JPH0721500B2 - 抗原または抗体の濃度を測定する方法 - Google Patents

抗原または抗体の濃度を測定する方法

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JPH0721500B2 JP62045095A JP4509587A JPH0721500B2 JP H0721500 B2 JPH0721500 B2 JP H0721500B2 JP 62045095 A JP62045095 A JP 62045095A JP 4509587 A JP4509587 A JP 4509587A JP H0721500 B2 JPH0721500 B2 JP H0721500B2
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Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、生体液中を循環する抗原または抗体の濃度を
測定する方法およびハプテンの濃度を測定する方法に関
する。
「従来の技術及び問題点」 液相および固相免疫測定方法並びにこれらの変形および
変法は、循環する抗原および抗体のホストの測定につい
ての文献において記載されてきた。１つまたはそれ以上
の免疫測定方法技術に関し、米国またはその他の国にお
いて数々の特許が出されている。抗原およびハプテンの
測定においては、拮抗的な二抗体放射性免疫測定法が実
質的に重要な役割を果している。この方法は感度も再現
性も良いが、抗原と結合した抗体から結合しなかった抗
原またはハプテンを分離するために遠心操作が必要であ
る。この方法は、一次の液相動力学を用いるが、ポリエ
チレングリコールを触媒とする第二抗体に依拠する。そ
こで、この方法においてはいくつかの欠点が必然的とな
る。即ち（ａ）同位体標識のために高度に精製された抗
原またはハプテンがどうしても必要であり、また（ｂ）
トレーサの不純物と不安定性および／またはポリエチレ
ングリコール−第二抗体の分離に一部依拠して極めて非
特異性のある結合が起る。
拮抗的な二抗体酵素免疫測定方法は、前記方法に比べは
るかに小規模で使用されている。抗原またはハプテンの
酵素標識は、それらの同位体標識に比べてはるかに安定
であるけれども、かかる測定方法においては、非特異的
な結合が生じて何度も洗浄する必要があり、そのため
に、感度および再現性を落す結果となっている。
前記の二重抗体拮抗型の測定方法においては、蛍光物質
または化学発光物質標識を用いた場合でも、非特異的な
結合や感度の低さ、再現性といった固有の問題を十分に
解決することができない。米国特許第3,817,837号に記
載されている均一系の酵素免疫測定方法は、拮抗的な二
抗体放射免疫測定に対する上述した非特異的な結合問題
を部分的には解決した。しかしながら、前記米国特許第
3,817,837号の方法は、体液中にかなり高濃度で存在す
る低分子量のハプテン（不完全抗原）に限られている。
米国特許第4,420,568号に記載された蛍光偏光拮抗免疫
測定方法は、米国特許第3,817,837号に記載された感度
問題の大部分を解決することに成功した。しかしなが
ら、その応用は低分子量の分子に限られている。以来、
他の拮抗的な蛍光免疫測定方法が高分子量の抗原に対し
報告されているが、蛍光偏光法と同様、実施のために特
殊な装置が必要である。
拮抗的な固体相免疫測定方法は、この過去10年で使用さ
れるようになり、低分子量のハプテンと分子量30,000
（ドルトン）以下のいくつかの高分子量の抗原に対して
拮抗的な二抗体法に次第にとってかわっている。このよ
うな同位体を用いた拮抗的な固体相免疫測定方法は、液
相免疫測定方法にともなう非特異結合の問題を実質上な
くしたが、固体支持体上の立体障害に一部依拠する高分
子量の抗原に対しては応用することができない。
固体相非同位体拮抗免疫測定方法は、同様な固体支持体
上の立体障害の問題があり、酵素標識の場合には、標識
それ自体の大きさが立体的な問題に加わる。本発明は、
拮抗的な固体相免疫測定方法に固有な固相支持体の立体
障害問題を解決しようとするものである。高分子量で多
価の抗原および抗体を測定するために、固体相免疫学的
放射能および非放射能測定方法が十分に開発されてき
た。いくつかの方法が報告されており、最近、米国およ
びその他の国の特許のいくつかにおいてかかる分析技術
の種々の態様が記載されている。
米国特許第3,654,090号は、多価の抗原を検出するため
の逐次的二段階免疫測定方法の最も初期の技術のひとつ
である。以来、上記特許の基本的技術の変法が放射能ま
たは非放射能信号を発生するプローブを用いて高分子量
の抗原を測定するために応用されている。このような方
法はイムノメトリック法と呼ばれている。
イムノメトリック法において、同一の抗原に対して異な
る種において生起する２種類のポリクローナル抗体（ひ
とつは固体支持体に固定化され、第２のものは信号発生
プローブで標識されている。）を用いると、測定感度が
上がり、バックグラウンド信号がある程度減少すること
が分析的見地から確認され、その方法が確立されてい
る。米国特許第4,376,110号は、イムノメトリック法に
おいて多価の抗体上の２種の異なるエピトープに対し２
種のモノクローナル抗体を使用することを教示してい
る。これとは異なり、米国特許第3,654,090号、米国特
許第4,376,110号は、同時インキュベーション（非段階
測定システム）を採用している。同様に、米国特許第4,
474,892号も、同一の抗原に対して異なるクラスまたは
サブクラスのモノクローナル抗体を用いる２部位イムノ
メトリック法を記載している。これらの上記方法は、十
分な感度，特異性およびバックグラウンド信号のある程
度の低減を達成するが、抗体を固体支持体に固定し、固
体相型の反応とするために、全て反応速度が遅くなると
いう問題を生ずる。固体相反応が液相反応より遅いとい
うことははっきりと確認されており、また、固定化に先
立って、固定化される抗体が高い親和性定数を持つもの
であったとしても、非常に低いバックグラウンド比を持
つということも十分知られている。このことは大部分，
固体支持体上の立体障害効果が大きいためである。この
ような方法にあっては、固定化される抗体の量並びに第
二の抗体に結合され信号を発生するプローブの濃度およ
び特異的な活性を最適に合わせないと、いわゆる“高濃
度域のフック現象”が起ってしまい、かかる方法の信頼
性および有効性を損う結果となってしまう。
イムノメトリック法の更なる欠点は抗体を固定化する工
程のバッチ間のバラツキである。米国特許第4,496,654
号は、抗体の固定化におけるバラツキについて論じ、最
初にアビジンを固体支持体上に固定化し、次いで、この
支持体とビオチニル化した抗体とを反応させ固体相抗体
支持体を形成すると、均一な固定化が達成されることを
教示している。しかしながら、かかる開示された変法に
おいても、反応速度の遅さと、“高濃度域のフック現
象”の危険性は避けられない。本発明は、これらイムノ
メトリック法に特有のこれら欠点を解消せんとするもの
である。
従来の抗原を検出するためのイムノメトリック法の変法
は、イムノソルバントのような固定化された抗原を用い
ることにより、特異的な抗体を測定するためにも拡張さ
れている。このような技術の注目に値する応用は、アレ
ルゲン特異性免疫グロブリンIgE（レアギン性免疫グロ
ブリン）の検出のために広く用いられている。歴史的に
は、特異的なアレルゲン試験は、米国特許第3,720,760
号およびその他の国における対応特許の教示に従い、か
かる特許においては、特異的なアレルゲンは固体支持体
（主として濾紙ディスク）に固定し、アレルゲン特異性
免疫グロブリンIgEを含有する可能性のある被検試料と
反応させる。最初のインキュベーション（通常24時間）
の後、血清成分に由来する特異的結合を除くため固体支
持体を洗浄し、次いで、固体支持体を標識した抗−IgE
抗体と反応させる。固体支持体の第２の洗浄工程の後、
標識された物質の存在をチェックする。この方法は広く
普及しているが、いくつかの欠点を持っている。即ち、
固体相反応であるために反応速度が遅く、IgEに対し本
来のアレルゲンと同一の結合特性を有する固定化された
アレルゲンを生成することが困難なこと、さらに、固体
相アレルゲンの製造におけるバッチ間のバラツキがある
ことである。最近、Aalbarseらは、ラジオアレルゴソル
ベント試験型測定方法における固体相に結合された抗原
に代えてハプテンで修飾した抗体を使用することを記載
している（J.Imm.Methods87:51−57（1986））。かかる
方法においては、特異的なアレルゲンIgEを含有する可
能性のある被検試料をトリニトロベンゼンスルホン酸
（TNP）で修飾した特異的なアレルゲンと２時間反応さ
せ、次いで、固体相に結合された抗TNPと一晩反応させ
て、IgE−アレルゲン−抗TNP複合体を形成する。この固
体相を洗浄した後、再度125I−抗IgE抗体と反応させ再
洗浄し、被検試料中のアレルゲン特異性IgEの濃度に正
比例する125I同位体の存在をカウントする。このアプロ
ーチにおいて、著者は、最初の反応で液相の反応動力学
の利点を活用したと主張しているが、アレルゲンのTNP
標識の程度を立証できていない。アレルゲンをハプテン
例えばTNPで直接標識することは、標識の過程で標識さ
れていない必須アレルゲン成分を見落す可能性があり、
したがって、上記方法においては、定量することができ
ない。さらに、この方法では反応時間が２日であり、こ
の点でも米国特許第3,720,760号に記載された方法と比
べて反応時間が長く改善されていない。
本発明は、従来のアレルゲンテストおよびその改良法に
ともなう問題点を解消せんとするものである。
「問題点を解決するための手段」 本発明は、新しい方法を用いる生物体液中で循環する抗
原または抗体の測定に関するものである。本明細書中に
おいて記載する方法は、まず所定のリガンドで実質的に
標識されているマトリックスまたはバックボーンに化学
的に結合された特異的な抗原または抗体を使用する。そ
して被検試料との最初の液相反応の後、被検抗原または
抗体と信号発生プローブで標識された抗−抗原または抗
−抗体との間で形成される免疫複合体を、マトリックス
に結合したリガンドに対する抗リガンドを含有する固体
支持体上でそのまま固定することを特徴とするものであ
る。
「作用」 所定のリガンドで実質的に標識されたマトリックスに対
し抗原または抗体を結合させる本方法は、少なくとも２
つの明確な目的に役立つ。
（ａ）マトリックスに結合されるリガンドがごく少数で
も免疫複合体全てが効果的に完全に固定化されるので、
抗リガンドを介して固体支持体上に固定化されることの
できる免疫複合体の数が大きく増大する。本明細書中で
記載するようにマトリックスを使用することなく抗原ま
たは抗体を所定のリガンドで直接標識すると抗リガンド
により固体支持体に固定化される免疫複合体の数が制限
される。何故ならば、少数の抗原または抗体のみが所定
のリガンドで標識されまた標識されていない抗原または
抗体からリガンドで標識された抗原または抗体を分離す
るための高度なアフィニティ−クロマトグラフィ技術を
使用する必要が生じるからである。
（ｂ）最初の反応で液相の反応動力学を用いる有用性が
明らかである。何故ならば、これによりマトリックスに
結合した抗原または抗体と信号を発生する標識された抗
−抗原または抗−抗体との間の免疫複合体の形成が促進
されるからである。
液相の反応動力学が必要ない場合には、本発明の教示
は、抗原または抗体をマトリックスに結合し、前記マト
リックスを所定のリガンドで標識し、次いで、前記マト
リックスを抗リガンドを含有する固体相支持体と予め反
応させることにより、有効な固体相マトリックスを製造
するために用いることができる。
次に上記概要の本願発明をそのいくつかの分析スキーム
を以下に示すことによりさらに詳しく説明する。
スキームI:非段階的測定方法 所定の抗原または抗体を含有する可能性のある被検試料
を、液相中で標識されたリガンド−抗体または標識され
たリガンド−抗原と、それらとは異なるように標識され
た特異的な抗−抗体または標識された特異的な抗−抗原
の存在下で反応させる。液相中の免疫複合体を、マトリ
ックスを介して特異的な抗原または抗体に結合したリガ
ンドに対する固体支持体上の固定化された抗リガンドと
反応させる。次いでこの固体相を洗浄し、抗−抗原また
は抗−抗体に結合した標識発生信号をチェックする。抗
原または抗体の検出に対し適用した本方法を下記に図式
的に示す。
（ａ）抗体検出の非段階的測定方法 洗浄およびＺのチェック 図中に於いて Ab1＝測定される循環する抗体 Ag＝液体マトリックスに共有結合されたAb1に対する特
異的な抗原 Ｘ＝液体マトリックスに共有結合されたリガンド Ｙ＝固体支持体に共有結合または受動的に結合れた抗リ
ガンド Ｚ＝信号発生標識（酵素，放射性活性標識，蛍光性化合
物，化学発光性化合物，生物発光性化合物または酵素の
基質） ●●●●●＝液体マトリックス 抗体Ab1の濃度なＺにより発生する信号に正比例する。
（ｂ）抗原検出の非段階的測定方法 固体相を再洗浄し、循環するAgの濃度がＺによって発生
される信号Ｚに正比例するＺをチェックする。
スキームII:段階的測定方法 段階的測定方法においては、被検試料をリガンドで標識
した抗原または抗体と反応させ、次いで固体相抗リガン
ドと接触させ特定の時間反応させる。続いて、固体相を
洗浄し、信号発生プローブで標識した抗−抗原または抗
−抗体と再度反応させる。固体相を再び洗浄し、信号発
生プローブに対しチェックする。以下にかかる概念を概
略的に示す。
（ａ）抗体検出の段階的測定方法 固体相を洗浄し、Ｚをチェックする。
スキームIII:ハプテンの検出：拮抗的測定方法 ハプテン検出の場合、所定のハプテンに対する抗体をマ
トリックスまたはバックボーンに化学的に結合させ、次
いでリガンドで標識する。上記のハプテンを含有する可
能性のある被検試料を、液相でリガンドで標識された抗
体を含むマトリックスと、以下に示すように、ハプテン
で標識されたプローブ（Ｈ−Ｚ）の存在下で反応させ
る。所定の時間内にリガンドで標識された抗体上の結合
部位に対する被検ハプテンと標識されたハプテンプロー
ブとの間の拮抗が起こる。次いで、固体相を含有するマ
トリックスに結合したリガンドに対する固体支持体上に
固定化された抗リガンドを添加する。固体相を洗浄し、
被検試料中のハプテンの濃度に反比例するハプテンで標
識されたプローブの存在をチェックする。
固体相を洗浄しＺをチェックする。
ある種のハプテンに対しては、ハプテンで標識した信号
発生プローブが高分子量の特にある種の標識である場合
には、生じ得る立体障害を回避するためにマトリックス
を用いることなくリガンドを直接ハプテン抗体に結合す
るのが有利であることもある。
特異的な抗原または抗体を結合させるためにマトリック
スまたはバックボーンを用い、次いで前記バックボーン
を所定のリガンドで標識するのが本発明の好ましい実施
態様である。当業者であれば、前記マトリックスに対す
る結合の様式または順序を変えることは容易に想到する
ことができるであろう。
可溶性の抗原または抗体のマトリックスの調製 以下の一連の反応は、所定の抗原または抗体と特異的な
リガンドを含有するマトリックスまたはバックボーンの
ための種々の反応スキームである。これら一連の反応に
おいて、可溶性ポリマは種々の化合物で活性化され、種
々の機構により反応せしめられる。活性化されたポリマ
・マトリックスは、抗原または抗体に直接結合される場
合もあるし、ポリペプチドポリマまたはコポリマを介し
て間接的に抗原または抗体に結合され、次いでこれに抗
原または抗体が共有結合される場合もある。マトリック
ス−抗原もしくは抗体複合体またはマトリックス−ポリ
ペプチド／コポリマ−抗原もしくは抗体複合体は、然る
後、リガンドで直接または予め標識されたリガンド鎖で
間接的に標識される。これらの例で使用されるリガンド
はビオチンであり、かつ抗リガンドはアビジンである。
他の使用し得るリガンド−抗リガンドの組合せについて
は、可能な他のリガンドについての記載部分において言
及する。
反応スキーム１ かかる反応手順においては、２つの可溶性炭水化物を用
いた。即ち、（ｉ）分子量6,000〜80,000（ドルトン）
の可溶性デキストランおよび（ii）分子量70,000〜400,
000（ドルトン）の可溶性フィコール。これら２つの炭
水化物は以下の実施例中でも用い、マトリックス−OHで
表わす。以下の実施例で使用したアミノ酸コポリマは
（ａ）ポリリジン、フエニルアラニン、（ｂ）ポリリジ
ン、アラニン、（ｃ）ポリグルタミン酸、グルタミン酸
エステル、（ｄ）ポリグルタミン酸、アラニン、リジ
ン、チロシンなど多数のコポリマの例から選択すること
ができる。当業者であれば、他のアミノ酸コポリマも容
易に想到することができるであろう。
反応手順1a 1,1′−カルボニルジイミダゾール（CDI）活性化及びカ
ップリング 但し、EDCとは、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミドであり、●●●−はマトリ
ックスである。
反応手順1b アミノ酸コポリマーとCDI反応の使用 「実施例」 以下に実施例を挙げるが本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
実施例１ 反応手順1bを用いた特異的なアレルゲンを含有するマト
リックスの調製； Bethell,Gらの方法（J.Biol.Chem.254:2572,1979年）を
改変した上記CDI活性化反応を、反応手順1bに従いアレ
ルゲンの調製に応用した。以下にその手順を記載する。
（ｉ） 上記反応手順１に記載した124nMのマトリック
ス−OHを、1,1′−カルボニルジイミダゾール（CDI）1
0.0mgを含むジメチルスルホキシド2.0mlに溶解し、室温
で振盪しながら30分間反応させた。
（ii） アミノ酸コポリマ（例えばグルタミン酸、グル
タミン酸エチルエステル）770nMをジメチルスルホキシ
ド2.0mlに溶解し、上記（ｉ）の反応混合物に加え、振
盪しながら、室温で24時間反応させた。
（iii） 上記（ｉ）の反応混合物を体積２倍の水で希
釈し、セファクリル−300カラムでクロマト分離し、マ
トリックス−コポリマ複合体を単離した。
（iv） マトリックス−コポリマを含有する画分を蒸留
水に対して透析し、更に、pH5.0の酢酸緩衝液に対して
透析した。
（ｖ） 透析したマトリックス−コポリマ複合体に、凍
結乾燥したアレルゲン抽出物20.0mgを加え、続いてＮ−
エチル−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド（EDC）0.15Mを加え、振盪しながら４℃で24時間反
応させた。反応のpHは、かかる反応中pH5.0に保持し
た。次いで、反応混合物をpH8.1の0.1M炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液に対して４℃で12時間透析した。
（vi） マトリックス−コポリマ複合体をジメチルホル
ムアミド1.0mlに溶解したＮ−ハイドロキシスクシンイ
ミドビオチン7.3μＭと４℃で一晩反応させた。最終反
応混合物をセファクリル−300カラムでクロマト分離
し、マトリックス−コポリマ−アレルゲン−ビオチン複
合体に対応する画分を集め、以下に詳述するようにアレ
ルゲン活性をチェックした。
これとは別に、上記反応を改変した。かかる変法におい
ては、ビオチニル化したポリリジンを以下のように上記
工程（vi）においてマトリックス−コポリマ−アレルゲ
ン複合体と反応させた。ポリリジン［分子量3,800（ド
ルトン）］1.8μＭとＮ−ハイドロキシスクシンイミド
ビオチン180μＭをジメチルホルムアミド1.0mlに溶解し
た。ビオチニル化したポリリジンをCM−セファロースカ
ラムに吸着し、NaCl2.0Mを含有するpH9.0の50nM−ホウ
酸ナトリウム緩衝液で溶出した。ビオチニル化したポリ
リジン複合体をpH5.0に調製し、（vi）で記載したよう
にEDCを用いてマトリックス−コポリマーアレルゲン複
合体と反応させ、クロマト分離し、マトリックス−コポ
リマーアレルゲン−ポリリジン−ビオチン複合体を得
た。
反応手順2a シアノゲンブロマイド活性化及びカップリング 反応手順2b シアノゲンブロマイド反応とアミノ酸コポリマー（AA
C）の使用 実施例２ 反応手順2bを用いたアレルゲンを含有するマトリックス
の調製； March,Sらの方法（Anal.Biochem.60 149、1974年）を改
変した上記シアノゲンブロマイド活性化反応を反応手順
2bに従い特異的なアレルゲンの調製に応用した。以下に
記載する。
（ｉ） 上記スキーム１で記載したように124mMのマト
リックス−OHを2.0M炭酸ナトリウム2.0mlに溶解し、シ
アノゲンブロマイド溶液（2gのCNBr結晶をアセトリトリ
ル1.0mlに溶解したもの）100μと２分間pH11.0で反応
させ、さらに同様のシアノゲンブロマイド溶液100μ
と２分間反応させた。
（ii） その後、直ちに、アミノ酸コポリマ385μＭを
上記（ｉ）に加え、室温で攪拌しながら、一晩反応させ
た。
（iii） 反応混合物をセファクリル300カラムでクロマ
ト分離してマトリックス−コポリマ複合体を単離し、蒸
留水に対して透析後、pH5.0の酢酸緩衝液に対して透析
した。
（iv） 透析したマトリックス−コポリマ複合体に凍結
乾燥したアレルゲン抽出物20mgとEDC0.15Mとを加え、反
応混合物をpH5.0に保持しながら、４℃で24時間反応さ
せた。続いて、この反応混合物をpH8.1の0.1M炭酸水素
ナトリウム緩衝液に対して、４℃で12時間透析した。こ
の後の反応手順は、実施例１で記載した工程（vi）に従
う。ビオチニル化されたポリリジンを用いる変法も又、
上記実施例１と同様である。
反応手順3a 1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDGE）活
性化及びカップリング 反応手順3b BDDGE反応とアミノ酸コポリマー（AAC）の使用 実施例３ 反応手順3bを用いた特異的なアレルゲンを含有するマト
リックスの調製； Sunberg,L.らの方法（Chromatography,90 87 1974年）
を改変した上記BDDGE活性化反応を反応手順2bに従いア
レルゲンの調製に応用した。以下に記載する。
（ｉ） 反応スキーム１に記載したように、150nMのマ
トリックス−OHを0.26mMのNaBH4を含有する0.3M水酸化
ナトリウム溶液4.0mlに溶解し、1,4−ブタンジオール−
ジグリシジルエーテル2.7mMと室温で４時間反応させ
た。
（ii） 上記（ｉ）で活性化したマトリックスにアミノ
酸コポリマ600nMを加え、４℃でさらに４時間反応させ
た。次いで、反応混合物を蒸留水に対して透析し、さら
にpH5.0の酢酸緩衝液に対して透析した。
（iii） 生成したマトリックス−コポリマー複合体
に、凍結乾燥したアレルゲン抽出物20.0mgとEDC0.15Mと
を実施例１の反応工程（ｖ）におけるように添加した。
続いて反応手順は、実施例１の反応工程（vi）に従う。
これとは別のビオチニル化ポリシジンの反応手順もまた
実施例１と同様である。
反応手順４ カルボキシメチル化反応 実施例４ 反応手順４を用いるアレルゲンを含有するマトリックス
の調製； Inman,Jの方法（J.Immunol.114:704（1975）を改変した
カルボキシメチル化による活性化反応を反応手順４に従
い特異的なアレルゲンの調製に応用した。以下に記載す
る。
（ｉ） 反応スキーム１で記載したマトリックス−OH0.
33μＭを0.32mlの1.35Mモノクロル酢酸ナトリウム（蒸
留水300ml＋5M水酸化ナトリウム135ml＋モノクロル酢酸
64.4gをpH6.8に調製し、最終体積を蒸留水で500mlとし
たもの）に溶解した。この混合物を数分間激しく混合し
た。
（ii） 10M水酸化ナトリウム86μを加え、蒸留水で
体積を0.43mlに調製し、40℃で３時間反応させた。
（iii） この反応混合物に2.0Mリン酸ナトリウム17.2
μを加え、0.1Mの塩酸を用いて滴定しpH7.0に調製し
た。活性化されたマトリックスを蒸留水に対して透析
し、続いて、pH5.0の酢酸緩衝液に対してさらに透析し
た。
（iv） 次いで、カルボキシメチル−マトリックスをア
ミノ酸コポリマ770nMと0.15MのEDC存在下pH5.0,4℃で24
時間反応させた。次いで、反応混合物を蒸留水に対して
透析し、続いて、pH5.0の酢酸緩衝液に対してさらに透
析した。
（ｖ） 凍結乾燥した特異的なアレルゲン20mgを0.15M
EDCとともに工程（iv）におけるマトリックス−コポ
リマ複合体に加え、実施例１の工程（ｖ）におけるよう
に反応させた。これ以後の反応手順は、実施例１の反応
工程（vi）に従い、これとは別のビオチニル化されたポ
リリジンを用いる反応もまた実施例１におけると同様で
ある。
反応手順5a 過ヨウ素酸化反応 反応手順5b アミノ酸コポリマーと過ヨウ素酸反応との使用 実施例５ 反応手順５を用いた特異的なアレルゲンを含有するマト
リックスの調製； Nakane,P.らの方法（J.Histochem Cytochem.22:1084（1
974）を改変した過ヨウ素酸化活性化反応を反応手順5b
に従い特異アレルゲンの調製に応用した。以下に記載す
る。
（ｉ） 反応手順１に記載した124nMのマトリックス−O
Hを0.3Mの炭酸水素ナトリウムにpH8.1で溶解し、1.0ml
の0.2M過ヨウ素酸ナトリウムと１時間室温で反応させ
た。
（ii） アミノ酸コポリマ500nMを加え、150分間室温で
反応させた。ナトリウムボロハイドライド0.26mMを加え
て、シッフ塩基を安定化した。
（iii） マトリックス−コポリマ複合体を蒸留水に対
して透析し、更にpH5.0の酢酸緩衝液に対して透析し
た。次いで、実施例１における反応工程（ｖ）、（vi）
と同様の工程を行う。これとは別にビオチニル化したポ
リリジンを用いた反応もまた実施例１に従う。
反応スキームII この反応スキームでは、可溶性のポリマを用いる。即
ち、（ｉ）分子量5,000〜120,000（ドルトン）のポリア
クリル酸（ii）分子量120,000〜240,000（ドルトン）の
カルボキシル化されたポリアクリルアミド（カルボシル
化度50〜100％）（iii）分子量5,000〜200,000の反応性
カルボキシル基を有するポリペプチド又はコポリマ。こ
れらの形態のポリマ及びコポリマの反応手順は同じであ
る。
実施例６ 反応スキームIIを用いた特異的なアレルゲンを含有する
マトリックスの調製； （ｉ） ポリアクリル酸又はカルボキシル化したポリア
クリルアミド0.033nMを2.0mlの0.01Mリン酸緩衝液pH8.0
に溶解した。0.1MのEDCと0.1MのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドをポリマ溶液に加え、さらに凍結乾燥した特異
的なアレルゲン抽出物10.0mgを加え、pHを8.0に保持し
ながら、室温で24時間インキュベートした。
（ii） ポリマーアレルゲン複合体をセファデックスＧ
−100カラムでクロマト分離し、pH7.5の0.01Mリン酸緩
衝液で溶出し、排除体積画分を集めた。
（iii） 集めた画分を遠心濃縮機で2.0mlまで濃縮し、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン0.73mMと２時間
室温で反応させた。
（iv） ポリマーアレルゲン−ビオチン複合体をpH7.5
の0.01Mリン酸緩衝液に対して４℃で18時間透析した。
リガンドと抗リガンドの選択 本発明に用いることのできる特異的なリガンドとそれら
に対する抗リガンドは、種々の化合物の中から選択され
る。ここに示す例は単に説明するために示したものであ
って、当業者であれば、それ以外のいかなるリガンド−
抗リガンドの組合せも容易に想到することができるであ
ろう。
リガンド 抗リガンド ハプテン 抗ハプテン ビオチン アビジン フロオロセイン 抗フロオロセイン ジニトロフエノール 抗ジニトロフエノール アビジン 抗アビジン ビオチン 抗ビオチン 牛血清アルブミン 抗牛血清アルブミン リガンドおよび抗リガンドの上記例において、ここに記
載した反応手順は、反応容器例えば試験管中で行なわ
れ、次いで、抗リガンドを含有する固体相支持体をその
反応容器に入れる。この場合の固体相支持体は、被覆さ
れたビーズ，浸漬スティック等である。
被覆したチューブ固体相法を用いるのも場合によっては
望ましい。何故ならば、操作および洗浄が容易であるか
らである。この場合、上記のリガンド−抗リガンドの組
合せは不適当となる可能性もある。その理由は、第１反
応を液相で行い、続いて固体相の分離を行うからであ
る。上記のリガンド抗リガンドの組合せを液相の第１反
応中で使用する必要がない場合には上記リガンド−抗リ
ガンドの組合せを効果的な固体相系の調製に使用するこ
とができる。一方、液相の第１反応を、被覆されたチュ
ーブのような同一の反応容器中で実施したい場合には、
以下に記載したような手法が可能である。
（１） マトリックスに結合したリガンドが、アビジン
であり、かつ固体相被覆チューブがアビジンで被覆され
ている。アビジンを含有する免疫複合体−マトリックス
をアビジン被覆チューブに効果的に固定化するために、
最初の液相反応が完結した後にビオチンを加える。これ
により上記スキームＩ及びIIに示したように のような固定化された複合体が形成される。
（２） 先に記載したように、マトリックスをビオチニ
ル化し、被覆された固体上の抗アビジン抗体を用いるこ
とで、前者の後者への固定化は最初の液相反応の後、抗
アビジン抗体とビオチニル化された液体免疫複合体マト
リックスの両方に結合する反応混合物にアビジンを添加
することにより達成される。これは下記の固定化された
複合体を形成する。
（３） 先に記載したようにマトリックスをビオチニル
化し、ビオチニル化された蛋白質例えば牛血清アルブミ
ンを用いることで、前者の後者への固定化は最初の液相
反応が生じた後、反応容器にアビジンを添加することに
より達成される。この場合、固体相には下記のような免
疫複合体が形成される。
この他、当業者であれば、他の可能な組合わせは容易に
想到することができるであろう。
実施例７ 本発明による循環する全IgE（レアギン免疫グロブリ
ン）の測定； 二種類のモノクローナル抗体を、精製IgEに対して作製
し、Galfe,GとMistein,Cの方法（Preparation of Monoc
lonal Antibodies:Strategies and Procedures In Enzy
mology,Immunochemical Techniques Vol.73 Langone,J.
and Van Vunakis,H.,eds.A cademic Press（1981）PP3
−46）を用いて、IgE分子上の相異るエピトープを識別
することを確認した。各々の抗体からIgG画分を、硫安
沈澱の後、DEAE−セファロースCL−6Bにより精製する。
一方の抗体は、Nakane,P.らの過ヨウ素酸方法（J.Histo
chem.Cytochem22 1084（1974））を用いてホースラディ
シュパーオキシダーゼに結合させ、適当な濃度になるよ
うに、0.15Mの塩化ナトリウム0.01％のチメロサール及
び0.1％のヒト血清アルブミンを含有するPH7.0の0.05M
リン酸緩衝液で試験溶液に稀釈した。IgEに対する第２
のモノクロナール抗体は反応スキームII、実施例６で記
載したように、ポリアクリル酸に結合させ、実施例６に
記載した特異的なアレルゲンの代わりに精製したIgG2.8
4nMを用いてさらにビオチニル化した。ポリアクリル酸
−抗IgE−ビオチン複合体は、上記の酵素標識抗体と同
じ緩衝液にて適当に稀釈する。
アビジンはCatt,K.and Treggear,G.Wの方法（Science15
8:1570（1967））を用いて1/8インチのポリスチレンビ
ーズに固定化し、さらに凍結乾燥することによって余分
の水分を除く。
10〜600IU/mlのIgE値を有する標準溶液は、馬血清中に
調製し、WHO（世界保健機構）のSecond International
Refernce Preparationのヒト血清IgE75/502に対して正
規化した。
循環血中の全IgE試料をランダムに30選び、以下の様に
測定した。
０濃度標準液も含めてIgE標準溶液各10μと各血清試
料10μとを12×75mmの試験管にピペットで入れた。各
々のチューブにポリアクリル酸−抗IgE−ビオチン複合
体溶液100μと酵素で標識したモノクローナル抗IgE抗
体溶液100μとを加え、てばやく混ぜ、室温で30分間
インキュベートした。この最初のインキュベーションの
後、各チューブにアビジン被覆ビーズをひとつずつ加
え、室温で振盪しながらさらに30分間インキュベートし
た。ビーズを前述の抗体を稀釈した緩衝液に0.5％のTwe
en20を含む洗浄液で２回洗浄し、0.5mlを酵素基質溶液
（過酸化水素3.5mg,O−フエニレンジアミン5.0mgを0.1M
のクエン酸リン酸緩衝液PH5.0に溶解したもの）を加
え、10分間反応させた。0.5Mの硫酸0.5mlを加えて呈色
反応を停止させ、分光光度計で波長492nmの吸収を測定
した。標準曲線の各点の吸収は、以下の表のようになっ
た。
30の血清試料の個々におけるIgE濃度を上記標準曲線か
ら計算し、ファルマシア社（ニュージャージー州、ピス
カタウェイ）製の全IgE酵素測定法を用いて同じ試料に
ついて測定したIgE濃度と比較した。結果は以下の通り
であった。
ファルマシア法による平均値:89IU/ml 本方法による平均値:88IU/ml （本方法による測定値）＝1.04 ×（ファルマシア法による測定値）−2.7IU/ml 相関係数＝0.9690 実施例８ 本発明を用いたIgE特異性アレルゲンの測定； 本発明の実施態様を用いてIgE特異性アレルゲンの測定
を行なった。以下に詳細を記載する。
上記実施例７で記載したようにpH7.0の0.05Mリン酸緩衝
生理食塩水に溶解させたマトリックス−アレルゲン−ビ
オチン，マトリックス−アレルゲン−AAC−ビオチンま
たはマトリックス−アレルゲン−AAC−ポリリジン−ビ
オチン200μを被検血清またはアトピー血清標準液100
μに添加し、室温で２時間反応させた。各チューブ
に、アビジン被覆ビーズをひとつ加え、室温で60分メカ
ニカルシェーカー上200ストローク／分で振盪反応させ
た。実施例７と同様にビーズを２回洗浄し、上記と同様
に緩衝液で稀釈したヤギ由来−抗IgE−ホースラディシ
ュパーオキシダーゼ酵素標識300μと更に60分反応し
た。ビーズを２回再洗浄し、実施例７で記載したのと同
様の酵素基質溶液300μと20分間反応させ、0.5mlの0.
5M硫酸を加えて反応を停止し、492nmの吸光度を測定し
た。
以下の結果は、反応スキームＩ及びIIで記載したような
種々のマトリックスに結合したアレルゲン群について得
られたものである。
（ａ）オオアワガエリ（G6） 精製したオオアワガエリアレルゲン（G6）を（ｉ）反応
手順1bの実施例１に記載したようにポリグルタミン酸，
グルタミン酸エステルを介してフィコール70に、（ii）
実施例６に記載したようにポリアクリル酸（PAA）に、
（iii）実施例６に記載したようにカルボキシル化した
ポリアクリルイミドに結合した。ファルマシア社（ニュ
ージャージー州ピスカタウェイ）製のファデバス−ラス
ト（Phadebas−Rast）キットによって分類されているG6
に対するクラスIVのアトピー血清を非アトピー血清で稀
釈し、クラスIII,II及びＩのアトピー血清をシュミレー
トし、４つの他のアトピー試料及び１つの非アトピー血
清とともに上記プロトコールを用いて測定した。これら
の測定結果を以下に示す。
（ｂ）樺の木 精製した樺の木アレルゲン抽出物（T3）を、 （ｉ） 反応手順1bを用い実施例１に記載したようにア
ミノ酸コポリマーポリリジンフエニルアラニンを介して
フィコール70に、 （ii） 反応手順2bを用い実施例１に記載したようにポ
リグルタミン酸，アラニン，リジン，チロシンコポリマ
を介してデキストラン80に、 （iii） 反応スキームIIの実施例６に記載したように
カルボキシル化したポリアクリルアミド（CPA）に 結合した。
ファルマシア社製のファデバス−ラストキットによって
分類されたT3に対するクラスIVのアトピー血清を非アト
ピー血清で稀釈し、クラスIII,IIおよびＩのアトピーク
ラスをシュミレートし、T3に対する２つのアトピー血清
と１つの非アトピー血清とともに上記プロトコールを用
い測定した。以下に、これらの測定結果を示す。
所定のアレルゲンに対して用いるマトリックス，コポリ
マー並びに反応スキームおよび手順の選択は個々のアレ
ルゲンの蛋白質量に依存し、当業者であればこれらの選
択は容易に想到し得るであろう。
本発明について詳細に説明したが、本発明はこれら具体
例のみに限定されるものではなく特許請求の範囲に記載
した発明こそが本発明の技術的思想であり、かかる発明
について法律的な保護権利を求めるものである。
「発明の効果」 本発明によれば、マトリックスに結合されるリガンドが
ごく少数であっても、免疫複合体全てが効果的に完全に
固定化されるので、抗リガンドを介して固体支持体上に
固定化される免疫複合体の数を大きく増大させることが
できる。また、本発明にあっては、第１反応を液相の動
力学に従って行うので、マトリックスに結合した抗原又
は抗体と信号を発生する標識された抗−抗原又は抗−抗
体との間の免疫複合体の形成を促進することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールズ エイ カサル アメリカ合衆国 カリフォルニア 91030 サウス パサデナ フェア オークス アベニュー 1621

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体試料中の抗原または抗体の濃度を測定
    する方法であって、 （ａ）液相反応において、上記抗原に特異的な複数の特
    異的抗体または上記抗体に特異的な複数の特異的抗原と
    の化学的結合が可能で、かつ該液相中に溶解されたマト
    リックスに、リガンドが結合されたものに、上記特異的
    抗体または上記特異的抗原を介して、上記抗原または上
    記抗体が結合されてなる可溶性複合体を形成すること； （ｂ）抗−リガンドを介して、上記可溶性複合体のリガ
    ンドに結合された固体支持体と、抗−抗原によって抗原
    に結合された、または抗−抗体によって抗体に結合され
    た標識とを含む不溶化複合体を形成すること； （ｃ）上記不溶化複合体を洗浄すること； （ｄ）上記サンプル中の上記抗原または抗体の濃度の表
    示である標識の存在を知るために、上記洗浄された不溶
    化複合体を観測すること を順に含むことを特徴とする上記の方法。
  2. 【請求項２】上記標識が酵素的標識、放射性標識、蛍光
    性標識、化学発光性標識または生物発光性標識であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】上記マトリックスが、分子量が6,000〜80,
    000ダルトンの可溶性炭水化物または分子量が70,000〜4
    00,000ダルトンのフィコールであることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】上記マトリックスがデキストランであるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】上記マトリックスが分子量が5,000〜200,0
    00の可溶性ポリマまたはコポリマであることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
  6. 【請求項６】上記リガンドがアミノ酸コポリマを介して
    上記マトリックスに共有結合で結合されることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
  7. 【請求項７】上記リガンドがアビジンであり、上記固体
    支持体がアビジンで被覆されたチューブであり、かつビ
    オチンの添加により、可溶性複合体が前記アビジン被覆
    チューブに効果的に固定化されることを特徴とする特許
    請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
  8. 【請求項８】上記リガンドがビオチンであり、上記固体
    支持体が抗アビジン抗体で被覆されたチューブであり、
    かつアビジンの添加により、可溶性複合体が上記抗アビ
    ジン抗体被覆チューブに効果的に固定化されることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項から第４項のいずれかに
    記載の方法。
  9. 【請求項９】上記リガンドがビオチンであり、上記固体
    支持体がビオチニル化されたタンパク質で被覆されたチ
    ューブであり、かつアビジンの添加により、可溶性複合
    体が前記抗アビジン抗体被覆チューブに効果的に固定化
    されることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第６
    項のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】上記リガンドがアビジンと牛血清アルブ
    ミンから選ばれ、上記抗リガンドは抗アビジンと抗牛血
    清アルブミンから選ばれることを特徴とする特許請求の
    範囲第１項または第２項記載の方法。
  11. 【請求項１１】上記リガンドが上記マトリックスに共有
    結合され、かつ上記特異的抗体または上記特異的抗原が
    化学的に上記マトリックスに結合されることを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記試料が抗原または抗体を含み、 かつ上記可溶性複合体が、 上記可溶性複合体形成のために、前記標識により標識化
    された抗−抗原または抗−抗体の存在化で、リガンド
    と、特異的抗体または特異的抗原と、試料を液相中で反
    応させ、次いで上記不溶化複合体形成のために、固体支
    持体上で、この可溶性複合体と固定化抗−リガンドを反
    応させ、次いで該不溶化複合体を洗浄し、次いで洗浄さ
    れた不溶化複合体を抗−抗原または抗−抗体上の標識の
    存在を知るために観測することにより形成されることを
    特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】上記試料が抗原または抗体を含み、 上記可溶性複合体が、上記記リガンドと上記特異的抗体
    または特異的抗原を含む前記マトリックスと試料を液相
    中で反応させて形成され、 上記不溶化複合体が、不溶化複合体形成のために、上記
    可溶性複合体と固定化抗−リガンドを、固体支持体上で
    接触させ、これを前記標識により標識化された抗−抗原
    または抗−抗体と反応させ、その結果得られた不溶化複
    合体を再洗浄し、次いで上記洗浄された不溶化複合体を
    抗−抗原または抗−抗体に結合した標識の存在を知るた
    めに観測することにより形成されることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
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