DK169974B1 - Anvendelse af midler til påvisning af esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer i leukocytter samt midler til en sådan anvendelse - Google Patents

Description

i DK 169974 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af midler til påvisning af esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer i leukocytter, hvilke midler består af en sugedygtig bærer, et filmlag, en pulverblanding, et lyofilisat, en opløsning eller 5 en reagenstablet indeholdende et egnet esterase- og/eller proteasepåvisningsprincip, en puffer samt eventuelt yderligere sædvanligt anvendte tilsætningsstoffer til påvisning af leuko-cytter i urin, hvor midlet sættes til den urin, der skal undersøges, og den fremkomne farvedannelse bedømmes visuelt 10 eller fotometrisk, samt midler til en sådan anvendelse.

Anvendelsen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Midlet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 3's kendetegnende del anførte.

15

Ved diagnoseringen af sygdomme i nyrer og urogeni talrør har påvisningen af leukocytter i urinen stor betydning. Hidtil blev denne påvisning gennemført mikroskopisk, idet antallet af leukocytter, som fandtes i et bestemt urinvolumen, blev talt un-20 der mikroskop. Denne metode er dog meget tidsrøvende, besværlig og trættende og kræver desuden anvendelsen af skolet personale.

Igennem nogen tid har det derfor været forsøgt som påvisnings-25 princip for leukocytter i forskellige legemsvæsker at finde frem til enzymatiske reaktioner, da leukocytterne besidder et bredt enzymspektrum.

Midler til påvisning af leukocytter i legemsvæsker, hvor den 30 i leukocytterne tilstedeværende esterolytiske og/eller proteolytiske aktivitet anvendes til analytiske formål, kendes fra de tyske offentliggørelsesskrifter nr. 28 26 965 og nrt 28 36 644. Sulfonphthaleinesterne henholdsvis azo-farve= stofestere anvendes derved som substrater for leukocyt-35 esteraser og/eller -proteaser. De ved den enzymatiske omsæt- 2 DK 169974 B1 ning frigjorte farvestoffer bestemmes ifølge almindeligt kendte metoder, De i disse skrifter beskrevne midler er dog endnu for ufølsomme. De udviser for lange reaktionstider for den nedre påvisningsgrænse, således at den praktiske 5 anvendelse endnu er forbundet med visse ulemper fremfor alt for lange ventetider ved gennemførelsen af testen.

i

Forskellige metoder til påvisningen af proteaser og esteraser kendes også fra histo- og den cytokemiske enzymologi 10 (jvf. f.eks. A.G.E. Pearse Histochemistry, Theoretical and Applied, 3. udgave, Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968). I princippet anvendes derved ligeledes farveløse eller svagt farvede estere, som ved den enzymatiske spaltning for det meste dekomponeres i en far-15 veløs syre og en ligeledes farveløs alkohol-(phenol)-kom= ponent. Senere omsættes så i en efter den enzymatiske forsæbning følgende reaktion til farvede produkter, f.eks. ved kobling med diazoniumsalte eller oxidativ reaktion.

20 F. Schmalzl og H. Braunsteiner beskriver f.eks. i Klin.

Wschr. 46, 642 (1968) en specifik cytokemisk leukocyt-esterase-påvisning med naphthol-AS-D-chloracetat som substrat og et diazoniumsalt til dannelse af farvede azoforbin- delser.

25

Til et middel til hurtig og simpel påvisning af leukocytter i legemsvæsker, såsom f.eks. i urin, har det vist sig, at tokomponentsysterner af denne art ikke er egnet. De reagerer alt for ufølsomt. F.eks. viser prøver med 5.000 leukocytter/ 30 yl ingen reaktion. Desuden reagerer som bekendt mange i urin forekommende forbindelser, såsom urobilinogen, stercobilino= gen, bilirubin og andre, med diazoniumsalte. Sådanne reaktioner mellem bestanddele i urin og diazoniumsalte giver således problemer ved nogle i handelen værende patenterede tests, nemlig den der er beskrevet i DE-2.229.611, som angår anven-35 delse af diazoniumsalte til bestemmelse af urobilinogen og 3 DK 169974 B1 den, der er beskrevet i US-3.880.588, som angår anvendelsen af diazoniumsalte til bestemmelse af bilirubin. I litteraturen vedrørende esterasepåvisning under anvendelse af diazoniumsalte angives også bireaktioner med andre urinbestanddele, og 5 sådanne diazoniumsalte er også på grund af deres egenfarve uegnede til brug i en leukocyttest.

F. Sweetman og L. Ornstein beskriver i J. Histochem./Cytochem.

22, 327-339 (1974) såvel som Ornstein et al. i Abstracts Histochem. Soc. 1973, side 411, anfarvningen af forskellige 10 esterolytiske og proteolytiske enzymer på elektroforeseplader, der tjener til rensning og separation af enzymer. Der anvendes herved kobling af forskellige naphthylestere, bl.a. 1-naph-thyl-N-acetyl-D,L-alanin med diazoteret pararosanilin. Hertil behøves reaktionstider på over 2 timer til anfarvningen til 15 trods for den høje udgangskoncentration af enzymer, der udvindes fra 40-100 millioner celler/ml, og fraskillelse af forstyrrende bibestanddele.

P.M. Starkey og A.J. Barrett beskæftiger sig i Biochem. J. 155, 265-271 (1976) med karakteriseringen af en fra humane 20 miltceller isoleret og rent fremstillet elastase. Dette enzyms spaltningsaktivitet over for forskellige napthylestere og nitroanilinderivater beskrives. På basis af immunologiske undersøgelser drages den slutning, at denne elastase stemmer overens med den fra humane neutrofile leukocytter. Forfatterne 25 udfører kun deres undersøgelser med henblik på de kemiske egenskaber hos leukocyt-enzymer, men gennemfører ingen påvisning af ubekendte mængder af sådanne enzymer.

Der kendes endvidere forskellige esterase-påvisningsprincipper på basis af en puffer, et bestemt diazoniumsalt samt en egnet 30 ester. F.eks. beskrives i W.J. Williams et al., Haematology, 2. udgave 1977, kapitel A25: Leukocyte esterases, side 1633-1636, Naphtholchloracetat i forbindelse med flerfoldigt diazo-terede farvestoffer og en phosphatpuffer til påvisning af en 4 DK 169974 B1 esteraseaktivitet. US-patentskrift nr. 3.905.872 omhandler en kombination af naphthylphosphat eller phenylphosphat med et diazoniumsalt til bestemmelse af alkalisk phosphatase. Alle disse tidligere kendte esterase-påvisningssystemer har dog 5 ikke vist sig at være anvendelige til påvisning af leukocyt- , ters esterolytiske og/eller proteolytiske enzymaktivitet i legemsvæsker.

Formålet med den foreliggende opfindelse var nu at tilveje-10 bringe et middel til påvisning af esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer med en kombination af estere og dia= zoniumsalte som reaktionskomponenter for disse enzymer, hvormed disse på simpel og let håndterbar måde kan påvises på kort tid, og som ikke udviser forstyrrende bireaktioner 15 med andre bestanddele i prøven, der skal undersøges.

Dette blev opnået ved, at der anvendes en bestemt kombination af egnede estere og specielt substituerede diazoniumsalte, hvorved på overraskende måde de anvendte diazoniumsalte 20 ikke indgår i bireaktioner med andre urinbestanddele, såsom f.eks. bilirubin og urobilinogen, men specifikt og hurtigt kobler de ved spaltningen af de anvendte estere dannede phenoliske komponenter under dannelse af en farvende forbindelse.

25

De egnede estere skal være tilstrækkeligt reaktive over for de esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer, således at de hurtigst muligt spaltes i syre- og alkoholkomponenter-30 ne (indbefattet phenoler). Estrene skal også udvælges således, at de frigjorte alkoholkomponenter kob- i ler godt og fuldstændigt med de anvendte diazoniumsalte. Reaktiviteten af diazoniumsaltene skal afstemmes ved pas- * sende valg af substituenterne, således at der ganske vist 35‘ sker en tilstrækkelig hurtig kcbling med de af de ifølge opfindelsen anvendte estere frigjorte alkoholkomponenter, men dog 5 DK 169974 B1 ikke sker nogen reaktion med andre bestanddele af testopløsningen.

Den foreliggende opfindelse angår således midler til påvisning af esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer, specielt de i leukocytterne tilstedeværende esteraser og/eller proteaser, hvilket middel består af en sugedygtig bærer, et 5 filmlag, en pulverblanding, et lyofilisat, en opløsning el ler en reagenstablet indeholdende et egnet esterase- henholdsvis protease-påvisningsprincip, en puffer samt eventuelt yderligere sædvanligt anvendte tilsætningsstoffer, kendeteanet ved det i krav 3's kendetegnende del anførte.

10

Egnede substituerede diazoniumsalte i forbindelse med den foreliggende opfindelse er forbindelser med den almene formel I

15 R2 /1 /Λ (+) - (-) R ( \—N= N X' ' (I) \_jy

20 R R

R4 R5 hvori R^ betegner en lavere alkyl-,en lavere alkoxy-, en lavere alkylmercapto-, en N-morpholino-, en N-thiomorpholino-, en N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino-, 25 en N-piperidinogruppe, halogen eller hydrogen, R^ betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en aryl= oxy-, en lavere alkylmercapto-, alkylamino-, dialkylamino-, en hydroxy-, en N-morpholino-, N-thiomorpholino-, N-pyrro= lidino-, en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino-, N-piperi= 30 dino-, phenylamino-, en eventuelt med en lavere alkyl- eller lavere alkoxyrest substitueret phenylgruppe, halogen eller hydrogen, R2f R^, Rg, der kan være ens eller forskellige, hver betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en lavere alkyl= 35 mercaptogruppe, halogen eller hydrogen, hvorhos R^ og R2 tilsammen danner en annelleret benzenring og X betegner en stabiliserende anion.

6 DK 169974 B1

Egnede anvendelige estere vælges fra den gruppe forbindelser med den almene formel II

5 ,R'i

_/-A-B

I (II) R« K 3 ] 10 hvori R!lf R’2f R'3f R^f der kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogen- eller et halogenatom, en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en aryl-, en aralkyl-, en aralkoxy-, en hydroxy-, en carboxy-, en carboxy-lavere-15 alkoxy-, en aralkoxycarbonyl-, en aralkoxycarbonyl-lavere- alkoxy-, en nitro- eller en lavere acylaminogruppe, eller to substituenter danner en eventuelt med halogen substitueret benzoannelleret rest, X’ betegner et svovlatom eller en eventuelt med en lavere 20 alkyl-, en aryl-, en aralkyl- eller en acylrest substitu eret iminogruppe, A betegner en aminosyre- eller en peptidrest,

B betegner en i peptidkemien sædvanlig eller derfra afledt nitrogenbeskyttelsesgruppe, eller 25 forbindelserne med den almene formel III

0 - A - B

I 1 (III) 30 r"2 Y R”4 r-3 hvor R"^, R"2f rM3' r"4' ^er kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogenatom, en lavere alkyl-, 35 en lavere alkoxy-, alkylamino- eller dialkylaminogruppe, hvorhos to nabosubstituenter også kan danne en annelleret benzenring, A og B har ovennævnte betydning.

7 DK 169974 B1

Estere med den almene formel II og III forsæbes hurtigt og fuldstændigt af esteraser og proteaser, f.eks. af de i de neutrofile granulocytter forekommende esteraser og proteaser. De frigjorte phenolkomponenter reagerer udmærket, hur-S

tigt og selektivt med de meget elektrofile diazoniumsalte med den.almene formel I. Der kan derfor ifølge opfindelsens princip fremstilles stabile og hurtigt virkende midler til påvisningen af leukocytter i legemsvæsker. Desuden har det ^ vist sig, at midlerne ifølge opfindelsen også er særdeles velegnede til påvisning af proteolytiske enzymer, som f.eks. af ela-stase, chymotrypsin eller trypsin i vandige opløsninger eller legemsvæsker, såsom f.eks. fuldblod, serum eller væske, pankreas-sekret eller vandige afføringsekstrakter.

15

Diazoniumsaltene med den almene formel I er delvis kendte forbindelser. Derivater, hvori substituenterne R1 og/eller R3 betegner en N-thiomorpholino-, N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino- eller N-piperidinogruppe, 2o er hidtil ukendte forbindelser. De kan dog i analogi med de kendte stoffer fremstilles ifølge i og for sig kendte fremgangsmåder.

Forbindelserne med den almene formel II er beskrevet i DE-of-25 fentliggørelsesskrift nr. 28 54 987.

Estrene med den almene formel III er hidtil ukendte forbindelser. De kan fremstilles ved, at man ifølge i peptidkemien sædvanlige metoder omsætter forbindelser med den almene for-

30 mel IV

OH

R (IV) 35 R,,4 •r" R 3

hvori R"^, R"2' ^"3 °9 ^"4 ^ar ovennævnte betydning,med aminosyrer og peptider af den almene formel V

8 DK 169974 B1 HO - A - B (V) hvori A og B har ovennævnte betydning, - henholdsvis egnede reaktive derivater heraf.

5

Som reaktive derivater anvendes f.eks. syrechlorider eller de ved peptidsyntese sædvanligvis anvendte blandingsanhy= drider, f.eks. med chlormyresyreethylester eller aktiv ester.

10

Med halogen i definitionen af R^, R2, R3/ R^ og R^ henholdsvis R'^, R’27 r*3 °9 r*4 s^al forstås fluor, chlor, brom og jod, fortrinsvis chlor og brom.

De lavere alkyl-, alkoxy-, alkylmercapto-, alkyl- og dialkyl= aminogrupper i definitionerne af R^ - Ry R*^ - R'^ samt R"1 - R"^ indeholder 1-5, fortrinsvis 1-3 carbonatomer, hvorhos de tilsvarende methylrester ganske særligt foretrækkes , 20

Som stabiliserende anion X foretrækkes tetrafluorborat, tetrachlorzinkat henholdsvis perchlorat.

Med en aralkoxygruppe i definitionen af H' , R^/ R<3 °9 ^'4 25 samt en aralkylgruppe i definitionen af X' skal f.eks. for stås med oxy-lavere-alkyl henholdsvis lavere alkylrester substituerede phenyl- og naphthylgrupper, hvorhos alkylres-ten indeholder 1-5, fortrinsvis 1-3, carbonatomer. Benzyl= oxy- eller benzylresten foretrækkes særligt.

30

Som lavere acylaminogruppe af R1^, R^» R*3 °9 ^'4 kommer amidgrupper af lavere alifatiske carboxylsyrer med 1-5, fortrinsvis 1-3, carbonatomer på tale. Acetylaminoresten * foretrækkes særligt.

35 9 DK 169974 B1

Som acylrest i definitionen af X' kommer resterne af alifatiske carboxylsyrer med 1-5, fortrinsvis 1-3, carbonatomer eller også aromatiske carboxylsyrer, såsom f.eks. benzoe- eller naphthoesyrerne, på tale. Acetyl- og benzoylresterne 5 foretrækkes særligt.

Med en aryl- henholdsvis aralkylrest i definitionen af H* 1, ^'3/ R'4 og X’ skal fortrinsvis forstås phenyl- 10 eller naphthylgruppen henholdsvis benzylresten.

Som aminosyrerest i defintionen A kommer fortrinsvis resterne af naturlige α-aminosyrer i deres L- eller D-form eller også i deres racemiske form på tale. Resterne af glycin, ,. alanin, valin, leucin, isoleucin, phenylalanin og tyrosin foretrækkes særligt, hvorhos til enhver tid L-formen foretrækkes ganske særligt. Eventuelt tilstedeværende frie hy= droxygrupper kan være acyleret, fortrinsvis acetyleret.

Med en peptidrest i definitionen af A skal f.eks. forstås 20 di-, tri-, tetra- og pentapeptider, fortrinsvis di- og tri= peptider, hvorved der som aminosyrekomponenter fortrinsvis anvendes de ovennævnte aminosyrer.

Som i peptidkemien sædvanlige nitrogenbeskyttelsesgrupper 2g i definitionen af B skal f.eks. forstås acyl-, oxycarbonyl-, thiocarbonyl-, sulfonyl-, sulfenyl-, vinyl-, cyklohexenyl-, phosphoryl- eller carbamoylgrupper.

De ifølge opfindelsen anvendte diazoniumsalte med den almene ,n formel I og estrene af den almene formel II og III anvendes ^u -4 -1 i koncentrationer fra 10 mol/1 til 10 mol/1, fortrins- -3 -2 vis 10 mol/1 til 10 mol/1, imprægneringsopløsningbelægningsmasse eller til væsken, der skal undersøges.

25 En yderligere bestanddel af midlerne ifølge opfindelsen til påvisning af proteolytiske enzymer og specielt leukocyt-proteaser er et egnet puffersystem. Hertil kommer f.eks. phosphat-, borat-, barbiturat-, tris-(hydroxymethyl)-amino= methan- (=tris), 2-amino-2-methyl-propandiol-l,3- (=amediol)- 10 DK 169974 B1 eller aminosyre-puffere på tale, hvorhos pH-værdier og kapacitet skal vælges således, at der i måleopløsningen henholdsvis på teststrimlerne indstilles en pH-værdi på 6-10, fortrinsvis fra 7-9.

5

En yderligere bestanddel af midlerne ifølge opfindelsen til påvisningen af proteolytiske enzymer kan være et befugtnings- , middel, da der herved kan opnås en mere homogen farveforde-ling og undertiden klarere farver. Der kan anvendes kation-10 aktive,men også anionaktive samt amphotere og ikke-ionogene befugtningsmidler i koncentrationer fra 0,05-2% (vægt/volumen), fortrinsvis 0,1-1% (vægt/volumen).

Som yderligere bestanddele af midlerne ifølge opfindelsen 15 kan som stabilisator tjene et phosphor- eller phosphonsyre=

amid med den almene formel VI

fs r7 - P = 0 (VI) 20 7 1 R8 hvori Rg betegner en dialkylamino-, en alkoxy-, en aryloxy-, en alkyl- eller en arylgruppe eller en N-morpholinrest,og 2 5 Rj og Rg betegner en dialkylaminogruppe eller en N-morpho= linrest.

Som alkoxy- eller alkylgrupper i definitionen af Rg kommer hydrocarbonrester med indtil 10 carbonatomer på tale.

30

Med aryl- henholdsvis aryloxygrupper i definitionen af Rg skal forstås eventuelt med halogen, lavere alkyl- eller alkoxygrupper substituerede phenyl- eller naphthylrester.

35 Ved hjælp af forbindelserne med den almene formel VI lykkes en forbavsende stabilisering af recepterne.

Phosphor- og phosphonsyreamiderne med den almene formel VI er kendte forbindelser. De finder f.eks. ifølge tysk fremlæggelsesskrift nr. 22 35 127 anvendelse som stabilisatorer DK 169974 B1 11 af teststrimmelrecepter, der arbejder på basis af en per= oxidasepåvisning.

Stabilisatorerne af phosphor- og phosphonsyreamidtypen med 5 den almene formel VI sættes til den vandige eller fortrins vis den organiske imprægneringsopløsning i koncentrationer fra 1-20% (vægt/volumen), fortrinsvis 5-15% (vægt/volumen).

Det har nu overraskende vist sig, at reaktionstiderne af 10 de diagnostiske midler ifølge opfindelsen til påvisning af proteolytiske enzymer, specielt proteolytiske leukocyt-enzymer, kan forkortes væsentligt, når der yderligere til diazoniumsaltene, estrene og tidligere anførte hjælpestoffer tilsættes en eller flere aktivatorer. Aktivatorer, der 15 egner sig til midlet ifølge opfindelsen,har vist sig at være de i tysk patentansøgning P 29 05 531.0 beskrevne og i kra-yene definerede forbindelser.

Aktivatorerne anvendes i koncentrationer fra 0,5-10%, for-20 trinsvis 1-5% (vægt/volumen) i imprægneringsopløsningen.

Til fremstillingen af midlerne ifølge opfindelsen imprægneres f.eks. sugedygtige bærere, fortrinsvis filterpapir, cellulose eller plastfiberfilt/ined opløsninger af de nød-25 vendige sædvanligvis til fremstillingen af teststrimler anvendte reagenser (substrat, puffer, eventuelt befugtnings-middel) i let flygtige opløsningsmidler, såsom f.eks. vand, methanol, ethanol eller acetone. Dette sker hensigtsmæssigt i to særskilte trin: Først imprægneres med en vandig opløs-30 ning, som indeholder puffer og andre vandopløselige til sætningsstoffer. Derpå bliver diazoniumsaltene med den almene formel I og aktivatorer imprægneret med en opløsning af pro-tease-substratet med den almene formel II eller III. Imprægneringen kan dog også gennemføres i en anden rækkefølge el-3 5 ler med en anden sammensætning af de to imprægneringsopløs ninger.

Det færdige testpapir kan anvendes som sådant eller på i og for sig kendt måde klæbes på greb eller fortrinsvis fast 12 DK 169974 B1 gøres mellem plast og finmasket netværk ifølge DE patentskrift nr. 21 18 455.

Til fremstillingen af filmbelagte teststrimler bliver samt-5 lige reagenser indført og homogent blandet i opløsningen eller dispersionen af et filmdannende stof som f.eks. poly= vinylester eller polyamid. Blandingen påføres i et tyndt r lagt på en plastbærer og tørres. De filmbelagte teststrimler ifølge opfindelsen opskæres efter tørringen og kan an-1 o vendes i denne form eller på i og for sig kendt måde blive klæbet på greb eller anbragt f.eks. mellem plast og finmaskede netværk ifølge DE patentskrift nr. 21 18 455.

Det diagnostiske middel ifølge opfindelsen til påvisning 15 af proteolytiske enzymer, specielt leukocytproteaserne,kan fremstilles i form af pulverblandinger eller reagenstabletter, idet man behandler de ovenfor anførte prøvebestand-dele med sædvanlige galeniske tilsætningsstoffer og granulerer. Tilsætningstoffer af denne art er f.eks. carbon= 20 hydrater, såsom f.eks. mono-, oligo- eller polysaccharider, eller sukkeralkoholer, såsom f.eks. mannit, sorbit eller xylit,eller andre opløselige inerte forbindelse, såsom polyethylenglycoler eller polyvinylpyrrolidon. Pulverblandingerne eller reagenstabletterne har i almindelighed en 25 slutvægt på Omkring 50-200 mg, fortrinsvis 50-80 mg.

Til fremstillingen af lyofilisater med en samlet vægt på ca. 5-20 mg, fortrinsvis ca,lD. mg, frysetørres en opløsning, som foruden samtlige for testen nødvendige reagenser inde-30 holder sædvanlige strukturdannende stoffer, såsom f.eks. polyvinylpyrrolidon og eventuelt yderligere fyldstoffer, såsom f.eks. mannit, sorbit eller xylit.

Det diagnostiske middel ifølge opfindelsen i form af en 35 1 opløsning indeholder fortrinsvis samtlige for testen nødvendige reagenser. Som opløsningsmiddel kommer vand eller blandinger af vand med et vandopløseligt organisk opløsningsmiddel, såsom f.eks. methanol, ethanol, acetone eller 13 DK 169974 B1 dimethylformamid på tale. Af holdbarhedsgrunde kan det være fordelagtigt at fordele de for testen nødvendige reagenser på to eller flere opløsninger, som først bringes sammen ved den egentlige undersøgelse.

5

De således fremstillede diagnostiske midler muliggør efter neddypning i de legemsvæsker, der skal undersøges, eller efter tilsætning til den pågældende legemsvæske at påvise nærværelsen af proteolytiske enzymer, specielt leukocyt-10 proteaserne,på hurtig og simpel måde via en farvedannelse, som kan bestemmes visuelt eller fotometrisk, f.eks. remissionsfotometrisk eller i kuvetten. Da aktiviteten af leu-kocytproteaserne pr. celle bliver anset for en i alt væsentlig konstant størrelse, kan man af intensiteten af farve-15 dannelsen bestemme leukocytkoncentrationen af den under søgte legemsvæske. Derved omfatter de diagnostiske midler ifølge opfindelsen såvel intakte som lyserede leukocyt-ter, da aktiviteten af leukocytproteaserne også bevares fuldstændigt efter lysen af leukocytterne. En lysefejl optræ-20 der følgelig ikke.

Eksempel 1

Filterpapir (f.eks. Schleicher & Schull 23 SL) imprægneres 25 efter hinanden med følgende opløsninger og tørres derpå ved 60°C.

Opløsning 1 0,2 molær borax-saltsyre-puffer pH 8 30 10% phosphorsyretrimorpholid.

Opløsning 2 _3 2 x 10 mol/1 substrat «.o 10 mol/1 diazoniumsalt 35 opløst i acetone/l-decanol 98:2.

DK 169974 B1 14

Substrater S 1: 3-[N-(toluen-4’-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol S 2: 3-[N-(toluen-4’-sulfonyl)-L-alanyloxy]-1-methoxynaphthalin S 3: 1-[N-(toluen-4’-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-methoxynaphthaliri 5 S 4: 1- [N- (toluen-4 ’ -sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-isopropoxynaphthalin 'S 5: 1-[N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-pentoxynaphthalin S 6: 1- [N- (toluen-4' -sulfonyl) -L-alanyloxy] -4- dimethylaminobenzen S 7: 1- [N- (toluen-4 ’ -sulfonyl) -L-alanyloxy] -3 -diethylaminobenzen S 8: 1- [N- (toluen-4 ’ -sulfonyl) -L-alanyloxy]-3,5-dimethoxybenzen 10 S 9 : 1- [N- (toluen-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy]-3-methyl-5-methoxybenzen

Diazoniumsalte D 1: 2;4-dimethoxybenzendiazoniumtetrafluorborat D 2: 4-inethoxynaphthalin-l-diazoniumtetrafluorborat D 3: 2,5-dimethoxy-4-dimethylaminobenzendiazoniumtetrafluor= 15 borat D 4: 4-dimethylaminobenzendiazoniumtetrafluorborat.

Der fås papir, som ved neddypning i leukocytholdigt urin viser 100 leukocytter/yl i ca. 3 min. med de i tabellen anførte farver. Bestemmelsen kan også ske remissionsfotome-20 trisk.

7 DK 169974 B1 15

Substrat Diazoniumsalt Farve SI Dl Rødbrun

Si D 2 Rødbrun SI D 3 Blågrå 5 SI D 4 Grøn S 2 Dl Rød S 2 D 2 Lyserød S 2 D 3 Violet S 2 . . D 4 Lilla 10 S 3 Dl Rødviolet S3 D 2 Violet S3 D 3 Blågrå S 4 Dl Lilla S 5 Dl Lilla 15 S 6 Dl Lyserød S 7 Dl Lyserød S 8 Dl Rødviolet S 9 Dl Rødbrun

Eksempel 2 20 Filtrepapir imprægneres efter hinanden med følgende opløs ninger og tørres ved 60°C.

Opløsning 1 0,1 molær borat-puffer pH 8 Opløsning 2 _3 25 2 x 10 mol/1 2-methoxy-4-(N-morpholin)-benzendiazonium= tetrachlorzinkat 2 x 10 3 mol/1 substrat* 10% phosphorsyretrimorpholid i ethanol/l-decanol 98:2.

* Substrat.

DK 169974 B1 16 A: 3-[N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy]-indol B: 3-[N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy]-5-methylindol C: 3-[N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy]-7-methylindol D: 3-[N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy]-4-chlorindol 5 E: 3-[N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy]-5-bromindol * F: 3-[N-toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol G: 3-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-5-methoxyindol H: 3-[N-(4'-acetamidbenzensulfonyl)-L-alanyloxy]-indol I: 3-[N-(4'-methoxytosyl)-L-alanyloxy]-indol 10 K: [N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-benzen L: 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-naphthalin Μ: 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-methoxybenzen.

Med de således opnåede reagenspapir kan der i leukocyt-holdigt urin påvises 100 leukocytter/μΐ.

15 Reagenspapir med tilsvarende reaktivitet kan også fås, når man i stedet for de ovennævnte diazoniumsalte anvender 2-methoxy-4-(N-pyrrolidino)-benzendiazoniumtetrafluorborat 2-methoxy-4-(N-piperidino)-benzendiazoniumtetrafluorborat 2,6-dimethoxy-4(N-morpholino)-benzendiazoniumtetrafluor= 20 borat 4-methoxy-2-(N-morpholino)-benzendiazoniumtetrafluorborat 2-methoxy-4-[N(Ν'-methyl)-piperazino]-benzendiazonium= tetrafluorborat 2-methoxy-4-(N-thiomorpholino)-benzendiazoniumtetrafluorborat. 25 Eksempel 3

Der fremstilles følgende stamopløsninger:

Opløsning 1 — 3 2 x 10 mol/1 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]- 4-isopropoxynaphthalin —2 30 10 mol/1 2,4-dimethoxybenzendiazoniumtetrafluorborat i acetone/l-decanol 98:2.

DK 169974 B1 17

Opløsning 2 0,2 molær borax-saltsyre-puffer 10% phosphorsyretrimorpholid.

Efter at der til enhver tid til enten opløsning 1 eller 5 til opløsning 2 er blevet tilført de nedenfor anførte aktivatorer i de der anførte koncentrationer, fugtes filtrerpapir med opløsningerne 1 og 2 og tørres i hvert tilfælde ved 60°C.

Ved afprøvningen i isotonisk kogsaltopløsning med 300 leu-10 kocytter/μΐ reagerede testene i de anførte tider.

Aktivator mg aktivatortilsætning Reaktionstid til 20 ml af (sek.)

Opløsning 1 Opløsning 2

Uden - 54 15 2-azafluoren 33 - 17

Benzo-(h)-guinolin 36 8

Quinin 33 - 32 1,2-bis-4-pyridylethylen 37 - 34 1-decanol 400 - 5 20 1-tetradecanol 400 - 4

Nitroprussid-natrium - 31 38

Kaliumhexacyano- - 40 30 ferrat-(II)

Eksempel 4 25 Filtrerpapir fugtes med de følgende opløsninger og tørres derpå i hvert tilfælde ved 60°c.

Opløsning 1 _3 2 x 10 mol/1 3-(N-toluen-4'-sulfonyl-L-alanyloxy)-indol _3 2 x 10 mol/1 2-methoxy-4-morpholinobenzendiazoniumtetra= 30 chlorzinkat i acetone/l-decanol 98:2.

DK 169974 B1 18

Opløsning 2 0,2 molær borax-saltsyre-puffer pH 8 10% phosphorsyretrimorpholid.

1 et yderligere forsøg blev phosphcrsyretrimorpholid ude- f 5 ladt i opløsning 2.

Typen med phosphorsyretrimorpholid er fortsat ufarvet efter en påvirkning ved 60°C i 2 dage og giver gode reaktioner med leukocytholdige opløsninger. Typen uden phosphorsyre= trimorpholid viser grå farvninger.

10 Eksempel 5 På kendt måde blev der fremstillet en reagenstablet indeholdende følgende komponenter: 2 mg 3-(N-toluen-4’-sulfonyl-L-alanyloxy)-indol 2 mg 2-methoxy-4-(N-morpholino)-benzendiazoniumtetra= chlorzinkat 1,5 mg kaliumdihydrogenphosphat 30 mg dinatriumhydrogenphosphatdihydrat 20 mg mannit.

Disse tabletter blev opløst i 2 ml leukocytholdigt urin-20 stof og blandet omhyggeligt. Ved nærværelsen af leukocyt-ter indtrådte en rødviolet farvning.

100 leukocytter kunne således påvises på ca. 2 min.

Såfremt urinen blev tempereret til 37°C før tablettilsætningen og under reaktionen, kunne der i samme tidsrum på-25 vises 20 leukocytter.

DK 169974 B1 19

Eksempel 6 1-[N-(toluen-41-sulfonyl)--L-alanyloxy3-3,5-dimethoxybenzen

Til omsætningen ifølge aktiv ester-metoden opløses 14,6 g (0,06 mol) N-(toluen-4-sulfonyl)-L-alanin og 12,2 g (0,09 5 mol) N-hydroxybenzotriazol i 300 ml absolut eddikeester, afkøles til 0°C og behandles med 12,4 g (0,06 mol) dicyklo= hexylcarbodiimid. Til dannelsen af aktiv esteren omrøres i 2 timer ved 0°C og derpå yderligere i 2 timer ved stuetemperatur. Efter tilsætning af 6,2 g (0,04 mol) 3,5-di= 10 methoxyphenol og 5,5 ml (0,04 mol) triethylamin omrøres blandingen i 15 timer ved stuetemperatur. Det dannede Ν,Ν'-dicyklohexylurinstof suges fra. Filtratet inddampes i vakuum ved en badtemperatur på højst 50°C. Resten optages i 200 ml eddikeester og vaskes tre gange efter hin-15 anden med 100 ml 5%'ig citronsyre hver gang og derpå til svarende med 100 ml 5%'ig natriumhydrogencarbonatopløsning hver gang. Den organiske fase inddampes i vakuum efter tørring med natriumsulfat. Det olieagtige råprodukt renses søjlekromatografisk på en kiselgelsøjle med en toluen/ 20 eddikeesterblanding (4:1). Efter inddampning af de tilsva rende samlede fraktioner opløses resten i en ringe mængde methylenchlorid,og der udfældes ved tilsætning af ether.

Der fås 5,8 g (38%) 1-[N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]- 3,5-dimethoxybenzen som farveløse krystaller med smp. 110°C 25 dp°: -52,5° (c=l %, acetone).

Ved reaktion af N-(toluen-4-sulfony1)-L-alanin med de tilsvarende substituerede phenoler eller naphtholer fås på tilsvarende måde til følgende stoffer: DK 169974 B1 20

6.1. [N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-benzen farveløse krystaller, smp. 113°C

a^: -63,8° (c=l %, acetone) .

6.2. 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-dimethyl= * 5 aminobenzen_ farveløst« amorft pulver a^: -36,6° (c=l %, methanol)

Tyndtlagskromatografi: Færdigplade kiselgel (løbemiddel: Toluen/dioxan 2:1, påvisning: UV, 10 R^-værdi: 0,68) .

6.3. 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-methoxy= benzen_

farveløse krystaller, smp. 60-61°C

a^°: -62,9° (c=l %, methanol) 15 6.4. 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-naphthalin farveløs«viskos olie a^: -27,3° (c=l %, methanol) tyndtlagskromatografi: Færdigplade kiselgel (løbemiddel: Toluen/dioxan 4:1, påvisning: UV, 20 R^-værdi: 0,53) 6.5. 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-methoxy= naphthalin_ farveløse krystaller, smp. 136°C a^: -42,6° (c=l %, acetone) 25 6.6.1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-isopropoxy= naphthalin_ farveløse krystaller, smp. 93-96°C a^: -38,0° (c=l %, acetone) 6.7. 1-[N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-pentoxy= 30 naphthalin_;_' farveløse krystaller, 87°C 20 aD : “36,9° (c=l %, acetone) DK 169974 B1 21 6.8. I-[N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-diethylamino= benzen__

farveløse krystaller, smp. 83-84°C

aj^: -59,4° (ο=Γ'%, methanol) 5 tyndtlagskromatografi: Færdigplade kiselgel (løbemiddel: Xylen/methylethylketon 1:1 R^-værdi:0,68) 6.9. 1-[N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-methyl-5- methoxybenzen_

10 farveløse krystaller, smp. 79-81°C

a^°: 62,2° (c=l %, methanol) tyndtlagskromatografi: Færdigplade kiselgel (løbemiddel: Chloroform/methanol 20:1 Rf-værdi: 0,79).

15 Eksempel 7 2-[N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-methoxynaphthalin Opløsning 1

Til fremstilling af syrechloridet ifølge et-trinsmetoden opløses 19,44 g (0,08 mol) N-(toluen-4-sulfonyl)-L-alanin 20 i 100 ml absolut dimethylformamid, og der afkøles til -20°C.

Derpå tilsættes med pipette under omrøring og afkøling 5,81 ml (0,08 mol) thionylchlorid, og reaktionsblandingen henstår i 30 min. i kuldebad ved -20°C.

Opløsning 2 25 Til en opløsning af 6,96 g (0,04 mol) 4-methoxynaphthol-2 i 50 ml absolut dimethylformamid sættes 11,0 ml (0,08 mol) triethylamin. Blandingen afkøles til -20°C.

Omsætning

Opløsning 1 hældes i opløsning 2, og der omrøres under ude- 30 lukkelse af vand i ca. 4 timer ved -20°C. Derpå henstilles blandingen natten over i køleskab.

DK 169974 B1 22

Til oparbejdning inddampes reaktionsopløsningen i vakuum ved en badtemperatur på højst 50°C, Resten optages i ca, 150 ml eddikeester og vaskes efter hinanden tre gange hver gang med 100 ml 5%'ig citronsyre og derpå med 100 ml 5%'ig 5 natriumhydrogencarbonatopløsning hver gang. Efter tørring ? med natriumsulfat inddampes den organiske fase i vakuum. Råproduktet renses søjlekromatografisk på en kiselgelsøjle med en toluen/eddikeester-blanding (4:1). Efter inddampning af de tilsvarende samlede fraktioner i vakuum opløses resten 10 i en ringe mængde methylenchlorid og derpå fældes med en ether/ligroin-blanding (1:2). Der fås 2,8 g (18%) 2-[N-(toluen-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-methoxy= naphthalin i form af farveløse krystaller af smp. 119°C a^: -57,9° (c=l %, acetone).

15 Eksempel 8 2-methoxy-4-(N-morpholino)-benzendiazoniumtetrachlorzinkat 5-chlor-2-nitroanisol omsættes med et 1,5 gange molært overskud af morpholin i toluen som opløsningsmiddel ved flere timer opvarmning under tilbagesvaling (10-14 timer). Omsæt-20 ningen kan også hensigtsmæssigt gennemføres i morpholin som opløsningsmiddel. Hertil behandles 5-chlor-2-nitroanisolet med det 5-10 dobbelte volumen af morpholin. Eventuelt af-methyleret produkt skilles fra ved rystning med natrium= hydroxid eller eftermethyleres ved omsætning med diazomethan.

25 pen opnåede nitroforbindelse reduceres på sædvanlig måde med palladium-på-carbon i methanol eller tin-(II)-chlorid i saltsyre til amidet, og dette diazoteres, Diazoniumforbin-delsen overføres på kendt måde i saltsur opløsning ved tilsætning af koncentreret zinkchloridopløsning i tetrachlor= 30 zinkatet eller ved tilsætning af tetrafluorborsyre i tetra= fluorboratet og isoleres som sådant.

Smp. 170-172°C (tetrachlorzinkat) 166-168°C (tetrafluorborat) DK 169974 B1 23

Eksempel 9 4-methoxy-2- (N-morpholino) benzendiazoniumtetraf luorborat 18,76 g (0,1 mol) 3-chlor-4-nitroanisol, smp. 52°C, opvarmes med 87,1 g (1 mol) morpholin i 4 timer under tilbage-5 svaling. Derpå afkøles til stuetemperatur, sættes 100 ml isvand til reaktionsopløsningen, frasuges det udskilte gule reaktionsprodukt, vaskes med isafkølet 10%'ig eddikesyre og tørres det opnåede materiale ved 60°C i vakuum. Der fås 19,5 g blanding af N(3-hydroxy-6-nitrophenyl)morpholin 10 og N(3-methoxy-6-nitrophenyl)morpholin. Dette produkt opløses i methylenchlorid og tilsættes en etherisk opløsning af diazomethan. Efter to dages henstand ved stuetemperatur dekomponeres diazomethanoverskuddet ved tildrypning af 2N eddikesyre, gennemrystes den organiske fase flere gange med 15 2N natriumhydroxid og afdampes opløsningsmidlet i vakuum.

Der fås 19,1 g (=80,2%) N-(3-methoxy-6-nitrophenyl)morpholin, smp. 84-86°C. Derpå suspenderes dette stof i 250 ml methanol og hydrogeneres ved 20-30°C efter tilsætning af 1,9 g pal= ladium-på-carbon (10%'ig). Efter frasugning af katalysatoren 20 inddampes omhyggeligt, og den frigjorte base overføres i hydrochloridet ved tilsætning af etherisk saltsyre. Der udkrystalliseres 20,6 g (=73,1% af det teoretiske udbytte) N(3-methoxy-6-aminophenyl)morpholin-dihydrochlorid, smp. 237-240°C.

25 Dette stof suspenderes ved -5°C i 96 ml 6N saltsyre,og i løbet af 30 min. tildryppes en opløsning af 6 g natrium= nitrit i 12 ml vand. Den resulterende brunrøde diazonium= saltopløsning sættes ved 0°C under omrøring til 120 ml 35%'ig tetrafluorborsyre. Efter flere timers henstand fås 50 19,5 g (=63,5% af det teoretiske udbytte) 4-methoxy-2- (N-morpholino)benzendiazoniumtetrafluorborat i form af gule krystaller med smp. 115-116°C (dekomponering).

På tilsvarende måde fås: DK 169974 B1 24 a) 2-methoxy-4-(N-thiomorpholino)-benzendiazoniumtetrafluor= borat, smp. 106-108°C (dekomponering) af 5-chlor-2-nitroanisol og thiomorpholin.

Mellemproduktet, 2-amino-5(N-thiomorpholino)-anisol= i 5 dihydrochlorid, fremstilles på følgende måde: I en 1-liter trehalset kolbe med omrører anbringes 100 g tin-II-chloriddihydrat i 400 ml 6N saltsyre og hertil sættes under omrøring 25,4 g (1 mol) 2-nitro-5-(N-thio= morpholino)anisol portionsvis ved stuetemperatur. Derpå 10 opvarmes i 30 min, til75°C, afkøles til stuetemperatur og dryppes reaktionsopløsningen under iskøling i 750 ml 30%'ig natriumhydroxid. Den frigjorte base ekstraheres flere gange med ether, og denne overføres efter tørring og delvis afdampning af opløsningsmidlet ved tilsætning af etherisk saltsyre i hydrochloridet. Der fås 24,9 g (=83,8% af det teoretiske udbytte) 2-amino-5(N-thiomorpho= lino)-anisoldihydrochlorid, smp. 218-220°C.

b) 2-methoxy-4-(N-piperidino)-benzendiazoniumtetrafluorborat, smp. 123-125°C (dekomponering) af 5-chlor-2-nitroanisol 20 og piperidin.

c) 2-methoxy-4-(N-pyrrolidino)-benzendiazoniumtetrafluorborat, smp. 137-139°C (dekomponering af 5-chlor-2-nitroanisol og pyrrolidin.

d) 2-methoxy-4-[N(N1-methyl)-piperazino]-benzendiazonium= 25 tetrafluorboratdihydrotetrafluorborat, smp. 163°C (de- £ komponering) af 5-chlor-2-nitroanisol og N-methylpiperazin.

Ved fremstillingen af denne forbindelse gennemføres diazo= ' teringen med amylnitrit i methanol. Hertil opløses 39,6 g (0,1 mol) 2-amino-5-(N-methylpiperazino)anisoldihydro= tetrafluorborat i 175 ml methanol, tilsættes 11,6 g (0,1 mol) amylnitrit i 25 ml methanol og tildryppes lang-

Claims (7)

1. 25 DK 169974 B1 somt under omrøring ved 0°C 60 ml 35%'ig tetrafluorbor= syre. Ved henstand dannes 24,8 g (=51,7% af det teoretiske udbytte) brunlige krystaller af 2-methoxy-4-[N-(Ν'-methyl)- piperazino]-benzendiazoniumtetrafluorboratdihydrofluor= borat, smp. 163°C (dekomponering). 5 e) 2-methoxy-4-(N-morpholino)-benzendiazoniumtetrafluorborat, smp. 166-168°C (dekomponering) af 5-chlor-2-nitroanisol og morpholin. 10 Patentkrav.
2. 1. Anvendelse af midler til påvisning af esterolytiske og/el-ler proteolytiske enzymer i leukocytter, hvilke midler består 15 af en sugedygtig bærer, et filmlag, en pulverblanding, et lyofilisat, en opløsning eller en reagenstablet indeholdende et egnet esterase- og/eller proteasepåvisningsprincip, en puffer samt eventuelt yderligere sædvanligt anvendte tilsætningsstoffer til påvisning af leukocytter i urin, hvor midlet 2o sættes til den urin, der skal undersøges, og den fremkomne farvedannelse bedømmes visuelt eller fotometrisk, kendetegnet ved, at der som esterase- og/eller protease-på-visningsprincip anvendes en kombination af et diazoniumsalt og en ester, hvilket diazoniumsalt vælges fra gruppen af forbin-25 delser med den almene formel I *2\ A χΜ (I) *4 *5 hvori % betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en lavere alkylmercapto-, en N-morpholino-, en N-thiomorpholino-, en 35’ N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino-, en N- piperidinogruppe, halogen eller hydrogen,
3. 26 DK 169974 B1 s R3 betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en aryloxy-, en lavere alkylmercapto-, alkylamino-, dialkylamino-, en hydroxy-, en N-morpholino-, N-thiomorpholino-, N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino-, N-piperidino-, phe- 5 nylamino-, en eventuelt med en lavere alkyl-, eller lavere alkoxyrest substitueret phenylgruppe, halogen eller hydrogen, * R2, R4, R5, der kan være ens eller forskellige, hver betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en lavere alkylmercap-togruppe, halogen eller hydrogen, hvorhos R2 og R2 tilsammen 10 kan være en annelleret benzenring, og X betegner en stabiliserende anion, og hvilken ester er valgt fra gruppen af forbindelser med den almene formel II ,V 15 - /" I O R3 X y' R4' 20 hvor Ri', R2 *> R3', R4', der kan være ens eller forskelliqe, hver betegner et hydrogen- eller et halogenatom, en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en aryl-, en aralkyl-, en aralko-xy-, en hydroxy-, en carboxy-, en carboxy-1avere-alkoxy-, en aralkoxycarbonyl-, en aralkoxycarbonyl-lavere-alkoxy-, en 2 5 nitro- eller en lavere acylaminogruppe, eller til enhver tid to nabosusbtituenter betegner en eventuelt med halogen substitueret benzoannelleret rest, X* betegner et svovlatom eller en eventuelt med en lavere al- kyl-, en aryl-, en aralkyl- eller en acylrest substitueret 3 0 i minogruppe, * A betegner en aminosyre- eller en peptidrest, B betegner en i peptidkemien sædvanlig eller derfra afledt nitrogenbeskyttelsesgruppe, 35‘ eller forbi ndel ser med den almene formel III V 27 DK 169974 B1 O - A - B I (III) v^v V 5 hvori Ri", R2"/ R3", R4", der kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogenatom, en lavere alkyl-, en lavere al-koxy-, alkylamino- eller di al kylaminogruppe, hvorhos to nabo-substituenter også kan betegne en annelleret benzenring, og 1° A og B har ovennævnte betydning.
4. 2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som yder 1 i gere hjælpestoffer anvendes befugtningsmidler, stabiIsatorer, aktivatorer, filmdannere, galeniske tilsæt-15 ningsstcffer og/eller strukturdannende stoffer.
5. 3. Middel til påvisning af esterolytiske og/eller proteoly-tiske enzymer i leukocytter, hvilket middel består af en sugedygtig bærer, et filmlag, en pulverblanding, et lyofilisat, en 20 opløsning eller en reagenstablet indeholdende et egnet esterase- og/eller protease-påvisningsprincip, en puffer samt eventuelt yderligere sædvanligt anvendte tilsætningsstoffer, kendetegnet ved, at esterase- og/eller protease- påvisningsprincippet er en kombination af et diazoniumsalt og 2 5 en ester, hvilket diazoniumsalt er valgt fra gruppen af forbindelser med den almene formel I R2\_h r3 —^ tø1* N χ{~} (I) R4 R5 35 28 DK 169974 B1 hvori Rx betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en lavere alkylmercapto-, en N-morpholino-, en N-thiomorpholino-, en N-pyrrolidino-, en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino-, en N-piperidinogruppe, halogen eller hydrogen, R3 betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en aryloxy-, = en lavere alkylmercapto-, alkylamino-, dialkylamino-, en hy- 5 droxy-, en N-morpholino-, N-thiomorpholino-, N-pyrrolidino-, Ϋ en eventuelt N'-alkyleret N-piperazino-, N-piperidino-, phe-nylamino-, en eventuelt med en lavere alkyl-, eller lavere alkoxyrest substitueret phenylgruppe, halogen eller hydrogen, R2, R4, R5, der kan være ens eller forskellige, hver betegner en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en lavere alkylmercap-togruppe, halogen eller hydrogen, hvorhos R3 og R2 tilsammen kan være en annelleret benzenring, og X betegner en stabiliserende anion, og hvilken ester er valgt fra gruppen af forbindelser med den almene formel II 15 V v-Jv/0 · * · * ..ÅJO
6. 20 R « K4 hvor Ri'/ R2'/ R3' / R4', der kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogen- eller et halogenatom, en lavere alkyl-, en lavere alkoxy-, en aryl-, en aralkyl-, en aralkoxy-, en hydrcxy-, en carboxy-, en carboxy-1avere-alkoxv-, en aral-25 koxycarbonyl-, en ara 1koxycarbonyl-1avere-alkoxy-, en nitro-eller en lavere acylaminogruppe, eller til enhver tid to nabo-substituenter betegner en eventuelt med halogen substitueret benzoannelleret rest, X» betegner en svovlatom eller en eventuelt med en lavere al-3 0 kyl-, en aryl-, en aralkyl- eller en acylrest substitueret imi nogruppe, A betegner en aminosyre- eller en peptidrest, c B betegner en i peptidkemien sædvanlig eller derfra afledt ni- ’ trogenbeskyttelsesgruppe, 3 5 eller forbi ndel ser med den almene formel III DK 169974 B1 29 O - A - B Rl^ (III) R2^ V
7. 5 R3" hvori Ri”, R2"/ R3", R4", der kan være ens eller forskellige, hver betegner et hydrogenatom, en lavere alkyl-, en lavere al-koxy-, alkylamino- eller di a 1ky1aminogruppe , hvorhos to nabo-substituenter også kan betegne en annelleret benzenring, og A og B har ovennævnte betydning, hvor B, dersom Ri" og R2" eller R2" og R3" er en annelleret benzenring, ikke kan være en acetyl- eller benzyloxycarbonyl- gruppe. 15 '4. Middel ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det som yderligere hjælpestoffer indeholder befugtningsmidler, stabilisatorer, aktivatorer, fiImdannere, gal en i ske t i Isæt -2o ningsstoffer og/eller strukturdannende stoffer. 25 35