DK169347B1

DK169347B1 - Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid

Info

Publication number: DK169347B1
Application number: DK147292A
Authority: DK
Inventors: Seiga Itoh; Susumu Sekine; Akiko Saito; Moriyuki Sato
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1983-12-26
Filing date: 1992-12-08
Publication date: 1994-10-10
Also published as: DK610884A; US4758656A; ES539068A0; DE3486111D1; IL73892A0; NO174161C; EP0146944B1; DE3486111T2; AU580748B2; EP0146944A3; AU3718484A; DK168016B1; DK147292A; DK610884D0; EP0146944A2; IL73892A; DE146944T1; NO845132L; DK147292D0; NO174161B

Description

i DK 169347 B1

Ansøgningen angår derivater af humant interferon-r-poly-peptid.

Interferoner (i det følgende benævnt IFN) kan så vidt vi-5 des klassificeres i tre store grupper, nemlig IFN-a, IFN-0 og IFN-t. IFN-a fremstilles hovedsageligt ud fra leukocytter, IFN-0 ud fra fibroblaster og IFN-r ud fra T-lymphocytter. Disse interferoner er blevet noteret som biologisk aktive stoffer med antiviral aktivitet, aktive-10 rende egenskaber på naturlige killer-celler og makrofager, antitumor aktivitet og lignende. Overføringsmetoderne til opnåelse af interferoner ved isolering fra leukocytter og dyrkede celler kan imidlertid ikke give dem i tilstrækkelig mængde.

15

Rekombinant DNA-teknologi er nu blevet udviklet i en sådan grad, at masseproduktion af stoffer, som kun udskilles i en lille mængde i celler fra højere dyr og er vanskelige at isolere, såsom IFN, er blevet mulig ved anven-20 delse af mikroorganismer. F.eks. blev mRNA'er fra IFN-0 og IFN-a isoleret fra celler, og DNA komplementær til mRNA (cDNA) blev syntetiseret enzymatisk og klonet i Escherichia coli [Taniguchi, et al.: Proc. Jap. Acad., 55 (B) 464-469 (1979, Nagata, et al.: Nature 284, 316-320 25 (1980)].

Hvad angår IFN-r er det rapporteret, at det har en stærkere celleinhiberende aktivitet end andre IFN’er, baseret på det eksperiment, der gør brug af animalske celler 30 [B.Y. Rubin og S.L. Gupta: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 5928-5932 (1980)]. Endvidere er kloning af en IFN-r cDNA i Escherichia coli og bestemmelse af dens basesekvens nyligt rapporteret [P.W. Gray, et al.: Nature 295, 503 (1982), R. Devos, et al.: Nucleic Acids Research 35 10, 2487 (1982)].

DK 169347 B1 2

Opfinderne af den foreliggende opfindelse har uafhængigt klonet en DNA kodende for IFN-r til opnåelse af en klon kodende for et hidtil ukendt IFN-r, hvori, hvilket fremgår af den i tabel 1 viste basesekvens, den niende amino-5 syre for det modne IFN-r, der er rapporteret af Devos et al., lysin (Lys), (AAA), er erstattet med glutamin (Gin) (CAA). Endvidere blev IFN-r genet inkorporeret i vektor pKYP-10 med tryptophanpromotor (japansk offentliggjort uundersøgt patentansøgning nr. 110600/83), og massepro-10 duktion af IFN-r i Escherichia coli er opnået.

Derefter har opfinderne af den foreliggende opfindelse studeret produktionen af derivater af IFN-r polypeptid under anvendelse af det i tabel 1 viste IFN-r gen som ud-15 gangsmateriale.

Det blev rapporteret, at deletion af 11 aminosyrer fra den C-terminale ende af IFN-α nedsatte den specifikke aktivitet til en tredjedel [A.E. Franke, et al.: DNA 1, 20 223-230 (1981)], hvorimod addition af 18 aminosyrer til den N-terminale ende af IFN-« ikke ændrer den specifikke aktivitet [R.M. King et al.: J. Gen. Virol. 64, 1815-1818 (1983)].

25 Derivater af IFN-r er endnu ikke rapporteret. Opfinderne af den foreliggende opfindelse har konstrueret et derivat, hvori den tredie aminosyre i IFN-r som vist i tabel 1, cystein (Cys), blev erstattet med tyrosin (Tyr) (i det følgende benævnt 3-Tyr-IFN-r) og fandt, at den specifikke 30 aktivitet var 2-4 gange stærkere end for moderstoffet IFN-r. Endvidere konstrueredes de derivater, hvori Cys i stilling 1 var erstattet med serin (Ser) (1-Ser-IFN-r),

Cys i stilling 3 var erstattet med Ser (3-Ser-IFN-r), Cys i stilling 1 og 3 var erstattet med Ser (1,3-Ser-IFN-r), 35 og N-terminale aminosyrer af IFN-r vist i tabel 1 var slettet. Der blev for alle derivaterne, sammenlignet med udgangsmaterialet IFN-r, detekteret tilsvarende eller DK 169347 B1 3 større interferonaktivitet.

Den foreliggende opfindelse angår som nævnt et hidtil ukendt derivat af humant interferon-r-polypeptid med for-5 øget aktivitet i forhold til kendte IFN-r-forbindelser.

TABEL 1

CACATTGTTCTGATCATCTGAAGATCAGCTATTA6AAGAGAAAGATCAGTTMGTCCTTTGGACCTGATCAGCTTGATACAAGAACTACTGATTT

“20

met lys tyr thr ser tyr ile leu ala phe gin leu cys ile val. len CAACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCGGAAACG ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG

1 _,10 '20

gly ser-leu gly CYS TYR CYS GIN ASP PRO TYR VAL GLN GLU ALA GLU ASN LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA

GGT TCT CTT GGC TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA CAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA

i : t - — 30 -40

GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP LYS GLU GLU SER ASP

GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC

<* 1' 50 ‘60

ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER

AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT MA AAC TTT AM GAT GAC CAG AGC

70 80 SO

ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE PHE ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG

ATC CAA MG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC MG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA

100 -110

ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASN TYR SER VAL THR ASP LEU ASN.VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU

GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC

120 130 140

ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER GLH MET LEU PHE ARG

ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG MG CGA AM AGG AGT CAG ATG CTG TTT [mi (T) 146

GLY ARG ARG ALA SER GLN

GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA TGGTTGTCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTAAATCTAAATCTATTTATTAåTATTTAACATTATTTÅ TATGGGGAATATATTTTTAGACTCATCAATCÅAATAAGTATTTATAATAGCAACTTTTGTGTAATGAAAATGAATATCTATTAATATATGTATTA TTTATAATTCCTATATCCTGTGACTGTCTCACTTAATCCTTTGTTTTCTGACTAATTAGGCAAGGCTÅTGTGATTACAAGGCTTTATCTCAGGGG CCAACTAGGCAGCCAACCTAAGCAAGATCCCATGGGTTGTGTGTTTATTTCACTTGATGATACAATGAACACTTATAAGTGAAGTGATACTATCC AGTTACTA CCCCCCC ......

ί DK 169347 B1 4 På tegningen viser fig. 1 flow sheetet til konstruktion af pGBD-1, 5 fig. 2 flow sheetet til konstruktion af pGSB-6 og pGVA-4, fig. 3 flow sheetet til konstruktion af pGKV-13, fig. 4 flow sheetet til konstruktion af pGWC-10, 10 fig. 5 flow sheetet til konstruktion af pGVL-10, fig. 6 flow sheetet til konstruktion af pGVMIOl og 15 fig. 7 flow sheetet til konstruktion af pGWE4.

Den foreliggende opfindelse omhandler et rekombinant plasmid, hvori en DNA, der koder for et hidtil ukendt derivat af humant IFN-r, er inkorporeret, en mikroorganisme 20 indeholdende plasmidet, en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt derivat af humant IFN-r-polypeptid under anvendelse af mikroorganismen og derivatet af det humane IFN-r-polypeptid som sådant.

25 Konstruktion af det rekombinante plasmid udføres under anvendelse af cDNA opnået fra messenger-RNA kodende for IFN-r ved rekombinant DNA-teknologi eller chromosomal DNA kodende for IFN-r som udgangsmateriale.

30 I den foreliggende opfindelse kan en vilkårlig human IFN-r-cDNA anvendes, og foretrukkent anvendes pIFNr-G4. Escherichia coli indeholdende pIFNr-G4 er blevet deponeret i American Type Culture Collection, USA under nummeret ATCC 39123.

Basesekvensen for IFN-r-DNA i pIFNr-G5 blev bestemt ved metoden af Maxam og Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 35 DK 169347 B1 5 560 (1977)] og er vist i tabel 1.

Sammenligning af den humane IFN-r-cDNA i pIFNr-G4 og den kendte IFN-r-cDNA [R. Devos, et al.: Nucleic Acids Re-5 search, 10, 2487 (1982)] afslører følgende: Den første base [adenin (A)] af den triplet, der koder for lysin (den niende aminosyre i det modne humane IFN-r-polypep-tid) i det kendte IFN-r, erstattes med cytosin (C) i pIFNr-G4 cDNA’en. Følgelig er den niende aminosyre fra 10 den N-terminale ende af det humane IFN-r-polypeptid indkodet med pIFNr-G4-CDNA glutamin og ikke lysin. Det er derfor indlysende, at pIFNr-G4 koder for et hidtil ukendt humant IFN-r-polypeptid.

15 Derivater af IFN-r opnået ved deletion eller erstatning af aminosyrer i IFN-r vist i tabel 1 er også hidtil ukendte IFN-r-derivater.

Som plasmid til inkorporering af en DNA kodende for 20 IFN-r-derivat kan anvendes et vilkårligt plasmid, så længde DNA inkorporeret deri kan udtrykkes i Escherichia coli. Fortrinsvis anvendes et plasmid, hvori en fremmed DNA kan indsættes efter en egnet promotor, såsom trp-promotor eller lac-promotor, og længden mellem Shine-25 Dalgarno-sekvens (i det følgende benævnt SD-sekvens) og initieringscodon (ATG) indstilles, f.eks. til 6-18 basepar. Foretrukne eksempler er pKYPlO, pKYPll og pKYP12, der blev konstrueret af opfinderne af den foreliggende opfindelse (japansk offentliggjort uundersøgt 30 patentansøgning nr. 110600/83).

Som vist på tegningens fig. 1 spaltes pIFNr-G4 med PvuII, og BamHI-linker indføres i spaltningsstedet til opnåelse af pGBD-1.

Derpå nedbrydes pGBD-1 med SinI og BamHI, og et fragment på ca. 850 bp renses ved lav-geleringstemperatur-agarose- 35 DK 169347 B1 6 gelelektroforese (LGT-metoden) [L. Wieslander: Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)]. ρΚΥΡΙΟ nedbrydes med Clal og BamHI, og et fragment på ca. 4,3 kb renses. De således opnåede DNA-fragmenter og en syntetisk DNA vist på fig.

5 2, som koder for Tyr som den tredie aminosyre, ligeres med T4-DNA-ligase til opnåelse af pGSB-6. Derpå nedbrydes pGSB-6 med Clal og underkastes ifyldningsreaktion med DNA-polymerase I og ligeringsreaktion med T4-DNA-ligase til opnåelse af pGVA-4. Den samme procedure gentages med 10 undtagelse af, at man anvender den syntetiske DNA, der er vist på fig. 3, og som koder for Ser, som den første og tredie aminosyre til opnåelse af plasmid pGVK-13, som koder for et derivat, hvori første og tredie aminosyre fra den N-terminale ende i IFN-r, Cys, er erstattet med Ser.

15

For at opnå et IFN-r-derivat, hvori N-terminale aminosyrer er deleterede, som vist på fig. 4, nedbrydes pGKA-2 med Clal, nedbrydes med Bal31 i et kort tidsrum på 1-30 minutter for at udskære den DNA, der koder for N-terminal 20 aminosyre i IFN-r, og behandles med PstI, og et fragment på 4,3 kb renses. Separat nedbrydes vektor pTrS-3 indeholdende initieringscodon med Sphl, behandles med DNA-polymerase I og nedbrydes med PstI, og et fragment på 880 bp renses. Begge fragmenter ligeres med T4-ligase til op-25 nåelse af pGWC-10.

Reaktionsbetingelser påkrævet til den rekombinante DNA-teknologi beskrevet i det foregående er generelt som følger.

30

Nedbrydning af DNA med restriktionsenzymer udføres sædvanligvis ved at omsætte 0,1-20 ug DNA med 0,1-100 enheder, foretrukkent 1-3 enheder restriktionsenzym pr. ug DNA i en blanding af 2-200 mM, foretrukkent 10-30 mM 35 Tris-HCl (pH 6,0-9,5, foretrukkent pH 7,0-8,0), 0-200 mM NaCl og 2-20 mM, foretrukkent 5-10 mM MgCl2 ved 20-70 °C (optimal temperatur afhænger af anvendte restriktionsen- DK 169347 B1 7 zymer) i 15 minutter til 24 timer. Reaktionen standses sædvanligvis ved opvarmning til 55-75 °C i 5-30 minutter eller også ved at inaktivere restriktionsenzymet med reagenset, såsom phenol eller diethylpyrocarbonat.

5

Rensning af DNA-fragmenterne dannet ved nedbrydningen med restriktionsenzymer udføres ved LGT-metoden eller poly-acrylamidgelelektroforese [A.M. Maxam et al.: Proc.

Natl. Acad. Sci., USA 74, 560 (1977)].

10

Ligering af DNA-fragmenterne udføres med 0,3-10 enheder T4-DNA-ligase i en blanding af 2-200 mM, foretrukkent 10-40 mM Tris-HCl (pH 6,1-9,5, foretrukkent 7,0-8,0), 2-20 mM, foretrukkent 5-10 mM MgC^, 0,1-10 mM, foretrukkent 15 0,5-2,0 mM ATP og 1-50 mM, foretrukkent 5-10 mM dithio- threitol ved 1-37 °C, foretrukkent 3-20 °C i 15 minutter til 72 timer, foretrukkent 2-20 timer. Den rekombinante plasmide DNA, der dannes ved ligeringsreaktionen, indføres i Escherichia coli ved transformationsmetoden ifølge 20 Cohen et al. [S.N. Cohen et al.: Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 69, 2110 (1972)], om nødvendigt. Isolering af den rekombinante plasmide DNA fra Escherichia coli, der bærer DNA'en, udføres ved den metode, der er beskrevet i eksempel 1, eller ved metoden af Birnboim et al. [H. C. Birn-25 boim et al.: Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)]. Plasmid DNA nedbrydes med 1-10 typer restriktionsendonucleaser, og kløvningsstederne undersøges ved agarosegelelektrofo-rese eller polyacrylamidgelelektroforese. Endvidere undersøges, om nødvendigt, basesekvensen for DNA ved meto-30 den af Maxam-Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 560 (1977)].

Derivatet af IFN-r-polypeptidet ifølge opfindelsen fremstilles ved følgende metode.

Escherichia coli K-12 HB101 transformeres med et plasmid, såsom pGVA-4, og en Escherichia coli stamme bærende pGVA- 35 DK 169347 B1 8 4 udvælges fra de ampicillinresistente kolonier (i det

R

følgende benævnt Ap ). Den Escherichia coli stamme, der bærer pGVA-4, dyrkes i et medium til fremstilling af et derivat af IFN-r-polypeptid i de dyrkede celler.

5

Som mediet kan anvendes enten et syntetisk medium eller et naturligt medium, så længe det er egnet til dyrkningen af Escherichia coli og produktionen af derivatet af IFN-r-polypeptid.

10

Som carbonkilde kan anvendes glucose, fructose, lactose, glycerol, mannitol, sorbitol, etc.

Som nitrogenkilde kan anvendes NH4C1, (NH^J^SO^, casami-15 nosyre, gærekstrakt, polypepton, kødekstrakt, Bactotryp-ton, maj sstøbevæske, etc.

Desuden kan næringsstoffer, såsom K2HP04, KH2P04, NaCl, MgS04, vitamin og MgCl2 anvendes.

20

Dyrkning foretages ved pH 5,5-8,5 og ved 18-40 °C med luftning og omrøring.

Efter dyrkning i 5-90 timer akkumuleres derivatet af hu-25 mant IFN-r-polypeptid i dyrkede celler. De opsamlede celler behandles med lysozym, sønderdeles ved gentagen frysning og optøning og underkastes centrifugering. Den således opnåede ovenliggende væske underkastes ekstraktion efter en konventionel metode til ekstraktion af polypep-30 tider til udvinding af polypeptidet.

Bestemmelse af humant IFN-r udføres efter metoden af Armstrong [J.A. Armstrong et al.: Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)].

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

35 DK 169347 B1 9 EKSEMPEL 1

Konstruktion af plasmid pGWC-10 kodende for det polypep-tid, hvori et N-terminalt område af humant IFN-r er dele-5 teret: 25 ug pGKA-2 (5,2 kb) opnået ved fremgangsmåden ifølge referenceeksempel 2 blev opløst i 400 u liter af en pufferopløsning bestående af 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM 10 MgC^, 10 mM dithiothreitol og 10 mM NaCl (i det følgende benævnt "Y-10 pufferopløsning"). 50 enheder Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) blev tilsat og nedbrydningsreaktion udført ved 37 °C i 3 timer. Til 80 uliter af reaktionsopløsningen indeholdende 5 ug DNA blev der 15 sat 12 uliter 10-fold koncentreret BAL31 pufferopløsning [200 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 M NaCl, 120 mM CaCl2], 28 uliter vand og 0,25 enhed nuclease-BAL31 [produkt fra Be-thesda Research Laboratories (BRL)], reaktion blev udført ved 30 °C i 20 sekunder. BAL31 har den aktivitet for exo-20 nuclease, som nedbryder et DNA-molekyle fra enden, og ca.

30 basepar DNA fra Clal-stedet blev nedbrudt under de ovennævnte betingelser. DNA blev udvundet fra reaktionsopløsningen ved phenolekstraktion, chloroformekstraktion og ethanoludfældning. 1,0 ug af det således udvundne 25 pGKA-2-fragment nedbrudt med Clal og BAL31 blev opløst i 20 uliter Y-50 pufferopløsning. 2 enheder PstI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 2 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der udvundet 0,5 ug DNA-fragment på ca. 4,3 kb ved LGT-metoden.

30

Derpå blev 5,0 ug ATG-udtrykkelsesvektor pTrS3 (3,8 kb) opløst i 40 uliter Y-50 pufferopløsning. 10 enheder Sphl (produkt fra BRL) blev tilsat og nedbrydningsreaktion udført ved 37 °C i 3 timer. Efter phenolekstraktion og 35 chlorof ormekstraktion udvandtes ca. 3,0 ug DNA-fragment

ved ethanoludfældning. Ca. 3,0 ug af DNA-fragmentet blev opløst i en opløsning bestående af 67 mM Tris-HCl (pH

DK 169347 B1 10 8,3), 6,7 mM MgCl2, 10 mM mercaptoethanol, 6,7 nM EDTA og 16,6 mM (NH4)2S04, og 1 mM af hvert af stofferne dATP, dTTP, dCTP og dGRP blev tilsat. Endvidere blev der tilsat 6 enheder T4-DNA-polymerase (produkt fra Takara Shuzo 5 Co., hvilket også gælder det følgende), og reaktionen blev udført ved 37 °C i 1 time til nedbrydning af den fremstikkende ende. Efter phenolekstraktion blev der ved ethanoludfældning udvundet 1,0 ug DNA-fragment. 1,0 ug af DNA-fragmentet blev opløst i 20 uliter (totalvolumen) ΥΙΟ 50 pufferopløsning. 2 enheder PstI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der udvundet 0,5 ug DNA-fragment på ca. 880 bp indeholdende Ptrp ved LGT-metoden.

15 0,5 ug Clal-Pstl-fragment (ca. 4,3 kb) af pGKA2 opnået i det foregående og 0,5 ug pTrS3-SphI-T4-polymerase-PstI-fragment (880 bp) opnået som i det foregående blev opløst i 10 uliter (totalvolumen) T4-ligase-pufferopløsning. 0,3 enhed T4-DNA-ligase blev tilsat og ligeringsreaktion ud-20 ført ved 4 °C i 18 timer.

Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den således opnåede rekombinante plasmide blanding,

D

og plasmid DNA blev udvundet fra Ap -kolonien, der var 25 dannet, til opnåelse af pGWC-10 som vist på fig. 5. Strukturen af pGWC-10 blev fundet ved nedbrydning med EcoRI, Clal og BamHl og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved fremgangsmåden af Maxam og Gilbert, at sekvensen ved den N-terminale ende af det humane IFN-r-30 strukturgen i pGWC-10 var som følger.

Met Val Gin Glu Ala Glu -ATG GTA CAA GAA GCA GAA

35 Det blev også bekræftet, at 7 aminosyrer fra den N-terminale aminosyre (Cys) til den syvende aminosyre (Tyr) af det modne humane IFN-r-polypeptid var deleteret, og at DK 169347 B1 11 det humane IFN-r-polypeptidderivat startede med den ottende aminosyre (Val) [derivatet kaldes IFN-t(a1-7)] . Escherichia coli stamme bærende plasmid pGWC-10 er blevet deponeret hos FERM som Escherichia coli IGWC-10 (FERM BP-5 397).

EKSEMPEL 2

Fremstilling af IFN-r-derivater med Escherichia coli 10 stammer bærende pGBD-1, pGVA-4, pGVK-13 og pGWC-10:

Escherichia coli HB101 stammer bærende rekombinante plas-mider pGBD-1, pGVA-4, pGVK-13, opnået i eksempel 1-3 i DK patentansøgning nr. 6108/84, og pGWC-10 opnået i eksempel 15 1, som kaldes IGBD-1, IGVA-4, IGVK-13 og IGWC-10, blev dyrket ved 37 “C i 18 timer i LG-medium (10 g trypton, 5 g gærekstrakt, 5 g NaCl, 2 g glucose, 1 liter vand, indstillet til pH 7,0 med NaOH). 0,2 ml af dyrkningsvæsken blev podet over i 10 ml MCG-medium (0,6% Na2HP04, 0,3% 20 KH2P04, 0,5% NaCl, 0,1% NH4C1, 0,5% glucose, 0,5% casami- nosyre, 1 mM MgSC>4, 4 ug/ml vitamin B^, pH 7,2), og dyrkning blev udført ved 30 °C i 4 timer. Derpå blev 10 ng/ml indolacrylsyre (i det følgende benævnt IAA), som er en inducer for tryptophan-operon, tilsat, og dyrkning blev 25 fortsat i 4 timer. Dyrkningsvæsken blev centrifugeret ved 8000 omdr./min. i 10 minutter, og de høstede celler blev vasket med en pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl (pH 7,5). Vaskede celler blev suspenderet i 1 ml af den i det følgende beskrevne pufferopløsning, 30 og 5 μϋΐβΓ af en opløsning indeholdende 200 ug lysozym og 0,25 M EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) blev tilsat. Blandingen fik lov at henstå ved 0 “C i 30 minutter og frysning og tøning blev gentaget 3 gange for at bryde cellerne. De brudte celler blev centrifugeret ved 15000 35 omdr./min. i 30 minutter til opnåelse af en overliggende væske. Mængden af interferon i den overliggende væske blev bestemt efter metoden af Armstrong [J.A. Armstrong DK 169347 B1 12 et al.; Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)], hvori Sind-vis-virus blev anvendt som virus, og FL-celler afledt fra humane amnionceller blev anvendt som dyrecellerne. Resultaterne fremgår af tabel 2.

5 TABEL 2 Produkt, som 10 plasmidet IFN- r

Stammer Plasmid koder for (enh./ml) IGBD-1 pGBD-1 IFN-r spor IGVA-4 pGVA-4 3-Tyr-IFN-r 9 x 104 15 IGVK-13 pGVK-13 1,3-Ser-IFN-r 2 x 105 IGWC-10 pGWC-10 IFN-r(Al-7) 5 x 104 IGKA-2 pGKA-2 IFN-r 2 x 104 20 IGKA-2 er en stamme, der bærer plasmid pGKA-2, der koder for IFN-r.

EKSEMPEL 3 25 Konstruktion af plasmid pGWE4, der koder for det polypep-tid, hvori et N-terminalt område af det humane IFN-r er deleteret: 25 ug pGKA2 (5,2 kb) opnået ved fremgangsmåden ifølge re-30 ferenceeksempel 2 blev opløst i 400 uliter Y-10 pufferopløsning. 50 enheder Clal blev tilsat, og nedbrydningsreaktion udført ved 37 °C i 3 timer. Til 80 uliter af reaktionsopløsningen indeholdende 5 ug DNA blev der sat 12 uliter 10-fold koncentreret BAL31 pufferopløsning, 28 35 uliter vand og 0,25 enhed nuclease BAL31, og reaktionen blev udført ved 30 °C i 10 sekunder. BAL31 har aktiviteten for exonuclease, som nedbryder fra enden af et DNA- DK 169347 B1 13 molekyle, og ca. 20 basepar DNA fra Clal-stedet blev nedbrudt under de i det foregående beskrevne betingelser.

DNA blev genvundet fra reaktionsopløsningen ved phenol-ekstraktion, chloroformektraktion og ethanoludfældning.

5 1,0 ug af det således udvundne pGKA2-fragment nedbrudt med Clal og BAL31 blev opløst i 20 uliter Y-50 pufferopløsning. 2 enheder PstI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 2 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der udvundet 0,5 ug DNA-fragment på ca. 4,3 10 kb ved LGT-metoden.

Derpå blev 5,0 ug ATG-ud trykkel sesvektor pTrS3 (3,8 kb) opløst i 40 uliter Y-50 pufferopløsning. 10 enheder Sphl blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 15 °C i 3 timer. Efter phenolekstraktion og chloroformekstraktion blev ca. 3,0 ug DNA-fragment udvundet ved ethanoludf ældning. Ca. 3,0 ug af DNA-fragmentet blev opløst i en opløsning bestående af 67 mM Tris-HCl (pH 8,3), 6,7 mM MgCl2, 10 mM mercaptoethanol, 6,7 uM EDTA og 16,6 mM

20 (NH^^SO^ og 1 mM af hvert af stofferne dATP, dTTP, dCTP og dGTP. Endvidere blev der tilsat 6 enheder T4-DNA-poly-merase, og reaktionen blev udført ved 37 °C i 1 time til nedbrydning af den fremstikkende ende. Efter phenolekstraktion og chloroformekstraktion blev der udvundet 1,0 25 ug DNA-fragment ved ethanoludf ældning. 1,0 ug af DNA-fragmentet blev opløst i 20 uliter (totalvolumen) Y-50 pufferopløsning. 2 enheder PstI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 "C i 3 timer. Fra reaktionsopløsningen blev der ved LGT-metoden udvundet 0,5 ug 30 DNA-fragment på ca. 880 bp indeholdende P^ .

0,5 ug Clal-PstI-fragment (ca. 4,3 kb) af pGKA2 opnået som i det foregående og 0,5 ug pTrS3-SphI-T4-polymerase-Pstl-fragment (880 bp) opnået som i det foregående blev 35 opløst i 10 uliter (totalvolumen) T4-ligase-pufferopløsning. 0,3 enhed T4-DNA-ligase blev tilsat, og ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 18 timer.

DK 169347 B1 14

Escherichia coli HB101 blev transformeret under anvendelse af den således opnåede rekombinante plasmide blanding, og plasmid-DNA blev udvundet fra Ap -kolonien, der var dannet, til opnåelse af pGWE4 som vist på fig. 7. Struk-5 turen af pGWE4 blev fundet ved nedbrydning med EcoRI,

Clal og BamHI og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved metoden af Maxam og Gilbert, at sekvensen ved den N-terminale ende af det humane IFN-r-strukturgen i pGWE4 var som følger.

10

Met Asp Pro Tyr Val Gin -ATG GAC CCA TAT GTA CAA

Det blev også bekræftet, at 4 aminosyrer fra den N-termi-15 nåle aminosyre (Cys) til den fjerde aminosyre (Gin) i det modne IFN-r-polypeptid var udslettet, og at det humane IFN-r-polypeptidderivat blev startet med den femte aminosyre (Asp) [derivatet kaldes IFN-r(Δ/-4)]. Escherichia coli stamme bærende plasmid pGWE4 er blevet deponeret hos 20 FERM Escherichia coli IGWE4 (FERM BP-546).

EKSEMPEL 4

Produktion af IFN-r-derivater med Escherichia coli stam-25 mer bærende pGVLlO, pGVMIOl og pGWE4:

Escherichia coli HB101 stammer bærende rekombinante plas-mider pGVLlO opnået i eksempel 3 og pGVMIOl og pGWE4 opnået i eksempel 5-6 i DK patentansøgning nr. 6108/84, som 30 kaldes IGVL10, IGVM101 og IGWE4, blev dyrket ved 37 °C i 18 timer i LG-medium. 0,2 ml af dyrkningsmediet blev podet i 10 ml MCG-medium, og dyrkning blev foretaget ved 30 °C i 4 timer. Derpå blev der tilsat 10 ug/ml I AA, og dyrkning blev fortsat i 4 timer. Dyrkningsmediet blev 35 centrifugeret ved 8000 omdr./min. i 10 minutter, og de høstede celler blev vasket med en pufferopløsning indeholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl (pH 7,5). Vaskede DK 169347 B1 15 celler blev suspenderet i 1 ml pufferopløsning som beskrevet i det foregående, og 5 uliter af en opløsning indeholdende 200 ug lysozym og 0,25 M EDTA blev tilsat. Blandingen blev centrifugeret i 30 minutter til opnåelse 5 af en overliggende væske. Mængden af interferon i den overliggende væske blev bestemt efter metoden af Armstrong, hvori Sindvis-virus blev anvendt som virus, og FL-celler afledt fra humane amnionceller blev anvendt som dyrecellerne. Resultaterne er vist i tabel 3.

10 TABEL 3 Produkt, som 15 plasmidet IFN-r

Stammer Plasmid koder for (enh./ml) IGBD1 pGBDl IFN-r spor IGVL10 pGVLlO 1-Ser-IFN-r 8 x 104 20 IGVM101 pGVMIOl 3-Ser-IFN-r 3 x 105 IGWE4 pGWE4 IFN-t(a1-4) 2 x 105 IGKA2 pGKA2 IFN-r 2 x 104 25 IGKA-2 er en stamme, der bærer plasmid pGKA2, der koder for IFN-r.

Referenceeksempel 1 30 Indsætning af human IFN-r-DNA i udtrykkelsesvektoren pKYP-11: I dette eksempel blev 6 ug plasmid pIFNr-G4 (3,6 kb) opløst i 50 uliter (totalvolumen) af en opløsning indehol-35 dende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM dithio-threitol og 50 mM NaCl. Derpå blev 12 enheder af hvert af restriktionsenzymerne PvuII og Hindlll tilsat, og ned- DK 169347 B1 16 brydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 4 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 7 minutter til inaktivering af enzymerne og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 1,2 ug af et DNA-fragment på 5 1,3 kb indeholdende human IFN-r-DNA.

Separat blev 4 ug pKYP-11 opløst i 40 uliter (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM dithiothreitol og 50 mM NaCl. 8 enhe-10 der BamHI blev tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 5 minutter til inaktivering af enzym et. Derefter blev 30 uM af hvert af stofferne dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsat, og 8 enheder Escherichia coli DNA-15 polymerase I (Klenow-fragment, produkt fra New England Biolabs, 1 uliter) blev tilsat. Ifyldningsreaktion blev udført ved 15 °C i 1 time, og reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 68 °C i 15 minutter til inaktivering af DNA-polymerase I. 10 enheder Hindlll blev tilsat, og nedbryd-20 ningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer efterfulgt af opvarmning ved 65 °C i 5 minutter til at inaktivere Hindlll. Nedbrydningsreaktionsopløsningen af plasmidet pKYP-11 blev underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af ca. 2,5 ug af et DNA-fragment på ca. 4,7 kb in- 25 deholdende P. .

trp

Derpå blev 0,5 ug af DNA-fragmentet på 1,3 kb indeholdende human IFN-r-DNA og 1,0 ug af DNA-fragmentet på ca. 4,7 kb indeholdende P^.^, som blev opnået fra plasmidet pKYP-30 11, opløst i 20 uliter af en opløsning indeholdende 20 mM

Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC^, 5 mM dithiothreitol og 500 uM ATP, og 4 enheder T4-DNA-ligase (produkt fra New England Biolabs) blev tilsat. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 18 timer, og Escherichia coli HB101 blev 35 transformeret med den opnåede rekombinante plasmidblan- ding ved konventionel teknik til opnåelse af en Ap -koloni. Et plasmid, pGC-7, blev skilt fra dyrkningsmediet for 17 DK 169347 B1 kolonien. Strukturen af pGC-7 blev bekræftet ved nedbrydningen med Hindlll, BamHI, Hpal, Sall, EcoRI og Clal og agarosegelelektroforese. Escherichia coli stamme indeholdende pGC-7 er blevet deponeret hos FERM som Escherichia 5 coli IGC-7 (FERM P-6814, FERM BP-497).

Referenceeksempel 2

Konstruktion af rekombinant plasmid pGKA-2: 10

I dette eksempel blev 6 ug af den i referenceeksempel 1 opnåede PGC-7-DNA opløst i 59 uliter (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM

MgCl2, 10 mM dithiothreitol og 10 mM NaCl, og 12 enheder 15 BstNl (produkt fra New England Biolabs) blev tilsat. Der blev udført reaktion ved 60 °C i 3 timer, og reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 5 minutter til inaktivering af BstNl. Derpå blev 150 mM NaCl og 8 enheder Sall tilsat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 20 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev genopvarmet ved 65 °C i 5 minutter til inaktivering af Sall og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af 0,8 ug af et DNA-fragment på ca. 1125 bp indeholdende størstedelen af den humane IFN-r-DNA.

25

Separat blev 3 ug pKYP-10 opløst i 40 uliter (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 10 mM dithiothreitol og 100 mM NaCl. 6 enheder af hvert af stofferne Hindlll og Sall blev til-30 sat, og nedbrydningsreaktion blev udført ved 37 °C i 3 timer. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 65 °C i 5 minutter for at inaktivere Hindlll og Sall og underkastet rensning ved LGT-metoden til opnåelse af ca. 1,8 ug af et DNA-fragment på ca. 4,1 kb indeholdende PL .

Den N-terminale aminosyre i det modne humane IFN-r-poly-peptid er Cys. For at udtrykke moden IFN-r-DNA er det 35 DK 169347 B1 18 nødvendigt at tilvejebringe en initieringscodon (ATG) lige før den 5’-terminale codon TGT (Cys) og yderligere at indstille længden mellem SD-sekvens efter P og ATG til en passende længde på 6-18 bp. Derfor syntetiseredes føl-5 gende DNA-linker.

HindiII BstNI

MetCysTyrCys 5’ AGCTT ATG TGTTACTGCC 3' (18-mer) 10 3’ ATACACAATGACGGT 5' (15-mer)

To enkeltkædede DNA*er af 18-mer og 15-mer blev syntetiseret ved en konventionel triestermetode [R. Crea et ,_ al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 5765 (1978)]. Derpå blev 2 ug af den 18-mere og 2 ug af den 15-mere DNA opløst i 20 uliter (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC^, 5 mM dithio-threitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheder T4-polynu-cleotid-kinase (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) blev tilsat, og phosphoryleringsreaktion blev udført ved 37 "C i 60 minutter.

Derpå blev 2 ug af såvel phosphoryleret 18-mer som 15-mer DNA blandet, og blandingen blev opvarmet ved 70 °C i 5 25 minutter og fik lov at stå ved stuetemperatur til annealing til opnåelse af DNA-linkeren med den i det foregående givne struktur.

0,4 ug af BstNl-Sall-fragmentet på 1125 bp opnået som i ou det foregående og afledt fra pGC-7 og 1,0 ug af DNA-frag- mentet på 4,1 kb opnået ved nedbrydning af udtrykkelses- vektoren pKYP-10 med Hindlll og Sall blev opløst i 25

uliter (totalvolumen) af en opløsning indeholdende 20 mM

Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl0, 5 mM dithiothreitol og 500 35 ^ DK 169347 B1 19 uM ATP. Ca. 0,1 ug af DNA-linkeren nævnt i det foregående blev sat til blandingen efterfulgt af tilsætning af 6 enheder T4-DNA-ligase. Ligeringsreaktion blev udført ved 4 °C i 17 timer. Escherichia coli HB101 blev transformeret 5 under anvendelse af den opnåede rekombinante plasmide blanding ved konventionel teknik til opnåelse af en Ap -koloni. Et plasmid, pGKA-2, som vist på fig. 5, blev isoleret fra dyrkningsmediet for kolonien. Strukturen af pGKA-2 blev bekræftet ved nedbrydning med EcoRI, ClaX, 10 Hindlll, BstNl og Sall og agarosegelelektroforese. Det blev bekræftet ved metoden af Maxam-Gilbert, at basesekvensen fra SD-sekvensen (AAGG) til initieringscodonen (ATG) i plasmidet pGKA-2 var "AAGGGTATCGATAAGCTTATG".

15 Escherichia coli stamme indeholdende pGKA-2 er blevet deponeret hos FERM som Escherichia coli IGKA-2 (FERM P-6798, FERM BP-496).

Aktivitetsforsøg 20

De efterfølgende forsøg viser, at interferon-r-derivaterne ifølge opfindelsen adskiller sig væsentligt fra det kendte interferon-r.

25 FORSØG 1

Aktivitet af interferon-r i serum:

Aktiviteter af interferon-r ifølge opfindelsen (herefter g 30 angivet som Gin -IFN- r) og den beskrevne i de modholdte g publikationer (herefter angivet som Lys -IFN-τ) i serum, blev undersøgt på følgende måde.

g 10 μΐ af en opløsning indeholdende 100 ug/ml IFN-r (Gin - g 35 IFN-r eller Lys -IFN-r) og 490 μΐ humant serum blev blandet, og blandingen blev holdt ved 37 °C i 24 timer. Blandingen blev fortyndet 50 gange med MEM medium indeholden- 20 DK 169347 B1 de 5% kvægser umalbumin, og I FN-r-ak ti vi te ten (antivirus-aktivitet) blev bestemt ved metoden ifølge Armstrong (Armstrong J.A. et al.: Appl. Microbiol, 21, 723-725 (1971)). Som kontrol blev opløsningen indeholdende IFN-r, 5 holdt ved 4 °C i 24 timer og blev underkastet undersøgelser. Resultaterne er vist i efterfølgende tabel.

Gln9-IFN-r Lys9-IFN-r

Antivirus- Akti- Antivirus- Akti- 10 aktivitet Gennem- vitets- aktivitet Gennem- vitets- (U/ml) snit forhold (U/ml) snit forhold 200.0 193,3

Kontrol 158,0 169,3 1,00 201,8 212,1 1,00 15 149,9 241,2

I

284.0 205,7

Test 248,3 254,4 1,50 234,0 222,8 1,05 230,9 228,8 20 FORSØG 2

Aktivering af IFN-r ved behandling med trypsin: ^ 45 ul hver af 50 ug/ml Gln9-IFN-T og 50 ug/ml Lys9-IFN-r blev respektivt sat til 5 u liter af en trypsinopløsning under dannelse af blandinger indeholdende trypsin og IFN-r i vægtforhold på 1:50, 1:100, 1:200 og 1:400. Blandingen blev inkuberet ved 5 °C i 60 minutter. 20 uliter 30 af blandingen blev tilsat til 980 μΐ MEM medium indeholdende trypsininhibitor for at stoppe reaktionen. Antivi-rusaktivitet af reaktionsblandingen blev bestemt ved samme metode som beskrevet i forsøg 1. Resultaterne er vist 35 21 DK 169347 B1 i den efterfølgende tabel.

Gln9-IFN-r Lys9-IFN-r

Forhold Antivirus- Akti- Antivirus- Akti- 5 af tryp- aktivitet Gennem- vitets- aktivitet Gennem- vitets-sin: IFN-r (U/ml) snit forhold (U/ml) snit forhold 651,07 747,66

Kontrol 539,13 605,8 1,00 599,04 613,4 1,00 10 627,10 493,50 263,37 604,31 1:50 318,56 292,8 0,48 528,99 603,4 0,98 296,53 676,89 15 1059,30 633,76 1:100 843,73 887,7 1,46 684,30 688,7 1,12 760,21 748,04 20 1404,19 1271,8 1:200 1388,89 1326,0 2,18 1214,5 1240,6 2,02 1184,88 1235,6 1708,70 1004,08 25 1:400 1448,74 1553,1 2,56 1566,84 1309,2 2,13 1501,81 1356,62 284,0 205,7

Test 248,3 254,4 1,50 234,0 222,8 1,05 30 230,9 228,8 35

Claims

DK 169347 B1 Patentkrav : Derivat af humant interferon-r-polypeptid, kende-5 tegnet ved, at det indkodes af et rekombinant plasmid valgt blandt pGWC-10 og pGWE-4, som bæres af henholdsvis Escherichia coli FERM BP-397 og 546, og hvor po- 9 lypeptiderne er henholdsvis IFN-r(δΙ-7, Gin ) og IFN-r(δ1-4, Gin9). 10 15 20 25 30 35