DK165958B - Fremgangsmaade til isolering af htlv-iii proteiner, serologisk detektering af antistoffer til htlv-iii i serum fra aids- og prae-aids-patienter og detektering af htlv-iii infektioner ved immunoassays samt testsystem til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents
Fremgangsmaade til isolering af htlv-iii proteiner, serologisk detektering af antistoffer til htlv-iii i serum fra aids- og prae-aids-patienter og detektering af htlv-iii infektioner ved immunoassays samt testsystem til brug ved fremgangsmaaden Download PDFInfo
- Publication number
- DK165958B DK165958B DK602285A DK602285A DK165958B DK 165958 B DK165958 B DK 165958B DK 602285 A DK602285 A DK 602285A DK 602285 A DK602285 A DK 602285A DK 165958 B DK165958 B DK 165958B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- htlv
- iii
- virus
- antibodies
- test system
- Prior art date
Links
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 62
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 55
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 title 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 title 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 91
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 90
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 77
- 101710147327 Calcineurin B homologous protein 1 Proteins 0.000 claims description 47
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 claims description 47
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 claims description 47
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 claims description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 31
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 29
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 28
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 18
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 18
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 101710113614 DNA primase small subunit PriS Proteins 0.000 claims description 16
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 15
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 15
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 11
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 11
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 11
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 10
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 7
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 6
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 claims description 2
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 claims 15
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 41
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 abstract description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012532 cell-free culture fluid Substances 0.000 abstract 1
- 102100031987 Transmembrane emp24 domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 37
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 32
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 31
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 26
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 19
- 108010027044 HIV Core Protein p24 Proteins 0.000 description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101900058344 Human T-cell leukemia virus 1 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101500005065 Human T-cell leukemia virus 2 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 3
- 241000713821 Mason-Pfizer monkey virus Species 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 2
- GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N Heroin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)OC(C)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4OC(C)=O GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000713820 Squirrel monkey retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 229960002069 diamorphine Drugs 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 201000006747 infectious mononucleosis Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007992 BES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000713310 Human T-cell lymphotropic virus type 4 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100036760 Transmembrane emp24 domain-containing protein 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000007373 indentation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002496 iodine Chemical class 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229920006298 saran Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
DK 165958B
i
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til påvisning af antistoffer i serum fra AIDS- og præ-AIDS-patienter samt til biokemisk og immunologisk analysering af HTLV-III virus og dettes antigener. Opfindelsen angår 5 desuden et testsystem til brug ved fremgangsmåden.
En familie af T-lymphotrope retrovirus-typer fremkalder leukæmi på basis af T-celle-formering, udtynding af T-celler og immunosuppression hos mennesker, som inficeres 10 af disse virustyper. Disse retrovirus-typer kendes som HTLV-familien af T4-trope retrovirus-typer. Undergruppen HTLV-l fremkalder T-celleformering og leukæmi. Undergruppen HTLV-II inducerer T-celle-formeringen in vitro, men dens rolle i forbindelse med sygdomme er uklar. En tredje 15 gruppe af beslægtet virus, som kollektivt betegnes HTLV-III, er nu blevet isoleret fra dyrkede celler fra patienter med erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS). De biologiske egenskaber af HTLV-III og immunologiske analyser af dets proteiner viser, at dette virus er medlem af HTLV-20 familien. Serumprøver fra næsten 100% af AIDS-patienterne og fra næsten 90% af de homoseksuelle mænd med præ-AIDS , men fra under 1% af de heteroseksuelle donorer, indeholder antistoffer, som er reaktive overfor antigener til HTLV-III. Størstedelen af immun-reaktiviteten synes at 25 være rettet imod p24, som er et protein med en molekylvægt på 24000, der menes at være et kerne-antigen, og imod p41, som er et protein med en molekylvægt på 41000, der menes at være et kappe-antigen til dette virus.
30 Erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS) er en sygdom, som kun har været kendt i relativt kort tid, men som er udbredt i flere dele af verden. Dens voldsomme udbredelse blandt homoseksuelle mænd med mange seksualpartnere, blandt stiknarkomaner og blødere, blandt modtagere af 35 blodtransfusioner og blandt mennesker med nær heteroseksuel kontakt med personer fra disse risikogrupper er et tydeligt tegn på, at sygdommen spredes ved overførsel af
DK 165958 B
2 et inficerende stof. De primære mål for sygdommens angreb på menneskelegemet er specifikke underpopulationer af T-celler. Den svære immundefekt hos disse patienter skyldes et usædvanligt indhold af T-hjælpeceller (T4) i lympho-5 cyt-populationen, hvilket reducerer tilgængeligheden af mange T4-hjælpefunktioner, blandt hvilke kan nævnes B-cellernes produktion af antistoffer.
Retrovirus-infektioner vides at føre til nedsatte immun-10 funktioner i animalske systemer. Ved at analogisere den humane respons med disse ikke-humane systemer fandt man, at et humant retrovirus med en tropisme for T-celler måtte betragtes som en mulig kandidat i ætiologien af AIDS hos mennesker. Som nævnt ovenfor har man isoleret adskil-15 lige medlemmer af en familie af humane T-lymphotrope retrovirus -typer (HTLV). Et af disse isolater opnåedes fra en sort amerikaner med en aggressiv form for T-celle-lymphoma. Dette virus, som blev betegnet HTLV-I, er blevet ætiologisk knyttet til patogenesen af T-celle-leu-20 kæmi/lymphoma hos voksne (ATLL). En infektion med HTLV-I in vitro kan ændre T-cellefunktionen, og i visse tilfælde kan en sådan infektion føre til T-cellernes død. Et andet medlem af HTLV-familien blev isoleret fra en patient med en T-celle-variant af hårcelleleukæmi, og dette medlem 25 blev betegnet HTLV-II. Det er rapporteret, at HTLV-I og HTLV-II er blevet isoleret fra dyrkede T-celler fra patienter med AIDS. Det er endvidere rapporteret, at man har isoleret et andet retrovirus fra en homoseksuel patient med kronisk generaliseret lymphadenopati, som er et 30 syndrom, som ofte går forud for AIDS, og som derfor benævnes "præ-AIDS". Pro-viralt DNA fra HTLV-I er blevet påvist i det cellulære DNA hos to AIDS-patienter, og serum fra visse patienter viste sig at reagere med antigener til HTLV-I. Den indbyrdes sammenhæng imellem AIDS og 35 serum-antistoffer til HTLV-I protein er svag.
DK 165958 B
3 EP offentliggørelsesskrift nr. 138 667 beskriver midler og metoder til diagnosticering af lymphadenopati og erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS). Skriftet omtaler eksistensen og anvendelsen af et virus og af lysater her-5 af samt kerne-antigener til dette virus. Det fremgår imidlertid af skriftet, at det pågældende virus er ikke-reaktive i forhold til p24-kerneproteinerne af HTLV-I, og at det inkluderer p25-proteiner, som ikke genkendes af HTLV-p24 antiserum.
10
Den foreliggende opfindelse viser, at den primære årsag til syndromet er en human T-lymphotrop retrovirus-variant med begrænset tilbøjelighed til krydsreaktivitet med de kendte HTLV-undergrupper. Disse nye varianter betegnes 15 HTLV-III. Opfindelsen angår også anvendelsen af dette virus i en immunologisk screening af serumprøver fra patienter med AIDS eller præ-AlDS eller fra personer med en forøget risiko for at få AIDS.
20 HTLV-III blev oprenset fra supernatanter af cellekulturer, som understøtter den kontinuerlige produktion af disse cytopatiske virustyper. Disse HTLV-varianter (HTLV- III) mangler de vedvarende (transformerende) egenskaber, som kendetegner normale T-celler, og de udviser først og 25 fremmest cytopatiske virkninger på T-celle-hjælpefunk-tionen. Man overvandt den cytopatiske effekt ved at finde en meget tilgængelig og modtagelig celle for de cytopatiske varianter af HTLV, hvorved man bevarede kapaciteten med hensyn til permanent vækst efter virusinfektionen.
30 Disse cellekulturer muliggør en kontinuerlig produktion af HTLV-III virus.
Det har vist sig, at de antigener, som er forbundet med den infektion af humane celler, som skyldes HTLV-III vi-35 rus, specifikt genkendes af antistoffer fra AIDS-patien-ter. Nærmere bestemt reagerer HTLV-III, som er isoleret fra AIDS-patienter og transmitteret ved co-dyrkning med
DK 165958 B
4 en HT-cellelinie, eller dettes antigener specifikt med antistoffer fra serum udtaget fra AIDS-patienter. En påvisning af tilstedeværelsen af antistoffer eller antigener kan, om ønsket, foretages ved hjælp af denne reak-5 tion. En sådan analyse er meget nyttig til overvågning af HTLV-III virusinficerede celler og generelt til overvågning af kulturer, som indeholder dette virus, således at man kan sikre sig, at de faktisk producerer dette virus, ligesom man kan påvise AIDS-antistoffer i patienternes 10 serum. Hvis der findes en ikke-identificeret kultur, frembyder disse antigener en metode til at fastslå, hvorvidt denne kultur indeholder virustypen HTLV-III. Man kan foretage et konkurrerende radioimmuno-assay for disse antigener ved at anvende de rensede HTLV-III-antigener.
15 Hvis dyrkningsmaterialet på konkurrerende måde deltager i analysen, betyder dette, at kulturen indeholder det tilsvarende protein. Hvis kulturen indeholder proteinet, indeholder den tillige det nævnte virus, eftersom den uden tilstedeværelse af dette virus ikke kan indeholde 20 proteinet. De foretrukne detekteringsmetoder omfatter radioimmunoassay (RIA), ELISA (et enzym-bundet immuno-absorbent-assay) og ELIA (en indirekte immunofluorescens-analyse) såvel som "Western Blot" og "Western Dot" teknikker. Antigenerne p24 og p41 er særligt foretrukne, 25 idet p24-antigenet er et principalt kerne-protein i det nævnte virus, mens p41-antigenet er et principalt kappeantigen i det nævnte virus.
Med den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt en 30 fremgangsmåde til detektering af et lymphotropt retrovirus betegnet HTLV-III virus, som er normalt cytopatisk over for sit foretrukne mål, T^ hjælpeceller, som har en densitet på 1,16 g/ml bestemt ved en densitetsgradient i en saccharoseopløsning, som har et principalt kerne-anti-35 gen p24 med en molekylvægt på 24000 og et principalt kappe-antigen p41 med en molekylvægt på 41000, og som kun udviser begrænset krydsreaktivitet med alle andre kendte ' 5
DK 16595ο D
HTLV-undergrupper, eller rekombinant-fraktioner af HTLV-III virus, antistoffer til HTLV-III virus eller HTLV-III virus-antigener i en prøve. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at prøven underkastes en kon-5 kurrerende immunoassay-diskriminationsprocedure og/eller en Western Blot assay-procedure, hvilken procedure gør brug af andre HTLV III antigener end de i EP offentliggørelsesskrift nr. 138 667 beskrevne antigener eller antistoffer hertil, hvilke andre antigener er opnået ud 10 fra en uforgængelig cellekultur og/eller uafhængigt opnåede antistoffer til HTLV III, idet der ved uafhængigt opnåede antistoffer skal forstås antistoffer, der ikke cirkulerer frit i blod og derfor ikke er naturligt til stede i den prøve, der skal testes for tilstedeværende 15 virus.
Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til tegningen, hvor 20 fig. 1 viser identifikationen af HTLV-III antigener ved hjælp af serumprøver fra patienter i overensstemmelse med proceduren fra eksempel 2, fig. 2 viser de protein-bånd, som frembringes ved reak-25 tion med hyper immun-serum fra kaniner overfor HTLV-I, HTLV-II og HTLV-III, fig. 3 viser SDS polyacrylamid-gelprofilen af en prøve 125 mærket med I, 30 125 fig. 4 viser resultaterne af immunoprecipitation af I-mærket p24 fra HTLV-III med serum fra patienter med AIDS eller under AIDS-beslægtede betingelser, 35 fig· 5A viser den totale konkurrence imellem udfældning af mærket p24 og udfældning af ikke-mærket HTLV-III-eks-trakt og
DK 165958 B
6 fig. 5B viser to cellekloner inficeret med HTLV-III (H4/HTLV-III og H9/HTLV-III), som blokerede immuno-preci-pitationen af HTLV-III p24, og figuren viser også, at tilsvarende ikke-inficerede celler var fuldstændigt uden 5 virkning.
En cellelinie, som har relation til den foreliggende opfindelse, og som benævnes H9/HTLV-IIIB, er blevet deponeret hos the American Type Culture Collection (ATCC, 12301 10 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, USA) under ATCC nummeret CRL 8543 den 19. april 1984. H9 er en repræsentativ og foretrukken klonet cellelinie i overensstemmelse med opfindelsen. En yderligere deponering af Molt 3/HTLV-IIIg blev foretaget hos ATCC den 15. august 15 1984 under ATCC nummeret CRL 8602. Disse deponeringer sikrer, at materialerne er permanent til stede og tilgængelige for offentligheden.
Lysater af uforgængelige humane T-cellekloner såsom H9, 20 hvortil HTLV-III var blevet overført ved co-dyrkning med lymphocytter fra AIDS (betegnet H9/HTLV-IIIB), blev testet med humant serum i et strip-radioimmunoassay (RIA) baseret på "Western Blot" teknikken. De serumprøver, som anvendtes ved analysen, blev også testet ved ELISA med 25 renset HTLV-III. Serumprøver fra patienter med AIDS og fra et antal homoseksuelle personer og heroin-misbrugere genkendte et antal specifikke antigener, som ikke lod sig påvise på nogen anden måde. Det kan i korte træk anføres, at de antigener, som er knyttet til HTLV-III virus produ-30 ceret af HT-celler, tillader en påvisning af antistoffer i serum fra AIDS- og præ-AIDS-patienter. HTLV-III virus og dettes antigener gør det ligeledes muligt at påvise AIDS og præ-AIDS i andre prøver af humant serum, såsom donorblod.
35
En DNA-fusion har ligeledes ført til den konklusion, at der findes mindst to nøje afgrænsede fraktioner af HTLV-
DK 165958B
7 III, nemlig HTLV-IIIA og HTLV-IIIB, som især egner sig til anvendelse ved den omhandlede fremgangsmåde, der gør brug af et testsystem. Desuden har man fremstillet rekom-binant-fraktioner af HTLV-III. Disse nære derivater af 5 HTLV-III omfattes også af den foreliggende opfindelse.
Den fremtrædende immun-reaktivitet eller specificitet er rettet imod p41, som er et protein med en molekylvægt på 41000, og som er et kappe-antigen til HTLV-III virus, og 10 imod p24, der er et protein med en molekylvægt på 24000, og som er et kerne-antigen til HTLV-III virus. Antigenet p24 kaldes en p30-horaolog, fordi proteinets molekylvægt i de fleste virustyper er omkring 30000. I bovint leukæmivirus og i virus hørende til HTLV-serien er proteinets 15 molekylvægt omkring 24000 (når man tester proteiner med henblik på at eftervise et indbyrdes forhold på basis af aminosyresekvenser, er homologi-begrebet vigtigt. Når man har bestemt to proteiners aminosyresekvenser og anbragt disse ved siden af hinanden, siger man, at de to protein-20 er udviser homologi, hvis de samme aminosyrer forekommer i samme positioner i begge proteiner). Serumprøver fra patienter med AIDS, fra visse homoseksuelle personer og fra heroin-misbrugere genkender også et antal andre specifikke antigener, som ikke påvises i normalt serum. Dis-25 se antigener har omtrentlige molekylvægte på 65000 (p65), 60000 (p60) og 55000 (p55). Selv om også andre antigener blev påvist, var disse de mest signifikante. Det efterfølgende eksempel 4 giver en illustration af specificiteten af disse reaktioner.
30
Det omtalte HTLV-III virus kan oprenses fra en uren kilde for dette virus, såsom en vævskulturvæske, på følgende måde: Viruset koncentreres og renses ved saccharosedensi-tetsbinding, en procedure beskrevet i J. of Virology, 35 38:906-915, juni 1981. Det enkelte virus har en karakte ristisk densitet. Således har retrovirus af type C, hvor- 3 til HTLV-III hører, en densitet på 1,16 g/cm i en sac-
DK 165958B
8 charoseopløsning (virus-fraktionen kan lokaliseres ved at analysere prøver af hver fraktion for HTLV-III-specifik revers transcriptase-aktivitet). Cellerne fjernes fra dyrkningsmediet, hvorved der opnås et klart medium. Dette 5 medium centrifugeres i en centrifuge med kontinuerlig gennemstrømning, og efterhånden som mediet belastes som følge af rotationen, vil partiklerne inden i prøven bevæge sig imod rotorens periferi igennem en saccharose-gradient på mellem 20 og 60% med en densitet i området 3 10 fra 1,08 til 1,29 g/cm . Disse partikler bevæger sig imod periferien, indtil de når det punkt i saccharose-gradien-ten, hvor de finder deres egen densitet i omgivelserne (omkring 36 - 38% saccharose, som har den samme densitet på omkring 1,16). Partiklerne kan derefter ikke komme 15 længere. Når hele det klarede dyrkningsmedium er passeret igennem rotoren, vil alle partiklerne have samlet sig i dette punkt (bånd). Centrifugeringen fortsættes, således at viruset opnår en ligevægt, hvorved partiklerne ikke bevæger sig yderligere. Fraktionerne opsamles ved at pum-20 pe indholdet ud af rotoren og opsamle fraktioner med forskellige densiteter. På denne måde opnås en rensning af viruset. Der findes ingen celler i den fraktion, der har en massefylde på 1,16, fordi cellerne fjernes til at begynde med, og de celler, som måtte have undgået den be-25 gyndende fjernelse, bevæger sig længere ned i saccharose-gradienten, eftersom de er tungere end viruspartiklerne.
Der sker kun en ringe kontaminering med frie proteiner fra dyrkningsmediet, fordi disse er lettere. Det bundne 3 materiale i densitetsområdet fra 1,15 til 1,18 g/cm , op-30 samles og benyttes i eksperimentet.
For at opnå kerne-proteinet p24 tilsætter man ikke-ioniske detergenter, såsom' NP40, Triton® X100 eller Tween® 20, og salt (natriumchlorid). Denne kombination er 35 vigtig, fordi detergenten nedbryder kappen, som også indeholder lipider. Detergenterne bevirker en emulgering af lipiderne og fjerner disse fra strukturen. Derved bli- '
DK 165958B
9 ver viruspartiklerne tilgængelige for natriumchloridet.
De ioniske omgivelser, som skyldes tilsætningen af natriumchlorid, vil destruere den indbyrdes vekselvirkning mellem proteinerne, herunder kerne-proteinerne, og 5 nucleinsyren i kernen. Der opnås således en suspension af nucleinsyrer og frie proteiner, når viruset behandles med detergent og salt. Mediets ionstyrke sænkes ikke, før nu-cleinsyrerne fjernes, fordi disse vil kunne rekombinere under dannelse af et kompleks. Derfor reduceres salt-10 koncentrationen forsigtigt til 0,3 M, hvorefter mediet ledes igennem en kolonne indeholdende en ionbytter-harpiks, nærmere bestemt diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellulose), som er en kationisk matrix. Den er positivt ladet, således at den vil binde negative lad-15 ninger. Virus-ekstrakten ledes igennem DEAE-cellulose-ko-lonnen ved en saltkoncentration på omkring 0,3 M, som er tilstrækkelig til at holde nucleinsyrerne og proteinerne adskilt. Ved passage igennem kolonnen opsamler DEAE-cellulosen nucleinsyrerne, hvorved proteinerne kan for-20 lade kolonnen på ikke-bundet form.
Efter at nucleinsyrerne er blevet fjernet ved hjælp af DEAE-cellulosen, dialyseres proteinopløsningen imod en puffer. Man indstiller pH til omkring 6,5, hvorefter man 25 foretager en chromatografering på phosphorcellulose. Proteinet binder sig til kolonnen og fortyndes med en saltgradient. Forskellige proteiner vil blive elueret ved forskellige saltkoncentrationer. Proteinet p24 bliver således elueret ved koncentrationer på mellem 0,25 og 0,35 30 M natriumchlorid. Alternativt kan man foretage rensningen ved højtryksvæskechromatografi (HPLC).
Sammenfattende består processen til rensning og udvinding af det virale p24-antigen til HTLV af de følgende trin; 35 1) fjernelse af cellerne fra vævsdyrkningsmediet,
DK 165958 B
10 2) koncentrering og rensning af det urene virus ved sac-charosedens i tetsbinding, 3) tilsætning af en ikke-ionisk detergent, såsom Triton® 5 X100, og natriumchlorid til frigørelse af nucleinsyrerne og proteinerne i viruset og 4) chromatografering på DEAE-cellulose (positiv) efterfulgt af chromatografering på phosphorcellulose (cel- 10 lulosephosphat-harpiks).
Radioimmunioanalyseteknikker til påvisning af antistoffer omfatter radio-mærkede prøver af den såkaldte "blotteknik", såsom Western Blot ·teknikken eksemplificeret i 15 det nedenstående eksempel 2.
Til påvisning af antistoffer kan man også med fordel anvende det enzym-bundne immunosorbent-assay (ELISA) (se eksempel 1). Princippet i ELISA-prøven består i en reak-20 tion imellem specifikke antistoffer i serum fra AIDS-patienter og antigener til HTLV-III (som fortrinsvis på forhånd er bundet til overfladen af en skål med et antal fordybninger) og en efterfølgende reaktion imellem det således dannede immun-kompleks (fortrinsvis på skålens 25 overflade) og et sekundært antistof, som kan reagere med humane immunoglobuliner. Det sekundære antistof bindes ved hjælp af et passende enzym, som giver et farvet opløseligt produkt, når det inkuberes med et egnet substrat. Intensiteten af den opnåede farve er et mål for 30 indholdet af antistof i patientens serum, og den måles ved hjælp af en ELISA pladeaflæser.
Komponenterne i ELISA-testsystemet er følgende: 35 1) mikrotiter-plader belagt med HTLV-III lysat og behand let med proteinopløsninger for at forebygge yderligere adsorption af proteiner på pladerne under indvirkning af
DK 165958B
11 andet end antigen-antistof-vekselvirkninger; 2) positivt humant kontrolserum med kendt reaktivitet og kendt indhold af antistoffer til HTLV-I1I antigener; 5 3) negativt kontrolserum uden indhold af antistoffer til HTLV-III antigener? 4) sekundære antistoffer, der er reaktive overfor humane 10 immunoglobuliner, og som er mærket med et enzym (eksempelvis peroxidase, phosphatase etc.), og en opløsning til fortynding af antistoffet, hvilken opløsning består af normalt serum fra den dyreart, hvori det sekundære antistof frembringes; 15 5) en substratblanding (eksempelvis 0,05% o-phenylen- diamin og 0,005% Peroxidase; 6) en opløsning til standsning af enzymreaktionen (eksem- 20 pelvis 4N til peroxidase-reaktionen med o-phe- nylendiamin og ^2°2^ * 7) en buffer til udvaskning indeholdende en phosphat-buf-ret saltopløsning (PBS) og 0,02% Tween® 20 (eller en an- 25 den detergent) og 8) en phosphat-bufret saltoplsøning (PBS).
Prøven gennemføres ved, at man sætter test-serum til de 30 antigen-belagte fordybninger i mikrotiter-pladerne og in kuberer ved stuetemperatur i 2 timer (eller længere). Fordybningerne vaskes med bufferen og inkuberes med det sekundære antistof, hvortil der er bundet et enzym, i 1 time ved 37 °C. Pladerne vaskes på ny med vaskeopløs-35 ningen og derefter med PBS alene. Derpå behandles pladerne med substratopløsningen og inkuberes i 10 - 30 minutter, hvorefter reaktionen standses ved tilsætning af den
DK 165958 B
12 pågældende opløsning. Den farve, som dannes i hver fordybning, måles ved hjælp af en ELISA pladeaflæser.
Det ovennævnte ELISA-system kan modificeres, således at 5 man kan benytte renset p24 fra HTLV-III i stedet for lysat et af HTLV-III.
Antistoffer til HTLV-III kan også påvises ved indirekte immunofluorescens-analyse. I det efterfølgende eksempel 3 10 er der givet et eksempel på denne teknik. Denne analysemetode er signifikant, fordi den benytter den inficerede T-celle som udgangsmateriale. ELISA og Western Blot teknikkerne går derimod ud fra HTLV-III virus.
15 Som anført ovenfor kan antistofferne til HTLV-III også påvises i serum fra patienter med AIDS eller præ-AIDS ved hjælp af Western Blot teknikken (se eksempel 2). HTLV-III lyseres og fraktioneres ved elektroforese på en poly-acrylamid-pladegel. Gelens protein-bånd bliver derefter 20 elektroforetisk overført til et lag af nitrocellulose, f. eks. ved transversal elektroforese. De resterende protein-bindingssteder på nitrocelluloselaget mættes ved at inkubere laget i en opløsning indeholdende et ikke-beslægtet protein, såsom oksealbumin, hvorefter laget op-25 deles i smalle strimler, således at hver strimmel indeholder en repræsentativ profil af de virale antigener som adskilte bånd. De individuelle strimler benyttes som ma-trix-bundne antigener til påvisning af antistoffer, hvormed de er reaktive i serumprøver. Man har også foretaget 30 fastfase-radioimmunoassays med strimler. Test-serumprøver udtaget fra patienter, som mistænkes for at have pådraget sig AIDS, sættes til reagensglas, der indeholder de oven- 125 for beskrevne strimler. Et andet antistof for I-mærket anti-humant immunoglobulin fra geder sættes til strimler-35 ne, som derefter eksponeres på røntgenfilm. De strimler, som er positive overfor tilstedeværelsen af AIDS-anti-stoffer, udviser brede bånd i en lokalisering svarende
DK 165958 B
13 til en molekylvægt på 41000.
De komponenter, der indgår i Western Blot testsystemet, omfatter: 5 1) lag af nitrocellulose (eller en anden polymer-matrix), hvori de virale protein-bånd allerede er opløst ved gel-elektroforese og overført til lagene som angivet ovenfor, hvor de på passende måde er blokeret med proteinopløs- 10 ninger for at forebygge en yderligere ikke-specifik proteinbinding; 2) et positivt humant kontrol-serum; 15 3) et negativt humant kontrol-serum; 4) et sekundært antistof for humant immunoglobulin frembragt i en passende animalsk værtscelle og forsynet med en radioaktiv mærkning; 20 5) en opløsning til fortynding; 6) en vaskeopløsning (0,5% natriumdesoxycholat, 0,1 M NaCl, 0,5% Triton® X-100, 0,1 mmol phenylmethylsulfonyl- 25 fluorid og 10 mmol natriumphosphat; pH 7,5) og 3 7) reagenglas med lukkeanordninger (eksempelvis 15 cm ).
Til anvendelse af Western Blot testsystemet anbringer man 3 30 hver strimmel i et 15 cm reagenglas indeholdende 2,5 ml af fortyndingsmidlet, og strimlen behandles med 25 ul testserum og inkuberes ved 4 °C natten over. Derefter frasuges opløsningen, og strimlen vaskes i det samme reagensglas, idet vaskeopløsningen udvaskes 3 gange, og idet 35 der omrystes omhyggeligt under hver udvaskning. Til hvert glas sættes 2,5 ml fortyndingsmiddel, og der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Til glassets indhold sættes
DK 165958 B
14 20 μΐ af den radioaktive opløsning af det sekundære anti- 6 125 stof (omkring 2,5 x 10 dpm I). Efter inkubation i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur frasuges væsken, og strimlerne vaskes på ny som angivet ovenfor, 5 hvorefter de enkelte strimler udtages fra glassene, tørres på papirservietter og anbringes i rækkefølge på filterpapir. Strimlerne omvikles med en tynd plastfilm, eksempelvis af mærket Saran Wrap, og eksponeres på røntgenfilm i mørke. Filmen fremkaldes efter 24 - 48 timers 10 forløb. De antistoffer, som kan reagere med de virale antigener, påvises som mørke billeder på røntgenfilmen. Positive antistof-reaktioner med et antigen med en molekylvægt på 40000 - 45000 og et antigen med en molekylvægt på 23000 - 25000 er en diagnosticering af HTLV-III anti-15 stoffer.
125
Renset p24 kan mærkes radioaktivt med 1. Dette iod bindes primært til proteinets tyrosin-rester. Denne radio-mærkning og radioimmunoanalyse-procedurerne (RIA) 20 kan foretages i overensstemmelse med metoderne beskrevet af Kalyanaraman et al. i J. of Virology, 38(3):906-915, juni 1981.
Princippet i denne testprocedure er baseret på dannelsen 25 af immun-komplekser imellem antigener (generelt protein- agtige materialer, carbonhydrat-molekyler eller andre ma-kromolekyler) og specifikke antistoffer for de relevante antigener (f. eks. kanin-Ig imod HTLV-III). Disse komplekser omsættes yderligere med et andet antistof, som er 30 reaktivt overfor det første antistof, som benyttedes (eksempelvis gede-Ig imod kanin-Ig). Denne reaktion resulterer i dannelse af et ternært kompleks bestående af antigenet, det primære antistof og det sekundære antistof. Desuden vil det primære antistof, som altid anven-35 des i overskud i forhold til den mængde, som er nødvendig for at kompleksbinde hele mængden af tilstedeværende antigen, også danne binære komplekser med det sekundære
DK 165958B
15 antistof. Blandingen af komplekserne viser sig som et synligt bundfald og kan sedimenteres ved centrifugering.
Antigenet, som benyttes i denne test, er radioaktivt mær- 125 ket, sædvanligvis med isotopen I. Derfor kan immunpre-5 cipitationen let måles ved at estimere den radioaktivitet, som er forbundet med udfældningen, ved passende tæl- 125 ling (eksempelvis ved gamma-tælling for I-mærket antigen).
10 De komponenter, som indgår i testsystemet til konkurrerende radioimmunoanalyse for HTLV-III p24, omfatter: 125 1) mærket p24 (eksempelvis I); 15 2) et primært antistof, som kan reagere med HTLV-III p24 (enten et hyperimmunt antistof frembragt i et dyr ved podning med et antigen-præparat indeholdende HTLV-III p24 eller et patient-serum, som vides at indeholde et udfældende antistof antistof imod HTLV-III p24); 20 3) et sekundært antistof imod det primære antistof (eksempevis et antistof imod kanin-immunoglobuliner, hvis det primære antistof er et kanin-immunoglobulin, eller et antistof imod humant immunoglobulin, hvis det primære 25 antistof er et humant serum, der er reaktivt overfor HTLV-III p24); 4) det testmateriale, som skal evalueres for tilstedeværelse af HTLV-III p24, og 30 5) pH-buffere, overfladeaktive midler etc.
Proceduren ved anvendelse af dette testsystem involverer en inkubation af flere fortyndinger af det ikke-radio-35 aktive testmateriale med det primære antistof i separate reagensglas i 1 time, hvorefter der tilsættes en konstant mængde af det radioaktive antigen. Derefter inkuberes
DK 165958 B
16 reaktionsblandingen, først ved 37 "C og derefter ved 4 °C, natten over. Derefter tilsættes det sekundære antistof, og reaktionsblandingen inkuberes i yderligere 1 time ved 37 °C efterfulgt af 2 timer ved 4 °C. Derpå cen-5 trifugeres inkubationsblandingen for at sedimentere bund faldet, supernatanten frasuges, og radioaktiviteten i bundfaldet bestemmes ved anvendelse af en gamma-tæller.
Radioaktiviten i bundfaldet, dvs. i den del af reaktions-10 blandingen, som ikke indeholder et konkurrerende antigen, regnes som den maksimale udfældning af det mærkede antigen. Når en præ-inkubation af det primære antistof med et ikke-mærket antigen frembringer en reduktion i den radioaktivitet, som er knyttet til bundfaldet, må konklusionen 15 være, at den ukendte prøve indeholder den antigeniske aktivitet af HTLV-III p24.
I det følgende vil figurerne blive beskrevet i detaljer: 20 Fig. 1 viser identifikationen af HTLV-III antigener ved hjælp af serum fra patienter i overensstemmelse med proceduren beskrevet i eksempel 2.
Fig. 2 er en Western Blot analyse af antigeniske kryds-25 reaktiviteter imellem HTLV-I, HTLV-II og HTLV-III. Ekstrakterne af HTLV-I, HTLV-II og HTLV-III blev fraktioneret ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese, og proteinbåndene blev ved elektro-blotting overført til et lag af nitrocellulose. Efter blokering af de resterende protein-30 bindingssteder ved inkubation med 5% okseserumalbumin blev laget udskåret i segmenter, som hver indeholdt baner af HTLV-I-, HTLV-II- og HTLV-III-proteiner. Segment A blev inkuberet med et kanin-antiserum fremstillet imod en HTLV-I-ekstrakt, segment B med et kanin-serum imod en 35 HTLV-II-ekstrakt, segment C med et kanin-serum imod en HTLV-III-ekstrakt og segment D med normalt kanin-serum.
125
Efter udvaskning blev segmenterne omsat med I-mærket
DK 165958B
17 gede-IgG imod kanin-immunoglobulin. Lagene blev vasket omhyggeligt, suget tørre og eksponeret på røntgenfilm. Banerne 1, 2 og 3 i hvert segment repræsenterer henholdsvis HTLV-I, HTLV-II og HTLV-III. Tallene til venstre på 5 figuren repræsenterer molekylvægtene (x 1000) af standard-markeringsproteiner påført ved co-elektroforese.
125
Fig. 3 viser elektroforese-profilerne af I-mærket p24 125 fra HTLV-I, HTLV-II og HTLV-III. De I-mærkede p24-pro-10 teiner fra HTLV-I (C), HTLV-II (B) og HTLV-III (A) blev analyseret ved elektroforese igennem cylindriske 12% polyacrylamid-geler i nærværelse af SDS. Gelerne blev opdelt i skiver på 1 mm og optalt i en gamma-tæller. Posi-125 tionen af en I-mærket prøve af chymotrypsinogen (mole-15 kylvægt 25500) i en parallel gel er vist ved den lodrette stiplede linie.
125
Fig. 4 viser immunprecipitationen af I-mærket p24 fra HTLV-III ved hjælp af serum fra AIDS-patienter. Immuno-20 precipitationerne blev foretaget ved den dobbelte antistof-metode beskrevet af Kalyanaraman et al., J. Virol., 38:906-915 (1981). Seriefortyndinger af serum blev inkuberet med det mærkede p24 fra HTLV-III (omkring 8000 cpm) i 3 timer ved 37 °C efterfulgt af en inkubation natten 25 over ved 4 °C i 200 μΐ af en reaktionsblanding indeholdende 20 mmol Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 M NaCl, 0,3%
Triton© X-100 og 2 mg/ml okseserumalbumin, 1 mmol EDTA og 0,1 mmol PMSF. Derefter tilsattes et overskud (30 gange) af anti-humant gede-IgG, og inkubationen fortsattes 1 30 time ved 37 °C og 2 timer ved 4 °C. Inkubationsblandingen blev fortyndet til 1 ml med bufferen og centrifugeret ved 4000 omdr./min. i 15 minutter i en Beckman TJ-6 centrifuge. Radioaktiviteten, som var bundet i det centrifugerede bundfald, blev bestemt ved anvendelse af en gamma-35 tæller.
DK 165958B
18
Fig. 5 viser det homologe konkurrerende radioimmunoassay for HTLV-III p24. Ved analysen anvendtes en 1:1500 fortynding af et hyperimmunt kanin-serum fremstillet imod nedbrudt HTLV-III. I fravær af konkurrerende ikke-mærkede 5 antigener bevirkede denne serum-fortynding en 20% udfæld- 125 ning af det I-mærkede p24. Det ovennævnte kanin-serum blev præ-inkuberet i 1 time ved 37 °C med de nævnte ikke-mærkede antigener, hvorefter det mærkede antigen tilsattes (omkring 8000 cpm). De yderligere detaljer ved ana-10 lysen er de samme som beskrevet i omtalen af fig. 4 med den undtagelse, at det andet benyttede antistof var anti-kanin-immunoglobulin fra geder.
A. Konkurrence med retrovirale ekstrakter: 15 9_# , HTLV-III; #_# ,m HTLV-I;' o----o, HTLV-II; A_A , FeLV;^_Å , R-MuLV? m_m , SSV;n_D,
BaEV (M7); v_y SMRV; ψ_ψ, MPMV; ^BLV og x-----x, El AV p26.
20 B. Konkurrence med cellulære ekstrakter: 9_# , H4 celler inficeret med HTLV-III; 0_0 , ikke- inficerede H4 celler;n _a, ikke-inficerede H9 celler; 25 A_4 / HUT 102 celler, der producerer HTLV-I, og4_ , C3-44 celler, der producerer HTLV-II.
Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.
30 EKSEMPEL 1
Antistoffer til HTLV-III i serum fra patienter med AIDS og præ-AlDS-lymphadenopati-syndrom 35
Fordybningerne i plader med 96 fordybninger blev belagt natten over med et lysat af densitets-bundet HTLV-III i -
DK 165958 B
19 en mængde på 0,5 ug protein pr. fordybning i 100 ul 50 mmol natriumbicarbonat-buffer, pH 9,6. Fordybningerne blev vasket med vand og inkuberet i 20 minutter med 100 ul 5% okseserumalbumin i en phosphat-bufret saltopløsning 5 (PBS). Efter udvaskning sattes 100 ul 20% normalt gede-serum i PBS til hver fordybning, hvorefter der tilsattes 5 eller 10 ul test-serum (blod udtaget fra en human patient), og blandingen fik lov at reagere i 2 timer ved stuetemperatur. Fordybningerne blev vasket 3 gange med 10 0,5% Tween® 20 i PBS med henblik på at fjerne ikke-bundne antistoffer, og der inkuberedes i 1 time ved stuetemperatur med peroxidase-mærket anti-humant gede-IgG i en fortynding på 1:2000 i 1% normalt gede-serum i PBS. Anti-humant gede-IgG er et andet antistof, som binder sig til 15 det antistof-antigen-kompleks, der dannes i de positive fordybninger. Fordybningerne blev successivt vasket 4 gange med 0,05% Tween® 20 i PBS og 4 gange med PBS med henblik på at fjerne ikke-bundet gede-antistof, hvorefter de blev bragt til at reagere med 100 ul af en substrat-20 blanding indeholdende 0,05% o-phenylendiamin og 0,005% hydrogenperoxid i en phosphat-citrat-puffer, pH 5,0. Denne substrat-blanding detekterer peroxidase-mærkningen og danner et farvet produkt. Reaktionerne blev standset ved tilsætning af 50 ul 4 N HgSO^ og den dannede farve blev 25 målt ved anvendelse af en ELISA-aflæser, som giver en kvantitativ bedømmmelse af farveaflæsningen. Alle analyser blev foretaget som dobbelte prøver. De absorbanser, som var større end 3 gange den gennemsnitlige værdi af 4 normale kontrolaflæsninger, blev regnet som positive. De 30 opnåede resultater fremgår af tabel 1: 35
DK 165958 B
20
Tabel 1
Forsøgspersoner Antal positive/ Procent antal testede positive 5
Patienter med AIDS 43/49 87,8
Præ-AIDS 11/14 78,6
Stiknarkomaner 3/5 60
Homoseksuelle mænd 6/17 10 Seksuel kontakt med AIDS-patient 1/1
Vedvarende træthed 1/1
Andet 4/15 26,6
Andre kontrolprøver 1/186 0,5 15 Normale personer 1/164 0,6
Patienter med hepatitis B-virusinfektion 0/3 0
Patienter med rheumatoid arthritis 0/1 0 20 Patienter med systemisk lupus erythematosus 0/6 0
Patienter med akut mononucleose 0/4 0
Patienter med lymphatisk 25 leukæmi 0/8 0 EKSEMPEL 2
En Western Blot analyse af forsøgsområdet blev gennemført 30 på følgende måde: HTLV-III blev lyseret og fraktioneret ved elektroforese på en 12% polyacrylamid-pladegel i nærværelse af natriumdodecylsulfat (SDS). Protein-båndene på gelen blev elektroforetisk overført til et nitrocellulose-lag i overensstemmelse med proceduren beskrevet af 35 Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350 (1979). Derefter gennemførtes radioimmunoanalyser på fastfase-strimler. Laget blev inkuberet ved 37 °C i 2
DK 165958 B
21 timer med 5% okseserumalbumin i 10 mmol Tris-HCl, pH 7,5, indeholdende 0,9% NaCl og derefter skåret i strimler på 0,5 cm. Hver strimmel blev inkuberet i 2 timer ved 37 °C og 2 timer ved stuetemperatur i et reagensglas med skrue-5 kapsel, som indeholdt 2,5 ml buffer 1 (20 mmol Tris-HCl, pH 7,5, 1 mmol EDTA, 0,2 M NaCl, 0,3% Triton© X-100 og 2 mg/ml okseserumalbumin samt 0,2 mg/ml humane antistoffraktioner, Fab). Test-serum (25 μΐ) udtaget fra patienter med AIDS eller fra patienter, der udviste præ-AlDS-10 symptomer, sattes derefter til de individuelle reagensglas, som indeholdt strimlerne, og inkubationen blev fortsat i 1 time ved stuetemperatur og derefter natten over i kulde. Strimlerne blev vasket 3 gange med en opløsning indeholdende 0,5% natriumdesoxycholat, 0,1 M 15 NaCl, 0,5% Triton© X-100, 1 mmol phenylmethylsulfonyl- fluorid og 10 mmol natriumphosphat, pH 7,5. Strimlerne blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med 2,4 ml buffer 1 og 0,1 ml normalt gede-serum. Affinitetsrenset 125 og I-mærket anti-humant gede-immunoglobulin (μ-kæde og 20 Fc-fragment )(1,25 x 10^ cpm) sattes til reaktionsblan dingen, hvorefter inkubationen fortsattes i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev strimlerne vasket, tørret, anbragt som beskrevet ovenfor og eksponeret på røntgenfilm. Fig. 1 er en grafisk fremstilling af resulta-25 terne af disse forsøg. Strimmel 1 er test-serum fra en voksen patient med T-celle-leukæmi; strimmel 2 er en normal donor; strimmel 3 hidrører fra en mor til et barn med AIDS; strimlerne 4 og 6 - 10 hidrører fra AIDS-patienter, og strimmel 5 hidrører fra en patient med præ-AIDS.
30 EKSEMPEL 3
Indirekte immunofluorescensanalyse for antistoffer til HTLV-III med fikserede celler og levende celler 35
Som indikatorceller anvendtes HTLV-III-inficerede negative celler, og som negative kontrolceller anvendtes
DK 165958 B
22 ikke-inficerede T-celler.
De inficerede celler blev vasket med phosphat-bufret saltvand (PBS) og resuspenderet i PBS i en mængde på 5 lO^/ml. Omkring 50 ml af cellesuspensionen blev anbragt som pletter på præparatglas, lufttørret og fikseret i acetone i 10 minutter ved stuetemperatur. Præparatglas-sene blev anbragt ved -20 °C, indtil de skulle anvendes.
Til de fikserede celler sattes 20 ml humant test-serum, 10 som var fortyndet 1:10 med PBS, og der inkuberedes i 1 time ved 37 °C. Præparatglassene blev vasket, hvorefter de fik lov at reagere i 30 minutter ved stuetemperatur med en fortyndet opløsning af fluorescein-konjugeret anti-humant gede-IgG. Præparatglassene blev på ny vasket 15 og undersøgt for fluorescens under et mikroskop. En negativ kontrol udnyttede ikke-inficerede forældreceller.
Det ovenfor anførte beskriver et fikseret cellesystem, i hvilket man eftersøger antistof-antigen-reaktionen såvel inden i som uden for cellen.
20
Til immunofluorescensanalyse på levende celler blev alle de ovenfor beskrevne reaktioner gennemført i et reagensglas og ikke på et præparatglas, og man undlod at foretage en kemisk fiksering af cellerne. Efter reaktion med 25 det fluorescein-konjugerede anti-humane antistof blev cellerne overført til et præparatglas og undersøgt under mikroskop for antistof-antigen-reaktioner på cellens overflade.
30 Resultaterne af hver af disse analyser viser en kraftig fluorescens-reaktion, som er specifik med serum fra AIDS-og præ-AlDS-patienter.
EKSEMPEL 4 35
Serum fra patienter med klinisk dokumenteret AIDS, patienter med Kaposi's sarcoma, personer med seksuel kontakt
DK 165958 B
23 med AIDS-patienter, stiknarkomaner, homoseksuelle mænd og heteroseksuelle donorer blev afprøvet for reaktivitet overfor HTLV-III. Det anvendte system var ELISA. Lysater af saccharosedensitets-bundet HTLV-III blev påført mikro-5 titerplader med 96 fordybninger. Det benyttede test-serum blev fortyndet med en fortyndet opløsning af normalt gede-serum og overført til fordybningerne, hvor det fik lov at reagere 2 timer eller natten over ved stuetemperatur. Antistofferne i humant serum blev påvist ved reak-10 tion imellem det primære immun-kompleks og peroxidase-mærket anti-humant gede-immunoglobulin efterfulgt af udviklingen af et farvet peroxidase-reaktionsprodukt. De opnåede resultater fremgår af tabel 1. Ud af 49 klinisk diagnosticerede AIDS-patienter udviste de 43 (88%) serum-15 reaktivitet i dette forsøg. 14 homoseksuelle mænd med præ-AIDS blev også testet for antistoffer til HTLV-III.
Af disse var de 11 (79%) positive. Blandt 17 homoseksuelle mænd uden kliniske symptomer på AIDS var der 7 positive. Af disse var mindst en kendt for at være lang-20 varig seksualpartner til en person med et diagnosticeret AIDS-tilfælde. En anden led af vedvarende træthed og udviste tidlige tegn på AIDS. En af de 3 stiknarkomaner, som var positiv med hensyn til serum-antistoffer til HTLV-III, var også homoseksuel.
25
Derimod var der kun en af 186 kontrolpersoner, som reagerede positivt i dette forsøg. Kontrolpersonerne omfattede 3 patienter med en hepatitis B-virusinfektion, en med rheumatoid arthritis, 6 med systemisk lupus erythemato-30 sus, 4 med akut mononucleose og 8 med forskellige former for lymphatisk leukæmi og lymphoma, af hvilke nogle var positive for HTLV-I. De resterende forsøgspersoner var normale donorer med ukendte seksuelle tilbøjeligheder, herunder laboratoriepersonale med en alder på mellem 22 35 og 50 år.
DK 165958 B
24 EKSEMPEL 5
For at undersøge specificiteten af reaktionerne blev ly-sater af de HTLV-III-inficerede cellekloner analyseret og 5 sammenlignet med lysater af de samme cellekloner inden virusinfektionen. Man fandt ikke noget reaktivt antigen i de ikke-inficerede kloner med den undtagelse, at man fandt et bånd med en molekylvægt på 80000 i H17, som bandt antistoffer fra alle de afprøvede humane serumprø-10 ver, men ikke fra kanin- eller gede-serum. Antigener, som udtrykkes umiddelbart efter virusinfektionen og genkendes af det humane serum, som anvendes ved analysen, omfatter p65, p55, p41, p39, p32 og p24. Desuden påvistes et protein med en omtrentlig molekylvægt på 130000 og et pro-15 tein med en molekylvægt på 48000. Med normalt humant serum påvistes ingen af antigenerne. Disse resultater viser, at de påviste antigener enten er virus-kodede proteiner eller cellulære antigener, som induceres specifikt gennem en viral infektion.
20 25 30 35
DK 165958B
25 EKSEMPEL 6
Saccharosedensitets-bundet HTLV-III fra supernatanter fra dyrkning af H9/HTLV-III-celler blev analyseret ved 5 Western Blot teknik til bestemmelse af de antigeniske ligheder med HTLV-I og HTLV-II. Lysater af HTLV-I, HTLV-II og HTLV-III blev fraktioneret ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese og ved hjælp af elektro-blotting overført til et lag af nitrocellulose. Protein-båndene blev 10 derefter omsat med hyperimmunt kanin-serum til HTLV-I, HTLV-II eller HTLV-III. Resultaterne er vist på fig. 2.
Den kraftigste immun-reaktivitet for p24 blev observeret med de homologe antisera (banerne A-l, B-2 og C-3). Moderat kraftige krydsreaktiviteter kunne iagttages imellem 15 HTLV-II p24 og anti-HTLV-I (bane A2) og imellem HTLV-III p24 og anti-HTLV-II (bane B3). Svage reaktiviter kunne også iagttages imellem HTLV-III p24 og anti-HTLV-I (bane A3), og imellem HTLV-I p24 og et anti-HTLV-III (bane Cl).
På trods af den moderate reaktivitet imellem HTLV-III p24 20 og anti-HTLV-II (bane B3) fandt man imidlertid ikke nogen reciprok reaktivitet imellem HTLV-II p24 og anti-HTLV-III (bane C2). Der observeredes ingen reaktivitet med normalt kanin-serum (plade D).
25 Det vigtigste HTLV-III kerneprotein, p24, blev oprenset fra lysatet af et saccharosedensitets-bundet viruspræparat. Dette virus blev solubiliseret med 0,5% Triton® X-100, 0,8 M NaCl, 20% glycerol og 0,1 mmol phenylmethyl-sulfonylfluorid (PMSF) i 50 mmol Tris-HCl, pH 7,9, hvor-30 efter ekstrakten blev befriet for nucleinsyrer ved en portionsvis adsorption og eluering fra DEAE-cellulose med 0,3 M NaCl. Eluatet blev dialyseret imod 50 mmol BES-buffer, pH 6,5, indeholdende 1 mmol EDTA og 0,1 mmol PMSF og chromatograferet på en phosphorcellulose-kolonne ækvi-35 libreret med den samme buffer. Proteinerne blev elueret under anvendelse af en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,6 M. HTLV p24 blev elueret mellem 0,25 og 0,3 M NaCl. Fig.
DK 165958B
26 3 viser SDS-polyacrylamid-gelprofilen af en prøve efter 125
mærkning med I. Med hensyn til elektroforetisk mobilitet mindede HTLV-III p24 meget om HTLV-I p24 og HTLV-II
125 p24, og den bevægede sig meget hurtigere end I-mærket 5 chymotrypsinogen i en parallel gel som molekylvægtsmarkering (molekylvægt 25500) (figur 2, lodret stiplet linie).
Specificiteten af det rensede p24 blev analyseret ved immuno-precipitation med patientens serum og ved konkur-10 rerende radioimmunoanalyser under anvendelse af hyper-immun kanin-serum.
Figur 4 viser resultaterne af immuno-precipitation af 125 I-mærket p24 fra HTLV-III med serum fra patienter med 15 AIDS eller AIDS-beslægtede tilstande. Disse eksperimenter frembragte et stort udvalg af antistoffer, hvilket stemte godt overens med resultaterne af en Western Blot-analyse, som viste, at immun-reaktiviteterne med p24 havde en tendens til at variere over et stort interval, og at serum 20 fra visse AIDS-patienter ikke udviste nogen signifikant antistof-reaktivitet med p24.
Der gennemførtes en homolog konkurrerende radioimmunoana- 125 lyse under anvendelse af I-mærket HTLV-III p24 og et 25 kanin-antistof imod nedbrudt HTLV-III. Fig. 5A viser en total konkurrence imellem udfældning af det mærkede p24 og den ikke-mærkede HTLV-III-ekstrakt. Ekstrakterne af HTLV-I og HTLV-II viste kun en minimal konkurrence ved protein-koncentrationer, som var omkring 100 gange så hø-30 je som koncentrationen af HTLV-III. På den anden side viste det sig, at et stort antal andre pattedyr-retro-virus-typer (katteleukæmi-virus (FeLV), Rauscher museleukæmi -virus (R-MuLV), abesarcoma-virus (SSV), endogent bavian-virus (BaEV), dødningehovedabe-retro-virus (SMRV), 35 Mason-Pfizer abevirus (MPMV) og okseleukæmi-virus (BLV)) ikke deltog i denne immuno-precipitation. På lignende måde virkede to cellekloner, som var inficeret med HTLV-III '
DK 165958 B
27 (H4/HTLV-III og H9/HTLV-III), blokerende på immuno-preci-pitationen af HTLV-III p24, men de tilsvarende ikke-infi-cerede celler var fuldstændigt uden virkning (fig. 5B).
De celler, der producerer HTLV-I og HTLV-II, udviste mar-5 ginale virkninger i denne konkurrence ved relativt højere protein-koncentrationer. De antigener, som var involveret i de ovenstående reaktioner, var derfor specifikke over for HTLV-III og celler, der producerer HTLV-III. Der var påviselige tilbøjeligheder til krydsreaktion (omend på et 10 lavt niveau) imellem HTLV-III p24 og p24 fra HTLV-I og HTLV-II. Disse tilbøjeligheder til krydsreaktion lod sig lettere påvise i et mindre krævende system, såsom Western Blot (figur 2). Renset p26 fra inficerende hesteanæmi-virus (EIAV) viste her kun en ringe tilbøjelighed til 15 krydsreaktion i den homologe radioimmunoanalyse for HTLV-III p24 (fig. 5A). Virkningen af HTLV-III blev kontrolleret i homologe konkurrerende radioimmunoanalyser for HTLV-I p24 og HTLV-II p24. Selv om disse systemer udviste betydelig kryds-reaktivitet imellem HTLV-I og HTLV-II, 20 var konkurrencen fra HTLV-III kun minimal i hver enkelt analyse.
Disse resultater viste, at HTLV-III er et enestående retrovirus med et væsentligt kerne-protein, p24, der er 25 uden relation til de fleste andre retrovirus-typer. Imidlertid deler p24 fra HTLV-III et lavt, men påviseligt niveau af antigenisk krydsreaktivitet med HTLV-I og HTLV-II, men ikke med andre retrovirus-typer. Disse krydsreaktiviteter med HTLV-I og HTLV-II kunne ses mere klart 30 ved Western Blot-analyse end ved konventionelle konkurrerende radioimmunoanalyser. Der var analogi med påvisningen af krydsreaktiviteter imellem HTLV-I p24 og BLV p24 ved Western Blot-analyse, selv om der ikke kunne påvises nogen krydsreaktivitet imellem de to virus-typer 35 ved konkurrerende radioimmunoanalyser. Det stod klart, at HTLV-I og HTLV-II var nærmere beslægtet med hinanden, end HTLV-III var beslægtet med HTLV-I eller HTLV-II. Disse '
DK 165958 B
28 kendsgerninger var i overensstemmelse med påvisningen af en begrænset nucleinsyresekvens-homologi imellem HTLV-III og såvel HTLV-I som HTLV-II, især i genomernes gag-pol-region.
5 EKSEMPEL 7
Der konstrueredes terapeutiske AIDS-specifikke testudstyr til påvisning af antistoffer, idet der til påvisningen 10 anvendtes flere forskellige teknikker. Et sådant testudstyr til påvisning af antistoffer bestod af et antal indbyrdes adskilte rum, et system af plader, som inden anvendelsen blev belagt med p24 fra HTLV-III, og ELISA-materialer til påvisning af enzymer og bestående af nor-15 malt gede-serum, peroxidase-mærket anti-humant gede-IgG og en farveskiftende indikator, der bestod „af o-phenylen-diamin og hydrogenperoxid i en phosphat-citrat-buffer.
Et andet testsystem til påvisning af antistoffer under 20 anvendelse af den såkaldte "Dot Blot-teknik" bestod af en beholder forsynet med lukning, i hvilken beholder der befandt sig et lag af nitrocellulose med HTLV p24 fastknyttet ved "dot-blotting" samt overfladeaktive midler såvel som pH-modificerende midler, okseserumalbumin og humant 25 Fab. Denne beholder til Dot Blot-analyse indeholdt også 125 en forsyning af fortyndet normalt gede-serum og I-mær-ket anti-humant gede-immunoglobulin.
Endnu et AIDS-specifikt testsystem til påvisning af HTLV-30 III ved konkurrerende radioimmunoanalyse bestod af en beholder, der var opdelt i mindre rum, og beholderen inde- 125 holdt I-mærket p24 fra HTLV-III, anti-HTLV-p24 fra kaniner (eller geder), opløsninger af overfladeaktive midler, pH-regulerende buffere, okseserumalbumin og gede-35 antiserum til kanin-immunoglobulin (eller kanin-antiserum til gede-immunoglobulin).
Claims (42)
1. Fremgangsmåde til detektering af et lymphotropt retro-5 virus betegnet HTLV-III virus, som er normalt cytopatisk over for sit foretrukne mål, hjælpeceller, som har en densitet på 1,16 g/ml bestemt ved en densitetsgradient i en saccharoseopløsning, som har et principalt kerne-antigen p24 med en molekylvægt på 24000 og et principalt 10 kappe-antigen p41 med en molekylvægt på 41000, og som kun udviser begrænset krydsreaktivitet med alle andre kendte HTLV-undergrupper, eller rekombinant-fraktioner af HTLV-III virus, antistoffer til HTLV-III virus eller HTLV-III virus-antigener i en prøve, kendetegnet ved, 15 at prøven underkastes en konkurrerende immunoassay-diskriminationsprocedure og/eller en Western Blot assay-procedure, hvilken procedure gør brug af andre HTLV III antigener end de i EP offentliggørelsesskrift nr. 138 667 beskrevne antigener eller antistoffer hertil, hvilke 20 andre antigener er opnået ud fra en uforgængelig cellekultur og/eller uafhængigt opnåede antistoffer til HTLV III, idet der ved uafhængigt opnåede antistoffer skal forstås antistoffer, der ikke cirkulerer frit i blodet og derfor ikke er naturligt til stede i den prøve, der skal 25 testes for tilstedeværende virus.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven underkastes en konkurrerende immunoassay-diskriminationsprocedure og/eller en Western Blot assay- 30 procedure, som er specifik for et HTLV III protein valgt blandt p24, p32, p39, p41, p48, p55, p60, p65 og pl30.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at HTLV III proteinet er p24. 35
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at HTLV III proteinet er p41. DK 165958 B 30
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at HTLV III proteinet er pl30.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at HTLV III virus benyttes til detektering af antistoffer til HTLV III virus i prøven.
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, k e n -detegnet ved, at et HTLV III virus-antigen benyt- 10 tes til detektering af antistoffer til HTLV III virus i prøven.
8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at der anvendes mærket HTLV III 15 virus, mærkede rekombinant-fraktioner af HTLV III virus eller mærkede HTLV III virus-antigener.
9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, k e n -detegnet ved, at der anvendes mærkede antistoffer 20 til HTLV-III virus.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at man detekterer HTLV-III virus, rekombi-nant-fraktioner af HTLV-III virus eller HTLV-III virus- 25 antigener i prøven.
11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at diskriminationsproceduren er valgt blandt ELISA, immunoprecipitation og immunofluore- 30 scensanalyse.
12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man omsætter et antistof til HTLV-III virus med et HTLV-III virus antigen under dan- 35 nelse af et immunkompleks, hvorefter man omsætter dette immunkompleks med et mærket sekundært antistof til opnåelse af et produkt, hvis kvantitet let kan bestemmes. DK 165958B 31
13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det sekundære antistof er mærket med et enzym, der kan frembringe et farvet produkt.
14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det sekundære antistof er mærket med radioaktivt 125τ
15. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, k e n -10 detegnet ved, at diskriminationsproceduren er af Western Blot-typen, hvori protein-bånd fra HTLV-III virus dannes ved elektroforese af HTLV-III virus på en poly-acrylamid-gel i nærværelse af natriumdodecylsulfat, protein-båndene i gelen overføres til et nitrocellulose-lag, 15 som mættes med et ikke-beslægtet protein, og laget opdeles i strimler, der repræsenterer profilen af HTLV-III virus-antigenerne, hvorefter antigenerne benyttes til påvisning af antistoffer i prøven. 20
16· Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, ken detegnet ved, at antigenet er opnået ved en metode, hvorved man koncentrerer HTLV-III virus ved ultra-centrifugering fra viruskultur-supernatanter, fjerner li-piderne ved centrifugering igennem 20 % (w/w) saccharose 25 i TNE-buffer til dannelse af en saccharosegradient, opdeler saccharosegradienten i fraktioner og isolerer antigen-båndene ved at analysere prøver af hver fraktion for HTLV-III virus-specifik revers transcriptase-aktivitet.
17. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 9, kendeteg net ved, at prøven omfatter vævskulturmateriale eller primære celler fra legemsvæsker.
18. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 35 ved, at kappe-antigenet p41 er mærket. DK 165958B 32
19. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at kerne-antigenet p24 er mærket.
20. AlDS-specifikt testsystem omfattende en ruminddelt 5 beholder, hvori mindst ét af .rummene indeholder mindst ét lymphotropt retrovirus betegnet HTLV-III virus, som er normalt cytopatisk over for sit foretrukne mål, T4 hjælpeceller, som har en densitet på 1,16 g/ml bestemt ved en densitetsgradient i en saccharoseopløsning, som 10 har et principalt kerne-antigen p24 med en molekylvægt på 24000 og et principalt kappe-antigen p41 med en molekylvægt på 41000, og som kun udviser begrænset krydsreaktivitet med alle andre kendte HTLV-undergrupper, eller rekombinant-fraktioner af HTLV-III virus, antistoffer til 15 HTLV-III virus eller HTLV-III virus-antigener, kendetegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder mindst ét HTLV-III protein opnået fra en uforgængelig cellekultur og/eller uafhængigt opnåede antistoffer til HTLV-III proteiner som defineret i krav 1, idet HTLV-20 III proteinet eller proteinerne ikke kan være identisk med nogen af de i EP offentliggørelsesskrift nr. 138 667 beskrevne proteiner.
21. AIDS-specifikt testsystem ifølge krav 20, kende-25 tegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder et HTLV-III protein valgt blandt p24, p32, p39, p41, p48, p55, p60, p65 og pl30.
22. Testsystem ifølge krav 21, kendetegnet 30 ved, at HTLV-III proteinet er p24.
23. Testsystem ifølge krav 21, kendetegnet ved, at HTLV-III proteinet er p41.
24. Testsystem ifølge krav 21, kendetegnet ved, at HTLV-III proteinet er pl30. DK 165958 B 33
25. Testsystem ifølge ethvert af kravene 20-24, kendetegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder antistoffer til HTLV-III virus.
26. Testsystem ifølge ethvert af kravene 20-24, ken detegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder HTLV-III virus.
27. Testsystem ifølge ethvert af kravene 20-24, k e n -10 detegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder HTLV-III virus-antigener.
28. Testsystem ifølge ethvert af kravene 20-24, kendetegnet ved, at mindst ét af beholderens rum 15 indeholder HTLV-III virus-lysat.
29. Testsystem ifølge krav 28, kendetegnet ved, at det omfatter 20 a) mikrotiterplader belagt med HTLV-III virus-lysat og behandlet med proteinopløsninger for at modvirke yderligere adsorption af proteiner på pladerne ved andre mekanismer end antigen-antistof-vekselvirkninger, b) positivt humant kontrolserum med kendt reaktivitet og 25 kendt indhold af antistoffer til HTLV-III virus-anti gener, c) negativt kontrolserum uden indhold af antistoffer til HTLV-III virus-antigener, d) et enzym-mærket sekundært antistof, der er reaktivt 30 over for humane immunoglobuliner, og en fortyndings opløsning for det sekundære antistof bestående af normalt serum fra den dyreart, i hvilken det sekundære antistof frembringes, e) en substrat-blanding af o-phenylendiamin og ^02, 35 f) en opløsning til standsning af enzymreaktionen, g) en buffer til udvaskning og h) en phosphat-bufret saltopløsning. DK 165958 B 34
30. Testsystem ifølge krav 26, kendetegnet ved, at beholderen indeholder et antal mindre rum, plader, som inden anvendelsen er belagt med HTLV-III, og ELISA-materialer til påvisning af enzymer og bestående af 5 normalt gede-serum og peroxidase, mærket anti-humant gede-IgG samt en farveskiftende indikator.
31. Testsystem ifølge krav 30, kendetegnet ved, at den farveskif tende indikator består af o-phe- 10 nylendiamin og hydrogenperoxid i en phosphat-citrat-buffer.
32. Testsystem ifølge krav 31, kendetegnet ved, at HTLV-III er til stede i form af et lysat. 15
33. Testsystem ifølge krav 26, kendetegnet ved, at det desuden indeholder en phosphat-bufret saltopløsning og fluorescein-konjugeret gede-antiserum-IgG.
34. Testsystem ifølge krav 26, kendetegnet ved, at det desuden indeholder et lag af nitrocellulose og en polyacrylamid-pladegel i nærværelse af natriumdode-cylsulfat, overfladeaktive midler, pH-modificerende midler, okseserumalbumin, humant Fab og en forsyning af for- 125 25 tyndet normalt gede-serum og I-mærket anti-humant gede-immunoglobulin.
35. Testsystem ifølge krav 27, kendetegnet ved, at beholderen indeholder 30 a) lag af nitrocellulose med HTLV-III protein-bånd, som på forhånd er opdelt ved gelelektroforese og på passende måde blokeret med proteinopløsninger for at forhindre en yderligere ikke-specifik proteinbinding, 35 b) et positivt humant kontrolserum, c) et negativt humant kontrolserum, d) et sekundært antistof til humant immunoglobulin, hvil- * DK 165958 B 35 ket antistof er frembragt i en passende animalsk værtcelle og mærket med en radioaktiv mærkning, e) en opløsning til fortynding, f) en opløsning til udvaskning og 5 g) reagensglas med lukkehætter.
36. Testsystem ifølge krav 35, kendetegnet ved, at opløsningen til udvaskning består af 0,5 % na-triumdesoxycholat, 0,1 M NaCl, 0,5 % Tritone x-100, 0,1 10 mmol phenylmethylsulfonylfluorid og 10 mmol natriumphos- phat, idet opløsningens pH-værdi er 7,5.
37. Testsystem ifølge krav 20, kendetegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder kappe- 15 antigenet p41.
38. Testsystem ifølge krav 21, kendetegnet ved, at mindst ét af beholderens rum indeholder kerneantigenet p24. 20
39. Testsystemet ifølge krav 20, kendetegnet ved, at beholderen indeholder a) lag af nitrocellulose med HTLV-III protein-bånd, som 25 på forhånd er opdelt ved gelelektroforese og på pas sende måde blokeret med proteinopløsninger for at forhindre en yderligere ikke-specifik proteinbinding, b) et positivt humant kontrolserum, c) et negativt humant kontrolserum, 30 d) et sekundært antistof til humant immunoglobulin, hvilket antistof er frembragt i en passende animalsk værtcelle og mærket med en radioaktiv mærkning, e) en opløsning til fortynding, f) en opløsning til udvaskning og 35 g) reagensglas med lukkehætter.
40. Testsystem ifølge krav 39, kendetegnet DK 165958B . 36 ved, at opløsningen til udvaskning består af 0,5 % na-triumdesoxycholat, 0,1 M NaCl, 0,5 % Triton® X-100, 0,1 mmol phenylmethylsulfonylfluorid og 10 mmol natriumphos-phat, idet opløsningens pH-værdi er 7,5. 5
41. Testsystem ifølge krav 39, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder primære antistoffer, som kan reagere med enten kappe-antigenet p41 eller kerne-antigenet p24, sekundære antistoffer til de primære 10 antistoffer, pH-regulerende buffere og overfladeaktive midler.
42. Testsystem ifølge krav 37, kendetegnet ved, at beholderen indeholder et reaktionskammer, hvor- 15 igennem man kan tilsætte det testmateriale, som skal evalueres for kappe-antigenet p41 eller kerne-antigenet p24. 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US60294584 | 1984-04-23 | ||
| US06/602,945 US4520113A (en) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
| US63561084A | 1984-07-30 | 1984-07-30 | |
| US63561084 | 1984-07-30 | ||
| US64371584A | 1984-08-24 | 1984-08-24 | |
| US64371584 | 1984-08-24 | ||
| US8500762 | 1985-04-23 | ||
| PCT/US1985/000762 WO1985004903A1 (en) | 1984-04-23 | 1985-04-23 | Isolation of proteins of htlv-iii, serological detection of antibodies to htlv-iii in sera of patients with aids and pre-aids conditions, and detection of htlv-iii infection by immuno-assays using htlv-iii and its proteins |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK602285A DK602285A (da) | 1985-12-23 |
| DK602285D0 DK602285D0 (da) | 1985-12-23 |
| DK165958B true DK165958B (da) | 1993-02-15 |
| DK165958C DK165958C (da) | 1993-07-05 |
Family
ID=27416866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK602285A DK165958C (da) | 1984-04-23 | 1985-12-23 | Fremgangsmaade til isolering af htlv-iii proteiner, serologisk detektering af antistoffer til htlv-iii i serum fra aids- og prae-aids-patienter og detektering af htlv-iii infektioner ved immunoassays samt testsystem til brug ved fremgangsmaaden |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0181374B1 (da) |
| KR (1) | KR890001592B1 (da) |
| AT (1) | ATE69621T1 (da) |
| AU (1) | AU571702B2 (da) |
| CA (1) | CA1247005A (da) |
| DE (1) | DE3584716D1 (da) |
| DK (1) | DK165958C (da) |
| GR (1) | GR850976B (da) |
| HK (1) | HK7093A (da) |
| IE (1) | IE58321B1 (da) |
| IL (1) | IL74995A (da) |
| NZ (2) | NZ228756A (da) |
| SG (1) | SG65692G (da) |
| WO (1) | WO1985004903A1 (da) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8423659D0 (en) | 1984-09-19 | 1984-10-24 | Pasteur Institut | Cloned dna sequences |
| AU578661B2 (en) * | 1984-02-29 | 1988-11-03 | Dittmer, Thomas H. | Method for diagnosis of A.I.D.S. |
| US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
| IL76082A (en) * | 1984-08-22 | 1991-07-18 | Us Health | Molecular clones of the genome of htlv-iii and a process for the preparation thereof |
| US7285271B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-10-23 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Antigenic composition comprising an HIV gag or env polypeptide |
| US7393949B1 (en) | 1987-12-24 | 2008-07-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Human immunodeficiency virus (HIV) nucleotide sequences |
| CA1341482C (en) * | 1984-10-31 | 2005-05-10 | Paul A. Luciw | Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses |
| US7273695B1 (en) | 1984-10-31 | 2007-09-25 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | HIV immunoassays using synthetic envelope polypeptides |
| US4725669A (en) * | 1984-11-09 | 1988-02-16 | President And Fellows Of Harvard College | Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III |
| ATE138100T1 (de) * | 1984-12-24 | 1996-06-15 | Genentech Inc | Fusionen von aids-verwandten polypeptiden |
| US6534285B1 (en) | 1984-12-24 | 2003-03-18 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
| US5853978A (en) * | 1985-12-04 | 1998-12-29 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and methods of use |
| BE904030A (fr) * | 1985-01-15 | 1986-07-14 | Cancer Res Inst | Procede de recherche d'anticorps et equipement ou kit pour la mise en oeuvre de ce procede. |
| DE3672624D1 (de) * | 1985-02-05 | 1990-08-23 | Us Commerce | Verfahren zum nachweis von htlv-iii neutralisierenden antikoerpern in sera. |
| WO1986004993A1 (en) * | 1985-02-26 | 1986-08-28 | United States Of America, Represented By The Unite | Detection of human t-cell leukemia virus type iii |
| US4774175A (en) * | 1985-03-01 | 1988-09-27 | Centocor, Inc. | Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III |
| AU580425B2 (en) * | 1985-05-24 | 1989-01-12 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Competitive elisa for the detection of antibodies |
| IT1214642B (it) * | 1985-11-21 | 1990-01-18 | Technogenetics Spa | Procedimento migliorato per la diagnosi in laboratorio di infezioni in particolare d avirushtlv iii. |
| US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
| US4808536A (en) * | 1986-02-27 | 1989-02-28 | Centocor, Inc. | Immunochemical method for detection of antibody against HTLV-III core protein based upon recombinant HTLV-III gag gene encoded protein |
| US4925784A (en) * | 1986-04-04 | 1990-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein |
| US4904581A (en) * | 1986-05-06 | 1990-02-27 | Epitope, Inc. | Method of detecting AIDS virus infection |
| DE3636540A1 (de) * | 1986-10-27 | 1988-04-28 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von anti-hiv, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren |
| AU1334588A (en) * | 1987-03-23 | 1988-09-22 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Assay for detecting hepatitis antigens and aids antibodies |
| FR2615623B1 (fr) * | 1987-05-22 | 1992-06-19 | Transgene Sa | Test de diagnostic du sida base sur la mise en evidence d'une diversite de la reponse isotypique, vaccins et serotherapies |
| EP0302154A1 (en) * | 1987-07-20 | 1989-02-08 | Soficorp Scientific Inc. | Detection of HIV and anti-lymphocyte antibodies |
| US5039604A (en) * | 1987-08-21 | 1991-08-13 | Cellular Products, Inc. | Test device and method of preparing same, assay kit and method for the simultaneous detection of two HTLV or HIV antibodies |
| JPH01113663A (ja) * | 1987-10-28 | 1989-05-02 | Eisai Co Ltd | Ａｔｌｖ抗体の測定試薬および測定方法 |
| IL89584A (en) * | 1988-03-15 | 1994-05-30 | Us Commerce | Focal immunoassay of hiv and hiv infected cells |
| US5268299A (en) * | 1988-04-14 | 1993-12-07 | Eastman Kodak Company | Diluent composition useful in the detection of antibodies in assays |
| US5077198A (en) * | 1988-04-14 | 1991-12-31 | Eastman Kodak Company | Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies |
| AU637097B2 (en) * | 1989-05-09 | 1993-05-20 | Abbott Laboratories | Process for preparing an improved western blot immunoassay |
| CA2017021A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Johannes Jacobus Schalken | Diagnostic test for detecting antibodies directed against antigens of one or more related viruses |
| DE69021640T2 (de) * | 1989-06-02 | 1996-04-04 | Abbott Lab | Standard-Reagenzien zur Quantifizierung von HIV p24. |
| AU635008B2 (en) * | 1989-12-13 | 1993-03-11 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd | Analytical apparatus and method for automated blot assay |
| CN103185795B (zh) * | 2011-12-30 | 2015-01-07 | 深圳市亚辉龙生物科技有限公司 | 一种检测eb病毒抗体的试剂装置及其方法 |
| CN102768276A (zh) * | 2012-07-23 | 2012-11-07 | 甘肃农业大学 | 脂环酸芽孢杆菌的间接elisa检测试剂盒及其应用 |
| CN104076153A (zh) * | 2014-05-14 | 2014-10-01 | 中国科学院海洋研究所 | 一种基于活性功能分子标记蔗糖酶信号系统及其应用 |
| AU2017361417A1 (en) | 2016-11-17 | 2019-06-13 | Capstone Surgical Technologies, Llc | Rotary oscillating surgical tool |
| WO2019083983A2 (en) | 2017-10-23 | 2019-05-02 | Bono Peter L | OSCILLATING SURGICAL INSTRUMENT / ROTARY FLAP MOVEMENT |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59151885A (ja) * | 1983-02-18 | 1984-08-30 | Eisai Co Ltd | 成人ｔ細胞白血病関連細胞株 |
| EP0136798A3 (en) * | 1983-08-25 | 1986-02-19 | Biotech Research Laboratories Inc. | Titre plate and assay kit for detection of antibodies in human serum and their production and use |
| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
| US4652599A (en) * | 1984-04-23 | 1987-03-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of continuous production of retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS using permissive cells |
-
1985
- 1985-04-22 NZ NZ228756A patent/NZ228756A/xx unknown
- 1985-04-22 IE IE102285A patent/IE58321B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-04-22 NZ NZ211860A patent/NZ211860A/xx unknown
- 1985-04-22 CA CA000479703A patent/CA1247005A/en not_active Expired
- 1985-04-23 EP EP85902364A patent/EP0181374B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-23 IL IL74995A patent/IL74995A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-04-23 AT AT85902364T patent/ATE69621T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-04-23 WO PCT/US1985/000762 patent/WO1985004903A1/en not_active Ceased
- 1985-04-23 GR GR850976A patent/GR850976B/el not_active IP Right Cessation
- 1985-04-23 AU AU43559/85A patent/AU571702B2/en not_active Expired
- 1985-04-23 DE DE8585902364T patent/DE3584716D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-04-23 KR KR1019850700402A patent/KR890001592B1/ko not_active Expired
- 1985-12-23 DK DK602285A patent/DK165958C/da not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-06-30 SG SG65692A patent/SG65692G/en unknown
-
1993
- 1993-02-04 HK HK70/93A patent/HK7093A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE851022L (en) | 1985-10-23 |
| GR850976B (da) | 1985-11-25 |
| IL74995A (en) | 1990-06-10 |
| DK602285A (da) | 1985-12-23 |
| EP0181374B1 (en) | 1991-11-21 |
| WO1985004903A1 (en) | 1985-11-07 |
| EP0181374A1 (en) | 1986-05-21 |
| IL74995A0 (en) | 1985-08-30 |
| KR860700046A (ko) | 1986-01-31 |
| HK7093A (en) | 1993-02-12 |
| NZ211860A (en) | 1990-10-26 |
| CA1247005A (en) | 1988-12-20 |
| SG65692G (en) | 1992-09-04 |
| AU4355985A (en) | 1985-11-15 |
| ATE69621T1 (de) | 1991-12-15 |
| DK165958C (da) | 1993-07-05 |
| AU571702B2 (en) | 1988-04-21 |
| DE3584716D1 (de) | 1992-01-02 |
| NZ228756A (en) | 1990-10-26 |
| DK602285D0 (da) | 1985-12-23 |
| KR890001592B1 (ko) | 1989-05-09 |
| IE58321B1 (en) | 1993-09-08 |
| EP0181374A4 (en) | 1986-09-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK165958B (da) | Fremgangsmaade til isolering af htlv-iii proteiner, serologisk detektering af antistoffer til htlv-iii i serum fra aids- og prae-aids-patienter og detektering af htlv-iii infektioner ved immunoassays samt testsystem til brug ved fremgangsmaaden | |
| JP2626721B2 (ja) | Ｈｔｌｖ―３の蛋白質の分離、エイズおよび前エイズ条件を持つ患者の血清中ｈｔｌｖ―３に対する抗体の血清学的検出、およびｈｔｌｖ―３およびその蛋白質を使用した免疫分析によるｈｔｌｖ―３感染の検出 | |
| EP0216191B1 (en) | Immunoassay for htlv-iii antigens | |
| US4661445A (en) | Competitive ELISA for the detection of HTLV-III antibodies | |
| US4886742A (en) | Enzyme immunoassay for detecting HIV antigens in human sera | |
| Araujo et al. | Antigenemia in recently acquired acute toxoplasmosis | |
| Forghani et al. | Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of enzyme immunoassay with neutralization, immune adherence hemagglutination, and complement fixation | |
| Forghani et al. | Antigen requirements, sensitivity, and specificity of enzyme immunoassays for measles and rubella viral antibodies | |
| US5705331A (en) | HIV nucleocapsid protein capture assay and method of use | |
| JPH02124461A (ja) | 免疫分析 | |
| US5637453A (en) | Whole blood method and kit for the detection of antibodies against human immunodeficiency virus (HIV) in HIV-seronegative individuals | |
| Masihi et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of influenza type-specific antibodies | |
| Tuokko | Comparison of nonspecific reactivity in indirect and reverse immunoassays for measles and mumps immunoglobulin M antibodies | |
| HU204929B (en) | Method and test set for detecting antibodies of aids retrovirus, as well as producing the retrovirus | |
| AU596404B2 (en) | Competitive elisa for the detection of antibodies | |
| US4814269A (en) | Diagnostic testing for antibodies against microorganisms | |
| Ravi et al. | A reverse passive haemagglutination test for detection of Japanese encephalitis virus antigens in cerebrospinal fluid | |
| Preissner et al. | Evaluation of the anticomplement immunofluorescence test for detection of antibody to varicella-zoster virus | |
| Chou et al. | Latex agglutination and enzyme-linked immunosorbent assays for cytomegalovirus serologic screening of transplant donors and recipients | |
| US4879211A (en) | Rapid immunoagglutination test for presence of HIV in body fluids | |
| De Stasio et al. | Screening for anti-human T-lymphotropic virus antibody in blood donors and polytransfused patients in Apulia (Italy) | |
| AU580425B2 (en) | Competitive elisa for the detection of antibodies | |
| Ishizaki et al. | Comparative diagnostic assay results for detecting antibody to HTLV-I in Japanese blood donor samples: particle agglutination but higher positive rates by immunofluorescence assays | |
| JPH05188057A (ja) | Ｈｉｖ−１抗体の免疫酵素的検出法 | |
| EP0302154A1 (en) | Detection of HIV and anti-lymphocyte antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |