvilken der

observeres vækst 28 og 36°C

15 Bagsidepigment intet

Opløseligt pigment brunt på glucose/gærek- strakt-pepton

Penicillinfølsomhed (10 enheders plade)

Nitratreduktion - ++ 20 Gramfarve +

Syrefast farve

Catalase +

Diaminopimelinsyre meso-isomer

Cellevæg-sukkerarter galactose, arabinose, 25 ribose

Dannelse af nocardomycolinsyre +

Stammen X-14868 kan skelnes fra andre Nocardiaarter på basis af de i tabel IV anførte biokemiske karakteristika. Disse arter er blevet valgt af sammenligningsgrunde, idet de udgør den eneste gruppe inden 30 for slægten Nocardia, med hvilken X-14868 har nogen grad af phenoty-pisk affinitet.

DK 165216 B

7

Det fremgår af tabel IV, at meget få biokemiske data er tilgængelige for fire af arterne, nemlig N. transvalensis, N. formica, N. petrole-ophila og N. saturnea. Disse arter er imidlertid meget forskellige fra X-14868. N. transvalensis er blevet angivet at være meget lig N.

5 brasiliensis, som er medtaget i tabel IV. N. formica er muligvis forkert anbragt i slægten Nocardia og minder mere om slægten Strepto-• myces. N. petroleophila og N. saturnea er meget forskellige arter med lille affinitet til andre Nocardia spp. Medlemmer af disse to arter kan leve i et carbonfrit medium ved udnyttelse af atmosfærisk carbon-10 dioxid, og dette er ikke tilfældet ved de andre arter, herunder X-14868.

DK 165216B

8

Tabel IV

Sammenligning af stammen X-14868 med andre Nocardia arter.

E

3 i- tn O ς) ·*· tn c ci > ^ — 5 r- *3 ·** tn

U tn c 'O O -C

«sieco Eoc. *·· U iA SJ *w f— Cl f3 o CO rc*tz ^ Ό o U L, — Ο O — C^·— O > u /s j; t*· c4* ·*· ·*· ·>*· L» tn —· ·_ tj W O ··»’*” o m cj c Ξ — >» o i- rpco mwm o ·*-* o i- .«tib^ — ooofoooisco ^ o »o ra *-> **— u c. * c, ΰ, w ,ϋ t carbonudnyttelse

Glucose + + + + + +· + + + l-Arabinose L-Rhannose D-Fructose + + + + + + + ±

Galactose + +

Mannitol + -a + + +

Inositol +

Saccharose +

Maltose + + + + + +

Mannose + ++ + + + +*

Glycerol + + + + + +-

Lactose +

Paraffin + + + + - + + + +

Acetat + + + + + + +

Butyrat + + + + + + +

Mai at +++ ++ +

Propionat ++++ ++

Pyruvat + + + + + + +. +

Succinat .+++ ++ 4

Citrat + a.

Nitratreduktion +++-,-++---+ xanthinhydrolyse +-- + 4

Gelatinehydrolyse +- ++.----* ! 9

De i nærværende beskrivelse beskrevne arter Nocardia X-14868 omfatter alle stammer af Nocardia, som producerer antibiotiket X-14868A, og som ikke sikkert kan skelnes fra kulturen Nocardia X-14868 og dennes underkulturer, herunder mutanter og varianter. Forbindelsen X-14868A 5 er strukturelt identificeret i beskrivelsen, og efter at denne identifikation er kendt, er det let at skelne de stammer, der producerer den vækstfremmende virksomme forbindelse X-14868A fra andre stammer.

De farmaceutisk tolerable salte af forbindelsen X-14868A kan fremstilles på sædvanlig måde. Disse salte fremstilles ud fra den frie 10 syreform af forbindelsen ved metoder, som er velkendte på området, f.eks. ved vask af den frie syre i opløsning med en egnet base eller et egnet salt. Eksempler på sådanne farmaceutisk tolerable basiske stoffer, som kan danne salte til for den foreliggende opfindelses formål, omfatter alkalimetalbaser såsom natriumhydroxid, kaliumhy-15 droxid og lithiumhydroxid; jordalkalimetalbaser såsom calciumhydroxid og bariumhydroxid; samt ammoniumhydroxid. Alkalimetal- eller jordal-kalimetalsalte, der kan anvendes til dannelse af farmaceutisk tolerable salte, kan omfatte anioner såsom carbonater, hydrogencarbona-ter og sulfater.

20 Ved dyrkning under egnede betingelser producerer Nocardia X-14868 forbindelsen X-14868A. En fermentationsvæske, som indeholder Nocardia X-14868, fremstilles ved at pode sporer eller mycelium af den organisme, der producerer forbindelsen X-14868A, i et egnet medium og derefter dyrke dette under aerobe betingelser. Til produktion af 25 X-14868A er det muligt at dyrke på et fast medium, men til produktion af store mængder foretrækkes flydende medium. Dyrkningstemperaturen kan varieres inden for et vidt område, 20-35eC, inden for hvilket organismen kan vokse, men en temperatur på 26-30°C og en i det væsentlige neutral pH-værdi foretrækkes. Ved den submerse aerobe fer-30 mentering af organismen til produktion af X14868A kan mediet som carbonkilde indeholde en kommercielt tilgængelig glyceridolie eller et carbonhydrat såsom glycerol, glucose, maltose, lactose, dextrin eller stivelse, i ren eller rå tilstand, og som nitrogenkilde kan der anvendes et organisk materiale såsom sojabønnemel, destillations-35 remanenser, jordnøddemel, bomuldsfrømel, kødekstrakt, pepton, fiskemel, gærekstrakt eller majsstøbevand og, om ønsket, uorganiske nitro-

DK 165216B

10 genkilder såsom nitrater og ammoniumsalte. Mediet kan også indeholde mineralsalte såsom ammoniumsulfat, magnesiumsulfat, natriumchlorid, kaliumchlorid, kaliumphosphat eller calciumcarbonat, pufferstoffer såsom natriumcitrat eller -phosphat og spormængder af tungmetalsalte.

5 I beluftede submerse kulturteknikker anvendes der fortrinsvis et antiskummiddel såsom flydende paraffin, fede olier eller siliconefor-bindelser. Til produktion af forbindelsen X-14868A kan der anvendes mere end én type carbonkilde, nitrogenkilde eller antiskummiddel.

X-14868A har vist sig at have vækstfremmende virkning på drøvtyggere, 10 dvs. dyr med vomfunktion, f.eks. kvæg. En diskussion af den mekanisme, ved hvilken foder fordøjes, nedbrydes og metaboliseres af drøvtyggere, kan ses i USA patentskrift nr. 3.839.557, som omhandler anvendelsen af visse antibiotika til forbedring af foderudnyttelsen hos drøvtyggere, og hvortil der henvises. Økonomisk vigtige drøvtyg-15 gere omfatter kvæg, får og geder.

Effektiviteten af X-14868A til modificering af forholdet mellem flygtige fedtsyrer, som produceres i vommen (og således forbedrer drøvtyggerens foderudnyttelse), påvises ved hjælp af følgende test in vitro.

20 Vomvæske fås fra en stud, der er udstyret med en vom-fistula. Studen holdes på følgende .foder:

Majs: 89,93%

Alfalfamel: 5,000%

Sojabønneoliemel: 3,00% 25 Kalk: 0,80%

NaCl: 0,60%

Dicalciumphosphat: 0,50%

Spormineraler: 0,025%

Vitamin-præmix-tilsætning: 0,1% 30 Vitamin A, TIU: 4,0003

Vitamin D3, IU: 0,801 Vitamin E, TIU: 3,002.

DK 165216 B

11

Vomvæsken sies straks gennem en si. Til hver fermentering sættes 75 ml af den resulterende væske til en 250 ml kolbe, som har følgende bestanddele: 1 g af en blanding af fintformalet korn og hø i forholdet 80%: 20%; 5 1 ml af en 18%'s vandig glucoseopløsning (1 millimol/kolbe); 1,5 ml af en 3,1%'s vandig urinstofopløsning (0,76 millimol/kolbe); 60 mikromol af hver af de 10 essentielle aminosyrer (arginin, histi-din, leucin, methionin, threonin, valin, lysin, isoleucin, phenylala-nin og tryptophan); og 10 1 ml af en vandig opløsning af testmedikamentet, hvorved der fås enten 10 eller 25 pg/ml (beregnet på hele fermentationsblandingens rumfang på 80 ml).

Hver kolbe inkuberes ved 38°C under rystning i et vandbad, som er forsynet med gashætte. Carbondioxid ledes kontinuerligt gennem hæt-15 ten. Efter 4 timers inkubering centrifugeres 10 ml af fermentations-væsken ved 14.000 rpm (ca. 30.000 g) i 20 minutter. 3 ml af den overstående væske sættes til 1 ml af en 25%'s metaphosphorsyreopløs-ning, som indeholder 23 mikromol 2-methylvaleriatiesyre som intern standard. Den resulterende væske lades sætte sig ved stuetemperatur i 20 30 minutter. Væsken filtreres gennem et 0,22 millimikron "Millipore”- filter og afkøles, indtil der udføres gas-væskechromatografisk analyse for flygtige fedtsyrer.

Resultaterne af gas-væskechromatografisk analyse (GLC) på fire in vitro-kontrolfermentationer og to fermentationer, hvortil der er sat 25 henholdsvis 10 og 25 ppm X-14868A, fremgår af nedenstående tabel V.

DK 165216 B

12

Tabel V

Forholdet mellem mol propionat (C3) og acetat (C2) plus n-butyrat (11C4) i in vitro-vom-fermentationer 5 Flygtig fedtsyre VFA molforhold

Forbindelser Koncentration C^/(C^rnC^) X positiv kontrol

Negativ kontrol 0 0,203 51,8 X-14868A 5 ppm 0,323 82,5 10 50 ppm 0,358 91,2

Positiv kontrol (Monensin) 50 ppm 0,392 100,0

Som vist i tabel V forbedres forholdet mellem propionat (C3) og 15 acetat og n-butyrat signifikant. Ved forøgelse af propionater frem for acetater ud fra carbonhydraterne forøges effektiviteten af car-bonhydrat og dermed foderudnyttelsen.

Administration af forbindelse X-14868A forøger effektiviteten af foderudnyttelsen hos drøvtyggere, når det administreres oralt til 20 dyrene. Den letteste måde at administrere forbindelsen er at blande det i dyrets foder.

Forbindelsen kan imidlertid også med fordel administreres på andre måder. F.eks. kan det inkorporeres i tabletter, flydende former, boli eller kapsler og gives til dyrene. Formulering af forbindelsen til 25 sådanne dosisformer kan udføres ved metoder, som er velkendte inden for veterinærmedicinen.

Kapsler fremstilles let ved at fylde gelatinekapsler med en hvilken som helst ønsket form af den ønskede forbindelse. Om ønsket kan forbindelsen fortyndes med et inert pulverformet fortyndingsmiddel, 30 f.eks. sukker, stivelse eller renset krystallinsk cellulose, for at forøge dets volumen for at gøre kapselfyldningen lettere.

DK 165216B

13

Tabletter af forbindelsen fremstilles ved sædvanlige farmaceutiske processer. Foruden den aktive bestanddel indeholder en tablet normalt en base, en desintegrant, en absorbent, et bindemiddel og et smøremiddel. Typiske baser omfatter lactose, flormelis, natriumchlorid, 5 stivelse og mannitol. Stivelse er også en god desintegrant, ligesom algininsyre er det. Overfladeaktive midler såsom natriumlaurylsulfat og dioctylnatriumsulfosuccinat anvendes også undertiden. Almindeligt anvendte absorbenter omfatter også her stivelse og lactose, medens magnesiumcarbonat også kan anvendes til olieagtige stoffer. Hyppigt 10 anvendte bindemidler er gelatine, gummiarter, stivelse, dextrin og forskellige cellulosederivater. Blandt de almindeligt anvendte smøremidler er magnesiumstearat, talkum, paraffinvoks, forskellige metalliske sæber og polyethylenglycol.

Administrationen af forbindelsen kan foregå ved en langsomt opløselig 15 bolus. Sådanne boli fremstilles ligesom tabletter, bortset fra, at et middel, som forsinker opløsningen af forbindelsen, er inkorporeret.

Boli fremstilles til frigørelse over længere perioder. Den langsomme opløsning fremmes ved anvendelse af en meget vanduopløselig form af forbindelsen. Et stof såsom jernfilspåner tilsættes for at forøge 20 bolusens vægtfylde og for at holde den på plads i bunden af vommen.

Opløsning af forbindelsen forsinkes ved anvendelse af en matrix af uopløselige stoffer, i hvilken stoffet er indlejret. F.eks. kan der anvendes stoffer såsom vegetabilske voksarter, rensede mineralvoksarter og vanduopløselige polymerstoffer.

25 Flydende former af forbindelsen fremstilles lettest ved at vælge en vandopløselig form af forbindelsen. Hvis der af én eller anden grund ønskes en uopløselig form, kan der fremstilles en suspension. Alternativt kan en flydende form formuleres som en opløsning i et fysiologisk tolerabelt opløsningsmiddel såsom polyethylenglycol.

30 Suspensioner af uopløselige former af forbindelsen kan fremstilles i ikke-opløsningsmidler såsom vegetabilske olier, f.eks. jordnøddeolie, majsolie eller sesamolie, i en glycol såsom propylenglycol eller en polyethylenglycol; eller i vand, alt afhængig af den valgte forbindelses form.

DK 165216B

u

Egnede fysiologisk tolerable adjuvanser er nødvendige for at holde forbindelsen suspenderet. Adjuvanserne kan vælges blandt fortykkelsesmidler, f.eks. carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatine og alginater. Mange typer overfladeaktive midler kan anvendes 5 til at suspendere forbindelsen. F.eks. kan lecithin, alkylphenol/-polyethylenoxid-adduktionsprodukter, naphthalensulfonater, alkylben-zensulfonater og polyoxyethylensorbitanestere anvendes til fremstilling af suspensioner i flydende ikke-opløsningsmidler.

Der kan desuden tilsættes mange stoffer, som indvirker på hydrofili-10 teten, vægtfylden og væskens overfladespænding ved fremstillingen af suspensioner i individuelle tilfælde. F.eks. kan silicone-antiskum-midler, glycoler, sorbitol og sukkerarter være nyttige suspenderings-midler.

Den suspenderbare forbindelse kan tilbydes til brugeren som en su-15 spension eller som en tør blanding af forbindelsen og adjuvanser til fortynding før brug.

Forbindelsen kan også administreres i drøvtyggernes drikkevand. Inkorporering i drikkevandet udføres ved at sætte en vandopløselig eller vand-suspenderbar form af forbindelsen til vandet i en passende 20 mængde. Formulering af forbindelsen til tilsætning til drikkevandet følger de samme principper som formulering af flydende former.

Den mest praktiske måde at indgive dyr forbindelsen på er at inkorporere forbindelsen i foderet. Alle typer foder kan tilføres forbindelserne, herunder almindelige tørre foderstoffer, flydende foder-25 stoffer og pelletterede foderstoffer.

Formuleringen af drøvtyggerfoderstoffer, som skal indeholde passende mængder forbindelse er velkendt. Det er blot nødvendigt at beregne den mængde forbindelse, som ønskes administreret til hvert dyr, at indregne mængden af foder/dag, som dyret æder, og den koncentration 30 af forbindelsen, der er i den anvendte præmix, og at beregne den rigtige koncentration af forbindelsen eller af præmixen i foderet.

DK 165216B

15

Alle metoder til formulering, blanding og pellettering af foderstoffer, som normalt anvendes til drøvtyggerfoder, kan anvendes til fremstilling af foderstoffer, som indeholder forbindelsen.

Det er blevet vist, at oral administration af forbindelsen på for-5 delagtig måde ændrer dannelsen af propionater i forhold til dannelsen af acetater i vommen. Det kan derfor postuleres, at den samme behandling også vil være fordelagtig for en-mavede dyr, som fordøj er fibrøse vegetabilske materialer i cecum, da det må forventes, at en gunstig ændring i propionat/acetat-forholdet vil indtræde efter oral 10 administration af den pågældende forbindelse.

Heste, svin og kaniner er eksempler på dyr, som fordøj er en del af deres foder ved cecal fermentering.

IR-Absorptionsspektrum for forbindelsen I er vist på fig. 1.

I tabel VI er angivet fysiske konstanter for den komponent, der 15 produceres ved dyrkning af Nocardia X-14868.

Tabel VI

fysiske konstanter for X-14868A

Komponent Smp. [α]ρ. specifik *Mikroanalyse, fundet 20 PC drejning i XC %H XNa ZOMe chloro- meth- form anol X-14868A 193-195 +40,6° +23,8° 60,11 8,54 2,38 12,10 25 _______ *Mikroanalyse, beregnet Molvægt eC %H ZNa ZOMe X-14868A: 30 C47H79o17Na 939,25 60,10 8,50 2,45 13,22

DK 165216B

16

Opfindelsen belyses nærmere i nedenstående eksempler: EKSEMPEL 1

Fermentering af Nocardia X-14868 i rystekolbe

En kultur, som producerer X-14868A, dyrkes og holdes på en stivelse-5 casein-agarskråkultur med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Opløselig stivelse 10,0

Casein 1,0 K2HP04 0,5 10 Vandfrit MgS04 0,5

Agar 20,0 pH-Værdien indstilles på 7,4 med natriumhydroxid før autoklavering ved 1 atmosfæres tryk i 20 minutter.

Skråkulturen podes med Nocardia X-14868-kultur og inkuberes ved 28°C 15 i 7-14 dage. Et stykke myceliumholdig agar fra den velvoksede agar-skråkultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml steriliseret podningsmedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Tomatpresserester 5,0 20 Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Majsstivelse 20,0

Calciumcarbonat 1,0 25 K2HP04 1,0 pH-Værdien indstilles på 7,0 med natriumhydroxid før sterilisation.

Det podede podningsmedium inkuberes ved 28eC i 72 timer i et med 250 rpm roterende rysteapparat.

DK 165216B

17

En 3 ml's portion (3 v/v%) af den resulterende kultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml steriliseret produktionsmedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand): 5 Glycerol 40,0

Pepton 5,0

Cerelose 2,0

Kartoffelstivelse 2,0

Affedtet sojagrit 5,0 10 Afbitret tørret gær 5,0

Natriumchlorid 5,0

Calciumcarbonat 0,2 pH-Værdien indstilles på 6,4 før autoklavering

Det podede medium inkuberes ved 28°C i 5 dage i et rysteapparat med 15 250 rpm. Styrken af X-14868A i fermentationsvæsken bedømmes ved forsøg mod Staphylococcus aureus ATCC 6538P under anvendelse af en agardiffusions-hulpladeteknik.

EKSEMPEL 2

Isolering af X-14868A-natriumsalt og X-14868B-natriumsalt fra en 20 rystekolbefermentation:

Trin A: Hele væsken fremstillet, som beskrevet i eksempel 1, fra 50 halv-liters Erlenmeyerkolber hver indeholdende 100 ml, efter 5 dages fermentering sammenhældes (5 liter) og ekstraheres to gange med et halvt rumfang ethylacetat. Efter omrøring i ± time fraskilles opløs-25 ningsmiddelfasen og inddampes til en olie (4 g) under reduceret tryk.

Olien opløses i diethylether og chromatograferes på en ved diethylet-heropslæmning pakket kolonne med 200 g silicagel. Kolonnen elueres med en gradient mellem 2 liter diethylether og 2 liter diethylether/-acetone (9:1) og derefter 2 liter diethylether/acetone (1:1) og 30 endelig 2 liter methylenchlorid/ethylalkohol (7:3). Fraktioner på hver 40 ml opsamles, og fraktion nr. 18-75 sammenhældes, opløsnings-

DK 165216 B

18 midlet fjernes under reduceret tryk, og den således vundne remanens (1,66 g) opløses i ethylacetat og vaskes to gange med et lige så stort rumfang IN HCl, hvorefter der vaskes to gange med et lige så stort rumfang af en ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløs-5 ning. Opløsningsmiddelfasen tørres over natriumsulfat og ved tilsætning af n-hexan fås X-14868A-natriumsalt-krystaller. Ved omkrystallisation af ethylacetat/n-hexan fås en analyseren prøve af X-14868A-natriumsalt, smeltepunkt 193 -194°C. Trin B: Fra fraktion nr. 161-215 fås, efter at opløsningsmidlet er fjernet under reduceret 10 tryk, og remanensen er optaget i ethylacetat og vasket med IN HCl efterfulgt af ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløsning og tørring over natriumsulfat og påfølgende tilsætning af n-hexan, X-14868B-natriumsalt-krystaller, smeltepunkt 172,5-174°C.

EKSEMPEL 3 15 Tankfermentering af Nocardia X-14868.

En kultur af Nocardia X-14868, som producerer X-14868A, dyrkes og holdes på en stivelse-casein-agarskråkultur med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Opløselig stivelse 10,0 20 Casein 1,0 K2HP04 0,5

Vandfrit magnesiumsulfat 0,5

Agar 20,0 pH-Værdien indstilles til 7,4 med natriumhydroxid før autoklavering.

25 Skråkulturen podes med en kultur af Nocardia X-14868 og inkuberes ved 28°C i 7-14 dage. Et stykke agar med mycelium fra den velvoksede agar-skråkultur anvendes derefter til fremstilling af et vegetativt inokulum ved podning af en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholer 100 ml inokulummedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret 30 vand):

DK 165216B

19

Tomatpresseremanens 5,0

Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0 5 Majsstivelse 20,0

Calciumcarbonat 1,0 K2HP04 1,0 pH-Værdien indstilles på 7,0 før autoklavering.

Det podede medium inkuberes i 72 timer ved 28°C i et med 250 rpm 10 roterende rysteapparatur.

60 ml (3 v/v%) af denne kulturvæske anvendes til podning af en 6 liters Erlenmeyerkolbe, som indeholder 2 liter inokulummedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Tomatpresseremanens 5,0 15 Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Majsstivelse 20,0

Calciumcarbonat 1,0 20 K2HP04 1,0 pH-Værdien indstilles på 7,0 før autoklavering.

Det podede medium inkuberes i 72 timer ved 28°C i et med 250 rpm roterende rysteapparatur.

4 liter af denne kultur anvendes til at pode 230 liter af nedenståen-25 de produktionsmedium i en 380 liters fermenteringsbeholder (g/liter ledningsvand):

Glycerol 40,0

Pepton 5,0

Cerelose 2,0 30 Kartoffelstivelse 2,0

DK 165216B

20

Affedtet sojagrit 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Natriumchlorid 5,0

Calciumcarbonat 0,2 5 Antiskummiddel 0,1 pH-Værdien i mediet indstilles på 6,4 før sterilisering i 1,25 time med 4,2 kg/cm^ damp.

Det podede medium beluftes med komprimeret luft i en mængde på 90 liter/minut og omrøres med omrørere med 280 rpm. Fermenteringen 10 udføres ved 28°C i 5 dage.

Styrken af X-14868A i fermentationsvæsken bedømmes ved forsøg mod Staphylococcus aureus ATCC 6538P under anvendelse af agardiffusions-hulpladetest.

EKSEMPEL 4 15 Isolering af X-14868A fra tankfermentation af Nocardia X-14868.

Trin A: Til hele væsken fra en 230 liters fermentation som beskrevet i eksempel 3 sættes efter 115 timers vækst et lige så stort rumfang ethylacetat. Efter omrøring i 1 time fraskilles opløsningsmiddelfasen, og den inddampes til 4,2 liter under reduceret tryk. Den kon- * 20 centrerede opløsningsmiddelekstrakt vaskes to gange med et lige så stort rumfang IN HC1 og derefter to gange med et lige så stort rumfang af ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløsning. Opløsningsmiddelfasen tørres over natriumsulfat og inddampes under reduceret tryk til en olien. Olien opløses i n-hexan og ekstraheres én 25 gang med acetonitril og derefter to gange med acetonitril/methanol i forholdet 8:2. Acetonitril- og acetonitril/methanol (8:2)-ekstrakterne sammenhældes, og opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk.

Den resulterende olie opløses i diethylether, behandles med aktivkul og filtreres, og ved tilsætning af n-hexan fås rå X-14868A-natrium-30 salt-krystaller. De rå krystaller opløses i methylenchlorid og underkastes chromatografi på en ved methylenchloridopslæmning pakket

DK 165216 B

21 kolonne med 600 g silicagel. Kolonnen elueres med 4 liter diethylet-her/acetone/ammoniakvand i forholdet 8:2:0,02. Fraktioner på hver 45 ml opsamles, og fraktion nr. 13-15 sammenhældes. Opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, og remanensen opløses i ethylacetat og 5 vaskes først to gange med lft HC1 og derefter to gange med ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløsning og tørres over natriumsulfat. Ethylacetatfasen inddampes til en olie, som opløses i methy-lenchlorid, og ved tilsætning af n-hexan fås krystallinsk X-14868A-natriumsalt, smeltepunkt 193-195°C.

10 Trin B: Moderluden fra de rå X-14868A-natriumsalt-krystaller (beskrevet ovenfor i trin A) chromatograferes på en ved methylenchlori-dopslæmning pakket kolonne med 1 kg silicagel. Kolonnen elueres med 1 liter n-hexan og derefter med en graduent mellem 4 liter diethylet-her/n-hexan (7:3) og 4 liter diethylether/acetone (8:2). Fraktioner 15 på hver 40 ml opsamles, og fraktion nr. 43-80 sammenhældes. Opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, og remanensen opløses i ethylacetat og vaskes med IN HC1 efterfulgt af ved stuetemperatur mættet vandig natriumcarbonatopløsning, og der behandles med aktivkul. Efter filtrering inddampes ethylacetatfasen til en olie. Olien 20 opløses i·diethylether, og ved tilsætning af n-hexan fås yderligere X-14868A-natriumsalt, smeltepunkt 193 -195eC.

Trin C: Fraktion nr. 22-40 fra den i trin A beskrevne silicagelkolon-ne giver krystallinsk X-14868C-natriumsalt, smeltepunkt 172-175°C.

EKSEMPEL 5 25 Fremstilling af thalliumsaltet af X-14868A.

En opløsning af 51 mg af X-14868A-natriumsalt opnået ifølge eksempel 2 i methylenchlorid vaskes med IN HC1 og derefter med vand og derefter fire gange med en vandig opløsning af thalliumcarbonat. Opløsningsmidlet fraskilles og inddampes til et lille rumfang under 30 reduceret tryk, og efter tilsætning af n-hexan fås krystallinsk thalliumsalt af X-14868A. Ved omkrystallisation af diethylether/n-hexan fås krystaller, der er egnede til røntgenanalyse.

DK 165216 B

22 EKSEMPEL 6

Fremstilling af calciumsaltet af X-14868A.

En opløsning af 200 mg af X-14868A-natriumsalt opnået ifølge eksempel 2 i ethylacetat vaskes først med IN HCl og derefter tre gange med ved 5 stuetemperatur måttet vandig calciumhydroxidopløsning. Opløsningsmidlet fraskilles og fjernes under reduceret tryk. Calciumsaltet af X-14868A isoleres som et hvidt fast skum.

EKSEMPEL 7

Rystekolbefermentering af Nocardia X14868.

10 En kultur, som producerer X-14868A, dyrkes og holdes på en stivelse-casein-agarskråkultur med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Opløselig stivelse 10,0

Casein 1,0 15 K2HP04 0,5

Vandfrit magnesiumsulfat 0,5

Agar 20,0 pH-Værdien indstilles på 7,4 med natriumhydroxid før autoklavering ved 1 atmosfæres tryk i 20 minutter. · 20 Skråkulturen podes med Nocardia X-14868-kultur og inkuberes ved 28°C i 7-14 dage. Et stykke myceliumholdig agar fra den velvoksede agar-skråkultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml steriliseret podningsmedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand): 25 Tomatpresserester 5,0

Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Claims

5 Det podede podningsmedium inkuberes ved 28®C i 72 timer i et med 250 rpm roterende rysteapparat. En 3 ml's portion (3 v/v%) portion af den resulterende kultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml steriliseret produktionsmedium med følgende sammensætning 10 (g/liter destilleret vand): Cerelose 45,0 Stivelse 20,0 Sojabønnemel 15,0 Caseinhydrolysat (syre) 1,0 15 "Black strap"-melasse 3,0 Calciumcarbonat 2,5 Ledningsvand ad 1 liter pH-værdi 7,1 Det podede medium inkuberes ved 28°C i 7 dage i et med 250 rpm ro-20 terende rysteapparat. Styrken af forbindelsen X-14868A i fermentationsvæsken bedømmes ved forsøg mod Staphylococcus aureus ATCC 6538P under anvendelse af agardiffusions-hulpladetest.

1. Vækstfremmende middel til drøvtyggere, 25 kendetegnet ved, at det indeholder en forbindelse med formlen I DK 165216 B 24 OMe A>OMe OMe oh Me a JL m Me» JMe ^ Y jBsfj I/—\ /—Λ J-Λ J sn^^vA"n^o 4,IMe I OH H 4 H = = Η Ό Η H OH C02H Me ne n .

2. Fremgangsmåde til fremstilling af præmixer eller præparater til 5 middelbar konsumtion som vækstfremmende midler til drøvtyggere, kendetegnet ved, at der inkorporeres en forbindelse med formlen I OMe Λ^ΟΜβ .L· J«'»nMe OMe OH =^0 ΓΙη0'lYt0^1·τΜε COjH Me M_e B Me H HH OH et præparat, som er uskadeligt for dyret, fortrinsvis i dyrets 10 foder.