DK169364B1 - Fremgangsmåde til måling af niveauet af antigener,antistoffer eller haptener i en flydende prøve - Google Patents

Description

i DK 169364 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til måling af niveauet af et antigen, antistof eller hapten i en flydende prøve.

Væskefase- og fastfaseimmunoanalyser og talrige modifikationer og variationer heraf er blevet beskrevet i litteraturen til måling 5 af en mængde antigener og antistoffer i kredsløbet. Der er blevet udstedt talrige US-patenter og patenter fra andre lande vedrørende et eller flere aspekter ved immunoanalysemetoder.

Kompetitive dobbeltantistofimmunoanalysemetoder med isotopmærkning og separation har spillet en væsentlig rolle ved målingen af 10 antigener og haptener. Sådanne metoder er følsomme og reproducerbare, men kræver centrifugering for at separere det frie, mærkede antigen eller hapten fra den antistofbundne mærkning. Skønt sådanne metoder udnytter førsteordenvæskefasekinetik, bygger de på en polyethylenglycolkatalyseret anden antistofseparation. Der er 15 adskillige iboende ulemper ved sådanne systemer; nemlig (a) det strenge krav vedrørende et meget oprenset antigen eller hapten til isotopmærkning og (b) høj uspecifik binding, hvilket tildels skyldes sporingsisotopurenhed og -ustabilitet og/eller den anden antistofse-paration udført med polyethylenglycol.

20 Kompetitive dobbeltantistofimmunoanalysemetoder med enzym mærkning og separation er blevet anvendt i meget mindre skala. Antigen- eller haptenenzymmærkninger har, skønt de er mere stabile end de modsvarende isotopmærkninger, ulemper ved sådanne analyser på grund af ekstrem høje uspecifikke bindinger og kræver multiple vask, 25 hvilket således nedsætter følsomheden og reproducerbarheden.

Anvendelse af fluorescerende eller kemi lumi nicerende mærkninger i stedet for i dobbeltantistofanalyserne af den kompetitive type har ikke helt løst det iboende problem med uspecifik binding og begrænset følsomhed og reproducerbarhed af sådanne metoder. Homogene 30 enzymimmunoanalyser som beskrevet i US patent nr. 3.817.837 har tildels været rettet mod problemet med uspecifik binding beskrevet ovenfor for kompetitive dobbeltantistofmetoder med ikke-i sotopisk mærkning og separation. Den lære, man kan drage af US patent nr. 3.817.837, er imidlertid begrænset til lavmolekylære haptener, som 35 er tilstede i temmelig høje koncentrationer i legemsvæsker.

Ved den kompetitive immunoanalyse med fluorescenspolarisation, som er beskrevet i US patent nr. 4.420.568, har man med held elimineret de fleste af de følsomhedsproblemer, som er beskrevet i US patent nr. 3.817.837, men indtil nu har anvendelsen heraf været DK 169364 Bl 2 begrænset til små molekyler. Der er siden blevet omtalt andre kompe-titive fluorescensimmunoanalyser for højmolekylære antigener, men ligesom med fluorescenspolarisation kræver de til deres udøvelse et instrument, som er specielt beregnet hertil.

5 Kompetitive fastfaseimmunoanalyser har været i brug i det sidste tiår og har gradvis erstattet kompetitive dobbeltantistofmetoder med separation for lavmolekylære haptener og adskillige større antigener med en molekylvægt på mindre end 30.000 dalton. Sådanne kompetitive fastfaseimmunoanalyser med isotopmærkning er 10 praktisk talt fri for de problemer med uspecifik binding, som er forbundet med kompetitiv væskefaseimmunoanalyser, men kan ikke anvendes med højmolekyle antigener, hvilket tildels hovedsagelig skyldes sterisk hindring på det faste bæremateriale.

Kompetitive fastfaseimmunoanalyser med ikke-isotopmærkning er 15 forbundne med lignende problemer med hensyn til sterisk hindring på det faste bæremateriale og i tilfælde med enzymmærkninger adderer størrelsen af selve mærkningen også til det steriske problem. Den foreliggende opfindelse retter sig mod nogle af de i kompetitiv fastfaseanalyse iboende steriske hindringsproblemer vedrørende 20 fastfasebærematerialer. Immunometriske fastfaseanalyser med eller uden isotopmærkning er blevet veludviklet til målingen af højmolekylære, polyvalente antigener og antistoffer. Der er blevet publiceret adskillige metoder, og i den senere tid er der blevet udstedt adskillige US-patenter og patenter i andre lande, som beskriver 25 adskillige aspekter ved denne analytiske metode.

US patent nr. 3.654.090 var en af de tidligste belæringer vedrørende en sekventiel, totrinsimmunoenzymometrisk analyse til påvisningen af polyvalente antigener. Der har siden været anvendt adskillige modifikationer af dette patents oprindelige belæring til 30 målingen af højmolekylære antigener under anvendelse af signalfrem-bringende prober med eller uden isotopmærkning.

Af indlysende analytiske grunde er det vel godtgjort, at anvendelsen af to forskellige polyklonale antistoffer rejst i forskellige arter rettet mod det samme antigen (ét immobiliseret på et fast 35 bæremateriale og det andet mærket med en signalfrembringende probe) forøger analysens følsomhed og nedsætter i en vis udstrækning baggrundssignaler i immunometriske analyser. US patent nr. 4.376.110 angår anvendelsen af to monoklonale antistoffer rettet mod to forskellige epitoper på polyvalente antigener i immunometrisk 3 DK 169364 B1 analyser. I modsætning til US patent nr. 3.654.090 udnyttes i US patent nr. 4.376.110 et ikke-sekventielt analysesystem med coinku-bering. I US patent nr. 4.474.892 beskrives også på lignende måde et dobbeltsidet (to epitoper) immunometrisk analysesystem, hvortil 5 anvendes monoklonale antistoffer af forskellige klasser eller subklasser rettet mod det samme antigen. Skønt man med de ovenfor beskrevne metoder opnår acceptabel følsomhed, specificitet og i en vis udstrækning reducerede baggrundssignaler, har de alle den ulempe, at de er forbundet med lav reaktionskinetik på grund af 10 immobiliseringen af antistoffet på det faste bæremateriale og en reaktion af fastfasetypen. Det er vel underbygget, at fastfasereak-tioner har lavere reaktionskinetik end væskefasereaktioner og også har lavere forhold mellem signal og baggrund, selv om det immobiliserede antistof har en højere affinitetskonstant forud for immobil -15 isering. Dette skyldes i høj grad steriske hindringsproblemer på det faste bæremateriale. Hvis sådanne metoder ikke optimeres på den rigtige måde hvad angår mængden af immobiliseret antistof og koncentrationen og den specifikke aktivitet af den signal producerende probe fastgjort til det andet antistof kan den såkaldte "højdosis 20 hægteeffekt" (eng: "high-dose hook effect") sætte sådanne metoders pålidelighed og gyldighed på spil.

En yderligere ulempe ved immunometriske metoder er inkonsi-stensen ved antistofimmobili seringsprocessen fra portion til portion. I US patent nr. 4.496.654 diskuteres dette problem med inkon-25 sistent immobilisering af antistoffer, og det anføres, at ved først at immobilisere avidin på et fast bæremateriale, derefter omsætte dette bæremateriale med biotinyleret antistof til frembringelse af et fastfaseantistofbæremateriale opnås ensartet immobilisering. Ved den diskuterede modifikation er lavere reaktionskinetik imidlertid 30 uundgåelig, og faren for en "højdosis hægteeffekt" er stadig sandsynlig. Den foreliggende opfindelse retter sig mod disse mangler og de i disse immunometriske analyser iboende ulemper.

Modifikationer af klassiske immonometriske analyser til påvisning af antigener er også blevet udstrakt til målingen af specifikke 35 antistoffer ved at anvende immobili serede antigener som immunosor-banset. En særlig applikation af sådanne metoder er blevet meget anvendt til påvisning af allergenspecikke immunoglobuliner, IgE (rea-gin-immunoglobuliner). Historisk har test af specifikke allergener fulgt belæringerne i US patent nr. 3.720.760 og de tilsvarende 4 DK 169364 B1 patenter fra andre lande, hvor specifikke allergener immobil i seres på et fast bæremateriale (hovedsagelig filterpapirskiver) og omsættes med en patientprøve, som mistænkes for at indeholde det allergenspecifikke immunoglobulin IgE. Efter en i ni ti el inkubering 5 (typisk 24 timer) vaskes det faste bæremateriale for at fjerne enhver uspecifik binding fra serumkomponenterne, derefter får det faste bæremateriale lov til at reagere med et mærket antistof mod IgE. Efter et andet vasketrin undersøges det faste bæremateriale for tilstedeværelse af mærket materiale. Denne fremgangsmåde har, skønt 10 den er meget anvendt, adskillige ulemper; nemlig langsom reaktionskinetik på grund af fastfasereakti onerne, vanskeligheder ved at frembringe immobil i serede allergener, som har de samme bindingskarakteristika som de naturlige allergener overfor IgE og uoverensstemmelse ved frembringelse af et fastfaseallergen fra en portion 15 til den næste.

For nylig beskrev Aalberse et al., (J.Imm.Methods 87:51-57 (1986)) anvendelsen af haptenmodificerede antigener i stedet for fastfasekoblede antigener i en analyse af radioallergosorbenstest-typen. Ved en sådan analyse omsættes en patientprøve, som mistænkes 20 for at indeholde specifik allergen-IgE, med trinitrobenzensul fonsyre-(TNP)-modificeret specifik allergen i to timer, og omsættes derefter yderligere natten over med et fastfasekoblet anti-TNP til dannelse af IgE-allergen-TNP-anti-TNP-kompleks. Den faste fase vaskes og omsættes igen natten over med 125-I-anti-IgE-antistof, 25 vaskes igen og tælles for tilstedeværelse af 125-I-isotop, som er direkte proportional med koncentrationen af allergenspecifik IgE i patientprøven. Ved denne fremgangsmåde hævder forfatterne at have opnået fordelen med væskefasekinetik i den første, reaktion, men de dokumenterer ikke TNP-mærkningsgraden af deres allergener. Direkte 30 mærkning af allergener med haptener, såsom TNP, giver det problem, at man mister visse vitale al lergene komponenter, som måske ikke mærkes ved en sådan fremgangsmåde, og de vil således ikke blive kvantificeret ved fremgangsmåden. Det lykkes heller ikke forfatterne at vise en forøget reaktionstid (2 dage) sammenlignet med den 35 metode, der er beskrevet i US patent nr. 3.720.760.

Ved den foreliggende opfindelse undgås de problemer, der er forbundet med den traditionelle allergentestmetode og modifikationerne heraf.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til 5 DK 169364 B1 måling af niveauet af et antigen (Ag^), antistof (Ab^) eller hapten (H) i en flydende prøve, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der i en væskefasereaktion dannes et opløseligt kompleks, hvori antigenet (Ag^), antistoffet (Abj) eller hapten (H) er bundet gennem 5 henholdsvis et specifikt antistof (Ab), antigen (Ag) eller antihap-ten (anti-H) til en matrix, som er opløselig i væskefasen og bærer en ligand (X), og at der derefter dannes et uopløseliggjort kompleks, som omfatter en fast bærer bundet til liganden (X) af det opløselige kompleks gennem en anti-ligand (Y), hvor det uopløselig-10 gjorte kompleks bærer et mærke (Z), som er bundet til antigenet (Agj) via et anti-antigen (anti-Agj), til antistoffet (Abj) via et anti-antistof (anti-Abj) eller til hapten (H), at det uopløselig-gjorte kompleks vaskes, og at det vaskede uopløseliggjorte kompleks undersøges for tilstedeværelse af mærket (Z) for at tilvejebringe et 15 mål for niveauet af antigen (Agj), antistof (Abj), eller hapten (H) i prøven.

Fremgangsmåden med at fæstne antigener eller antistoffer til en flydende, opløselig matrix, som derefter mærkes med en given ligand, tjener mindst to særskilte formål: 20 (a) det forøger det potentielle antal immunokomplekser, som kan immobiliseres på en fast bærer via en anti-ligand, eftersom det kun er nødvendigt, at nogle få ligander fæstnes til den flydende matrix for at opnå fuldstændig immobilisering af hele immunokomplekset. Direkte mærkning af antigener eller antistoffer med en given ligand 25 uden brug af en flydende matrix som her beskrevet ville begrænse antallet af immunokomplekser, som kan immobiliseres på den faste bærer ved hjælp af en anti-ligand, eftersom der er mulighed for, at kun nogle få antigener eller antistoffer ville blive mærket med en given ligand, og det ville kræve anvendelse af minutiøse affinitets-30 kromatografimetoder for at separere de ligandmærkede antigener eller antistoffer fra de umærkede antigener eller antistoffer, (b) fordelene ved at anvende væskefasekinetik i den første reaktion er indlysende, eftersom det letter dannelsen af immunokomplekset mellem antigenerne eller antistofferne fæstnet til den 35 flydende matrix og det signal fremkaldende, mærkede anti-antigen eller anti-antistof.

Hvis væskefasekinetik ikke er eftertragtet kan belæringen ifølge den foreliggende opfindelse anvendes til at fremstille 6 DK 169364 B1 effektive fastfasematrixer ved at fæstne antigener eller antistoffer til en flydende matrix og mærke denne matrix med en given ligand, derefter præomsætte denne matrix med en fastfasebærer indeholdende en anti-ligand.

5 Der beskrives adskillige analytiske systemer i forbindelse med opfindelsen.

System I: Ikke-sekventiel analyse:

En patientprøve, som mistænkes for at indeholde et givent 10 antigen eller antistof, omsættes i væskefase med den flydende matrix, som indeholder det ligandmærkede antistof eller det ligandmærkede antigen i nærværelse af et anderledes mærket specifikt anti-antistof eller et anderledes mærket, specifikt anti-antigen. Dette immunologiske kompleks omsættes i væskefasen med en anti-ligand 15 immobil i seret på en fast bærer, hvilken anti-ligand er rettet mod den ligand, der er fæstnet til det specifikke antigen eller antistof via den flydende matrix. Den faste fase vaskes derefter og undersøges for den signalfrembringende mærkning, der er signal fastgjort til anti-antigenet eller anti-antistoffet. Dette kan vises grafisk 20 for påvisningen af antigener eller antistoffer på følgende måde: (a) ikke-sekventiel analyse til påvisning af antistof:

Ag Ag Ag

Prøve (Abi)—j—Anti-Ab1—2 25 *

Anti-Ab1—Z Anti-Ab1—Z

Ab1 Ab1 X···············9

J-i-Y

30 Anti-Ab1—Z Anti-Ab1—Z

Ab1 Ab1 t-Y-x...*9......'........

Vask og undersøg for z.

Hvor Abl = cirkulerende antistof, som skal måles.

35 Ag = specifik antigen rettet mod Abl og som er covalent fast gjort til den flydende matrix.

X = ligand covalent fastgjort til den flydende matrix.

Y = anti-ligand covalent eller passivt fastgjort til den faste bærer.

7 DK 169364 B1 Z = signal fremkaldende mærkning (enzym, radioaktiv mærkning, fluorescerende forbindelse, kemi lumi niscerende forbindelse, biolumi-niscerende forbindelse eller et enzymsubstrat).

5 ····· = den flydende matrix.

Koncentrationen af antistoffet Abl er direkte proportional med det signal, som frembringes af Z.

(b) Ikke-sekventiel analyse til påvisning af antigen: 10 AO AD Ab X························

Prøve (a9) Anti-Ag—Z

Anti-Ag—Z Anti-Ag—Z

15 Ag Ag Ag

Ab Ab Ab

Vask, tilføj: J— §—Y

Anti-Ag—Z Anti-Ag—Z

Ag Ag Ag 20 |_γ_χ. · Ά. *··ίϊ····ίϊ· ·······

Genvask den faste fase og undersøg for Z, hvor koncentrationen af cirkulerende Ag er direkte proportional med det signal, som frembringes af Z.

25

System II: Sekventielle analyser: I sekventielle analyser omsættes patientprøven med ligandmærket specifik antigen eller antistof i væskefasen, kontaktes derefter med fastfaseantiliganden og får lov til at reagere i en specifik tids-3 0 periode. Den faste fase vaskes derefter og omsættes igen med et anti-antigen eller anti-antistof mærket med en signal fremkaldende probe. Den faste fase genvaskes og undersøges for den signal fremkaldende probe.

Det efterfølgende er den skematiske præsentation af et sådant koncept: (a) Sekventiel analyse til påvisning af antistof: DK 169364 B1 s ^ Ag Ag Ag 5 ...........7“.........

j— Prøve (Abi)

Ab1 Ab1

Ag Ag Ag 10

Ab1 Ab1 A9 Ag Ag i-Y-x........................

Vask fast fase Anti-Abl—Z

15 Anti-Ab1—Z Anti-Ab1—Z

Ab1 Ab1 m Ag Ag Ag l-Y-x........................

Vask fast fase og undersøg for Z.

20 (b) Sekventiel analyse til påvisning af antigen: „c Ab Ab Ab 25 X··················««····

Prøve (Ag)

Ag Ag Ag

Ab Ab Ab X·········«*·············

30 L|_Y

Ag Ag Ag m Ab Ab Ab i-Y-x........................

Vask fast fase L Anti-Ag—Z

35 *

Anti-Ag—Z Anti-Ag—Z

Ag Ag Ag te Ab Ab Ab i-Y-x........................

Vask fast fase og undersøg for Z.

9 DK 169364 B1

System III: Haptenpåvisning: Kompetitive analyser:

Ved haptenpåvisning fastgøres et specifikt antistof rettet mod en given hapten, som man ønsker at undersøge, kemisk til en opløselig, flydende matrix eller rygrad og mærkes derefter med en ligand.

5 En patientprøve, som mistænkes for at indeholde dette hapten, omsættes i væskefase -med den opløselige matrix indeholdende det ligandmærkede specifikke antistof i nærværelse af en haptenmærket probe (H-Z) som afbildet nedenfor. Der sker en konkurrence mellem patienthaptenet og den mærkede haptenprobe for bindingssteder på det 10 ligandmærkede antistof i en given tidsperiode. Dette efterfølges af tilsætning af en immobiliseret anti-ligand på en fast bærer, hvilken anti-ligand er rettet mod den ligand, som er fastgjort til den opløselige matrix indeholdende det specifikke antistof. Den faste fase vaskes og undersøges for tilstedeværelsen af den haptenmærkede 15 probe, hvilket er omvendt proportional med koncentrationen af hapten i patientprøven.

Ab Ab Ab Ab X························

Prøve (H) —1— H—2

20 I

H H-Z H H-Z

Ab Ab Ab Ab

J- f-Y

25 H H-Z H H-Z

a, Ab Ab Ab Ab .............................

Vask fast fase og undersøg for Z.

For visse haptener kan det være fordelagtigt at fæstne liganden 30 direkte til det haptenspecifikke antistof uden at anvende en opløselig, flydende matrix for at undgå mulig sterisk hindring, hvis den haptenmærkede, signal fremkaldende probe har en høj molekylvægt, navnlig visse enzymmærkninger.

Anvendelsen af en opløselig, flydende matrix eller rygrad til 35 fastgørelse af specifikke antigener eller antistoffer og efterfølgende mærkning af rygraden med en given ligand er den foretrukne udførelsesform for den foreliggende opfindelse. Variationer i fremgangsmåden eller sekvensen af fastgørelser til matrixen vil være indlysende for en fagmand.

10 DK 169364 B1

Fremstilling af opløselig, flydende antigen- eller antistofmatrix De efterfølgende reaktionssæt beskriver forskelige reaktionssystemer til fremstilling af opløselige matrixer eller rygrade inde-5 holdende et givent antigen eller et givent antistof og en specifik ligand. I disse reaktionssæt aktiveres opløselige polymerer med forskellige forbindelser og omsættes ved forskellige mekanismer. De aktiverede polymermatrixer kobles enten direkte covalent med et antigen eller antistof eller indirekte med en polypeptidpolymer 10 eller copolymer, hvortil et antigen eller antistof derefter covalent fastgøres. Matrix-antigenkomplekset eller matrixanti stofkomplekset eller matrix-polypeptid/copolymer-antigenkomplekset eller matrix-po-lypeptid/copolymerantistofkomplekset mærkes derefter med en ligand direkte eller indirekte gennem en kæde tidligere mærket med ligand.

15 Den ligand, som anvendes i disse eksempler, er biotin, og anti- liganden er avidin. For andre mulige ligand-anti-ligand-kombinationer henvises til afsnittet vedrørende andre mulige ligander.

Reaktionssystem 1 20 I denne reaktionssekvens anvendes to opløselige kulhydrater: (i) opløselig dextran med en molekylvægt, som varierer fra 6000 til 80.000 dalton, og (ii) opløselig Ficoll med en molekylvægt, som varierer fra 70.000 til 400.000 dalton. Disse to kulhydrater anvendes i de efterfølgende eksempler og forkortes MATRIX-OH. De amino-25 syrecopolymerer, som anvendes i de efterfølgende eksempler, kan udvælges blandt en række sådanne copolymerer, hvor eksempler herpå er (a) polylysin, phenylalanin, (b) polylysin, alanin (c) polyglutaminsyre, glutaminsyreester eller (d) _polyglutaminsyre, alanin, lysin, tyrosin. Andre aminosyrecopolymerer vil være ind-30 lysende for en fagmand.

35

Reaktionssekvens la.

1,1'-carbonyldiimidazol (CDI) aktivering og kobling.

11 DK 169364 B1 N=>\

5 Matrix—OH + [^N-C-N^J

J °

y=N

Matrix—O—C—IN I

II ^ o

10 I Protein—NHZ

pH 10,0 L- (Antigen eller antistof)

H

Matrix—O— C—N —Protein-

II

0

15 I

J— (a) K-Hyclroxysuccinirnidbiotin

* pH 5,0 _ (b) EDC

Η H

1 I

Matrix—O— C — N —Protein— N —Biotin

II

o 20

Polylysin -NH2 N-Hydroxy succiniirddbiot in

H

Polylysin —N—Biotin·1-

Η H

I I

Matrix—O— C — N —Protein—Polylysin — N—Biotin

II

o 30 35 EDC er N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid.

12 DK 169364 B1

Reaktionssekvens lb

Anvendelse af aminosyrecopolymer med CDI-reaktion.

N=\ y—N

Matrix—OH + [ ^N—C—N ^_I

s 1 ‘

O

II /=N

Matrix— O— C— N I

• Aminosyrecopolyiner pH 10.01—(AAC)

H

10 Matrix—O—C—N—AAC

0

EDO I

pH 5,0 —I— Protein-NH2 H

Matrix—O— C—N —AAC—Protein--

II

15 ° I

L(a) t^Ifydroxysucciniinidbiotin Η H

Matrix—O—C—N— AAC—Protein—N—Biotin pH5,0 — (b)EDC

II

o

Polylysin -NH2

20 -I

N-Hydroxysuæirmnidbiotin 1

H

Polylysin — N—Biotin·*-

T

Η H

25 i i

Matrix—O— C—N—AAC—Protein—Polylysin — N -Biotin

II

O

De efterfølgende eksempler angives alene for at illustrere opfindelsen.

Eksempel 1 30 Fremstilling af Matrix indholdende specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens lb.

Ovennævnte CDI-aktiveringsreaktion, modificeret fra Bethell, G. et al., J.Biol.Chem. 254:2572(1979) blev anvendt til at fremstille specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens lb og er 35 beskrevet her: (i) 124 nM Matrix-OH, som beskrevet under reaktionssekvens 1, se ovenfor, blev opløst i 2,0 ml dimethyl sul foxid indeholdende 10,0 mg 1,1'-carbonyldiimidazol (CDI) og blev omsat ved omgivelsestemperatur i 30 minutter med hyppig rystning.

13 DK 169364 B1 (ii) 770 nM aminosyrecopolymer (f.eks. giutaminsyre, ethylgiu-tamat) opløst i 2,0 ml dimethyl sul foxid blev tilsat til reaktionsblandingen i (i) ovenfor og fik lov til at reagere i 24 timer ved omgi vel sestemperatur under omrystning.

5 (iii) reaktionsblandingen fra (i) og (ii) ovenfor blev fortyn det med 2 voluminer vand og blev kromatograferet på en Sepharcryl-300 søjle for at isolere Matrix-copolymer-komplekset.

(iv) Fraktioner indeholdende Matrix-copolymeren blev dialyseret mod destilleret vand og yderligere dialyseret mod acetatpuffer pH

10 5,0.

(v) Til det dialyserede Matrix-copolymer-konjugat tilsattes 20,0 mg frysetørret allergenekstrakt efterfulgt af tilsætningen af 0,15 M N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), og blandingen fik lov til at reagere i 24 timer ved 4°C under omryst- 15 ning. Reaktionens pH-værdi blev holdt ved pH 5,0 under denne reaktionsperiode. Reaktionsblandingen blev derefter dialyseret mod 0,1 M natriumbicarbonatpuffer ved pH 8,1 i 12 timer ved 4°C.

(vi) Matrix-copolymer-allergen-konjugatet blev derefter yderligere omsat med 7,3 μΜ N-hydroxysuccinimidbiotin opløst i 1,0 ml 20 dimethyl formamid natten over ved 4°C. Den sidste reaktionsblanding blev kromatograferet på en Sephacryl-300 søjle, og fraktionerne svarende til Matrix-copolymer-allergen-biotin-konjugatet blev hældt sammen og undersøgt for allergenaktivitet, som angivet i detaljer nedenfor.

25 Alternativt blev ovennævnte reaktion modificeret, og biotinyle- ret polylysin blev omsat med Matrix-copolymer-allergen-konjugatet i trin (vi) ovenfor på følgende måde: 1,8 μΜ polylysin (molekylvægt 3.800 dalton) og 180 μΜ N-hydroxysuccinimidbiotin..blev opløst i 1,0 ml dimethyl formamid og fik lov til at reagere i 4 timer ved omgi vel- 30 sestemperatur. Det biotinylerede polylysin blev kromatograferet på en CM-Sepharosesøjle og blev elueret med 50 mM natriumborat pH 9,0 indeholdende 2,0 M natriumchlorid. Det biotinylerede polylysinkonju-gat blev indstillet til pH 5,0 og omsat med Matrix-copolymer-aller-gen-konjugatet under anvendelse af EDC som beskrevet under (vi) og 35 blev kromatograferet til frembringelse af Matrix-copolymer-aller-gen-polylysin-biotin-konjugatet.

Reaktionssekvens 2a;

Cyanogenbromidaktivering og -kobling.

14 DK 169364 B1

Matrix—OH + CN—Br pH 11,0

Matrix—O—C=N

Protein—NH2

10 H

Matrix—O— C—N —Protein-

II

O

J— (a) N-I^droxysuccinimidbiotin

15 HH pH 5,0 _ (b) EDC

I I

Matrix—O—C—N—Protein—N—Biotin

II

o

Polyiysin -NH2

N-%droxysucclniinidbiotiQ -J

20 *

H

Polyiysin — N—Biotin·*-

T

Η H

25 1 I

Matrix—O—C — N—Protein—Polyiysin —N—Biotin

II

o 30 35 15 DK 169364 B1

Reakti onsskema 2b

Anvendelse af aminosyrecopolymer (AAC) med cyanogenbromid-reaktion.

g Matrix—OH + CN—Br j- pH 11,0

Matrix—O—C=N

J— Aminosyrecopoly- -* mer (AAC)

10 H

Matrix—O— C—N —AAC

II

0

EDC I

pH 5,0 —I— Protein—NH2

15 H

Matrix—O— C—N —AAC—Protein -

II

o N-HydroKysuccinimidbiotin

20 Η H pH 5,0 — (b) EDC

Matrix—O— C—N —AAC—Protein— N —Biotin

II

O

Polylysin -NH2 N-Ifydroxysucciniiaidbiotirrl 25 ▼

H

Polylysin — N—Biotin ^ - 1 -

Η H

30 I l

Matrix—O—C—N—AAC—Protein—Polylysin — N— Biotin

II

o

Eksempel 2

Fremstilling af Matrix indeholdende specifikke allergener under 35 anvendelse af reaktionssekvens 2b.

Ovennævnte cyanogenbromidakti veringsreaktion, som er modificeret fra March, S. et al., Anal.Biochem. 60:149(1974), blev anvendt til fremstillingen af specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens 2b og er beskrevet her: 16 DK 169364 B1 (i) 124 nM Matrix-OH, som beskrevet under system 1, se ovenfor, blev opløst i 2,0 ml 2,0 M natriumcarbonat og blev omsat med 100 /il cyanogenbromidopløsning (2g CNBr-krystaller opløst i 1,0 ml acetoni-tril) i 2 minutter ved pH 11,0 og blev yderligere omsat i endnu 2 5 minutter med 100 ml af den samme cyanogenbromidopløsning.

(ii) Umiddelbart derefter tilsattes 385 nM aminosyrecopolymer til (i) ovenfor, og blandingen fik lov til at reagere natten over ved omgi vel sestemperatur og under omrøring.

(i i i) Reaktionsblandingen blev kromatograferet på en Sephacryl-10 300 søjle for at isolere Matrix-copolymer-konjugatet og blev yder ligere dialyseret mod destilleret vand efterfulgt af dialyse mod acetatpuffer pH 5,0.

(iv) Til det dialyserede Matrix-copolymer-konjugat tilsattes 20 mg frysetørret allergenekstrakt og 0,15 M EDC, og blandingen fik lov 15 til at reagere i 24 timer ved 4°C, medens reaktionsblandingens pH-værdi blev holdt på 5,0. Dette blev efterfulgt af dialyse af reaktionsblandingen indeholdende Matrix-copolymer-allergen-konju-gatet mod 0,1 M natriumbicarbonat pH 8,1 i 12 timer ved 4°C. Reaktionssekvensen her følger den, som er beskrevet i eksempel 1 ved 20 reaktionstrin (vi). Den alternative reaktion, hvortil anvendes bioti nyleret polylysin, er også den samme som i eksempel 1, se ovenfor.

25 30 35

Reaktionssekvens 3a 1,4-Butandioldiglycidylether-(BDDGE)-aktivering og -kobling.

17 DK 169364 B1 5 Matrix-OH + H2C-CH-CH2~0—(CH2)4-0-CH-CH2

L0J L0J

I NaOH L- NaBH4

Matrix—O—CH2— C H—CH2—O—(CH2)4—O— C H— C H2

io oh L0J

I (i) Protein—NH2, eller [— (ii) Protein—OH, eller 4- (iii) Protein—SH

H

(i) Matrix—O—CH2— C H—CH2—O—(CH2)4—O— C H—CH2—N —Protein

OH OH

15 (ii) Matrix—O—CH2—CH—CH2—O—(CH2)4—O—C H—CH2—O —Protein _

OH OH

(iii) Matrix—O—CH2—C H—CH2—O—(CH2)4—O—C H—CH2—S —Protein

OH OH

2Q j_ (a) H-Hydroxysucciiiiinidbiotin

H

Matrix—O—CH2—CH—CH2—O—(CH2)4—O—CH—CH2—. . .—Protein—N—Biotin OH OH

Polylysin-NH2 25 i

N-Hydroxysucolminidbtotln -j pH5.0-(b)EDC

H

Polylysin — N— Biotin^---- 30 t

Matrix—O—................... —Protein—Polylysin —Biotin 35 18 DK 169364 B1

Reaktionssekvens 3b

Anvendelse af aminosyrecopolymer med BDDGE-reaktion.

Matrix—OH + H2C—CH—CH2—O—(CH2)4—O—CH—CH2

5 L0J L0J

I NaOH LNaBH4

Matrix—O—CH2— C H-CH2-0-(CH2)4—O— C H— C H2 OH L0J

^ l— &niæsyrecopoly- ▼ mer (AAC)

H

Matrix—O—CH2—C H—CH2—O—(CH2)4—O— C H—CHZ— N —AAC-

OH OH

ir EDO I

10 pH 5.0 —1— Protein—NHZ

H

Matrix—O—................................—CHZ— N —AAC—Protein 1— N-i^droxysuecixiimicibiotin 20

F F

Matrix—O—......................—CH2— N —AAC—Protein— N —Biotin

Poiylysin J— N-Hydra^succinimidbiotin

25 * pH 5.0 - (b) EDC

H

Poiylysin — N—Biotin ◄-

J

Η H

30 ! 1

Matrix—O—............—CH2—N—AAC—Protein—Poiylysin — N —Biotin

Eksempel 3

Fremstilling af Matrix indeholdende specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens 3b.

35 Ovennævnte BDDGE-aktiveringsreaktion, som er modificeret fra

Sunberg, L. et al., J.Chromatography, 90:87 (1974), blev anvendt til fremstillingen af specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens 3b og er beskrevet her: (i) 150 nM Matrix-OH som beskrevet under reaktionssystem 1 blev 19 DK 169364 B1 opløst i 4,0 ml 0,3 M natriumhydroxid indeholdende 0,26 mM natrium-borhydrid og blev omsat med 2,7 mM 1,4-butandioldiglycidylether i 4 timer ved omgivelsestemperatur.

(ii) Til den aktiverede Matrix i (i) ovenfor tilsattes 600 nM 5 aminosyrecopolymer og blandingen blev yderligere omsat i 4 timer ved 4°C. Reaktionsblandingen blev derefter dialyseret mod destilleret vand og yderligere dialyseret mod acetatpuffer pH 5,0.

(iii) Til det fremkomne Matrix-copolymer-konjugat tilsattes 20,0 mg frysetørret allergenekstrakt og 0,15 M EDC som i reaktions- 10 trin (v). Reaktionssekvensen følger den fra eksempel 1 ved reaktionstrin (vi). Den alternative sekvens med biotinyleret polylysin er også den samme som i eksempel 1, se ovenfor.

15 20 25 30 35 20 DK 169364 B1

Reaktionssekvens 4

Carboxymethyleri ngsreakti on.

g Matrix—OH + Jiatriurochloracetat i

O

II

Matrix—0-CHz— C —OH EDC I

pH 5.0 Aminosyre- jq J copolymer (MC)

O H

II I

M atrix—O—CH2— C—N —AAC EDC I

pH 5,0 —1— Protein—NH2 15 OH

15 II I

Matrix—O—CH2— C—N —AAC—Protein- pH 8,1 (a) N-Hydroxysucciiiiinidbiotin

OH H

II I I

2Q Matrix—O—CH2—C — N —AAC—Protein— N —Biotin

Polylysin -NH2

I pH 5,0 _ (b) EDC

N-Hydro^succi^iiinij.- H

H

25 I

Polylysin —N—Biotin·*- i

OH H

II I I

Matrix—O—CH2— C—N —AAC—Protein—Polylysin — N —Biotin 30

Eksempel 4

Fremstilling af Matrix indeholdende specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens 4:

Carboxymethyleringsaktiveringsreaktionen, som er modificeret 35 fra Inman, J.J.Immunol. 114:704 (1975), blev anvendt til fremstilling af specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens 4 og som beskrevet her: (i) 0,33 μΜ Matrix-0H, som beskrevet under reaktionssystem 1, blev opløst i 0,32 ml 1,35 M natriumchloracetat (300 ml destilleret 21 DK 169364 B1 vand + 135 ml 5M natriumhydroxid + 64,4 g chloreddikesyre; pH indstillet til 6,0 og slutvoluminet indstillet til 500 ml med destilleret vand. Denne blanding blev blandet nogle få minutter med kraftig omblanding.

5 (ii) 86 μ1 10 M natriumhydroxid blev tilsat, og voluminet blev indstillet til 0,43 ml med destilleret vand, og blandingen fik lov til at reagere i 3 timer ved 40°C.

(iii) 17,2 /ti 2,0 M monobasisk natriumphosphat blev tilsat til reaktionsblandingen, som blev titreret til pH 7,0 under anvendelse 10 af 0,1 M saltsyre. Den aktiverede Matrix blev derefter dialyseret mod destilleret vand efterfulgt af yderligere dialyse mod acetatpuffer pH 5,0.

(iv) Carboxymethyl-matrixen blev derefter omsat med 770 nM aminosyrecopolymer i nærværelse af 0,15 M EDC ved pH 5,0 i 24 timer 15 ved 4°C. Reaktionsblandingen blev derefter dialyseret mod destilleret vand efterfulgt af dialyse mod acetatpuffer pH 5,0.

(v) 20 mg frysetørret specifik allergen blev tilsat sammen med 0,15 M EDC til Matrix-copolymer-konjugatet i trin (iv) og fik lov til at reagere som i eksempel 1 reaktionstrin (v). Reaktionssekven- 20 sen følger sekvensen fra eksempel 1 reaktionstrin (vi), og den alternative reaktion under anvendelse af biotinyleret polylysin er den samme som i eksempel 1, se ovenfor.

25 30 35 5 22 DK 169364 B1

Reaktionssekvens 5a Periodatreaktion

/C—OH

Matrix^ + Nal04 (Natrimrperiodat)

H

10 /C=0

Matrix Dialdéhyd

^c=o I

H

NaBH4 Protein—NH2 15 s \

Matrix—i N—Protein- (a) N-HydroxysucciirLmidbiotin

H

20 Matrix—Protein— N— Biotin PH 5/° — (b) EDC

Polylysin -NH; N-HydroxysuccirdjTiidbiotin —| 25

Polylysin —N—Biotin·*- I -

H

30 Matrix C N—Protein—Polylysin —N—Biotin 35 23 DK 169364 B1

Reaktionssekvens 5b

Under anvendelse af aminosyrecopolymer med periodatreaktion.

q_oh 5 Matrix/ + Nal04 (Natriumperiodat)

X-OH

H

vC=0

Matrix Dialdahyd 10 XC=0

H

NaBH4 i Aminosyrecopolymer

Matrix—N—AAC 15 ^ EDC Protein

Matrix——AAC—Protein--- (a) N-Hydrascysuccinimidbiotin

H

Matrix-Γ N-AAC-Protein- N -Biotin

Polylysin -NH2

25 . . ! pH 5,0-(b) EDC

N-Hydroxysuccinimidbiotm —I '

H

Polylysin —N—Biotin-4-- 30 *

H

^ 1 Matrix-/ N—AAC—Protein—Polylysin — N—Biotin

Eksempel 5 35 Fremstilling af Matrix indeholdende specifikke allergener under anvendelse af reaktionssekvens 5:

Ovennævnte periodataktiveringsreaktion, som er modificeret fra Nakane, P. et al., J.Histochem.Cytochem. 22:1084 (1974), blev anvendt til fremstilling af specifikke allergener under anvendelse 24 DK 169364 B1 af reaktionssekvens 5b og er beskrevet her: (i) 124 nM Matrix-OH som beskrevet under reaktionssystem 1 blev opløst i 0,3 M natriumbicarbonat ved pH 8,1 og blev omsat med 1,0 ml 0,2 M natriumperiodat i 1 time ved omgivelsestemperatur.

5 (ii) 500 nM aminosyrecopolymer blev tilsat, og blandingen blev omsat i 150 minutter ved omgivelsestemperatur. Der blev tilsat 0,26 mM natriumborhydrid for at stabilisere den Schiff'ske base.

(iii) Matrix-copolymer-konjugatet blev dialyseret mod destilleret vand og blev yderligere dialyseret mod acetatpuffer pH 5,0.

10 Reaktionssekvensen følger derefter de samme trin som i eksempel 1 reaktionstrin (v) til reaktionstrin (vi), og den alternative reaktion med bi otinyleret polylysin følger den fra eksempel 1, se ovenfor.

15 Reaktionssvstem II:

Der anvendes opløselige polymerer i dette reaktionssystem: (i) polyacrylsyre med en molekylvægt, som varierer fra 5000 til 120.000 dalton, (ii) 50% til 100% carboxyleret polyacrylamid med en molekylvægt, som varierer fra 120.000 til 240.000 dalton og (iii) polypep-20 tider eller copolymerer, som udviser reaktive carboxylgrupper, og som varierer med en molekylvægt på fra 5000 til 200.000 dalton. Reaktionssekvensen for disse former af polymerer og copolymerer ligner hinanden.

25 30 35 25 DK 169364 B1 —ch2— c -ch2- c —ch2— —ch2— c—ch2—c—ch2— c=o c=o c=o c=o I E p 11 p τ' I 1 OH OH eLleX OH NH2

Polyacrylsyre Carboxyleret polyacrylamid R—C—OH R—C—NH2

5 II II

o o R— C-OH R—C —NH2

II II

q eller q

10 EDO + I

N-Hydroxysucc:miinid —Protein—NH2

H

R— C—N —Protein

II

0 15

^ ~ N-Hydroxysacciirunidbiotin Η H

1 I

R—C — N —Protein— N —Biotin

II

o 20 Eksempel 6

Fremstilling af Matrix indeholdende specifikke allergener under anvendelse af reaktionssystem II.

(i) 0,033 nM polyacrylsyre eller carboxyleret polyacrylamid blev opløst i 2,0 ml 0,01 M phosphatpuffer pH 8,0. 0,1 M af hver af 25 EDC og N-hydroxysuccinimid blev tilsat til polymeropløsningen efterfulgt af tilsætningen af 10,0 mg frysetørret specifik allergenekstrakt, og blandingen blev inkuberet i 24 timer ved omgivelsestemperatur under opretholdelse af pH-værdien på 8,0.

(ii) Polymer-allergen-konjugatet blev kromatograferet på en 30 Sephadex G-100 søjle og blev elueret med 0,01 M phosphatpuffer pH

7,5, og eksklusionsvolumenet blev opsamlet.

(i i i) Det opsamlede eksklusionsvolumen blev koncentreret til 2,0 ml ved centrifugal fordampning og blev omsat med 0,73 mM N-hydroxysuccinimidbiotin i 2 timer ved omgivelsestemperatur.

35 (iv) Polymer-allergen-biotin-konjugatet blev dialyseret mod 0,01 M phosphatpuffer pH 7,5 i 18 timer ved 4°C.

26 DK 169364 B1

Valg af ligand- og anti-ligand-konfiguration:

Specifikke ligander og deres anti-ligandmodparter, som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, udvælges fra en mængde forskellige forbindelser. De viste eksempler er kun 5 illustrative, og anvendelsen af en hvilken som helst anden kombination af ligand og anti-ligand vil være indlysende for en fagmand.

Ligand Anti-ligand

Hapten Anti-hapten 10 Biotin Avidin

Fluorescein Anti-fluorescein

Dinitrophenol Anti-dinitrophenol

Avidin Anti-avidin

Biotin Anti-biotin 15 Bovinserumalbumin Anti-bovinserumalbumin.

I forbindelse med ovennævnte eksempler på ligander og anti-ligander udføres den her beskrevne reaktionssekvens i en reaktionsbeholder, f.eks. et reagensglas, derefter indføres 20 fastfasebærematerialet indeholdende anti-liganden i den samme reaktionsbeholder. Fastfasebærematerialet kunne i dette tilfælde være belagte kugler, dipstick og lignende.

Det er undertiden ønskeligt at anvende et fastfasebæremateriale i form af et coated reagensglas, eftersom det er let at håndtere og 25 vaske. I dette tilfælde kan den ovennævnte konfiguration være uegnet, eftersom den første reaktion udføres i væskefase efterfulgt af en fasefaseseparation. Hvis man ikke tragter efter en første væskefasereaktion, så er ovennævnte kombinationer af ligander og anti-ligander egnede ved fremstillingen af en fastfasematrix som her 30 beskrevet. Hvis man på den anden side tragter efter en første reaktion i væskefase, og hvis begge reaktioner skal udføres i den samme reaktionsbeholder, såsom f.eks. et coated reagensglas, kan der anvendes adskillige mulige konfigurationer ved en sådan applikation: (1) Liganden fastgjort til den flydende matrix er avidin, og 35 det fastfasecoatede reagensglas er coated med avidin. For at effektuere immobiliseringen af immunokompleksmatrixen indeholdende avidin på det avidincoatede reagensglas tilsættes biotin efter at den initielle væskefasereaktion er blevet afsluttet. Dette vil danne følgende immobil i serede kompleks: 27 DK 169364 B1

MATRIX..........................Avidin-Biotin-Avidin - IX

som vist i systemerne I og II, se ovenfor.

(2) Ved at biotinylere den flydende matrix som beskrevet tidligere og anvende et anti-avidin-antistof på det fastfasecoatede 5 reagensglas kan immobilisering af førstnævnte på sidstnævnte opnås ved efter den initielle væskefasereaktion at tilsætte avidin til reaktionsblandingen, som vil bindes til både anti-avidin-antistoffet og den biotinylerede flydende immunokomplexmatrix. Dette vil danne følgende immobil i serede kompleks:

10 MATRIX ....................Biotin-Avidin-Anti-Avidin- IX

(3) Ved at biotinylere den flydende matrix som beskrevet tidligere og anvende et reagensglas coated med biotinyleret protein, såsom bovinserumalbumin, kan immobilisering af førstnævnte på sidstnævnte opnås ved at tilsætte avidin til reaktionsbeholderen 15 efter at den initielle væskefasereaktion har fundet sted. Dette vil danne følgende immunokompleks på den faste fase:

MATRIX ...................Biotin-Avidin-Biotin-BSA - IX

Andre mulige kombinationer er indlysende for en fagmand.

Eksempel 7 20 Bestemmelse af cirkulerende total IgE (reagin-immunoglobuliner) ifølge den foreliggende opfindelse:

Der blev rejst to forskellige monoklonale antistoffer mod oprenset IgE og som genkendte to forskellige epitoper på IgE-mole-kylet under anvendelse af metoden ifølge Galfre, G. og Milstein, C.

25 (Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures. I "Method of Enzymology", Immunochemical Techniques, bd.73, Langone, J. og van Vunakis, H., red. Academic Press (1981) s.3-46).

IgG-fraktionen fra hvert antistof blev oprenset på DEAE-Sepha-rose CL-6B efter ammoniumsulfatpræcipitering. Et antistof blev 30 konjugeret til peberrodperoxidaseenzym under anvendelse af periodat-metoden ifølge Nakane, P. et al., J.Histochem.Cytochem. 22:1084 (1974) og blev fortyndet til en arbejdsopløsning i 0,05 M phosphat-puffer pH 7,0 indeholdende 0,15 M natrimchlorid, 0,01% thimerosal og 0,1% human serumalbumin. Det andet monoklonale antistof mod IgE blev 35 fæstnet til polyacrylsyre og blev biotinyleret som beskrevet under reaktionssystem II, eksempel 6, se ovenfor, under anvendelse af 2,94 nmol oprenset IgG i stedet for det specifikke allergen som beskrevet i eksempel 6. Polyacrylsyre-anti-IgE-biotin-komplekset blev fortyndet til en arbejdsopløsning i samme puffer som den ovenfor beskrevne 28 DK 169364 B1 enzymmærkning.

Avidin blev passivt immobil i seret på 0,3 cm polystyrenkugler under anvendelse af metoden ifølge Catt, K. og Tregear, G.W., Science 158:1570 (1967) og blev frysetørret for at fjerne overskyd-5 ende fugt.

Standarder, som havde IgE-værdier på fra 10 til 600 internationale enheder pr. ml, blev fremstillet i hesteserum og blev standardiseret mod den 2. internationale referencepræparation for human serum-IgE, nr.75/502 fra World Health Organization.

10 Total cirkulerende IgE i 30 tilfældigt valgte serumprøver blev bestemt på følgende måde: 10 μΐ af hver af IgE-standarderne inklusiv en 0-standard og 10 ml af hver serumprøve blev pipetteret i et 12x75 mm reagensglas. Til hvert reagensglas tilsattes 100 /il af polyacrylsyre-anti-IgE-biotin-15 komplekset og 100 ml af det enzymmærkede, monoklonale anti-IgE-antistof, og reagensglassene blev kort omblandet og inkuberet i 30 minutter ved omgivelsestemperatur. Efter denne initiel1e inkubering blev 1 avidincoated kugle tilsat til hvert reagensglas, og alle reagensglas blev yderligere inkuberet i 30 minutter under omrystning 20 ved omgivelsestemperatur. Kuglerne blev derefter vasket to gange med den samme puffer, som blev anvendt til de monoklonale antistoffer, men indeholdende 0,5% Tween-20, og blev omsat 10 minutter med 0,5 ml enzymsubstrat indeholdende 3,5 mg hydrogenperoxid og 5,0 mg o-pheny-lendiamin i 0,1 M citrat-phosphatpuffer pH 5,0. Farvereaktionen blev 25 stoppet ved at tilsætte 0,5 ml 0,5 M svovlsyre, og farveabsorbansen blev bestemt på et spektrofotometer ved en bølgelængde på 492 nm. Absorbansen for hvert punkt på standardkurven er opstillet herefter:

IaE Int.enheder/ml Absorbans 30 0 0,010 10 0,051 30 0,106 100 0,313 300 0,809 35 600 1,370

IgE-koncentrationen i hver af de 30 serumprøver blev beregnet ud fra ovennævnte standardkurve og blev sammenlignet med IgE-koncentrationen bestemt i prøven under anvendelse af Pharmacia's total 29 DK 169364 B1

IgE enzymanalyse (Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.) med følgende regressi onsresultater:

Gennemsnit Pharmacia: 89 int.enheder/ml.

Gennemsnit for den foreliggende metode: 88 int.enheder/ml.

5 Foreliggende metode =1,04 Pharmacia - 2,7 int.enheder/ml.

Korrelationskoefficient = 0,9690.

Eksempel 8

Bestemmelse af IgE-specifikke allergener under anvendelse af den foreliggende opfindelse: 10 Bestemmelsen af IgE-specifikke allergener blev udført under anvendelse af udførelsesformerne ifølge den foreliggende opfindelse og blev analyseret ifølge følgende protokol: 200 /il Matrix-allergen-biotin eller Matrix-allegen-AAC-biotin eller Matrix-allergen-AAC-polylysin-biotin i 0,05 M phosphatpufret 15 sal in pH 7,0 som beskrevet i eksempel 7 ovenfor blev tilsat til 100 /il patientserum eller en atopisk kalibrator og fik lov til at reagere i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Der blev tilsat 1 avidincoated kugle til hvert reagensglas, og reaktionen fik lov til at fortsætte i 60 minutter ved omgivelsestemperatur på en mekanisk 20 omryster sat ved 200 slag pr. mi nut. Kuglerne blev vasket to gange som beskrevet i eksempel 7 ovenfor og blev omsat i endnu 60 minutter ved omgivelsestemperatur med 300 /il peberrodperoxidaseenzymmærket gedeanti-IgE fortyndet i samme puffer som ovenfor. Kuglerne blev genvasket to gange og yderligere omsat i 20 minutter med 300 /il 25 enzymsubstrat som beskrevet i eksempel 7 ovenfor, og reaktionen blev standset med 0,5 ml 0,5 M svovlsyre, og farveabsorbansen blev målt ved 492 nm.

Følgende resultater blev opnået med en udvalgt gruppe allergener fastgjort til forskellige matrixer som beskrevet i reaktionssy-30 stemerne I og II, se ovenfor.

(a) Timotegræs. G6:

Oprenset timote-græs (G6) blev fastgjort til (i) Ficoll 70 ved hjælp af polyglutaminsyre, glutaminsyreester som beskrevet i eksempel 1 i reaktionssekvens lb, (ii) polyacrylsyre (PAA) som beskrevet 35 i eksempel 6 og (i i i) carboxyleret polyacrylamid (CPA) som beskrevet i eksempel 6. En klasse IV, atopisk serum for G6 som klassificeret ved Phadebas-RAST-kit fra Pharmacia (Piscaway, N.J.) blev fortyndet i et ikke-atopisk serum for at simulere de atopiske klasser III, II og I og blev analyseret under anvendelse af ovennævnte protokol 30 DK 169364 B1 sammen med 4 andre atopiske prøver og 1 ikke-atopisk prøve med følgende resultater til følge: MATRIX_Ficoll 70_PM_CPA_ 5 _Absorbans_

Klasse IV 1,660 1,630 1,765

Klasse III 0,403 0,500 0,557

Klasse II 0,157 0,174 0,252

Klasse I 0,091 0,087 0,121 10 Ikke-atopisk serum 0,041 0,020 0,035

Patient nr.

1 1,783 2,878 2,753 2 0,534 0,637 0,955 15 3 1,036 1,232 1,163 4 0,434 0,441 0,409 b) Birketræ:

Oprenset birketræallergenekstrakt (T3) blev fastgjort til (i) 20 Ficoll 70 ved hjælp af aminosyrecopolymeren polylysin, phenylalanin som beskrevet i eksempel 1 under anvendelse af reaktionssekvens lb, se ovenfor, (ii) dextran 80 ved hjælp af polyglutaminsyre, alanin, lysin, tyrosin-copolymer som beskrevet i eksempel 2 under anvendelse af reaktionssekvens 2b, se ovenfor, og (i i i} carboxyleret polyacryl-25 amid (CPA) som beskrevet i eksempel 6 i reaktionssystem II, se ovenfor.

En klasse IV atopisk serum for T3 klassificeret ved hjælp af Phadebas-RAST-kit fra Pharmacia blev fortyndet med en ikke-atopisk serum for at simulere de atopiske klasser III, II og I og blev ana-30 lyseret under anvendelse af ovennævnte protokol sammen med to atopiske sera og en ikke-atopisk serum for T3 med følgende resultater: 35 31 DK 169364 B1 MATRIX_Ficoll 70_Dextran 80 CPA.

_Absorbans__

Klasse IV 1,066 1,126 2,430 5 Klasse III 0,239 0,242 0,979

Klasse II 0,105 0,112 0,313

Klasse I 0,075 0,082 0,178

Ikke-atopisk serum 0,045 0,062 0,026 10 Patient nr.

1 0,732 1,317 1,041 2 0,571 1,102 1,990

Valget af matrix, copolymer og reaktionssystem og -sekvens, som 15 skal anvendes for et bestemt allergen, vil afhænge af proteinindholdet i hvert allergen og vil være indlysende for en fagmand.

Det er hensigten, at den beskrevne opfindelse kun skal begrænses af den lovbestemte rækkevidde af de tilhørende krav.

20 25 30 35

Claims (6)

32 DK 169364 B1

1. Fremgangsmåde til måling af niveauet af et antigen (Ag^), antistof (Abj) eller hapten (H) i en flydende prøve, kendetegnet ved, at der i en væskefasereaktion dannes et opløseligt 5 kompleks, hvori antigenet (Ag^), antistoffet (Abj) eller hapten (H) er bundet gennem henholdsvis et specifikt antistof (Ab), antigen (Ag) eller antihapten (anti-H) til en matrix, som er opløselig i væskefasen og bærer en ligand (X), og at der derefter dannes et uopløseliggjort kompleks, som omfatter en fast bærer bundet til 10 liganden (X) af det opløselige kompleks gennem en anti-ligand (Y), hvor det uopløseliggjorte kompleks bærer et mærke (Z), som er bundet til antigenet (Ag·^) via et anti-antigen (anti-Ag^), til antistoffet (Abj) via et anti-antistof (anti-Abj) eller til hapten (H), at det uopløseliggjorte kompleks vaskes, og at det vaskede uopløseliggjorte 15 kompleks undersøges for tilstedeværelse af mærket (Z) for at tilvejebringe et mål for niveauet af antigen (Ag^), antistof (Abj), eller hapten (H) i prøven.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mærkningen er en enzymmærkning eller en radioaktiv mærkning eller en 20 fluorescerende forbindelse eller en kemi!uminiscerende forbindelse eller en biolumi niscerende forbindelse eller et enzymsubstrat.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at en prøve indeholdende antigen (Ag^) eller antistof (Ab^) omsættes med et ligandmærket (X), specifikt antigen (Ag) eller et 25 ligandmærket (X), specifikt antistof (Ab) anbragt på en matrix, at denne matrix derefter kontaktes med en på en fast bærer immobil i-seret anti-ligand (Y), at den faste bærer vaskes og omsættes med et anderledes mærket anti-antigen (anti-Ag-Z) eller anti-antistof (anti-Abj-Z), at den faste bærer genvaskes og undersøges for til - 30 stedeværelsen af mærkning (Z) knyttet til anti-antigenet (Anti-Ag) eller anti-antistoffet (Anti-Abj).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at mærkningen er en enzymmærkning eller en radioaktiv mærkning eller en fluorescerende forbindelse eller en kemi lumi niscerende forbindelse 35 eller en bioluminiscerende forbindelse eller et enzymsubstrat.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, at en prøve omsættes med en matrix bærende en ligand (X) specifikt antihapten (anti-H) i nærværelse af en hapten-mærket probe (H-Z), at kompetitiv binding får lov til at finde sted 33 DK 169364 B1 mellem prøvehaptenet (H) og den haptenmærkede probe (H-Z) for antihapten (anti-H) bindingssteder på den ligandmærkede matrix i en given tidsperiode, at det efterfølges af tilsætning af et på en fast bærer immobiliseret anti-ligand (Y) rettet mod den ligand (X), som 5 er bundet til det specifikke antihapten (anti-H), at den faste fase vaskes, og at tilstedeværelsen af den haptenmærkede probe (H-Z) undersøges.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at mærkningen er et enzym eller et radioaktivt grundstof eller en 10 fluorescerende forbindelse eller en kemi lumi niscerende forbindelse eller en biolumi niscerende forbindelse eller et enzymsubstrat. 15 20 25 30 35