JPH01113663A - Ａｔｌｖ抗体の測定試薬および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＡＴＬＶ抗体の測定試薬および測定方法に関す
る。従って本発明は主として医療の分野、とりわけ診断
薬、検査薬の分野において利用される。

〔従来の技術と問題点〕

ＡＴＬＶとはａｄｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍ
ｉａ　ｖｉｒｕｓ　、すなわち成人Ｔ細胞白血病ウィル
スの略称であり、別にＡＴＬ　ウィルスとも記述される
。

ＡＴＬＶおよびその抗体であり、本発明の測定対象であ
るＡＴＬＶ抗体については例えば下記文献に詳細に記述
されているので、それらの記述が本発明において参照さ
れる。

ｌ）　Ｍｉｙｏｓｈｉ、　１．ｅｔ　ａｌ　：Ｇａｎｎ
、　７１　：１５５．１９８０゜２）　Ｍｉｙｏｓｈｉ
、　Ｉ、　ｅｔ　ａｌ　：Ｊａｐ、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、０
ｎｃｏｌ、。

９（Ｓｕｌ）ｐｌ、）　：４８５．１９７９゜３）　Ｈ
ｉｎｃｕｎａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ　：Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

７８　：６４７６、１９８１゜ ４）　　Ｍｉｙｏｓｈｉ、　　ｆ、ｅｔ　ａｌ　：Ｇａ
ｎｎ、　　７３　：３９９．　１９８２゜５）　Ｍｉｙ
ｏｓｈｉ、　Ｉ、　ｅｔ　ａｌ　：Ｌａｎｃｅｔ　：６
ｇ３．１９ｇ２゜［３）　Ｓｈｉｍｏｙａｍａ、　Ｍ、
　ｅｔ　ａｌ　：Ｊａｐ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ
ｌ。

１２　：　１０９．　１９８２　。

７）　０ｈｋｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｉｍｍｕｎ
ｏｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、３．　Ｎｏ、５．　ｐ２６７、１９８３゜ＡＴ
ＬＶ抗体を測定する必要性並びに該測定に必要なＡＴＬ
関連抗原の製造方法およびその抗原を利用するＡＴＬＶ
抗体の測定方法と測定試薬については特開昭５９−６２
５２７号公報に詳細に記述されているので、それらの記
述もまた本発明において参照される。

上記文献の記述によれば、輸血供血者に相当数のＡＴＬ
Ｖ保持者がおり、輸血がＡＴＬＶの伝播に重要な役割を
果している可能性があるので、輸血供血者について血清
中のＡＴＬＶ抗体を測定し、それによってＡＴＬＶ保有
者をスクリーニングし、輸血による感染を防止すべきこ
と並びにそのための高感度な測定方法と測定試薬が提供
される必要があることが知られている。

かかる要請に応えて、特開昭５８−１８７８６１号公報
に記載の発明はＡＴＬ関連抗原産生細胞を利用して蛍光
免疫測定法あるいは酵素免疫測定法を適用する測定方法
を開示し、また前記特開昭５９−６２５２７号公報に記
載の発明はＡＴＬ関連抗原産生細胞を界面活性剤を用い
て処理することによりＡＴＬ関連抗原を製造し、当該抗
原を使用する測定方法および測定試薬を開示している。

ところでＡＴＬ関連抗原産生細胞およびそれから部分精
製して得られたＡＴＬ関連抗原にはＡＴＬＶ抗原以外に
非特異な種々の抗原成分が含まれている。従ってこれら
を利用して測定をおこなった場合には、これらのものは
測定対象であるＡＴＬＶ抗体を認識する以外に試料中に
存在する他の非特異な抗体成分、例えば抗核抗体あるい
は抗Ｔ細胞膜抗体をも認識することになり、測定結果は
必ずしもＡＴＬＶ抗体の存在を正確に表現しているもの
とは限らないことになるのである。

例えば全身性エリテマトーデスの患者の血清を試料とし
て測定した場合に、該試料はＡＴＬＶ抗体についてもと
もと陰性であるにもかかわらず、陽性としての測定結果
が得られることがある。

これは全身性エリテマトーデスに伴って生成する抗体成
分とＡＴＬ関連抗原中の非特異的成分とが反応した結果
であると考えられる。

かかる問題に対する一つの解決手段として特開昭６０−
３６９６７号公報に記載の発明が提示されている。該発
明は、適当なるＡＴＬＶ陰性細胞株、例えば急性リンパ
芽球性白血病患者からの細胞株を処理して得られる抗原
を別途に用意し、該抗原を使用して測定した測定結果を
対照として対比判定をおこなうことを要旨とするもので
あり、対比判定により非特異抗体に基づく測定錯誤を防
止することができるようになった。しかしながら該発明
にはなお疑義の残る余地がある。すなわちＡＴＬ関連抗
原が認識する非特異抗体とＡＴＬＶ陰性細胞株由来の抗
原が認識する非特異抗体とが免疫学的に同一であるとい
う保証はない。

むしろ精確には異なるとする方が正しい。従って後者の
存在不存在がそのまま前者の存在不存在を必ずしも表現
していることにはならず、結局該発明におけるＡＴＬＶ
抗体の存否判定にはまぎれが生じていることになる。そ
こで、本発明者らはＡＴＬＶ抗体を正確に紛れなく測定
することのできる方法を求めて検討を行い、その結果、
測定にあたりＡＴＬＶ抗原を被検試料に加えた試料を対
照試料として別途に用意し、被検試料についての測定結
果から対照試料についての測定結果を差引くことによっ
て当初の目的が達成されることを見出し、特開昭６０−
２４９０５８号公報に記載の発明を完成した。

その後本発明者は特開昭６０−２４９０５８号公報に記
載の発明の技術思想を利用しながら、さらに臨床検査の
日常業務の中で多数の被検試料について簡便単純にＡＴ
ＬＶ抗体を判定することのできる測定技術を見出すこと
を目的として検討を行った。

〔問題点を解決するための手段〕

種々の検討の結果、例えば電気泳動法によりあらかじめ
分子量分画したＡＴＬ関連抗原の転写ニトロセルロース
膜を用意しておき、当該膜に被検試料および被検試料に
ＡＴＬＶ抗原を添加して調製した吸収試料をそれぞれ加
え、それぞれにおいて出現するバンドを対比するだけで
簡便単純に被検試料中のＡＴＬＶ抗体の存在を判定する
ことができることを知り、本発明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明に係るＡＴＬ関連抗原とは、いわゆる成人Ｔ細胞
白血病関連抗原であり、さらに詳しくは、ＡＴＬ関連抗
原産生細胞中に抗原蛋白あるいはＣ型ウィルス粒子とし
て存在しているものである。ＡＴＬＶ抗体が存在すれば
、それとの間に特異的な抗原抗体反応を呈する。製造の
ためには、例えば成人Ｔ細胞白血病患者末梢血より採取
した白血病細胞との混合培養により樹立されたヒト謄帯
白血球由来のＭＴ−２と呼ばれる抗原産生細胞株を、界
面活性剤を用いて処理すればよい。

ＡＴＬ関連抗原についての、さらに詳細な説明並びにＭ
Ｔ−２および界面活性剤を用いる処理については、下記
文献の記述が参照される。

８）　Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ　：Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

７９　：２０３１．１９８２ ９）　Ｍｉｙｏｓｈｉ、　　Ｉ、　ｅｔ　ａｌ　：Ｇａ
ｎｎ、　？２　：９７８．　１９８１１０）　Ｍｉｙｏ
ｓｈ＋、　１．ｅｔ　ａｌ　：Ｎａｔｕｒｅ、　２９４
　ニア７０．１９８１１１）特願昭５７−１６９６７０
号 本発明に係るＡＴＬＶ抗原とは成人Ｔ細胞白血病の発病
ウィルス粒子に由来する該ウィルスに固有の抗原である
。ＡＴＬＶ抗体が存在すれば、それとの間に特異的な抗
原抗体反応を呈する。製造のためにはＡＴＬ抗原産生細
胞の培養上清からＡＴＬＶを濃縮して分離し、精製し、
次にかくして得られたＡＴＬＶを界面活性剤を用いて処
理すればよい。例えばＭＴ−２細胞の培養上清を濃縮お
よび超遠心分離してＡＴＬＶを回収し、さらにショ糖濃
度勾配をかけた超遠心分離をおこなって所定のフラクシ
ョンに分け、抗原陽性分画について透析して精製ＡＴＬ
Ｖを得る。次に精製ＡＴＬＶにデオキシコール酸ナトリ
ウムを加えて処理し、透析すればＡＴＬＶ抗原が得られ
る。

ＡＴＬ関連抗原を得るための産生細胞とＡＴＬＶおよび
ＡＴＬＶ抗原を得るための産生細胞とは必ずしも同一で
ある必要はない。しかし本発明におけるＡＴＬＶ抗原は
ＡＴＬ関連抗原を利用して測定する測定系の対照試料を
調製するためのものとして用意される関係上、両抗原は
同一の産生細胞から製造されるのが望ましい。

ＡＴＬ抗原産生細胞を処理してＡＴＬ関連抗原を得る方
法あるいはＡＴＬＶを処理してＡＴＬＶ抗原を得る方法
は処理のためのいかなる方法を採用してもよいが、例え
ばデオキシコール酸ナトリウム、オクチルフェノキシポ
リエトキシエタノール、ポリオキシエチレンαＱオクチ
ルフェニルエーテル等の界面活性剤を用いておこなう処
理がすすめられる。なお、界面活性剤による処理の詳細
について特開昭５９−６２５２７号公報の記述を参照に
することができる。

本発明においてＡＴＬ関連抗原は例えば電気泳動法によ
ってあらかじめ分子量分画し、ニトロセルロース膜に転
写しておく。この処理自体はウェスタンプロット法とし
て一般に公−知である。

例えばＡＴＬ関連抗原（ＯＤ２１１０３．６／ｍｆりを
長さ１２ｃｍの試料溝をもつ１ｍｍ厚の１２．５％ＳＤ
Ｓ／ポリアクリルアミドゲル上に２０ｍＡで３時間電気
泳動し、次にポリアクリルアミドゲルからニトロセルロ
ース膜へ１００　ｍＡで１４時間電気的に転写する。こ
の処理によってニトロセルロース膜上にハＡＴＬ関連抗
原に含まれる各種蛋白抗原がそれぞれの分子量に応じて
分画される。特に分子量３２．０００ダルトン、同２８
．０００ダルトン、同２４．０００ダルトン、同１９．
０００ダルトンの蛋白抗原はＡＴＬＶに特有の既知蛋白
抗原であることが知られており、それぞれＰ３２．　　
Ｐ２８．　　Ｐ２４．　　ＰＩ３と命名されてＡＴＬＶ
のメルクマールとなる。下記文献は当該分野における上
記記述の関連資料であり、参考のために列挙する。

１２）　Ｈａｙｎｅｓ、　Ｂ、Ｆ、、　Ｓ、巳、　Ｍｉ
ｌｌｅｒ、　Ｔ、　Ｊ、Ｐａ１ｋｅｒ。

Ｊ、０．　Ｍｏｏｒｅ、　Ｐ、Ｈ，Ｄｕｎｎ、　Ｄ、　
Ｐ、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ。

ａｎｄ　Ｒ，Ｓ、−Ｍｅｔｚｇａｒ、　１９８３．　Ｉ
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃ
ｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ａ　Ｊ
ａｐａｎｅｓｅｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｄｕｌｔ
　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　　ａｎｄｃｕｔａ
ｎｅｏｕｓ　ｌｙｍｐｈｏｍａｔｏｕｓ　ｖａｓｃｕｌ
ｉｔｉｓ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、　８０　：２０５４゜１３）　Ｋａｌｙａｎａｒａｍ
ａｎ、　Ｖ、　Ｓ、、　Ｍ、　Ｇ、　Ｓａｒｎｇａｄｈ
ａｒａｎ。

Ｂ、　Ｐｏ１ｅｓｚ、、　Ｆ、　Ｗ、Ｒｕ５ｃｃｔｔｉ
、　ａｎｄ　ＲｏＣ。

Ｇａ１ｌｏ、　１９８１．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ　ａ　ｔｙｐｅ　−Ｃｒ
ｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　１ｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍｃｕ
ｌｔｕｒｅｄ　ｈｕｍａｎ　Ｔ−１ｙｍｐｈｏｍａ　ｃ
ｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃｏｍ−ｐａｒｉｓｏｎ　　ｔｏ　
ｏｔｈｅｒ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕ
ｓｅｓ。

Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　３８　：９０６゜１４）　５
ｅｉｋｉ、　ＭｌＳ、Ｈａｔｔｏｒｉ、　Ｙ、　Ｈｉｒ
ａｙａｍａ、　ａｎｄＭ、Ｙｏｓｈｉｄａ、　　１９８
３．　　Ｈｕｍａｎ　ａｄｕｌｔ　Ｔ−ｃｅｌｌｌｅｕ
ｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　　：ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐ
ｒｏｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｏｍｅ　ｉｎｔｅｇｒａ−ｔｅ
ｄ　ｉｎ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｃｅｌｌ　ＤＮＡ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ、８０　：３６１ｇ。

本発明では特開昭６０−２４９０５８号公報に記載の発
明と同様に被検試料および被検試料にＡＴＬＶ抗原を添
加した吸収試料（対照試料）が用意されそれぞれについ
て測定が行われる。

被検試料はもっとも普通には被検血清として与えられ、
例えば輸血用血液からの血清の形で提供される。しかし
本発明は特にこれに限定されることはなく、形態および
出所についていかなる試料であってもよい。被検試料は
そのまま測定系の中へ加えられてもよいが、測定に先立
ち正常ウサギ血清（ＮＲ３）　によって適当な濃度に希
釈されることは自由である。

最も簡便にはＮＲ３およびＡＴＬＶ抗原液を別々の試験
管にとり、次に被検血清をそれぞれに加え前者を検体試
料、後者を吸収試料とすればよい。

また各試料は測定にあたっては適当な緩衝液を用いて反
応のための至適な濃度に希釈することが望ましく、例え
ば２％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０，０，９
％ＮａＣ１，０，１％ＮａＮ、を含む０．０２Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）を使用することがで
きる。

各試料はあらかじめ用意された前記転写ニトロセルロー
ス膜に加えられ、例えば室温で６０〜９０分間放置して
反応させる。次に洗浄用緩衝液でニトロセルロース膜を
洗浄して反応を終了させる。洗浄用緩衝液としては例え
ば０．９％ＮａＣ１゜０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含
む０．　ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ｊ（Ｃ１緩衝液（ｐＨ７，
５）を使用することができる。

反応があったバンドを検出するためには、適当な抗体検
出方法を適用して、反応バンドを出現させればよい。例
えば酵素標識間接法、ペルオキシダーゼ−抗ペルオキシ
ダーゼ複合体法（ＰＡＰ法）、アビジン−ビオチン標識
ペルオキシダーゼ複合体法（ＡＢＣ法）、抗ヒＨｇ結合
金コロイド法等を適宜に選択して出現させる。本発明は
これらの出現方法によって特別に限定されることはない
。

判定は以下のように行う。

先ずバンドの出現の程度について、濃厚に出現している
ときは十記号、やや薄いときは上記骨、出現していない
ときは一記号で表わすものとする。次にある分子量の蛋
白抗原に対するバンドの出現を検体試料および吸収試料
について対比し、表１に示すａ　−ｄの各場合に対応し
て蛋白抗原に対する抗体の存在または不存在の結果を判
定する。

表　　　１ ＡＴＬＶ抗体の陰性または陽−性を結論する最終判定は
対比すべきバンドの数が多くなるに従い高くなるので、
二以上のバンドを選択し、それぞれについて対比し、選
択した全てのバンドにおいて対比結果が不存在である場
合に最終判定は陰性であるとし、対比結果が存在である
バンドが一つでもある場合には最終判定は陽性であると
するのが望ましい。特に分子量３２．０００ダルトンの
蛋白抗原、同２８．０００ダルトンの蛋白抗原、同２４
．０００ダルトンの蛋白抗原、同１９．０００ダルトン
の蛋白抗原はＡＴＬＶに特有の既知蛋白抗原であるから
、これらに対するバンドを対比すべきバンドとして特別
に選択し、これらのうちの二以上の組合わせにおける対
比結果を上記の如く総合することによってＡＴＬＶ抗体
の最終判定をするのが好ましい。しかし本発明はこれに
限定されない。

本発明測定方法は操作が簡便単純であるにもかかわらず
、その最終判定は後記実験例によって示されるごと（、
ＥＩＡ法による判定と同様に正確であり、ＡＴＬＶ抗体
についての陰性血清と陽性血清とを正確に判別すること
を可能にする。

本発明測定試薬はＡＴＬ関連抗原の転写ニトロセルロー
ス膜およびＡＴＬＶ抗原を必須の構成要素として含有す
る試薬である。当該ニトロセルロース膜右よびＡＴＬＶ
抗原は前記本発明測定方法を実施するために不可欠の要
素であり、測定方法におけると同一の目的を達成するも
のである。

本発明測定試薬を一個のセットとした場合、該セット中
に測定操作の便益のために希釈用緩衝液あるいは正常ウ
サギ血清等を添付することは自由であり、これらによっ
て本発明は限定されない。同様にバンドの出現のために
使用される抗体検出用の各種試薬、例えば酵素標識間接
法で使用される酵素標識抗ヒ）　ＩｇＧ抗体と基質と発
色剤、あるいはＰＡＰ法で使用されるペルオキシダーゼ
−抗ペルオキシダーゼウサギ抗体複合体（ＰＡＰ複合体
）と基質と発色剤、あるいはＡＢＣ法で使用されるビオ
チン化洗ヒ）ＩｇＧ抗体およびアビジン結合ペルオキシ
ダーゼと基質と発色剤、あるいは抗ヒト■ｇ結合金コロ
イド法で使用される抗ヒト、ＩｇＧ結合金合金コロイド
液酸銀含有増感液等はいずれも測定操作の便益のために
自由に添付されるものであり、これらによって本発明は
限定されない。

〔実施例〕

以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的に
説明する。

実施例Ｉ ＭＴ−２細胞２．４Ｘ１０７個に０．１５Ｍ　リン酸緩
衝生理食塩液（ｐＨ７，２）を加え、遠心分離して細胞
をパックした。これに０．２％デオキシコール酸ナトリ
ウム含有ベロナール緩衝液（ｐＨ７，５，μ＝０、１４
５）　５−を加えた。４℃下で４時間スターラーによっ
て撹拌し、その後１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分
離した。上清をとり、透析チューブに詰め、０．１５Ｍ
　ＩＪン酸緩衝生理食塩液に対して４℃下で２日間透析
し、その後１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離した
。上清をとりＡＴＬ関連抗原含有上清とした。当該上清
の００２８０値は１５／ｍｊ！であった。

得られたＡＴＬ関連抗原含有上清に０．１５Ｍ　！Ｊン
酸緩衝生理食塩液を加えて００２１１０値が３．６／ｍ
ｆとなるように希釈し、長さ１２ｃｍの試料溝をもつ１
ｍｍ厚の１２．５％ＳＯ５／ポリアクリルアミドゲルに
て電気泳動（２０＋ｎＡにて３時間）した。泳動後の蛋
白は、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルからニトロセル
ロース膜へ電気的に転写（１００ｍＡにて１４時間）し
、転写ニトロセルロース膜として用意した。

なおＡＴＬＶ抗原は次のように調製した。ＭＴ−２細胞
の培養上清３βを１０．ＯＯＯｒｐｍ　、　３０分間遠
心分離し、上清を回収した。回収した上清を濃縮し、濃
縮液を１００．００Ｏｒｐｍで２時間超遠心分離し、Ａ
ＴＬＶを沈渣として回収した。この沈渣を４ｍ！！の０
、ＯＩＭ　　）リス塩酸緩衝液１））ｌＴ、５　（０，
１５Ｍ−ＮａＣ１゜０．００２Ｍ−ＢＤＴＡ、　０．１
％ＮａＮ＊を含む）によ＜サスヘンジョンした後、１０
．００Ｏｒｐｍ　、３０分間遠心分離し、上清を粗製ウ
ィルス濃縮液として回収した。

１５〜６０％（Ｗ／Ｗ）　゛のショ糖濃度勾配液４５ｍ
１をニトロセルロースチューブに作成し、その上に粗製
ウィルス濃縮液２ｍｊ！を層積し、ＲＰＳ−２５−２０
−タ（日立）にて２２．００Ｏｒｐｍ　、　１５時間超
遠心処理し。

た。処理後、チューブの底より５０滴（約２ｍ！り／管
づづ分割し回収した。ヒ）ＡＴＬＶ抗体をインヒビッシ
ョン用抗体として使用する酵素免疫測定法によって各分
割中のＡＴＬＶの測定をおこない、ＡＴＬＶ陽性分劃を
分割ルし、０．０１Ｍ）ＩＪス塩酸緩衝液ｐＨ７，５（
０，１５Ｍ−ＮａＣ１，０，００２Ｍ−ＢＤＴＡ、　０
．１％ＮａＮ、を含む）で透析し、ＡＴＬＶ液１．１５
ｇ／ｒｄ！を得た。透析後の液に０．２％となるように
デオキシコール酸ナトリウムを加え、４℃で３０分間撹
拌した。デオキシコール酸ナトリウムを除去するために
、０．０１Ｍ　）リス塩酸緩衝液ｐＨ７，５（０，１５
Ｍ−ＮａＣ１，０，００２Ｍ−ＥＤＴＡ、　０．１％Ｎ
ａＮ、を含む）で透析し、ＡＴＬＶ抗原を得た。ＡＴＬ
Ｖ抗原の蛋白量は００２８０　として１．２３／ｍ！で
あり、３５ｍ！回収された。

以上の転写ニトロセルロース膜およびＡＴＬＶ抗原を組
合わせて本発明測定試薬とした。

実施例２ 正常ウサギ血清（ＮＲ３）および実施例１で調製したＡ
ＴＬＶ抗原液を別々の試験管に１００逆づつとり、次に
被検血清を５０ｄづつそれぞれに添加し、前者を検体試
料液、後者を吸収試料液とした。

それぞれよく撹拌した後、３７℃、１時間放置し、その
５０珂を検体希釈用緩衝液（２％ゼラチン、　　０．０
５　　％Ｔｗｅｅｎ−２０，０，９％ＮａＣ１，０，１
％ＮａＮ、を含む０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液
、ｐＨ７，５）にて１．０−に希釈し、実施例１で得た
転写ニトロセルロース膜と室温下で６０分間反応させた
。反応終了後、洗浄用緩衝液（０，９％ＮａＣｌ、　０
．０５Ｔｗｅｅｎ−２Ｑを含む０．ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ緩衝液、ｐＨ７，５）にてニトロセルロース膜を
洗浄し、その後至適濃度に希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ヒトＩｇＧ抗体（または抗ヒＨｇＭ抗体）を加え、
室温下で６０分間反応させた。反応終了後、精製水にて
ニトロセルロース膜を洗浄し、その後４−り四ロ、−１
−ナフトール（５０ｍｇ／Ｊ）と０．０１％Ｈ２０，を
用いて酵素反応を行い、出現したバンドの分子量によっ
て判定を行った。

実施例３ 実施例２におけると同様に調製した検体試料液と吸収試
料液をそれぞれよく撹拌した後、４℃、−夜装置し、そ
の５０４を検体希釈用緩衝液にて１．Ｏｍｌに希釈した
後、実施例１で得た転写ニトロセルロース膜と室温下で
６０〜９０分間反応させた。反応終了後、洗浄用緩衝液
にてニトロセルロース膜を洗浄し、その後至適濃度に希
釈した抗ヒトＩｇＧ　　（または抗ヒトＩｇＭ）ウサギ
抗体を加えて室温下で３０分間反応させた。反応終了後
、洗浄用緩衝液にてニトロセルロース膜を洗浄し、その
後至適濃度に希釈した抗つサギＩｇＧヤギ抗体を加えて
室温下で３０分間反応させた。

反応終了後、洗浄用緩衝液にてニトロセルロース膜を洗
浄し、その後至適濃度に希釈したペルオキシダーゼ−抗
ペルオキシダーゼウサギ抗体複合体（ＰＡＰ複合体）を
加えて、室温下で３０分間反応させた。反応終了後、精
製水にてニトロセルロース膜を洗浄し、その後４−クロ
ロ−１−ナフトール（５０ｍｇ／ａ）と０．０１％Ｈ２
Ｏ２を用いて酵素反応を行い、出現したバンドの分子量
によって判定を行った。

実施例４ 実施例２におけると同様に調製した検体試料液と吸収試
料液をそれぞれよく撹拌した後、３７℃、１時間放置し
、その５０珂を検体希釈用緩衝液にて２０倍希釈し、実
施例１で得た転写ニトロセルロース膜と６０〜９０分間
反応させた。反応終了後、洗浄用緩衝液にてニトロセル
ロース膜を洗浄し、その後至適濃度に希釈したピオチン
化洗１ｇＧ（または抗ヒ）　ＩｇＭ）抗体を加え、室温
下で３０分間反応させた。反応終了後、洗浄用緩衝液に
てニトロセルロース膜を洗浄し、その後至適濃度に希釈
したアビジン結合ペルオキシダーゼを加えて室温下で３
０分間反応させた。反応終了後、精製水にてニトロセル
ロース膜を洗浄し、その後４−クロロ−１−ナフトール
（５０ｍｇ／ｄ！＞と０．０１％Ｈ２０□を用いた酵素
反応を行い、出現したバンドの分子量によって判定を行
った。

実施例５ 実施例２におけると同様に調製した検体試料液と吸収試
料をそれぞれよく撹拌した後、４℃、−夜装置し、その
５０ＡＬｌを検体希釈用緩衝液にて１．０ｒｎＩ！に希
釈した後、実施例１で得た転写ニトロセルロース膜と６
０〜９０分間反応させた。反応終了後、洗浄用緩衝液に
てニトロセルロース膜を洗浄し、その後至適濃度に希釈
した抗ヒ）ＩｇＧ（または抗ヒＨｇＭ）抗体結合金コロ
イド液を加え、室温下で３０〜６０分間反応させた。反
応終了後、ニトロセルロース膜を精製水で洗浄し、その
後０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３，７）で平衡化した
。

クエン酸緩衝液を除いた後、乳酸銀を含む増感液を加え
、遮光下で５〜１５分間反応させた。反応終了後、増感
液を棄て、固定液を加え５分間固定を行った後、精製水
で洗浄し、出現したバンドの分子量によって判定を行っ
た。

〔発明の効果〕

実験例をもって本発明の詳細な説明する。

実験例１ 検体と方法 ＥＩ八へによＡＴＬＶ抗体が陰性と判明している検体３
検体と陽性と判明している検体３検体の計６検体の被検
血清を用意した。

各検体につき実施例２記載の方法でバンドを出現させ、
Ｐ３２．　　Ｐ２８．　　Ｐ２４．　　ＰＩ３の各バン
ドにおけるバンドの出現の有無を求め、本発明による判
定を行った。

結果 結果を表２に示す 被検血清Ｎα１は検体側、吸収側ともいずれのバンドも
出現せず判定は陰性である。

被検血清Ｎα２は検体側でＰ２４のバンドが出現してい
るが吸収側でも消失せず同様にバンドが出現しているこ
とから、非特異的な反応と考えられ、判定は陰性である
。

被検血清Ｎα３も検体側、吸収側ともにＰ２８とＰ２４
のバンドが出現していることから、これらのバンドは非
特異的な反応と考えられ、判定は陰性である。

被検血清Ｎα４は検体側でＰ３２．　　Ｐ２８．　　Ｐ
２４゜ＰＩ３のバンドが出現しているが、吸収側では全
て消失していることから、特異的な反応と考えられ、判
定は陽性である。同様に被検血清Ｍｒ１．５とＮα６も
検体側に出現しているバンドが吸収側では消失している
ことから特異的な反応と考えられ、判定は陽性である。

特に被検血清Ｎα２とＮ００３の結果について検討して
みると、もし通常の測定法に従い検体側の出現バンドの
みから判定すると、これらの被検血清はもともとＡＴＬ
Ｖ抗体が陰性であるにもかかわらず陽性と誤った判定結
果を導くことになる。

しかし本発明方法に従い吸収試料と比較して判定すれば
、表２の如くそれらはやはりＡＴＬＶ抗体陰性であると
の正しい判定結果を得ることになり、真の陽性とは明瞭
に区別される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ＡＴＬ関連抗原を利用して被検試料中のＡＴＬＶ抗
   体を判定する測定試薬であって、当該ＡＴＬ関連抗原の
   転写ニトロセルロース膜およびＡＴＬＶ抗原を必須の構
   成要素として含むことを特徴とするＡＴＬＶ抗体の測定
   試薬。 ２　ＡＴＬ関連抗原がＭＴ−２細胞由来である特許請求
   の範囲第１項記載のＡＴＬＶ抗体の測定試薬。 ３　ＡＴＬＶ抗原がＭＴ−２細胞由来である特許請求の
   範囲第１項または第２項記載のＡＴＬＶ抗体の測定試薬
   。 ４　ＡＴＬ関連抗原を利用して被検試料中のＡＴＬＶ抗
   体を判定する測定方法において、当該ＡＴＬ関連抗原の
   転写ニトロセルロース膜に被検試料および被検試料にＡ
   ＴＬＶ抗原を添加して調製した吸収試料をそれぞれ加え
   、それぞれにおいて出現するバンドを対比することを特
   徴とするＡＴＬＶ抗体の測定方法。 ５　バンドがＡＴＬＶにおける分子量（ただし分子量は
   ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による。）
   ３２，０００ダルトンの蛋白抗原、同２８，０００ダル
   トンの蛋白抗原、同２４，０００ダルトンの蛋白抗原、
   同１９，０００ダルトンの蛋白抗原に対応してそれぞれ
   出現するバンドのいずれか二以上の組合わせである特許
   請求の範囲第４項記載のＡＴＬＶ抗体の測定方法。 ６　ＡＴＬ関連抗原がＭＴ−２細胞由来である特許請求
   の範囲第４項または第５項記載のＡＴＬＶ抗体の測定方
   法。 ７　ＡＴＬＶ抗原がＭＴ−２細胞由来である特許請求の
   範囲第４項ないし第６項のいずれか一項に記載のＡＴＬ
   Ｖ抗体の測定方法。