DK166730B - Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse - Google Patents
Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse Download PDFInfo
- Publication number
- DK166730B DK166730B DK119391A DK119391A DK166730B DK 166730 B DK166730 B DK 166730B DK 119391 A DK119391 A DK 119391A DK 119391 A DK119391 A DK 119391A DK 166730 B DK166730 B DK 166730B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- glu
- group
- ser
- thr
- asp
- Prior art date
Links
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims description 59
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 5
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 claims 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 99
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 39
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 39
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 36
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- -1 B29 amino acid Chemical class 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 6
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000759036 Sus scrofa Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100533230 Caenorhabditis elegans ser-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 101000713596 Homo sapiens T-box transcription factor TBX19 Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100036773 T-box transcription factor TBX19 Human genes 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N insulin rabbit Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol Chemical compound CNCO IZXGZAJMDLJLMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002103 osmometry Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 150000003641 trioses Chemical class 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
DK 166730 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte humaninsul inanaloger, som udviser lav associationsgrad i opløsning, farmaceutisk tolerable salte deraf og insulinpræpara-5 ter, -som indeholder disse.
DEN KENDTE TEKNIK
Siden insulinets opdagelse i 1922 har der været anvendt mange forskellige insulinpræparattyper til behandling af diabetes mellitus. I starten benyttede man udelukkende io insulinopløsninger med hurtigt indtrædende og relativt hurtigt ophørende insulinvirkning, men senere er der også fremkommet insulinpræparater med mere udstrakt virkningsprofil frembragt ved at sænke insulinets opløselighed ved tilsætning af f.eks. zinksalt og/eller protaminer. Af tilgængeligheds-15 grunde er det hertil anvendte insulin sædvanligvis blevet udvundet af bugspytkirtler fra husdyr, hyppigst okser, svin og får, men i de senere år er der på markedet- også fremkommet præparater indeholdende humaninsulin af bioteknologisk oprindelse.
20 Humaninsulin har den nedenfor anførte struktur: A-kæde
S-S
I 7 | H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-25 1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12
S
B-kæde S
30 H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-1234 56789 10 11 12 20
DK 166730 B
2 A-kæde (fortsat) -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 13 14 15 16 17 18 19 | 21
5 S
' ^ 1
B-kæde (fortsat) S
-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-10 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 B-kæde (fortsat) -Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH 25 26 27 28 29 30
Insulinerne fra visse husdyr er strukturmæssigt meget 15 lig med humaninsulin. Hunde- og svineinsulin adskiller sig blot fra humaninsulin ved at indeholde Ala i- 3o-stillingen i B-kæden, og kanininsulin adskiller sig blot fra humaninsulin ved at indeholde Ser i samme position. Ved hjælp af semisyn-tetiske fremgangsmåder er det muligt at omdanne disse insuli-20 ner til humaninsulin ved at udskifte B30-aminosyreresten med Thr, jfr. f.eks. Morihara et al., Nature 280 (1979), 412 -413, og Markussen (USA-patentskrift nr. 4.343.898).
Når et sådant insulin opløses ved fysiologisk pH-vær-di, indstiller der sig en koncentrationsafhængig associa-25 tionsligevægt mellem monomert, dimert, tetramert, hexamert og endog polymert insulin. Ligevægten kan eksempelvis bestemmes ved ultracentrifugering, ved osmometri eller ved gelfiltrering, jfr. f.eks. R. Valdes Jr. og G.A. Ackers, "Methods in enzymology", bind 61 (Enzyme Structure, del H, udgivere: 30 Hirs & Timasheff) , Academic Press 1979, side 125 - 142. I normale formuleringer af insulinpræparater forskydes denne ligevægt på en sådan måde, at insulinet i meget høj grad foreligger på en hexamer form.
3
DK 166730 B
Der kan foretages substitutioner i insulinmolekylet med henblik på at forbedre insulinets virkhingsprofil ved behandlingen af diabetes. Fra beskrivelsen til PCT-patent-ansøgning nr. WO 86/05497 er det således kendt at substituere 5 én eller flere af aminosyreresterne Glu i insulinmolekylet med en neutral aminosyrerest, hvorved der sker en forskydning af insulinets udfældningszone, således at der opnås langsom afgivelse efter injektion.
Fra beskrivelsen til europæisk patentansøgning med 10 publikationsnummer 214.826 kendes endvidere insulinanaloger, som absorberes særligt hurtigt efter injektion. Denne virkning skyldes, at man ved visse substitutioner især i B9-B12-stillingerne og i B26-B28-stillingerne i insulinmolekylet opnår en undertrykkelse af insulinets associeringsevne, så-15 ledes at det stort set foreligger på monomer eller dimer form. Imidlertid udviser mange af disse insulinanaloger en nedsat biologisk virkning.
Gennem årene er der beskrevet et stort antal, kunstigt fremstillede humaninsulinanaloger, som oftest med det formål 20 at belyse strukturens indflydelse på aktiviteten, jfr. f.eks. Mårke et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360 (1979), 1619 - 1632. Undersøgelser af indvirkningen af substitutioner i insulinets (B22-B26)-sekvens på receptorbindingen har været særligt interessante, da denne sekvens formodes at være et 25 væsentligt område for bindingen af insulinreceptoren, og da naturligt forekommende mutationer er fundet med substitutioner i dette område, jfr. f.eks. S. Shoelson et al. PNAS 80 (1983), 7390 - 94, og M. Kobayashi et al.: Biomed. Res. 5, (3) (1984), 267 - 72. Man finder meget lave biologiske akti- 30 viteter for analoger, hvori PheB24 eller PheB25 er substitueret, og det konkluderes derfor, at tilstedeværelsen af disse to aminosyrer har afgørende betydning for receptorbindingen.
Det har overraskende vist sig, at visse humaninsul inanaloger, hvori en af aminosyreresterne PheB24 eller PheB25 35 ikke er til stede, udviser lav associationstendens i opløsning og samtidig in vitro udviser uændret eller endog højere biologisk aktivitet end humaninsulin. Udeladelsen af enten
DK 166730B
4
PheB24 eller PheB25 har den virkning, at LysB2^ ændres til LysB28, hvilket fører til en positiv ladning i denne stilling i humaninsulinmolekylet.
SAMMENDRAG AF OPFINDELSEN
5 I det bredeste aspekt angår den foreliggende opfindel se følgelig humaninsulinanaloger, i hvilke der i B28-stillin-gen er en positivt ladet aminosyrerest, dvs. Lys eller Arg, dvs. i 8-stillingen i B-kæden beregnet fra GlyB20.
De foreliggende insulinanaloger har overraskende en io lav associeringsgrad og samtidig en forøget fysisk stabilitet sammenlignet med andre insulinanaloger med lav associeringsgrad. Indførslen af en positiv ladning i B28-stillingen kan opnås på to måder. Enten ved at udelade en af aminosyreresterne i B24-, B25-, B26-, B27- eller B28-stillingen i hu-15 maninsulinmolekylet, hvilket giver en humaninsulinanalog med Lys i B28-stillingen, eller ved at udskifte ProB28 i humaninsulinmolekylet med Lys eller Arg. Hvis der· foretrækkes Arg i B28-stillingen, kan udeladelsen af en af aminosyrerne i B24-, B25-, B26—, B27- eller B28-stillingen yderligere kombi-20 neres med udskiftning af den oprindelige LysB29 med en Argrest.
De foreliggende humaninsulinanaloger kan yderligere have én eller flere ændringer i den C-terminale ende af B-kæden, sammenlignet med humaninsulin. Aminosyreresterne i 25 stillingerne B25 - B27 og aminosyreresterne efter LysB28 el-ler ArgD kan arbitrært vælges blandt de naturligt forekommende aminosyrerester, eller B29-aminosyren eller B30-amino-syren eller begge kan mangle.
Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse 30 kan TyrB26 være erstattet af en anden, uladet aminosyrerest, i hvilken det andet kulstofatom i sidekæden (C^) er sp2-hy- bridiseret (bindingerne har en (mere) plan struktur).
Med henblik på at stabilisere molekylet mod kemisk nedbrydning kan Asn i A21-stillingen og/eller B3-stillingen 5
DK 166730 B
endvi'dere være udskiftet med en anden aminosyrerest.
De foreliggende humaninsulinanaloger "er kendetegnet ved følgende formel I: A-kæde
5 S-S
I "" r H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- s 10 |
B-kæde S
H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- A-kæde (fortsat) (I)
15 -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y1-OH
s
B-kæde (fortsat) S
20 | -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- B-kæde (fortsat) -X1-X2-X3-X4-X5-X6 hvor X1, X2, X3, X5, Y1 og Y2 kan være en hvilken som helst, 25 naturligt forekommende aminosyrerest, idet dog X^ ikke er Pro, X4 er Lys eller Arg, X6 kan være en hvilken som helst, naturligt forekommende aminosyrerest, som bærer den C-termi-nale hydroxygruppe, eller -OH, eller X5 og X6 danner sammen den C-terminale hydroxygruppe, eller er farmaceutisk to-30 lerable salte deraf.
Ved en anden udførelsesform af opfindelsen udvælges X5
DK 166730B
6 blandt gruppen bestående af en hvilken som helst, naturligt forekommende aminosyrerest med undtagelse af Tro.
Ved en udførelsesform kan Y1 og/eller Y2 i ovennævnte formel være udvalgt blandt gruppen bestående af en hvilken 5 som helst, naturligt forekommende aminosyrerest med undta-gel-se. af Asn.
I ovennævnte formel I kan X1 mere specifikt være Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn eller Tyr, X2 kan mere specifikt være Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser eller Phe, X3 kan mere spe-10 cifikt være Pro, Glu, Asp, Ser, Thr eller His, X5 kan mere specifikt være Lys, Thr, Ser, Ala, Asp eller Glu, X6 kan mere specifikt være Thr-OH, Ser-OH, Ala-OH, Asp-OH, Glu-OH eller -OH, Y1 kan være Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr, Gin eller Gly, mere foretrukket Gly, Asp, 15 Glu eller Ala, og Y2 kan være Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala, Met, Trp, Tyr, Gin eller Gly, mere foretrukket Glu eller Asp.
En gruppe af de foreliggende humaninsulinanaloger kan karakteriseres som sådanne, i hvilke en af aminosyreresterne 20 i B24- eller B25-stillingen er udeladt, at aminosyreresten i B26-stillingen eventuelt er udskiftet med en anden, uladet aminosyrerest, i hvilken kulstofatomet i γ-stillingen er sp2-hybridiseret, at eventuelt én eller flere af aminosyreresterne i A21-, B3- og B3O-stillingen er forskellig fra amino- 25 syreresten i den tilsvarende stilling i humaninsulin, og at der eventuelt ikke er nogen aminosyrerest i B3O-stillingen.
Ifølge en mere enkel definition er sådanne analoger humaninsulinanaloger, i hvilke der ikke findes TyrB2^, i hvilke PheB25 eventuelt er udskiftet med en anden, uladet 30 aminossyrerest, i hvilken kulstofatomet i γ-stillingen er SP -hybridiseret, i hvilket én eller flere af aminosyreresterne i A21-, B3- og B30-stillingerne eventuelt er for skellige fra aminosyreresterne i humaninsulin, og i hvilke der eventuelt ikke er nogen aminosyrerest i B3O-stillingen.
35 Eksempler på uladede aminosyrerester, i hvilke er sp -hybridiseret, er Tyr, Phe, His, Trp eller Asn.
En gruppe af humaninsulinanaloger ifølge denne opfin- 7
DK 166730 B
delse' har strukturen, der er vist med nedenstående formel II, hvor X betegner Tyr, His, Phe eller Asn, Y beregner Thr, Ser, Ala, Asp eller Glu eller er udeladt, og hvor eventuelt én eller begge de understregede Asn er udskiftet med Asp ved 5 udskiftning eller deamidering, eller den understregede Asn i A-kæden kan være Gly.
A-kæde
S-S
I I
10 H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- s
B-kæde S
15 | H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- A-kæde (fortsat) (II) -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH 20 |
S
B-kæde (fortsat) S
25 -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 1 B-kæde (fortsat)
-X-Thr-Pro-Lys-Y-OH
Foretrukne humaninsulinanaloger ifølge den foreliggende opfindelse er følgende: des(PheB25)-humaninsulin, des-
DK 166730B
8 (TyrB26)-humaninsulin, des(Thr527)-humaninsulin, des(Pro528)-humaninsulin, des(Phe525)-svineinsulin, des(Pro528)-svinein-sulin, des(ProB28)-kanininsulin, des(PheB25),des(Thr530)-humaninsulin, des(Tyr526),des(Thr530)-humaninsulin, (Ser^21)-5 des(Pro528)-human insulin, (GlyÅ21)-des(Pro528)-humaninsulin, (GlyA2^)-des(Phe525)-humaninsulin, (AspA21j-des(Phe525)-humaninsulin, (His525)-des(Tyr526),des(Thr530)-humaninsulin, (AsnB25)-des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsulin, (AspA21)-des(PheB25),des(Thr530)-humaninsulin, (Asp528)-des(PheB25)-10 humaninsulin, (Asp53)-des(Phe525)-humaninsulin, (Lys528)-hu-maninsulin, (Lys528,Thr529)-humaninsulin og (Arg528)-des-(Lys529)-humaninsulin.
Humaninsulinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse kan fordelagtigt anvendes ved behandling af diabetes, 15 da den formindskede associationsgrad fører til en hurtigere optagelse i blodstrømmen, end det er tilfældet med almindeligt insulin, ikke blot efter den almindeligt anvendte, subkutane injektion, men også ved non-parenteral indgivelse, jfr. international patentansøgning nr. WO '87/06137. Deres 20 forbedrede fysiske stabilitet gør dem mere fordelagtige i behandlingen af diabetes.
Insulinanalogerne ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles ved at ændre proinsulingenet ved at udskifte kodoner på egnede steder i det naturlige humanproinsulingen 25 med kodoner, der koder for de ønskede aminosyrerester og/el-ler ved at udelade kodoner svarende til de ønskede udeladelser. Alternativt kan man syntetisere hele DNA-sekvensen, der koder for den ønskede insulinanalog. Genet, der koder for den ønskede insulinanalog, indsættes derefter i en egnet ekspres-30 sionsvektor, der, når den overføres til en egnet værtsorganisme, f.eks. E. coli, Bacillus eller gær, laver det ønskede produkt. Ekspressionsprodukete isoleres derefter fra cellerne eller dyrkningsmediet afhængigt af, hvorvidt ekspressionsproduktet udskilles fra cellerne eller ej.
35 De hidtil ukendte insulinanaloger kan også fremstilles ved kemisk syntese ved metoder, der er analoge med den meto- 9
DK 166730 B
de, der er beskrevet af Mårki et al. (Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem., 360 (1979), 1619 - 1632). DeT'kan også dannes fra adskilte, in vitro fremstillede A- og B-kæder indeholdende de relevante aminosyrerester og udeladelser, hvorefter de 5 modificerede A- og B-kæder knyttes sammen ved at danne di-sulfidbroer på kendt måde (f.eks. Chance et al., i: Rick DH, Gross E (udgivere) Peptides: Synthesis - structure - Function. Proceedings of the seventh American peptide symposium, Illinois, 721 - 728).
10 Insulinanalogerne kan endvidere fremstilles ved en metode, der er analog med den metode, der er beskrevet i europæisk patentansøgning med publikationsnummer 163.529, hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. Ved sådanne metoder udtrykkes en insulinprecursor for humaninsulinanalogen, hvori 15 den basiske aminosyre i B28- eller B29-stillingen, (hvis slutproduktet skal have en basisk aminosyre i denne stilling) knyttes til GlyA1 enten ved hjælp af en peptidbinding eller en peptidkæde af varierende længde og udskilles af gær med disulfidbroerne i de rigtige stillinger og omdannes derefter 20 til den ønskede humaninsulinanalog under anvendelse af Mori-haras metode (Morihara supra) eller den såkaldte transpepti-deringsreaktion (se USA-patentskrift nr. 4.343.898).
De foreliggende insulinanaloger kan følgelig fremstilles ved at indsætte en DNA-sekvens, der koder for en precur-25 sor for den pågældende insulinanalog, i en egnet gærekspressionsvektor, der, når den transformeres til gær, er i stand til udtrykke og udskille precursoren for insulinanalogen, i hvilken LysB28, ArgB28, Lys629 eller ArgB29 er knyttet til GlyA1 med en peptidbinding eller en peptidkæde med formlen 30 III
-Rn-R1- (III) hvor R er en peptidkæde med n aminosyrerester, n er et helt tal fra 0 til 33, og R1 er Lys eller Arg, når den transformerede gærstammer dyrkes i et egnet næringsmedium. Precur-35 soren udvindes derefter fra dyrkningsmediet og omsættes med 10
DK 166730 B
en aminoforbindelse med formlen IV
Q-QR" (IV) hvori Q er en enkelt aminosyrerest, fortrinsvis Thr, eller et dipeptid, og R" er en carboxylbeskyttelsesgruppe (f.eks.
5 methyl eller tert.butyl), under anvendelse af trypsin eller et trypsinlignende enzym som katalysator i en blanding af vand og organisk opløsningsmiddel på analog måde som beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.343.898 (hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning), hvorefter carboxylbeskyttelses-io gruppen fjernes, og insulinanalogen isoleres fra reaktionsblandingen.
Hvis insulinanal ogerne som den C-terminale rest i B-kæden indeholder en aminosyrerest, der er forskellig fra Lys eller Arg , kan de også fremstilles ved en metode, der er 15 analog med den metode, der er beskrevet i europæisk patentansøgning med publikationsnummer 195.691, hvis beskrivelse inkorporeres heri ved reference. Ved denne metode fremstilles insulinanalogprecursorer af den art, der har -en bro mellem A~ og B-kæden bestående af et enkelt par af basiske aminosyrer 20 (Lys, Arg) , i gær, og de omdannes derefter til. insulinanalo-gen ved enzymatisk omdannelse.
Hvis den C-terminale aminosyrerest i B-kæden er Lys eller Arg, kan insulinanalogerne fremstilles ud fra ovennævnte biosyntetiske precursorer ved enzymatisk spaltning med 25 trypsin.
Humaninsulinanalogerne ifølge denne opfindelse, i hvilke der kun findes udskiftninger inden for de sidste ami-nosyrerester nærmest den C-terminale ende af B-kæden, kan endvidere fremstilles på i og for sig kendt måde ud fra 30 f.eks. svineinsulin som beskrevet i K. Inoye et al.; JACS 101 (3), (1979), 751 - 752, hvorved svineinsulin først spaltes med trypsin til des-(B23-30)-humaninsulin, hvorefter sidstnævnte enzymatisk kobles med et syntetisk peptid, der har den ønskede aminosyresekvens.
35 De foreliggende insulinanaloger kan anvendes til frem- 11
DK 166730 B
stilling af hidtil ukendte præparater med insulinaktivitet, der kan erstatte human- og svineinsulin i dé~"insulinpræparater, der hidtil har været kendt. Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater, der er kendetegnet ved at indeholde en 5 humaninsulinanalog med den i krav 1 angivne formel eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. Sådanne præparater foreligger i vandig opløsning eller suspension, fortrinsvis ved neutral pH-værdi. Det vandige medium er gjort isotonisk, f.eks. med natriumchlorid, natriumacetat eller glycerol. End-io videre kan det vandige medium indeholde zinkioner, pufferstoffer, såsom acetat og citrat, og konserveringsmidler såsom m-cresol, methylparaben eller phenol. Præparatets pH-værdi indstilles til en ønsket værdi, og insulinpræparatet steriliseres ved sterilfiltrering.
15 De foreliggende insulinanaloger kan også blandes med andre insulinanaloger med retarderet insulinaktivitet til fremstilling af insulinpræparater bestående af en blanding af hurtigtvirkende og protraheret virkende insulin.
Insulinpræparaterne ifølge denne opfindelse kan anven-20 des analogt med anvendelsen af kendte insulinpræparater.
TERMINOLOGI
De for aminosyrerne anvendte forkortelser er dem, der er angivet i J.Biol.Chem. 243 (1968), 3558. Aminosyrerne er i L-konfiguration. Arten af de heri angivne insuliner er human, 25 medmindre andet er angivet.
KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGERNE
Opfindelsen belyses yderligere under henvisning til vedlagte tegninger, på hvilke
Fig. 1 viser ekspressionsplasmidet pYGABA 14-276, 30 Fig. 2 viser gærvektoren pAB24,
Fig. 3 viser DNA-sekvensen af det 0,4 kb lange EcoRI-Xbal-fragment fra plasmidet pKFN-864, og
DK 166730B
12
Fig. '4 viser fremstillingen af ekspressionsplasmidet pKFN- 866.
DETALJERET BESKRIVELSE
• DNA-sekvenser, som koder for modificerede insulinpre-5 cursorer, konstrueres med basis i ekspressionskassétten, der er indeholdt i BamHI-restriktionsfragmentet fra ekspressionsplasmidet pYGABA som vist i fig. 1. Det har en længde på 1103 basepar og indeholder i det væsentlige følgende (nævnt i rækkefølge startende fra 5'-enden): GAPDH-promotoren (Travis io et al., J. Biol. Chem., 260 (1985), 4384 - 4389) efterfulgt af det kodende område bestående af følgende: De 83 N-terminale aminosyrer af MF al-leadersekvensen kodet for af vildtype-gær-DNA-sekvensen som beskrevet af Kurjan & Herskowitz efterfulgt af de to kodons AAA og AGA for Lys og Arg og efterfulgt 15 af det kodende område for insulinprecursorenkeltkæde des[ThrB30]-humaninsulin (SCI), som er et syntetisk fremstillet gen, hvor der er benyttet foretrukne gærkodons. Efter to stopkodons findes et Sall-restriktionssted, og resten af sekvensen udgøres af MFal-sekvensen indeholdende ter-20 minatorområdet. Sekvensen er fremstillet udelukkende ved hjælp af standardteknikker.
Den anvendte metode er den såkaldte "oligonucleotide site directed mutanegesis", som er beskrevet af Zoller & Smith, DNA, bind 3. (1984), Nr. 6, 479 - 488. Metoden er kort 25 beskrevet i det følgende og er detaljeret beskrevet i eksempel 1: Isoleret fra ekspressionsplasmidet indsættes insulin-precursorsekvensen i en enkeltstrenget, genomt cirkulær M13-bakteriofagvektor. Til det enkeltstrengede genom annelleres en kemisk syntetiseret komplementær DNA-streng. DNA-strengen 30 indeholder den ønskede sekvens omgivet af sekvenser, som er helt homologe med insulinsekvenser i det cirkulære DNA. Derpå forlænges primeren biokemisk in vitro i hele det cirkulære genoms længde under anvendelse af Klenow-polymerase. Denne streng vil bevirke dannelse af enkeltstrengede fager, som ved 35 dyrkning i E.coli gør det muligt at isolere dobbeltstrenget 13
DK 166730 B
DNA med den ønskede sekvens. Fra dette dobbeltstrengede DNA kan der isoleres et restriktionsfragment, som kan genindsættes i ekspressionsvektoren.
FREMGANGSMÅDE TIL UDFØRELSE AF OPFINDELSEN
5 Opfindelsen illustreres yderligere ved følgende eksempler: EKSEMPEL 1
Konstruktion af ekspressionsplasmidet, der kan anvendes til at udtrykke des(PheB25]-SCI.
io Ekspressionskassetten, der er indeholdt i ekspres sionsplasmidet pYGABA (vist i figur 1) på et BamHI-restrik-tionsfragment, isoleres: Ekspressionsplasmidet inkuberes med restriktionsendonuclease BamHI. Betingelserne var: 20 jug plasmid, 50 enheder BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-15 værdi: 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i et rumfang på 100 μΐ. Temperaturen var 37°C og reaktionstiden 2 timer. De to DNA-fragmenter opspaltes på en 1%'s agarosegel, og de tørrede fragmenter isoleres.
Ligering til M13 vektoren Ml3mpi8: 20 Det isolerede restriktionsfragment ligeres til bakte- riofagvektoren M13mpl8 også klippet med restriktionsendo-nukleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: 0,2 μg frag ment, 0,02 μg vektor, 50 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et rumfang på 20 μΐ. 5 μΐ af 25 denne blanding transformeres ind i E. coli-stammen JM101. Tilstedeværelsen af fragment i vektoren og orienteringen af fragmentet bestemmes ved restriktionsenzymkortlægning på dobbeltstrenget M13-DNA, som er isoleret for transformanter.
Isolering af enkeltstrenget (ss) DNA (templat): 30 ss-DNA isoleres fra ovennævnte transformant under an vendelse af en metode, der er beskrevet af Messing i Gene 19
DK 166730 B
14.
(1982), 269 - 276.
5'-fosforylering af mutageniserlngsprimeren:
Mutagenisationsprimern med sekvensen 51-TTGGAGTGTA-GAAACCTCTT-31 phosphoryleres i 5'-enden i en 30 μΐ reaktions-5 blanding indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,0, 10 mM MgCl2/ 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonucleotid og 3,6 enheder af T4 polynucleotidkinase. Reaktionen udføres i 30 minutter ved 37°C. Derefter inaktiveres enzymet ved at inkubere blandingen i 10 minutter ved 65°c.
io Sammenføjning af templat og phosphoryleret mutageniseringsprimer:
Sammenføjningen af templat og primer udføres i et 10 μΐ rumfang indeholdende 0,5 pmol templat, 5 pmol primer, 20 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM 15 DTT ved opvarmning i 10 minutter ved 65“C og efterfølgende afkøling til 0°C.
Ekstension/ligeringsreaktion:
Til ovennævnte reaktionsblanding sættes 10 μΐ af følgende blanding: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM 20 TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enheder T4 DNA ligase og 2,5 enheder af Klenowpoly-merase. Derefter udføres omsætningen i 16 timer ved 16°C,
Transformering af JM101:
Ovennævnte reaktionsblanding transformeres i forskel-25 lige fortyndinger til CaCl2-behandlet E.coli JM191-celler under anvendelse af standardprocedurer og udspredes på 2 x YT-topagar på 2 x YT-agarplader. (2 x TY = trypton: 16 g/1, gærekstrakt: 10 g/1, NaCl 5 g/1. 2 x YT-topagar = 2 x YT tilsat 0,4% agarose og autoklaveret. 2 x YT-agarplader = 2 x YT 30 tilsat 2% agar og autoklaveret). Pladerne inkuberes natten over ved 37°C.
DK 166730B
15
Identificering af positive kloner:
Der anvendes plaque-lifthybridisering,~som beskrives i det følgende: Et nitrocellulosefilter anbringes på en plade med en passende plaquetæthed, således at filteret befugtes.
5 Filteret bades herefter i følgende opløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M. NaOH i 30 sekunder, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH-vær-di: 8,0 i 1 minut, 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M"natriumcitrat) til senere brug. Filteret tørres på et 3 MM filtrerpapir og pvarmes i 2 timer ved 8°C i en vakuumovn.
io Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5'-TTGGAGTGTA- GAAACCTCTT-31 mærkes radioaktivt i 5'-enden i et 30 μΐ reak-tionsrumfang indeholdene 70 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonucleotid, 20 pmol γ-·*2Ρ-ΑΤΡ og 3,5 enheder T4-polynucleotidkinase. Blandingen inkuberes ved 15 37°C i 30 minutter og derefter i 5 minutter ved 100°C.
Det tørre filter præhybridiseres i 2 timer ved 65° C i 6 x SSC, 0,2% okseserumalbumin, 0,2% "Ficoll"®, 0,2% poly-vinylpyrrolidon, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 jug/ml laksesperm-DNA. Derefter sættes reaktionsblandingen indehol-20 dende den mærkede probe til 15 ml frisk præhybridiserings-blanding, og filteret bades deri natten over ved 28eC under forsigtig omrystning. Efter hybridisering vaskes filteret tre gange i 2 x SSC + 0,1% SDS i 15 minutter pr. gang, hvorpå der autoradiograferes. Efter vaskning i den samme opløsning, men 25 nu ved 52° C og ny autoradiografering identificeres plaques indeholdende DNA-sekvenser, som er komplementære til mutageniseringsprimeren .
Re-screening af positive kloner
Da den identificerede klon er et resultat af en he-30 teroduplex, udplades plaquen igen. Hybridiseringen og identificeringen gentages.
Oprensning af dobbeltstrenget M13-fag-DNA
En rescreenet klon anvendes til infektion af E. coli-stamme JM101. En kultur indeholdende ca. 108 fager og 5 kolo- 16
DK 166730 B
nier 'af JM101 dyrkes i 5 timer i et 5 ml 2 x YT medium ved 37°C. Derefter oprenses dobbeltstrenget, cirkulært DNA fra pelletten under anvendelse af den fremgangsmåde, som er beskrevet af Birnboim, & Doly, Nucleic Acids, Res., 2 (1979), 5 1513.
Isolering af et restriktionsfragment indeholdende modificeret insulinprecursor DNA-præparationen (ca. 5 μg) oprenset som beskrevet ovenfor spaltes med 10 enheder af restriktionsendonucleasen io BamHI i 60 μΐ 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i 2 timer ved 37eC. DNA-produkterne adskilles på en agarosegel, og fragmentet oprenses fra gelen.
Ligering til gærvektoren pAB24 (fig. 2)
Det isolerede restriktionsfragment ligeres til gærvek-15 toren pAB24, som er skåret med restriktionsendonucleasen BamHI, i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μg, vektor 0,02 /xg, 50 mM Tris-HCl, pH-værdi: 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM
DTT, 1 mM ATP i et samlet rumfang på 20 μΐ-. 5 μΐ af reaktionsblandingen anvendes til transformation af E. coli-stam-20 men MC1061, hvori det modificerede ekspressionspiamid identificeres og opformeres. Plasmidet er identisk med pYGABA, bortset fra det deleterede kodon.
Transformation af gær
Transformation af ekspressionspladmidet til gærstammen 25 Saccharomyces cerevisiae JC482ÅpepALeu2cir° (a, his4, pep4, ura3, leu2, cir°) gennemføres som beskrevet at Ito et al., J. Bact., Vol 153 (1983), No. 1, 153 - 168. De transformerede celler udplades på SC-ura-medium (0,7% Yeast Nitrogen Base, 2,0% glucose, 0,5% casaminosyrer, 2,0% agar) til selektion 30 for plasmidholdige celler.
17
DK 166730 B
Eksempel 2
Konstruktion af et ekspressionsplasmid, som kan anvendes til produktion af des(TyrB26)-SCI.
Der gås frem på stort set samme måde som beskrevet 5 ovenfor i eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren har sekvensen 5' -ACCCTTTGGAGTGAAGAAACCTCT-if'at hybridi-seringstemperaturen er 36°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen er 60°C. Det modificerede plasmid har en sekvens, som er identisk med pYGABA, bortset fra det deleterede io kodon.
Eksempel 3
Konstruktion af et ekspressionsplasmid, som kan anvendes til produktion af (HisB25),des(TyrB26)-SCI.
Der gås frem på stort set samme måde som beskrevet 15 ovenfor i eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren har sekvensen 5'AATACCCTTTGGAGTGTGGAAACCTCTTTCACC-3', at hy-bridiseringstemperaturen er 43°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen er 66’C. Det modificerede plasmid har en sekvens, som er identisk med pYGABA, bortset fra de modi-20 ficerede og deleterede kodons.
Eksempel 4
Konstruktion af et ekspressionspiamid, som kan anvendes til produktion af (AsnB25),des(TyrB26)-SCI.
Der anvendes stort set samme fremgangsmåde som beskre-25 vet ovenfor i eksempel 1 bortset fra, at mutageniseringsprimeren har sekvensen 51-AATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCTCTTTCACC-31, at hybridiseringstemperaturen er 42°C, og at vasketemperaturen efter hybridiseringen er 65°C. Det modificerede plasmid har en sekvens, som er identisk med pYGABA, bortset 30 fra de modificerede og deleterede kodons.
18
DK 166730 B
Eksempel 5
Ekspression af precursor og isolering deraf fra kulturmediet.
Gær, som er transformeret som beskrevet i eksempel l -4, propageres på Petriskåle, som indeholder minimalmedium 5 udenniracil, i 48 timer ved 30°C. 100 ml rystekolber indeholdende minimalmedium uden uracil + 5 g/1 casaminosyrer + 10 g/1 ravsyre + 30 g/1 glucose ved pH 5,0 inokuleres med en enkelt koloni fra Petripladen. Kolberne rystes derpå ved 30°C i en inkubator i 72 timer.
10 Efter centrifugering steriliseres 1 liter opsamlet su pernatant ved filtrering og indstilling på pH-værdien 4-4,5 og en ledningsevne under 10 mS ved tilsætning af 5 M saltsyre samt vand. Med en gennemstrømingshastighed på 120 ml/time sættes supernatanten derpå på en 1,6 x 6 cm søjle af S/"Se-15 pharose"® FF, som i forvejen er ækvilibreret med 50 mM eddikesyre, 50% (rumfang) ethanol, indstillet på pH-værdien 4,0 med NaOH. Søjlen vaskes derpå med 60 ml puffer, hvorefter precursoren elueres med en lineær gradient af NaCl fra 0 til 0,35 M i 360 ml puffer med en gennemstrømningshastighed på 10 20 ml/time. Eluatet opdeles i fraktioner på 4 ml og detekteres for UV-absorbans. Fraktioner indeholdende precursor identificeres ved hjælp af RP-HPLC-analyse, og fraktionerne hældes sammen. Efter afsaltning på en søjle af "Sephadex"® G25 i 1 M eddikesyre isoleres precursoren ved frysetørring.
25 Eksempel 6
Fremstilling af des (PheB2S),des(ThrB30)-humaninsulin.
400 mg des(PheB25)-SCI, fremstillet ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 1 og 5, opløses i 40 ml 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% (rumfang) ethanol 30 indstillet til pH-værdien 9 med HC1, og 40 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 32 mg immobiliseret trypsin i den samme puffer tilsættes. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8 - 10°C med forsigtig omrøring, hvorpå der filtreres. Gelen vaskes med 40 ml puffer, og de opsamlede fil- 19 trate'r sættes på en 2,6 x 7,5 cm søjle af Q-"Sepharose"® FF, som forinden er ækvilibreret med 50 mM tr i s*( hydroxymethyl) -aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet på pH-værdien 8,0 med HC1. Derefter elueres søjlen med en lineær 5 gradient af NaCl fra 0 til 0,15 M i den samme puffer i løbet af -6 -timer med et flow på 225 ml/time. Eluatet detekteres for UV-absorbans, og fraktioner, som indeholder proteinhovedtop-pen, samles. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,4 efter fjernelse af ethanol i vakuum.
io 250 mg des(PheB25),des(ThrB3°)-humaninsulin isoleres ved frysetørring.
Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse, ved plasmadesorptionsmassespektrometri og ved sekventiel Ed-man-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridylerede A- og B-kæ-15 der.
Eksempel 7
Fremstilling af des(PheB25)-humaninsulin.
200 mg des(PheB25),des(ThrB3°)-humaninsulin, som er fremstillet ved den i eksempel 6 beskrevne fremgangsmåde, 20 opløses i en blanding indeholdende 400 mg threoninmethyl-ester, 2,0 ml ethanol og 0,8 ml vand. pH-Værdien indstilles på 6,3 med eddikesyre, og der tilsættes 4 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 3,2 mg immobiliseret trypsin. Efter henstand i 2 timer ved 20°C med let omrøring fra-25 filtreres gelen, og proteinet fældes ved tilsætning af 10 rumfang 2-propanol. Det lufttørrede bundfald genopløses i 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl, 60% (på rumfangsbasis) ethanol, pH 8,25, og sættes på en 2,6 x 20 cm Q-"SepharoseM® FF-søjle, som er ækvilibreret med den samme puffer, og der 30 elueres med en lineær NaCl-gradient i den samme puffer stigende fra 0 til 0,1 M over 15 timer ved et flow på 125 ml/time. Fraktionerne, som indeholder des(PheB25)-humaninsulin-(B30-methylester), hældes sammen, og ethanolet fjernes i vakuum, hvorpå proteinet fældes ved pH-værdien 6,1. Suspensio-35 nen centrifugeres, og bundfaldet frysetørres. Methylesteren 20
DK 166730B
hydrdlyseres derpå i 10 minutter i kold 0,1 M NaOH ved en proteinkoncentration på 10 mg/ml. Reaktionen afbrydes ved indstilling af pH-værdien på 8,5, og der tilsættes 2 rumfang 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan/HCl, pH 8,5. Opløsningen 5 sættes derefter på en 2,6 x 20 cm Q-"Sepharosen® FF-søjle, og der elueres som beskrevet ovenfor. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,5 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.
Der fås 80 mg des(PheB25)-humaninsulin efter frysetørring.
io Produktets identitet bekræftes ved hjælp af aminosyre- analyse, plasmadesorptionsmassespektrometri og sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte vinylpyridylerede A- og B-kæder.
Eksempel 8 15 Fremstilling af des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsulin.
250 mg des(TyrB2®)-sci, som er fremstillet under anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 2 og 5, opløses i 25 ml 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan, 20% (på rumfangsbasis) ethanol indstillet til pH-værdien 9 med HC1 og 20 25 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 20 mg immobiliseret trypsin i den samme puffer tilsættes. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8' - 10“C med let omrøring, hvorpå der filtreres. Gelen vaskes med 25 ml puffer, og de opsamlede filtrater sættes på en 2,6 x 7,5 cm søjle af Q-"Se-25 pharose"® FF, som forinden er ækvilibreret med 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet på pH-værdien 8,0 med HC1. Søjlen elueres derefter med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,15 M i den samme puffer over 6 timer med et flow på 225 ml/time. Eluatet 30 detekteres for UV-absorbering, og fraktioner indeholdende proteinhovedtoppen hældes sammen. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,4 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.
Ved frysetørring fås 130 mg des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsulin.
35 Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse og 21 sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridyle-rede A- og B-kæder.
Eksempel 9
Fremstilling af (His®25),des(TyrB26),des(ThrB30)-humaninsu-5 lin.
450 mg (His®25),des(Tyr®25)-sci, fremstillet ved hjælp af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 3 og 5, opløses i 45 ml 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% (på rumfangsbasis) ehtanol indstillet til pH 9 med HCl, og 45 ml (sedi-io menteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 36 mg immobili-seret trypsin i den samme puffer tilsættes. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8 - 10°C med let omrøring, hvorpå den filtreres. Gelen vaskes med 40 ml puffer, og de sammenblandede filtrater sættes på en 2,6 x 7,5 cm søjle af Q-"Sepha-15 rose"® FF, som i forvejen er ævkilibreret med 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet til pH 8,0 med HCl. Derefter elueres søjlen med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,15 M i den samme puffer over 6 timer med et flow på 225 ml/time. Eluatet detekteres for 20 UV-absorbering, og fraktioner, som indeholder. proteinhoved-toppen hældes sammen. Proteinet fældes ved pH 5,4 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.
Ved frysetørring isoleres 200 mg (His®25),des-(TyrB26),des(ThrB3°)-humaninsulin.
25 Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanlyse og sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridyle-rede A- og B-kæder.
Eksempel 10
Fremstilling af (AsnB25),des(Tyr®26),des(Thr®30)-humaninsulin 30 150 mg (AsnB25),des(Thr®26)-SCI, fremstillet ved an vendelse af fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 4 og 5, opløses i 15 ml 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, 20% (på rumfangsbasis) ethanol indstillet til pH 9 med HCl, og der 22
DK 166730B
tilsættes 15 ml (sedimenteret rumfang) "Sepharose"® indeholdende 12 mg immobiliseret trypsin i den samme"puffer. Suspensionen henstår i 24 timer ved 8 - 10°c med let omrøring, hvorpå den filtreres. Gelen vaskes med 40 ml puffer, og de 5 sammenblandede filtrater sættes på en 1,6 x 10 cm søjle af Q-"Sepharose"® FF, som forinden er ækvilibreret med 50 mM tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 50% (på rumfangsbasis) ethanol, indstillet til pH 8,0 med HC1. Derefter elueres søjlen med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,15 i den samme puffer over 6 10 timer med et flow på 90 ml/time. Eluatet detekteres for UV-absorbering, og fraktioner, som indeholder proteinhovedtop-pen, hældes sammen. Proteinet fældes ved pH-værdien 5,4 efter fjernelse af ethanolet i vakuum.
Ved frysetørring fås 80 mg (AsnB25),des(TyrB26)-15 des (ThrOJU) -humaninsulin.
Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse og sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridylere-de A- og B-kæder.
Eksempel 11 20 Fremstilling af (AspA21),des(PheB25),des(ThrB30)-humaninsulin 50 mg des(PheB2 5),des(ThrB3 0)-humaninsulin, som er fremstillet ved fremgangsmåderne beskrevet i eksempel 6, opløses i 10 ml vand ved indstilling af pH-værdien på 2 med 1 M HC1. Opløsningen henstår i 16 dage ved 30“C. Efter afkøling 25 (til 20°C) tilsættes 7,5 g urinstof, og pH-værdien indstilles på 8,1 med 1 M NaOH. Opløsningen sættes derpå til en 1,6 x 20 cm Q-"SepharoseM® FF-søjle, som i forvejen er ækvilibreret med 20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl, 7 M urinstof, pH 8,1, ved 4°C, og der elueres med en lineær NaCl-gradient i 30 den samme puffer stigende fra 0 til 0,05 M over 24 timer med et flow på 40 ml/time. De sammenblandede fraktioner, som indeholder proteinet fra den sidste elueringtop, afsaltes på en søjle af "Sephadex"® G25 i 1 M eddikesyre og frysetørres.
Der fås 30 mg (AspA21),des(PheB25),des(ThrB30)-human-35 insulin.
23
Produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse, 5-trins-Edman-nedbrydning og c-terminalanalyse under anvendelse af carboxypeptidase A.
Eksempel 12 5 Fremstilling af (SerA21),des(ProB28)-humaninsulin
Konstruktion af et ekspressionsplasmid, der kan anvendes til fremstilling af (SerA21),des(Pro328)-humaninsulin og fremstilling af (Ser^·2-*-) ,des (Pro328) -humaninsulin.
Et plasmid stammende fra pUC-19, pKFN-864, som koder 10 for denne analog, fremstilles ved spaltet duplexmutagenese (Y. Morinaga et al., Biotechnology 2 (1984), 636 - 639) af plasmidet pKFN-734 under anvendelse af to mutagene primere, NOR-648 CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGCTGCAGTA og NOR-745 ATTGTTC-GACAATACCCTTAGCAGCCTTGGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACC. Plasmidet 15 pKFN-734 fremstilles ved ligering af det 0,4 kb lange EcoRI-Xbal-fragment, som koder for en syntetisk gærsignalleader, der er sammensmeltet indvendigt til et syntetisk insulinpre-cursorgen, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21), ‘fra plasmidet pLaC212spx3 til det 2,7 kb lange EcoRI-Xbl-fragment fra pUC-20 19 (c. Yannisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103 - 119).
Plasmidet pLaC212spx3 er beskrevet i eksempel 3 og i fig. 6 og 13 i PCT-ansøgning nr. WO 89/02463.
DNA-sekvensen af det 0,4 kb lange EcoRI-Xbal-fragment fra pKFN-864, som koder for signalleaderinsulin, B(l-29,des-25 Pro28)-Ala-Ala-Lys-A(l-21,Ser21) er vist i fig. 3.
pKFN-864 skæres med EcoRI og Xbal, og det 0,5 kb lange fragment sammenføjes med det 9,5 kb lange NcoI-Xbal-fragment fra pMT636 og det 1,4 kb lange NcoI-EcoRI-fragment fra pMT636 og danner plasmidet pKFN-866, jvf. figur 4. Plasmidet pMT636 30 fremstilles fra pMT608 efter fjernelse af LEU-2-genet og fra pMT479, jvf. fig. 4. pMT608 er beskrevet i EP 195.691. pMT479 er beskrevet i EP 163.529. pMT479 indeholder Schizosaccharo-myces pombe TPI genet (POT), S. cerevisiae-triose-phosphatisomerasepromoteren og terminatoren, TPIp og TPIT 35 (Alber, T. og Kawasaki, G.J. Mol. Appl. Gen 1 (1982), 419 -
DK 166730 B
24 434) Plasmidet pKFN-866 indeholder følgende sekvens: TPIp-signalleaderinsulin B(l-29,des-Pro28)-Ala-Ala-Lys-A(l-21,Ser21)-TPIT.
S. cerevisiae stammen MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, AtpiA-5 tpi, pep 4-3/pep 4-3) dyrkes på YPGal (1% Bacto gærekstrakt, 2% galactose, 1% lactat) til en O.D. på 0,6 ved 600 nm.
100 ml af den dannede kultur høstes ved centrifugering, vaskes med 10 ml vand, centrifugeres og suspenderes i 10 ml af en opløsning indeholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM io Na2EDTA, pH = 8,0, og 6,7 mg/ml dithiotreitol. Suspensionen inkuberes ved 30°C i 15 minutter og centrifugeres, og cellerne suspenderes i 10 ml af en opløsning indeholdende 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH = 5.8, og 2 mg Novozym® 234. Suspensionen inkuberes ved 30°C i 30 minut-15 ter, og cellerne opsamles ved centrifugering, vaskes i 10 ml 1.2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH = 7,5) og suspenderes i 2 ml CAS. Til transformering blandes 0,1 ml CAS-resuspenderede celler med ca. 1 μg plasmid pKFN-866 og 20 henstår ved stuetemperatur i ca. 15 minutter. L ml (20% poly-ethylenglycol 4000, 10 mM CaCl2/ io mM Tris HC1, pH = 7.5) tilsættes, og blandingen henstår i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen centrifugeres, og pellet suspenderes i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM 25 CaCl2, 14 μg/ml leucin) og inkuberes ved 30°C i 2 timer. Derefter centrifugeres suspensionen, pellet suspenderes i 0,5 ml 1.2 M sorbitol. 6 ml topagar (SC medium ifølge Shennan et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) indeholdende 1,2 M sorbitol plus 2,5% agar) til- 30 sættes ved 52°C, og suspensionen hældes på toppen af plader indeholdende det samme agarstørknede medium, som indeholder sorbitol. Transformantkolonier opsamles efter 3 dages forløb ved 30°C, isoleres og anvendes til at starte flydende kulturer. En sådan transformant KFN-883 udvælges til nærmere ka-35 rakterisering.
25 Gærstammen KFN-883 dyrkes på YPD-medium (1% gærekstrakt, 2% pepton (fra Difco Laboratories) og"2% glucose). 10 ml kultur af stammen omrystes ved 30°C til en O.D. på 20 ved 600 nm. Efter centrifugering analyseres supernatanten ved 5 HPLC som beskrevet (L. Snel et al., Chromatographia 24 (1987.), 329 - 332). Der fås et udbyttet på ca 0,14 mg/1 insulin B(1-29,des-Pro28)-Ala-Ala-Lys-A(1-21,Ser2^·) .
Den enkeltstrengede insulinprecursor isoleres fra gæ-ringssupernatanten ved adsorption til en ionbyttersøjle ved 10 lav pH-værdi, desorption ved høj pH-værdi og udfældning af det opsamlede med zinkioner. Transpeptidering af precursoren til (SerA21),des(ProB2S),(ThrB30-OMe)-humaninsulin er som følger: 10 mmol (2,35 g) threoninmethylester og iskold eddikeis syre opløses i DMF til 5 ml, 2,5 ml 76,5% rumfang/rumfang DMF i vand tilsættes, og 0,5 g precursor opløses i blandingen, som holdes ved 12°C. Derpå tilsættes 50 mg trypsin i 1,25 ml 0,05 M calciumacetat, og efter 24 timers forløb ved 12eC sættes reaktionsblandingen til 100 ml acetone til udfældning af 20 peptiderne, som hvirvles rundt og tørres i vakuum.
Den isolerede insulinanalogester oprenses på en præparativ HPLC-søjle under anvendelse af en silica-C18-matrix ved sur pH. Den rensede ester hydrolyseres i et vandigt medium ved en pH-værdi på 10 og 25°C i 24 timer. Det dannede 25 (SerA21),des(ProB28)-humaninsulin fældes ved neutral pH med zinkioner. Bundfaldet renses med anionbytterkromatografi og afsaltes derefter ved gelfiltrering. Der fås et udbyttet af frysetørret (Ser^21),des(ProB28)-humaninsulin på 102 mg.
Eksempel 13 30 Fremstilling af des(ThrB27)-humaninsulin 1 g zinkfrit svineinsulin opløses i 40 ml vand ved indstilling af pH-værdien til 9, og en opløsning af 50 mg svinetrypsin i 10 ml 0,25 M ammoniumhydrogencarbonat indstillet til en pH-værdi på 9 med ammoniumopløsning tilsættes.
DK 166730 B
26
Opløsningen henstår derefter ved 48C, og efter 48 timers forløb fås et udbytte på 65% ved HPLC-analyse. Kéaktionsblandin-gen gelfiltreres ved 4°C på en 5 x 90 cm søjle af Sephadex® G50 superfine i 0,05 M ammoniumhydrogencarbonat med et flow 5 på 90 ml pr. time. Fraktioner indeholdende proteinhovedtoppen samles og frysetørres. Der fås et udbytte på 520 mg des(B23-B30)-humaninsulin.
Et peptid med sekvensen Gly-Phe-Phe-Tyr-Pro-Lys-Thr syntetiseres på en PAM-harpiks under anvendelse af beskytte-io de, symmetriske aminosyreanhydrider ved hjælp af et peptid-synteseapparat fra Applied Biosystems. Derefter spaltes pep-tidet fra harpiksen ved hjælp af vandfri hydrogenfluorid ved 0°C, hvorefter de tiloversblevne beskyttelsesgrupper fjernes på tilsvarende måde.
15 200 mg des(B23-B30)-humaninsulin og 400 mg peptid op løses i en blanding af 2,40 ml dimethylformamid og 1,20 ml vand, og blandingens pH-værdi indstilles til 6,5 med tri-ethylamin. Derpå tilsættes 10 mg svinetrypsin i 0,20 ml vand, og reaktionsblandingen henstår ved 20°C i 4 timer. Reaktionen 20 stoppes derefter ved tilsætning af 25 ml 2-propanol, og de udfældede proteiner isoleres ved centrifugering. Det drænede bundfald opløses i 10 ml 1 M eddikesyre og sættes på en 2,6 x 20 cm søjle af Lichroprep® RP-18 (25 - 40 μιιι) , som forinden er ækvilibreret med 0,5 mM saltsyre, 0,1 M natriumchlorid i 25 30% (på rumfangsbasis) ethanol. Søjlen elueres derefter ved 20°c med et flow på 20 ml pr. time med den samme buffer, men med en lineær forøgelse af ethanol indholdet til 50% i løbet af 24 timer. Eluatet overvåges for UV-absorption, og fraktioner indeholdende proteinhovedtoppen opsamles. Proteinet blev 30 udfældet ved fortynding med samme rumfang som vand og indstilling af pH-værdien til 5,5 med natriumhydroxidopløsning, og efter henstand ved 4°C i 1 time isoleres bundfaldet ved centrifugering og frysetørring.
Der fås et udbytte på 80 mg des (ThrB27) -humaninsulin, 35 som identificeres ved sekventiel Edman-nedbrydning af de adskilte, vinylpyridylerede A- og B-kæder.
27
Eksempel 14
Formulering af injektionsopløsning 60 μιηοΐ af en humaninsulinanalog ifølge opfindelsen opløses i 4 ml 0,1 M HC1, og der tilsættes 20 ml 1,5%'s m-5 cresol. Opløsningen blandes derpå med 40 ml 4%'s glycerol og 20 ml 65 mM dinatriumhydrogenphosphat, og pH-værdién indstilles til 7,3. Til sidst indstilles opløsningen på 100 ml med vand, hvorpå den sterilfiltreres.
Eksempel 15 io Bedømmelse af associationsgrad
En 2,6 x 88 cm søjle af "Sephadex"® G-75 ækvilibreres med 13 mM natriumphosphatpuffer pH 7,3 med et flow på 22 ml/ time. Ved anvendelse af des(octapeptid-B23-30)-humaninsulin, cytochrome C, ribonuclease og mono- og dimermyoglobin som 15 molekylvægtsmarkører optegnes en kurve, der angiver molekylvægten som funktion af elueringsrumfanget.
Ved anvendelse af 1 ml opløsning indeholdende 0,6 mM zingfrit humaninsulin eller 0,6 mM insulinanalog fremstillet som beskrevet i eksempel 12 viser det sig, at sinkfrit human-20 insulin elueres som en såkaldt "tailing"-top med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 14 kD, og at analogerne fremstillet som beskrevet i eksempel 6-10 alle elueres som en symmetrisk top med en tilsyneladende molekylvægt på ca. 5 kD.
Disse resultater viser, at humaninsulinanaloger ifølge 25 opfindelsen stort set er monomere i opløsning ved pH 7,3, hvorimod det normale humaninsulin under de samme betingelser i vid udstrækning foreligger som en blanding af dimerer og højere oligomerer.
Eksempel 16 30 Bedømmelse af biologisk virkning
Den biologiske virkning in vitro bestemmes ved måling af bindingsaffiniteten til insulinreceptorerne på isolerede
DK 166730 B
28 rotteadipocyter og rottehepatocyter stort set som beskrevet i J. Gliemann, S- Gammeltoft: Diabetologia ITT (1974), 105 - 113.
Insulinanalogerne sammenlignes med semisyntetisk hu-5 maninsulin, hvis styrke sættes til 100%, og resultaterne er anført i nedenstående tabel:
Tabel
Adipocyter Hepatocyter des(PheB25),des(ThrB3 0)- io humaninsulin 223% 201% des(PheB25)-humaninsulin 225% 249% (AspA21),des(PheB25) des(ThrB3°)-humaninsulin 250% 242%
Claims (19)
1. Humaninsulinanaloger, kendetegnet ved, at de har følgende formel: -A-kæde S---S
5 I 7 'Τ' H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys~Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12 S
10 B-kæde S H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val~ 123456789 10 11 12 A-kæde (fortsat) » 15 13 14 15 16 17 18 19 20 21 -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y1-OH s
20 I B-kæde (fortsat) S -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
25 B-kæde (fortsat) -X1-X2-X3-X4-X5-X6 25 26 27 28 29 30 hvori X1, X2, X3, X5, Y1 og Y2 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest, idet dog X5 ikke er Pro, X4 30 er Lys eller Arg, og Xs er en hvilken som helst naturligt DK 166730 B forekommende aminosyrerest, der bærer den c-terminale -hydroxygruppe, eller -OH, eller X1 og X2 sammen danner den C-terminale hydroxygruppe, eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. 52.· - Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, 1 Λ - ·>—. at Y og/eller Y er udvalgt blandt gruppen bestående af en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest med undtagelse af Asn.
3. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn og Tyr, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser og Phe, X3 er udvalgt blandt gruppen bestående af Pro, Glu, Asp, Ser, Thr og His, • X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af.Lys, Thr, Ser, Ala,
15 Asp og Glu, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Thr-OH, ' Ser-OH, Ala-OH, Asp-OH, Glu-OH og -OH, eller X1 og X2 sammen danner den C-terminale hydroxygruppe, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Gly, Ser, Glu -og Ala, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Glu og Asp.
4. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, η at X er udvalgt blandt gruppen bestående af Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn og Tyr, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Tyr, Thr, Glu, Asp,. Ala, His, Ser og Phe, X3 er udvalgt blandt gruppen bestående af Pro, Glu, Asp, Ser, Thr og His,
25 X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Lys, Thr, Ser, Ala, Asp og Glu, X2 er -OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Gly, Ser, Glu og Ala, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Glu og Asp. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, 2 30 at X1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Phe, Ala, His, Thr, Ser, Asn og Tyr, X2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Tyr, Thr, Glu, Asp, Ala, His, Ser og Phe, X3 er udvalgt blandt gruppen bestående af Pro, Glu, Asp, Ser, Thr og His, X5 og X6 sammen danner den C-terminale hydroxygruppe, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Gly, Glu, Ser og Ala, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, 5 Gin, Glu og Asp.
6. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Phe, X2 er Tyr, X3 er Thr, X^ er Lys, Xs er Thr-OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, ίο Asp og Glu.
7. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Tyr, X2 er Thr, X3 er Pro, X5 er Thr, X6 er -OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Asp og
15 Glu.
8. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Phe, X2 er Tyr, X3 er Thr, X^ er Lys, X6 er Thr-OH, Y^ er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin,
20 Asp og Glu.
9. Humaninsulinanaloger ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X1 er Tyr, X2 er Thr, X3 er Pro, X5 er Thr, X6 er -OH, Y1 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Asp, Ser og Gly, og Y2 er udvalgt blandt gruppen bestående af Asn, Gin, Asp og
25 GlU.
10. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at indeholde en humaninsulinanalog med følgende formel: DK 166730B Ά-kæde S-S I 7 -| H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12
5 S ...... I B-kæde S H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A-kæde (fortsat) 13 14 15 16 17 18 19 20 21 -Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y1-OH 15 | S B-kæde (fortsat) S
20 -Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22. 23 24 B-kæde (fortsat) -X1-X2-X3-X4-X5-X6 25 26 27 28 29 30 25 hvor X1, X2, X3, x5, Y1 og Y2 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest, idet dog X5 ikke er Pro, X4 er Lys eller Arg, og X6 er en hvilken som helst naturligt forekommende aminosyrerest, der bærer den C-terminale hydroxygruppe, eller -OH, eller X5 og X6 sammen danner den C-30 terminale hydroxygruppe, eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf og en farmaceutisk tolerabel bærer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK119391A DK166730C (da) | 1988-12-23 | 1991-06-20 | Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK721588A DK721588D0 (da) | 1988-12-23 | 1988-12-23 | Humaninsulinanaloger |
| DK721588 | 1988-12-23 | ||
| DK477789A DK477789D0 (da) | 1989-09-28 | 1989-09-28 | Nye polypeptider |
| DK477789 | 1989-11-28 | ||
| DK8900296 | 1989-12-15 | ||
| PCT/DK1989/000296 WO1990007522A1 (en) | 1988-12-23 | 1989-12-15 | Human insulin analogues |
| DK119391A DK166730C (da) | 1988-12-23 | 1991-06-20 | Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
| DK119391 | 1991-06-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK119391D0 DK119391D0 (da) | 1991-06-20 |
| DK119391A DK119391A (da) | 1991-08-22 |
| DK166730B true DK166730B (da) | 1993-07-05 |
| DK166730C DK166730C (da) | 1993-11-15 |
Family
ID=27221157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK119391A DK166730C (da) | 1988-12-23 | 1991-06-20 | Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK166730C (da) |
-
1991
- 1991-06-20 DK DK119391A patent/DK166730C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK119391D0 (da) | 1991-06-20 |
| DK119391A (da) | 1991-08-22 |
| DK166730C (da) | 1993-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU641631B2 (en) | Human insulin analogues | |
| US5716927A (en) | Insulin analogs having a modified B-chain | |
| US5149777A (en) | Human insulin analogs and preparations containing them | |
| AU648670B2 (en) | A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| AU637365B2 (en) | Novel insulin compounds | |
| EP0419504B1 (en) | Insulin analogues | |
| DK159856B (da) | Humaninsulinderivater og farmaceutiske praeparater, som indeholder disse derivater | |
| CZ289997A3 (cs) | Insulinový derivát, farmaceutický prostředek pro léčení diabetes a způsob jeho léčení | |
| DK166730B (da) | Humaninsulinanaloger og deres farmaceutisk tolerable salte samt farmaceutiske praeparater indeholdende disse | |
| DK159161B (da) | Oehis(b-25)aa-eller oetyr(b-25)aa-humaninsulinforbindelser | |
| JPH09503646A (ja) | アンチトロンビンポリペプチド類似体及びその製造法 | |
| IE66691B1 (en) | Human insulin analoga and preparations containing them | |
| JPH06502650A (ja) | 安定化された優れたｇｒｆアナログ | |
| DD290426A5 (de) | Human insulin analoge | |
| DK159274B (da) | Hurtigt virkende human insulinanaloger og injicerbare oploesninger med hurtigt indsaettende virkning indeholdende saadanne insulinanaloger |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |