DK166763B1

DK166763B1 - Immunoglobulin-g-holdig fraktion

Info

Publication number: DK166763B1
Application number: DK132284A
Authority: DK
Inventors: Johann Eibl; Yendra Linnau; Otto Schwarz
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1983-03-16
Filing date: 1984-02-29
Publication date: 1993-07-12
Also published as: DK166763C; DK132284A; CA1245155A; US5122373A; JPH0639388B2; EP0122909A1; DE3466542D1; JPS601135A; EP0122909B1; ATE30034T1; DK132284D0

Description

DK 166763 B1

Opfindelsen angår en immunoglobulin-G-holdig fraktion af menneskelig eller dyrisk plasma til intravenøs anvendelse.

Immunoglobulinholdige præparater kan anvendes ved primære og 5 sekundære immundefekter, A- eller hypogammaglobulinami, ved antistofmangelsyndrom, ved virusinfektioner eller bakterielle infektioner.

Til udvinding af immunoglobulinholdige præparater af menne-10 skelig eller dyrisk plasma kendes allerede forskellige fremgangsmåder, f.eks. udfældning med ethanol (J.L.Oncley, M.Me-lin, D.A.Richart, J.W.Cameron & P.M.Gross, J.Am.Chem.Soc.

71, 541 (1949)) samt modificerede ethanolfremgangsmåder ifølge H.F.Deutsch, L.J.Gosting, R.A.Alberty & J.W.Williams, 15 J.Biol.Chem. 164, 109 (1964) og P.Kistier & H.Nitschmann,

Vox Sanguinis 7, 414 (1962).

Endvidere kendes en metode, ifølge hvilken immunoglobulin udfældes af plasma ved hjælp af ammoniumsulfat og polyethylen= 20 glycol (A.Polson, G.M.Potgieter, J.F.Largrier, G.E.F.Mears & F.J.Jourbet, Biochim.Biophys.Acta 82, 463 (1964)). Efter andre fremgangsmåder blev foreslået anvendelse af ionbyttere (E.A.Peterson & Η.A.Sober, J.Am.Chem.Soc. 78, 751 (1956)).

25 Disse fremgangsmåder havde den ulempe, at de udvundne præparater kun var egnede til intramuskulær applikation. Ved intravenøs anvendelse udviste de uønskede sidereaktioner, såsom en vasoaktiv virkning.

30 Man har derfor søgt at formindske sidefænomener eller bivirkninger, til hvilket formål immunoglobulinholdige præparater blev behandlet med opløselige proteolytiske enzymer, såsom pepsin, plasmin, papain og andre (DE-patentskrift nr.

1.148.037). Ved denne behandling forandres imidlertid molekyl-35 strukturen af immunoglobulinerne med en deraf følgende forkortet biologisk halveringstid. Det blev også konstateret, at 2 DK 166763 B1 enzymrester bliver tilbage i præparaterne, hvorved disse forurenes. Lagerstabiliteten er derfor ringe, og faren for videre fremskri den af dens proteolyti ske spaltning er stor.

5 I DE-offentiiggørelsesskrift nr. 29 36 047 beskrives en fremgangsmåde til fremstilling af et immunoglobulinpræparat, som kan indgives intravenøst, ved hvilken der foretages en kombineret rensning med ammoniumsulfat og polyethylenglycol i nærværelse af et opløseligt kulhydrat eller en polyol. Omend va-10 soaktive sidefænomener derved kan undgås, ønskes der stadig en forbedring med hensyn til sikkerheden og reproducerbarheden ved intravenøs anvendelse.

Til teknikkens standpunkt hører også de japanske patentskrif-15 ter JP-offentiiggørelsesskrift nr. 56-7721 og JP-offent1 iggø-relsesskrift nr. 56-15215 samt DE-offentliggørelsesskrift nr.

32 20 309, som angår fremgangsmåder til fremstilling af intravenøst anvendelige immunoglobulinpræparater. Behandlingen skal ske med immobi1iseret plasmin eller immobi1iseret pepsin, men 20 de resultater, der kan opnås hermed, er heller ikke tilfredsstillende, fordi præparaterne viser en uønsket høj antikomple-mentær aktivitet.

I EP-A-0 035 616 er endvidere beskrevet en fremgangsmåde til 25 fremstilling af en immunoglobulin-G-holdig fraktion, der hovedsagelig indeholder IgG-monomere.

Opfindelsen tilsigter at undgå de beskrevne ulemper og vanskeligheder og har den opgave at tilvejebringe en immunoglobulin-30 holdig fraktion af menneskelig eller dyrisk plasma, som kan appliceres intravenøst, og som er bivirkningsfri på optimal måde. Denne frihed skal også udstrække sig til uønskede leuko-peniske og bronkospastiske bivirkninger. Endvidere skal den immunoglobulin-G-holdige fraktion ifølge opfindelsen udvise en 3^ meget ringe antikomplementær aktivitet.

3 DK 166763 B1

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved, at fraktionen indeholder mindst 90% monomere IgG-molekyler, 5 mindst 95% gammag1 obu 1 i ner, mindst 90% funktionelt intakte IgG-molekylder, dvs. mindst 90% IgG-molekyler, som er bindelige til protein A af staphylococcus aureus, har en ant ikomp1ementær aktivitet på mindst 40 mg protein til neutralisation af en 1C CH-50-enhed og er i det væsentlige fri for vasoaktivt og leu-kopenisk virksomme stoffer og bronkospastiske stoffer, udtrykt ved følgende data: a) at den vasoaktive virkning ved hundeprøven som gennemsnit 15 af fire dyr, dvs. et blodtryksfald på højst 30%, først konstateres ved en dosis på mere end 500 mg/kg legemsvægt, b) at den leukopeniske virkning ved hundeprøven som gennemsnit af fire dyr, dvs. et fald i leukocyttallet på højst 50%, 20 først konstateres ved en dosis på mere end 500 mg/kg le gemsvægt, og c) at den bronkospastiske virkning ved marsvineprøven som gennemsnit af fire dyr, dvs. en stigning i åndedrætstrykket på 25 højst 30%, først konstateres ved en dosis på mere end 500 mg/kg legemsvægt.

Bestemmelsen af de funktionelt intakte IgG-molekyler sker efter protein-A-sepharose-metoden (FEBS Letters, bind 28, 30 1972, 73 ff, H.Hjelm, K.Hjelm, J.Sjoquist, "Protein A from

Staphylococcus aureus, its Solution by Affinity Chromatography and its Use as an Immunosorbent for Isolation of Immunoglobulins"). Metoden beror på, at protein A fra Staphylococcus aureus træder i vekselvirkning med IgG-molekyler-35 ne af stofklasserne IgG 1, 2 og 4 og binder dem. De funktio nelt aktive steder er CH2 og CH^ -områderne, d.v.s. dele af H-kæden i IgG-molekylerne.

4 DK 166763 B1

De forenede fraktioner Vg/VQ fra 1,30 til 2,20 fra molekylvægt sbestemmelsen ved hjælp af gelfiltrering indstilles til en bestemt proteinkoncentration, og 10 mg protein af dette præparat kromatograferes over 10 ml protein A-sepharose-5 immobiliseret protein A. De bundne IgG 1, 2 og 4 elueres med en nat’-iuricitrat-citronsyre-stødpude, pH 3,0. Derefter beregnes det bundne og ubundne IgG. V0 er elutionsrumfanget for de stoffer, som er større end gelens porestørrelse ved gelpermea-tionskromatografien, og Ve er det rumfang, ved hvilket stof- 10 ferne elueres ved gelpermeationskromatografien.

>*-

Fraktionen ifølge opfindelsen har en så ringe antikomplementær virkning, at den kræver ikke mindre end 40 mg protein til neutralisation af en CH50-enhed.

15

Bestemmelsen af denne ejendommelighed sker ifølge "Public Health Monograph" nr. 74, Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adaptation to Microtest, Washington 1965, og E.A.Kabal & M.Mayer, Experimental Immunochemistry, 2.ud- 20 gave, Thomas Springfield 1961.

Ved elektroforetisk bestemmelse finder man i fraktionerne ifølge opfindelsen mindst 95% gammaglobulin. Bestemmelsen sker ifølge Michael D. Gebott, Beckman Microzone Electrophoresis 25

Manual, Beckman Instruments, Inc. 1977, 015-083630-C.

Karakteristisk for de immunoglobulin-G-holdige fraktioner ifølge opfindelsen er deres farmakologiske egenskaber. De er nemlig i det væsentlige fri for vasoaktive og leukopenisk 30 virksomme samt bronkospasti ske stoffer.

Den vasoaktive virkning konstateres på følgende måde:

Forsøgsdyr (hunde) (bastarder af begge køn) får efter narkotisering 3 5 præpareret Vena jugularis og Arterie carotis. Før bedøvelsen påbegyndes en fastetid på mindst 12 timer. Pr. forsøgsstof kræves fire kvalificerede hunde, d.v.s. dyr, som ved intra- 5 DK 166763 B1 arteriel applikation af standardiseret intramuskulært anvendeligt immunoglobulin (''standardstof") viser en vasoaktiv virkning (blodtryksfald) på mindst 30% ved en dosering_på 50 mg/kg legemsvægt. Dette standardiserede intramuskulært anvendelige

C

immunoglobulin fremstilles efter den indledningsvis nævnte fremgangsmåde ifølge J.L.Oncley, M.Melin, D.A.Richart, J.W.Cameron & P.M.Gross, J.Am.Chem.Soc. 71, 541 (1949) . Hunde, som ikke viser nogen reaktion på standardstoffet, kan ikke anvendes til sammenligningsprøver.

1 o

Af standardstoffet opløses 160 mg i 1 ml Aqua ad iajectabilia, og der fortyndes med isotonisk NaCl-opløsning til 16,7 mg/ml. Det opløste stof anvendes inden for 4 timer.

15

Det ifølge opfindelsen intravenøst anvendelige immunoglobulin-G opløses således med Aqua ad injectabilia, at 1 ml indeholder 165 mg protein. Det opløste stof anvendes inden for 4 timer.

20

Dyrene anæstetiseres med en intravenøs enkeltdosis på 40 mg/kg nembutal (barbitural), og Vena jugularis externa bliver efter opdeling ved den nedre kant af underkæben præpareret, og der indføres et kateter. Derpå frilægges Arterie carotis ved samme hudsnit, og der indføres et kateter. Efter præpare-25 ring af arterien ventes i 30 minutter for at nå stabile udgangsværdier. Over det dybe venekateter måles det centrale venetryk, og over det overfladiske arterielle kateter måles det arterielle blodtryk ved hjælp af en tryktransducer. Via det arterielle kateter injiceres først det ifølge opfindelsen 30 intravenøst anvendelige immunoglobulin-G og derpå standardstoffet.

Under hele forsøgets varighed bliver via arteriekateteret optegnet det systoliske og diastoliske blodtryk af tryktrans-3 5 duceren.

6 DK 166763 B1

Blodtryksmiddelværdien (systolisk og diastolisk) samt middelværdien af leukocyttallet før injektionen af forsøgsstoffet og standardstoffet bestemmes. Det maksimale blodtryksfald bestemmes ved måling af blodtrykket gennem 20 minutter efter 5 injektion af forsøgsstoffet.

Den vasoaktive virkning af det ifølge opfindelsen intravenøst anvendelige immunoglobulin-G konstateres på den måde, at 500 mg/kg legemsvægt hund injiceres, og det gennemsnitlige 10 procentiske systoliske og diastoliske blodtryksfald hos fire hunde sammenlignes med den blodtryk s sænkende virkning af det intrarauskulært anvendelige standardstof.

Bestemmelsen af den leukopeniske virkning udføres på følgende 15 måde:

Forsøgsdyr (bastardhunde af begge køn) får efter narkotisering præpareret Vena jugularis og Arterie carotis. Før anæstesien begyndes en fastetid på mindst 12 timer. Pr. forsøgsstof 20 kræves fire kvalificerede hunde, som ved intraarteriel applikation af standardiseret intramuskulært anvendeligt immunoglobulin (standardstof), viser en leukopenisk virkning (leukocyt-fald på mindst 50% ved en dosering af 50 mg/kg legemsvægt. Hunde, som ikke viser nogen reaktion på standardstoffet, 25 kan ikke anvendes til sammenligningsforsøg.

Forberedelsen af forsøgsdyrene og forsøgsstofferne sker på samme måde som beskrevet i det foregående.

30 ΤΠ undersøgelse af leukocyttallet tages der blodprøver. Ved den første blodprøve bliver der til 40 μΐ blod sat 20 ml Iso-tone® II (en opløsning fra firmaet Coulter Electronics Ltd. til fortynding af blodprøver, bestående hovedsagelig af 7,93 9/1 NaC1> °9 6 dråber Zapoglobin® (en opløsning fra firmaet 35 DK 166763 R1 7

Coulter Electronics Ltd. til at hæmolysere erythrocyter, således at 1eukocyterne forbliver intakte og kan tælles), og der måles i Coulter tæller. Derefter udtages der efter 10, 15, 16, 17, 18 og 19 minutter andre blodprøver til bestemmelse 5 af leukocy ttal let. Derpå injiceres straks intraarterielt 500 mg immunoglobulin/kg legemsvægt intravenøst anvendeligt immuno= globulin-G inden for 90 sekunder. 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 og 20 minutter efter injektion udtages yderligere blodprøver. Efter 20 minutter injiceres 50 mg immunoglobulin/kg legems-vægt af standardstoffet inden for 90 sekunder. Blodprøver tages igen efter 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 og 20 minutter.

Den maksimale sænkning af leukocyttallet bestemmes ved bestemmelse af blodprøver, der udtages 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 og 20 minutter efter injektion af prøven.

Den leukopeniske virkning af intravenøst anvendeligt immuno= globulin-G konstateres på den måde, at der injiceres 500 mg/ kg legemsvægt hund, og det gennemsnitlige procentiske leuko= 2° cytfald hos fire hunde sammenlignes med den leukopeniske virkning af intramuskulært anvendeligt standardstof.

Bestemmelsen af den bronkospastiske (åndedrætstrykstigende) virkning hos marsvin sker på følgende måde: 25

Forsøgsdyr (marsvin af hankøn) får efter narkotisering præpareret luftrøret i strubehovedområdet. Efter intubation respireres forsøgsdyret ved hjælp af et åndedrætsapparat med et til dyrets legemsvægt svarende åndedrætsrumfang med en 30 åndedrætsfrekvens på 80/min. Derefter fripræparares Arterie carotis fra samme indsnit i huden. Efter intraarteriel injektion af forsøgsstoffet måles åndedrætstrykket løbende.

Til forsøget anvendes laboratorie-avlede marsvin af hankøn 35 med en legemsvægt mellem 500 og 700 g. Pr. forsøgsstof kræves fire kvalificerede marsvin, som ved intraartiel applika- 8 DK 166763 B1 tion af standardiseret intramuskulært anvendeligt immuno= globulin (standardstof) viser en åndedrætstrykstigning på mindst 30% ved en dosering af 50 mg/kg legemsvægt. Marsvin, som ikke viser nogen reaktion på standardstoffet, kan ikke 5 anvendes til sammenligningsforsøg.

Af standardstoffet opløses 160 mg i 1 ml Aqua ad injectabilia, og der fortyndes med isotonisk NaCl-opløsning til 16,7 mg/ml. Det opløste materiale anvendes inden for 4 timer.

10

Det ifølge opfindelsen intravenøst anvendelige immunoglobu= lin-G opløses med Aqua ad injectabilia således, at 1 ml indeholder 165 mg protein. Det opløste materiale anvendes inden for 4 timer.

15

Dyrene narkotiseres. Derefter præpareres luftrøret i strubehovedområdet, og der indføres en trakeal kanyle. Ved hjælp af et åndedrætsapparat respireres forsøgsdyret med et til legemsvægten svarende åndedrætsrumfang ved en åndedræts- 20 frekvens på 80/min. Som åndedrætsapparat anvendes en Harvard pumpe, type 681.

Derefter fripræpareres Arterie carotis fra samme hudindsnit og der indføres et kateter. Registreringen af åndedræts-25 trykket sker via en tryktransducer, som er tilsluttet ånde-drætsslangen ved hjælp af et T-stykke.

Efter præpareringen ventes mindst 10 minutter for at nå stabile udgangsværdier. Derefter konstateres nulpunktet, og 30 efter yderligere 2-3 minutter injiceres intraarterielt via kateteret 150 mg immunoglobulin/kg legemsvægt intravenøst anvendeligt immunoglobulin-G i løbet af 90 sekunder.

Efter 20 minutter injiceres intraarterielt 50 mg standard-35 stof/kg legemsvægt i løbet af 90 sekunder.

9 DK 166763 B1

Den maksimale åndedrætsstigning i de 20 minutter efter injektionen af prøven bestemmes og sættes i relation til udgangsmiddelværdien .

5 Den bronkospastiske virkning af intravenøst anvendeligt immuno= globulin-G konstateres på den måde, at der intraarterielt injiceres 500 mg/kg legemsvægt marsvin, og det gennemsnitlige procentiske åndedrætstryk hos fire marsvin sammenlignes med den åndedrætstrykstigende virkning af intramuskulært anvende-10 ligt imraunoglobulin-G, standardstof.

Immunoglobulin-G-holdige fraktioner ifølge opfindelsen, som på optimal måde er fri for bivirkninger,kan fremstilles ved, at en af menneskeblod eller dyreblod udvundet fraktion be-15 handles med pankreasenzymer såsom trypsin, chymotrypsin eller pankreasprotease, som er bundet til vanduopløseligt bærermateriale, og den behandlede fraktion underkastes eventuelt en yderligere fraktionering og koncentration.

20 Hertil anvendes med fordel Sepharose 4 B-gel® som vanduopløse-ligt bærermateriale.

Det rensede immunoglobulin kan eventuelt efter fjernelse af 25 uønskede ledsagestoffer udfældes med proteinfældningsmidler af den immunoglobulinholdige fraktion, der er behandlet med enzymer bundet til vanduopløseligt bærermaterialeog forarbejdes til et slutprodukt.

30 Specielt har en kombination af følgende rensnings- og koncentrationsforanstaltninger vist sig egnet: at et iimnunoglobulinholdigt bundfald udfældes af menneskelig eller dyrisk plasma ved behandling med ethanol ved en tempe-35 ratur under 0°C, 10 DK 166763 B1 at bundfaldet ekstraheres ved hjælp af en pufferopløsning, og at der af den fremkomne opløsning ved behandling påny med ethanol udvindes et pastaformet immunoglobulinkoncentrat, 5 at dette koncentrat renses ved dialyse, at den således rensede immunoglobulinholdige fraktion behandles ved forhøjet temperatur på ca. 37°C med et immobiliseret enzym af gruppen trypsin, chymotrypsin eller pankreasprote= 10 ase, at der af den således behandlede fraktion udfældes renset i det væsentlige af IgG bestående immunoglobulin ved hjælp af et proteinfældningsmiddel, fortrinsvis polyethylenglycol, 15 og at fældningen opløses, opløsningen sterilfiltreres og til sidst lyofiliseres.

20

Fremstillingen af fraktionerne ifølge opfindelsen belyses af følgende arbejdsforskrifter og eksempler.

Arbejdsforskrifter til fremstilling af et immobiliseret enzym: 25

Arbejdsforskrift 1:

Til 1 liter Sepharose 4 B-ge]®(Pharmacia) bliver der efter en vask med 4 liter destilleret vand sat 200 g bromcyan, 30 der er blevet opløst i 100 ml acetonitril, ved en pH-værdi på 11,0. Reaktionsblandingen køles med et isbad. Efter fjernelse af den flydende fase sættes der til gelen 800 mg trypsin (Sigma), som er opløst i 1 liter 0,2 molær NaHCO^.

Det ikke bundne trypsin skilles ved filtrering fra trypsin, 35 som er bundet til gelen.

11 DK 166763 B1

Efter at der til gel- trypsinet er sat 1 liter af en 1 molær glycin-opløsning, vaskes det grundigt proteinfrit med 0,2 molær NaHCO^-opløsning. Til slut suspenderes gel-trypsinet i 1 liter 0,9% NaCl-opløsning, og det er brugsfærdigt til inkuba- c tion med en immunoglobulinfraktion.

Arbejdsforskrift 2:

Det uopløselige enzym fremstilles på samme måde som i arbejds-forskrift 1, men i stedet for trypsin anvendes pankreasprote= ase (Merck).

Arbejdsforskrift 3: 15 Arbejdsforskrift 1 gentages, men.i stedet for trypsin anvendes α-chymotrypsin (Sigma).

Eksempler til fremstilling af den immunoglobulin-G-holdige fraktion: 20 EKSEMPEL 1.

Til menneske-blodplasma sættes 8% ethanol ved en pH-værdi på 25 q 7,2 og en temperatur på -2 C. Efter fraskillelse af bundfaldet forhøjes ethanolkoncentrationen til 25%, og samtidig sænkes temperaturen til -6°C. Det udfældede bundfald, som indeholder immunoglobulin, renses videre ved ekstraktion med en phosphat-acetat-stødpude, og der tilsættes 12% ethanol ved

O

en pH-værdi på 5,4 og en temperatur på -2 C.

Bundfaldet (der indeholder a- og β-globulin) kasseres. Etha= nolkoncentrationen i den overliggende væske bliver ved en pH- værdi på 7,2 og en temperatur på -10°C forhøjet til 25%.

3 5

Det udfældede pastaformede immunoglobulin samles, og ethanolen fjernes ved dialyse.

12 DK 166763 B1

Derefter sættes der til dialysatet 170 g/1 ammoniumsulfat ved en pH-værdi på 6,25. Bundfaldet fraskilles og kasseres.

Til den overliggende væske sættes ved en pH-værdi på 7,2 yderligere ammoniumsulfat indtil en koncentration på 280 g/1.

5

Bundfaldet opløses i vand, og med henblik på fjernelse af ammoniumsulfatet dialyseres.

Efter dialysen indstilles ionstyrken af immunoglobulinopløs-ningen til 0,15.

10 100 g immunoglobulin fremstilles med 30 ml trypsin .Jjnmobilise- ret efter arbejdsforskrift 1 og behandles ved 37°C i 72 timer.

Efter fjernelse af gel-trypsinet bliver det behandlede immuno= globulin udfældet med 135 g/1 polyethylenglycol 4000. Bund-15 faldet opløses i 0,9% NaCl, sterilfiltreres, aftappes og gøres holdbart ved frysetørring.

EKSEMPEL 2.

20

Udvindingen af den immunoglobulinholdige fraktion sker på samme måde som i eksempel 1.

Inkubationen udføres med den immobiliserede efter arbejds-25 forskrift 2 fremstillede pankreasprotease. 100 g immunoglo^ bulin behandles med 70 ml gelformet immobiliseret pankreasprotease og holdes ved 37°C i 70 timer. Efter fjernelse af gelen sættes der til den overliggende væske 75 g/1 poly= ethylenglycol 4000, og bundfaldet, der indeholder forurenin-30 gerne, kasseres.

Til den overliggende væske sættes yderligere polyethylenglycol 4000 indtil en slutkoncentration på 85 g/1. Det dannede bundfald kasseres.

35 DK 166763 B1 13

Ved forhøjelse af polyethylenkoncentrationen til 135 g/1 udfældes det rensede immunoglobulin og gøres holdbart som i eksempel 1.

5 EKSEMPEL 3.

Udvindingen af den immunoglobulin-G-holdige fraktion foretages på samme måde som beskrevet i eksempel 1, men behand-10 lingen med immobiliseret α-chymotrypsin udføres ved 37°C i 72 timer.

Dataene for de i eksempel 1-3 fremstillede immunoglobulin-G-holdige fraktioner ifølge opfindelsen, nemlig indholdet af I5 monomere IgG-molekyler, indholdet af funktionelt intakte

IgG-molekyler, den antikomplementære aktivitet såvel som indholdet af gammaglobulin ved elektroforetisk opdeling blev bestemt som beskrevet i det følgende. Disse værdier er be lyst i følgende tabeller og i det tilhørende diagram I.

20

Diagram I anskueliggør en elutionskurve under de anførte betingelser mellem 150 og 400 ml samt det relative elutions-rumfang V /VQ. Kurven gengiver de enkelte fraktioners proteinindhold målt ved en ekstinktion på 280 nm.

25 I følgende tabel I er anført Ve/VQ-forholdet efter den udførte gelpermeationskromatografi for de enkelte af kurven omfattede områder. Som det vil ses, er Ve/Vg-forholdet i området fra 1,30 til 2,20 over 90%.

30 35 14 DK 166763 B1 TABEL I.

Gelpermeationskroxna tograf i.

5 Vvo 1,0 - 1,29 1,30 - 2,20 2,21 - 2,70

Eksempel 1 Spor 92,4% 7,6%

Eksempel 2 " 93,2% 6,8% 10 Eksempel 3 " 91,8% 8,2% I tabel II er vist forholdet mellem de til protein A bundne og 15 de; ikke - bundne IgG-molekyler, idet de bundne svarer til de funktionelt intakte. Som det vil ses, er indholdet af funktionelt intakte IgG-molekyler i den samlede fraktion over 90%.

20 TABEL II.

Affinitetskromatografi med protein A-sepharose.

25 % af fraktion V^/Vq % af samlet immunoglobulin- 1,30 - 2,30 G-holdig fraktion ikke-bundet bundet

Eksempel 1 1,5 98,5 91,0 30 Eksempel 2 0,9 99,1 92,3

Eksempel 3 1,2 98,8 90,7 I tabel III er anført værdierne for den antikomplementære ak-3 5 tivitet og for elektroforesen, hvoraf det vil ses, at for præ- 15 DK 166763 B1 paraterne ifølge alle eksemplerne kræves værdier af den anti-komplementære aktivitet på mere end 50 mg immunoglobulin-G-holdig fraktion til neutralisering af en CΉ-50-enhed, og at der blev opnået elektroforetisk bestemte værdier af rent gamma-5 globulin på mere end 97%.

TABEL III.

Antikomplementær Elektroforese 1 o aktivitet

Eksempel 1 >50 mg/C'H-50 > 97,0% rent gammaglobulin

Eksempel 2 >50 mg/C'H-50 > 97,0% rent gammaglobulin

Eksempel 3 >50 mg/C'H-50 > 97,0% rent gammaglobulin 15

De farmakologiske ejendommeligheder eller data for de ifølge eksempel 1-3 fremstillede immunoglobulin-G-holdige fraktioner ifølge opfindelsen, nemlig den vasoaktive og den leukope-2o niske virkning i hundeprøven og den bronkospastiske virkning i marsvineprøven, blev bestemt som beskrevet i det foregående. Disse værdier fremgår af følgende tabeller: TABEL IV.

25

Gennemsnitsblodtryk af fire hunde i % af udgangsværdien efter injektion af 500 mg af præparatet ifølge opfindelsen pr. kg legemsvægt. Før injektionen måles blodtrykket og sættes til 100%, og efter injektion af stoffet måles blodtrykket igen.

30

Præparatet ifølge eksempel 1 forårsager et blodtryksfald på 9% (100% før, 91% efter injektion).

35 16 DK 166763 B1

Systolisk Diastolisk blodtryk blodtryk

Præparat ifølge eksempel 1 91% 86%

Præparat ifølge eksempel 2 93% 89% 5 Præparat ifølge eksempel 3 81% 79% TABEL V.

Gennemsnitsleukocyttal af fire hunde i % af udgangsværdien efter injektion af 500 mg af præparatet ifølge opfindelsen pr. kg legemsvægt. Før injektionen tælles leukocyttallet i en Coultertæl1 er og sættes til 100%. Efter injektionen tælles i-gen, og antallet af leukocytter sammen!ignesmed udgangsværdi- 15 en’

Eksempel 1 73%

Eksempel 2 62%

Eksempel 3 52% 20 TABEL VI.

25 Gennemsnitsstigning i åndedrætstryk hos fire marsvin i % af udgangsværdien (dvs. før injektion) efter injektion af 500 mg af præparatet ifølge opfindelsen pr. kg legemsvægt.

Eksempel 1 102% 30 Eksempel 2 110%

Eksempel 3 125% 35 17 DK 166763 B1

Overlegenheden af intravenøst anvendelige immunoglobulin-G-holdige fraktioner ifølge opfindelsen sammenlignet med de kendte intramuskulært anvendelige fremgår med stor anskuelighed af diagrammerne II - IV.

5 I diagram II er vist blodtrykskurverne ved systolisk og dia-stolisk måling på i hvert tilfælde fire hunde, idet der på abscissen er afsat de indgivne mængder i mg/kg legemsvægt af dyrene. Den fuldt optrukne linie i området fra A til B sva-10 rer til forløbet af blodtrykket ved indgift af intravenøst anvendelige immunoglobulin-G-holdige præparater ifølge opfindelsen. Forløbet af kurven fra A til C (fuldt optrukken linie og punkteret linie) svarer til forløbet af blodtrykskurven ved applikation af det intramuskulært anvendelige standard-15 stof. Det vil ses, at ved en applikation af det intramuskulært anvendelige standardstof på 5 mg/kg legemsvægt er blodtrykket faldet 30%, hvorimod ved applikation af præparatet ifølge opfindelsen dette fald først sker ved en dosering på 500 mg/kg legemsvægt, d.v.s. at det intravenøst anvendelige 20 immunoglobulin ifølge opfindelsen har en mindst 100 gange mindre vasoaktiv virkning end de kendte intramuskulært anvendelige præparater under iøvrigt samme betingelser.

Af diagram III vil ses den leukopeniske virkning ved hunde-25 prøven som gennemsnit af fire dyr i sammenligning mellem det intravenøst anvendelige præparat ifølge opfindelsen og det standardiserede intramuskulært anvendelige standardpræparat. Den fuldt optrukne linie i området fra A til B svarer til det intravenøst anvendelige immunoglobulin-G-holdige præparat 30 ifølge opfindelsen, og linien fra A til C (fuldt optrukken linie og punkteret linie) til forløbet af leukocyttallet ved applikation af det intramuskulært anvendelige standardstof.

Det vil ses, at ved en applikation på 0,5 mg/kg legemsvægt af det intramuskulært anvendelige standardstof er leukocytterne 35 faldet 50%, hvorimod ved applikation af præparatet ifølge opfindelsen dette fald først optræder ved en dosering på 500

Claims

1. Immunoglobulin-G-holdig fraktion af menneskelig eller dyrisk plasma til intravenøs anvendelse, kendetegnet ved, at den indeholder 35 Ulv 100/00 D I mindst 90% monomere IgG-molekyler, mindst 95% gammag1 obu 1 i nerf mindst 90% funktionelt intakte IgG-molekylder, dvs. mindst 90% IgG-molekyler, som er bindelige til 5 protein A af staphylococcus aureus, at den har en antikcamplementær aktivitet på mindst 40 mg protein til neutralisation af en CH-50-enhed og at den i det væsentlige er fri for vasoaktivt og leu-kopenisk virksomme stoffer og bronkospasti ske stoffer, udtrykt ved følgende data: 10 a) at den vasoaktive virkning ved hundeprøven som gennemsnit af fire dyr, dvs. et blodtryksfald på højst 30%, først konstateres ved en dosis på mere end 500 mg/kg legemsvægt, 15 b) at den leukopeniske virkning ved hundeprøven som gennemsnit af fire dyr, dvs. et fald i leukocyttallet på højst 50%, først konstateres ved en dosis på mere end 500 mg/kg legemsvægt, og 20 c) at den bronkospasti ske virkning ved marsvineprøven som gennemsnit af fire dyr, dvs. en stigning i åndedrætstrykket på højst 30%, først konstateres ved en dosis på mere end 500 mg/kg legemsvægt. 25

2. Anvendelse af en immunoglobulin-G-holdig fraktion ifølge krav 1 til fremstilling af præparater til behandling af primære og sekundære immundefekter, A- eller hypogammaglobulina-mi, antistofmangelsyndrom, virusinfektioner eller bakterielle 30 infektioner samt autoimmun- og immunkomp1ekssygdomme. 35