PL131123B1 - Agent for determination of esterases and/or proteolytic enzymes - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest srodek do ozna¬ czania esterolitycznych i/albo proteolitycznych en¬ zymów.W diagnostyce schorzen nerek i ukladu moczo¬ wo-plciowego duze znaczenie ma oznaczenie leuko¬ cytów w moczu. Dotychczas oznaczanie to prowa¬ dzono mikroskopowo w ten sposób, ze liczono pod mikroskopem leukocyty znajdujace sie w okreslonej objetosci moczu. Jednakze metoda ta jest bardzo czasochlonna, klopotliwa oraz mecza¬ ca i poza tym wymaga wyszkolonego personelu.Jako podstawe oznaczania leukocytów w róznych plynach ustrojowych próbowano od pewnego cza¬ su wprowadzic reakcje enzymatyczne, poniewaz leukocyty wykazuja szerokie spektrum enzyma¬ tyczne.Znane sa z opisów ogloszeniowych RFN nr 28 26 965 oraz nr 28 36 644 srodki do oznaczania leukocytów w plynach ustrojowych, w których do celów analitycznych wykorzystuje sie wystepuja¬ ca w leukocytach esterolityczna i/albo proteolitycz¬ na aktywnosc. Przy tym estry sulfonftaleinowe wzglednie estrowe barwniki azowe stosuje sie ja¬ ko substraty dla esteraz i/albo proteaz leukocy¬ tów. Uwalniane przy enzymatycznej reakcji barw¬ niki ocenia sie na ogól znanymi metodami. Przed¬ stawione w tych opisach srodki sa jeszcze za ma¬ lo czule. Wykazuja one zbyt dlugie czasy reakcji dla dolnej granicy oznaczania tak, ze praktyczne stosowanie ich zwiazane jest z pewnymi niedogod- 10 30 nosciami, a przede wszystkim za dlugimi czasami oczekiwania przy przeprowadzaniu testu.Rózne metody oznaczania proteaz i esteraz zna¬ ne sa tez z histo- i cytochemicznej enzymologii przykladowo A.G.E. Pearse, Histochemdstry, Theo- retical and Applied, 3. Ed., Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968. W zasadzie sto¬ suje sie przy tym równiez bezbarwne albo slabo zabaorwione estry, które przez enzymatyczne roz¬ szczepianie najczesciej rozpadaja0sie na bezbarwny kwas i równiez bezbarwny skladnik akloholowy (fenolowy). Ostatni w reakcji nastepujacej po en¬ zymatycznym zmydleniu przeksztalca sie w barwne produkty, na przyklad przez sprzegniecie z solami dwuazoniowymi albo przez reakcje utlenienia.F. Schmalzl i H. Braunsteiner opisuja na przy¬ klad w Klin. Wschr. 46, 642 (1968) charaktery¬ styczne cytochemiczne oznaczanie esteraz leukocy¬ tów naftoio-ASjD^ohlorooctanem jako sufostralem i sola dwuazoniowa celem utworzenia barwnego azozwiazku.Dwuskladnikowe uklady tego rodzaju okazaly sie nieodpowiednie jako srodek do szybkiego i prostego oznaczania leukocytów w plynach ustro¬ jowych, jak na przyklad w moczu. Sa one o wiele za malo czule. Przykladowo próby o 5000 leuko¬ cytach jil nie wykazuja reakcji. Poza tym z sola¬ mi dwuazoniowymi reaguje, jak wiadomo, wiele zwiazków obecnych w moczu, jak urobilinogen, sterkobilinogen, bilirubina oraz inne. Tego dowo- 131123131123 s dza najlepiej znajdujace sie w handlu opatento¬ wane testy do oznaczania uróbilinogenu lub biliru¬ biny w moczu, które stosuje sie do reakcji wykry¬ wania soli dwuazoniowych. Stosowane wedlug li¬ teratury do oznaczania esteraz sole dwuazoniowe wykazuja opisana reakcje uboczna z innymi sklad¬ nikami moczu i nie nadaja sie do uzycia na test leukoeytowy po czesci takze ze wzgledu na wlasne zabarwienie.Zadaniem omawianego wynalazku bylo opraco¬ wanie srodka do oznaczania w krótkim czasie, w prosty i latwy do wykonania sposób i który nie daje zaklócajacych reakcji ubocznych z innymi skladnikami badanej próby, esterolitycznych i/albo proteolitycznych enzymów na bazie kombinacji estrów i soli dwuazoniowych jako skladników re¬ akcji dla tych enzymów.Zadanie to rozwiazano w ten sposób, ze stosuje sie okreslona kombinacje odpowiednich estrów i specjalnie podstawionych soli dwuazoniowych, przy czym stosowane sole dwuazoniowe nieoczeki¬ wanie nie wchodza w reakcje uboczne z innymi skladnikami moczu, jak na przyklad z bilirubina i urobilinogenem, lecz charakterystycznie i szybko sprzegaja skladniki fenolowe powstajace przy roz¬ szczepieniu stosowanych estrów, tworzac barwny zwiazek.Odpowiednie estry musza byc wystarczajaco reaktywne wobec estrolitycznych i/albo proteoli¬ tycznych enzymów, aby mozliwie szybko ulegaly rozszczepieniu na skladniki kwasowe i alkoholowe (pod którymi rozumie sie takze fenole). Estry wy¬ biera sie tak, aby uwolnione Skladniki alkoholowe dobrze i calkowicie ulegaly sprzegnieciu z uzyty¬ mi solami dwuazoniowymi. Reaktywnosc soli dwu¬ azoniowych musi byc tak dobrana przez odpowied¬ ni rwybór podstawników, aby odbylo sie szybkie sprzegniecie ze skladnikami alkoholowymi uwol¬ nionymi ze stosowanych w srodku wedlug wyna¬ lazku estrów, ale aby nie zachodzila reakcja ubo¬ czna z innymi skladnikami badanego roztworu..Przedmiotem omawianego wynalazku sa zatem srodki do oznaczania esterolitycznych i/albo proteo¬ litycznych enzymów, szczególnie obecnych w leuko¬ cytach esteraz i/albo proteaz, w postaci, pasków testowych na chlonnym nosniku, warstwy folii, mieszanki proszkowej, liofilizatu, roztworu lub ta¬ bletki odczynnikowej, które zawieraja odpowiednia podstawe, oznaczania esteraz wzglednie proteaz, bu¬ for oraz ewentualnie dalsze stosowane zwykle sub¬ stancje dodatkowe, charakteryzujace sie tym, ze jako podstawe oznaczania esteraz wzglednie pro¬ teaz stosuje sie kombinacje zlozona ze specjalnie podstawionej soli dwuazoniowej i odpowiedniego estru, których reaktywnosc dobiera sie przez od¬ powiedni wybór podstawników tak, aby nastapi¬ lo wystarczajaco szybkie sprzegniecie ze skladni¬ kiem alkoholowym uwolnionym z estru, jednak aby nie nastapila reakcja z innymi skladnikami badanego roztworu.Odpowiednio podstawionymi solami dwuazonio¬ wymi w srodku wedlug wynalazku sa zwiazki o wzorze ogólnym 1, w którym B.t oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, grupe N-morfolinowa, 4 N-tiomorfolinowa, N^pirolidynowa, ewentualnie tf-alkilowana grupe N-piperazynowa, grupe N-pi- perydynowa, atom chlorowca albo wodoru, R« oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksy- s Iowa, grupe aryloksylowa, niska grupe alkilomer¬ kaptanowa, alkiloaminowa, dialkiloaminowa, hy¬ droksylowa, N-morfolinowa, N-tiomorfolinowa, N- -pirolidynowa, ewentualnie N^alkilowana grupe N-piperazynowa, Nnpiperydynowa, fenyloaminowa, u ewentualnie podstawiona przez niska reszte alki¬ lowa lub przez niska reszte alkoksylowa grupe fe- nylowa, atom chlorowca albo wodoru, R* R4, Rg sa jednakowe albo rózne, oznaczaja kazdorazowo niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, 11 niska grupe alkilomerkaptanowa, atom chlorowca aibo wodoru, a X oznacza stabilizujacy anion.Odpowiednimi nadajacymi sie do stosowania w srodku wedlug wynalazku sa estry wybrane z gru¬ py zwiazków o wzorze ogólnym 2, w którym R'lf ii Ra', Rj', R/ sa kazdorazowo jednakowe lub rózne i kazdorazowo oznaczaja atom wodoru albo chlo¬ rowca, niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksy¬ lowa, grupe arylowa, aryloalkilowa, aryloalkoksy- lowa, hydroksylowa, karboksylowa, karboksy-ni- H skoalkoksylowa, aryloalkoksykarbonylowa, aryloal- koksykarbonylo-niskoalkoksylowa, nitrowa albo niska grupe acyloaminowa, albo kazdorazowo dwa sasiadujace podstawniki oznaczaja ewentualnie podstawiona atomem chlorowca dokondensowana 30 reszte benzenowa, X' oznacza atom siarki albo grupe iminowa, ewentualnie podstawiona przez niska grupe alkilowa, arylowa, aryloalkilowa albo przez grupe acylowa, A oznacza reszte aminokwa¬ su albo reszte peptydowa, zas B oznacza stosowa¬ li na w chemii peptydów albo pochodzaca od niej grupe zabezpieczajaca azot, albo z grupy zwiazków o wzorze ogólnym 3, w którym R^, Rj", Rt", R/ sa jednakowe albo rózne, i oznaczaja kazdorazo¬ wo atom wodoru, niska grupe alkilowa* niska gru- 4i pe alkoksylowa, alkiloaminowa albo dialkiloamino- wa, przy czym ewentualnie dwa sasiadujace pod¬ stawniki oznaczaja , równiez dokondensowany pierscien benzenowy, zas A oraz B maja wyzej podane znaczenie. 45 Estry o wzorach ogólnych 2 i 3 zostaja szybko i calkowicie zmydlone przez esterazy i/albo pro- teazy, przykladowo przez esterazy i proteazy wy¬ stepujace w obojetnochlpnnych granulocytach.Uwolnione skladniki fenolowe reaguja dobrze, 50 szybko i selektywnie z wykazujacymi male powi¬ nowactwo elektronowe solami dwuazoniowymi o wzorze ogólnym 1. Dlatego mozna uzyskac zgod¬ nie z zasada wynalazku trwale i szybko wskazuja¬ ce srodki do oznaczania leukocytów w plynach 55 ustrojowych. Poza tym okazalo sie, ze srodki wed¬ lug wynalazku nadaja sie doskonale do ogólnego oznaczania proteolitycznych enzymów, jak np. ela- stazy, chymotrypsyny lub trypsyny w wodnych roztworach wzglednie w plynach ustrojowych, jak M np. we krwi calkowitej, surowicy i plynie, w wy¬ dzielinie trzustki albo w wodnych ekstraktach stolca.Sole dwuazoniowe o wzorze ogólnym 1 sa zwiaz¬ kami czesciowo znanymi. Pochodne, w których gg podstawniki Ra i/lub Rf oznaczaja grupe N-tiomor-& 131123 6 folinowa, N-piirolidynowa, ewentualnie N'-alkilo- wana grupe Nnpiperazynowa albo grupe N-pipe- rydynowa, sa zwiazkami nowymi. Mozna je jednak wytwarzac znanymi metodami przez analogie do znanych substancji.Zwiazki o wzorze ogólnym 2 opisane sa w nie* mieckim opisie patentowym nr P 28 54 987.3.Estry o wzorze ogólnym 3 sa zwiazkami nowy¬ mi. Mozna je wytwarzac w ten sposób, ze zwiazki o wzorze ogólnym 4, w którym R^, R2", R$* oraz R4" maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z aminokwasami i peptydami o wzorze ogólnym HO-A-B, w którym A i B maja wyzej podane znaczenie, wzglednie z odpowiednimi ich reaktywnymi pochodnymi metodami stosowanymi w chemii peptydów.Jako reaktywne pochodne stosuje sie, np. chlorki kwasowe wzglednie uzywane zwykle w syntezie peptydów mieszane bezwodniki, przykladowo z chloroimrówczanem etylu, albo aktywne estry.Jako chlorowiec w okresleniu R^ R2, R8, R4 i R5 wzglednie R/, R2', R»' i R4' rozumie sie fluor, chlor, brom i jod, a zwlaszcza chlor i brom.Niskie grupy alkilowe, alkoksylowe, alkilomer- kaptanowe, alkilo- i dialkiloaminowe w okresle¬ niach Ri—R5, R/—R4' jak równiez Ri"—R4" za¬ wieraja 1 do 5, przewaznie 1 do 3 atomów wegla, przy czym calkiem szczególnie wyrózniaja sie od¬ powiednie reszty metylowe.Jako stabilizujacy anion X korzystny jest anion tetrafluoroboranu, tetrachlorocynkanu wzglednie nadchloranu.Pod grupa aryloalkoksylowa w okresleniu R/, R2', R8' i R4' oraz pod grupa aryloalkilowa w okresle¬ niu X' rozumie sie np. podstawione przez oksy- -niski alkil wzglednie przez niskie reszty alkilo¬ we grupy fenylowe i naftylowe, przy czym reszta alkilowa zawiera 1 do 5, zwlaszcza 1 do 3 ato¬ mów wegla. Szczególnie korzystna jest reszta ben- zyloksylowa wzglednie benzylowa.Jako niska grupa acyloaminowa R/, R/, R$' i R4' wchodza w rachube ugrupowania amidowe niskich alifatycznych kwasów karboksylowych o 1 do 5, zwlaszcza 1 do 3 atomach wegla. Szczególnie wyróznia sie reszta acetyloaminowa.Jaiko reszta acylowa w okresleniu X' wchodza w rachube reszty alifatycznych kwasów karboksy¬ lowych o 1 do 5, zwlaszcza 1 do 3 atomach wegla albo tez aromatycznych kwasów karboksylowych, jak na przyklad kwasu benzoesowego lub nafto- esowego. Szczególnie wyróznia sie reszta acetylo- wa i benzoilowa.Pod reszta arylowa wzglednie aryloalkilowa w okresleniu R/, R2', Rs', R4' oraz X' rozumie sie przewaznie grupe fenylowa albo naftylowa wzgled¬ nie reszte benzylowa.Jako reszta aminokwasu w okresleniu A wcho¬ dza w rachube przewazanie reszty naturalnych a-aminokwasów w odmianie L albo D albo tez w postaci racemicznej. Szczególnie korzystne sa reszty glicyny, alaniny, waliny, leucyny, izoleu- cyny, fenyloalaniny i tyrozyny, przy czym kazdo¬ razowo calkiem szczególnie wyróznia sie odmiana L. Ewentualnie obecne wolne grupy hydroksylo¬ we moga byc acylowane, przewaznie acetylowane.Pod reszta peptydowa w okresleniu A rozumie sie np. di-, tri-, tetra i pentapeptydy, zwlaszcza di- i tripeptydy, przy czym jako skladniki aminokwa- sowe znajduja zastosowanie zwlaszcza wyzej wy- 5 mienione aminokwasy.Jako stosowane w chemii peptydów grupy za¬ bezpieczajace azot w okresleniu B rozumie sie np. grupy acylowa, oksykarbonylowa, tiokarbonylowa, sulfonyIowa, sulfenylowa, winylowa, cyklohekseny- 10 Iowa, fosforylowa lub karbamoilowa.Stosowane w srodku wedlug wynalazku sole dwuazoniowe o wzorze ogólnym 1 oraz estry o wzorze ogólnym 2 i 3 uzywa sie w stezeniach 10—* mola/l do 10—x mola/l, zwlaszcza 10—* mola/l do 10—* mola/l roztworu impregnacyjnego — ma¬ sy pokryciowej albo przeznaczonego do badania plynu.Dalszym skladnikiem srodka wedlug wynalazku do oznaczania proteolitycznych enzymów, a zwla¬ szcza proteaz leukocytów jest odpowiedni uklad buforowy. Wchodza tu w rachube na przyklad bu¬ for fosforanowy, boranowy, barbituranowy, tris- (hydroksymetylo/pamino-metan) = Tris (,2-amino- metan) = Tris(,2-ammo-2Hmetylo-il,3-propanodiol/ = Amediol) albo 'bufor aminokwasowy, przy czym wartosc pH i pojemnosc nalezy tak dobrac, aby wartosc pH w mierzonym roztworze wzglednie na pasku testowym ustawic na 6—10, przewaznie 7—9.Dalszym skladnikiem srodka wedlug wynalazku do oznaczania proteolitycznych enzymów moze byc srodek zwilzajacy, gdyz przez to mozna uzyskac bardziej jednorodny rozdzial zabarwienia i po czesci bardziej jaskrawe zabarwienie. Mozna sto¬ sowac kationowo albo tez aninowo czynne, jak tez amfoteryczne i niejonowe srodki zwilzajace w ste¬ zeniach 0,05—2% (wagowo/objetosciowo), zwlaszcza 0,1—1% (wagowo/objetosciowo).Jako dalszy skladniki srodka wedlug wynalazku moze sluzyc jako stabilizator amid kwasu fosforo¬ wego wzglednie fosfonowego o wzorze ogólnym 5, w którym R6 oznacza grupe dialkiloaminowa, alko- ksylowa, aryloksylowa, alkilowa albo grupe arylo¬ wa, albo grupe N^morfolinowa, a R7 i R8 oznaczaja grupe dialkiloaminowa lub grupe N-morfolinowa.Jako dalszy skladnik srodka wedlug wynalazku okresleniu R6 wchodza w rachube grupy weglowo¬ dorowe zawierajace do 10 atomów wegla.Pod grupa arylowa wzglednie aryloksylowa w okresleniu R« rozumie sie ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, przez niskie grupy alkilowe lub alkoksylowe grupy fenylowa lub naftylowa.Przy uzyciu zwiazków o wzorze ogólnym 5 uzy¬ skuje sie zadziwiajaca stabilizacje receptur.Amidy kwasu fosforowego i fosfonowego o wzo¬ rze ogólnym 5 sa zwiazkami znanymi, znajduja one zastosowanie znane np. z niemieckiego opisu wy- lozeniowego nr 22 35127 jako stabilizatory recep¬ tur na paski testowe, które pracuja na zasadzie wykrywania peroksydazy.Stabilizatory typu amidu kwasu fosforowego i fosfonowego o wzorze ogólnym 5 dodaje sie do wodnych albo korzystnie organicznych roztworów impregnacyjnych w stezeniach 1—20% (wagowo/ob¬ jetosciowo), zwlaszcza 5—15% (wagowo/objetoscio¬ wo). 29 18 30 35 40 45 50 55 60T IM 123 » NiespCKMetwanie stwierdzono, ze czas reakcji srodfca wedlug wynalazku do oznaczania proteoli¬ tycznych enzymów leukocytów, mozna znacznie skrócic, gdy cko soli dwuazoniowych, estrów i do¬ tychczas uzywanych .substancji ipomocTMCzycii do¬ datkowo wprowadzi sde jeden ailibo Mika aktywa¬ torów. Odpowiednimi do srodka Wedlug wynalaz¬ ku aMywatoraimi okazaly sie -zwiazki opisane i za¬ strzezone w opisie patentowymi iRFN nr 29 05 531.0.Aktywatory dodaje sie do roztworu impregna¬ cyjnego w stezeniach 0,5—10%, korzystnie 1—5% (wagowo/objetosciowo).W celu wytworzenia srodka wedlug wynalazku impregnuje sie na przyklad chlonny nosnik, zwla¬ szcza bibule filtracyjna, runo celulozowe lub z wlókna sztucznego, roztworami wymaganych, zwykle stosowanych do wytwarzania pasków testo¬ wych odczynników (substrat, bufor, ewentualnie srodki zwilzajace) W latwo lotnych rozpuszczalni¬ kach, jak np. w wodzie, metanolu, etanolu lub ace¬ tonie. Odbywa sie to korzystnie w dwu oddziel¬ nych etapach, najpierw impregnuje sie wodnym Toztworem, który zawiera bufor oraz inne rozpusz¬ czalne w wodzie substancje dodatkowe. Nastepnie impregnuje sie roztworem substratów proteaz o wzorze ogólnym 2 wzglednie 3, soli dwuazonio- wych o wzorze ogólnym 1 i aktywatorów. Jednak¬ ze impregnacje mozna prowadzic w innej kolejnos¬ ci wzglednie stosujac inny sklad obydwu roztwo¬ rów impregnacyjnych.Gotowe paski testowe mozna stosowac jako takie albo w znany sposób naklejone na uchwyty, albo zwlaszcza wspawane miedzy tworzywo sztuczne i siatke o drobnych oczkach wedlug opisu paten¬ towego RFN nr 2118 455.W celu wytworzenia pasków testowych pokry¬ tych powloka wszystkie odczynniki wprowadza sie do roztworu lub dyspersji substancji powlokotwór- czej, jak np. estru poliwinylowego lub poliamidu, i miesza do ujednorodnienia. Mieszanine rozsma- rowuje sie cienka warstwa na nosniku z tworzywa sztucznego i suszy. Pokryte powloka paski testo¬ we wedlug wynalazku po wysuszeniu tnie sie i mozna je stosowac jako takie albo w znany sposób naklejone na uchwyty albo np. wspawane miedzy tworzywo sztuczne i siatke o drobnych oczkach wedlug opisu patentowego RFN nr 2118 455.Srodek wedlug wynalazku do oznaczania proteo¬ litycznych enzymów, szczególnie proteaz leukocy¬ tów, w postaci mieszanek proszkowych albo table¬ tek odczynnikowych wytwarza sie w ten sposób, ze wymienione wyzej skladniki testu zadaje sie zwyklymi galenowymi substancjami dodatkowymi i granuluje. Tego rodzaju substancjami dodatko¬ wymi sa np. weglowodany, jak np. mono-j oligo- albo polisacharydy, albo cukroalkohole, jak np. mannit, sorbit lub ksylit, albo inne rozpuszczalne obojetne zwiazki, jak glikole polietylenowe albo poliwinylopirolidon.Mieszanki proszkowe lub tabletki odczynnikowe wykazuja na ogól ciezar koncowy okolo 50—200 mg, zwlaszcza 50—80 mg.W celu wytworzenia liofilizatów o ciezarze cal¬ kowitym kazdorazowo okolo 5—20 mg, zwlaszcza okolo 10 mg, odparowuje sie ze stanu zamrozenia roztwór, który obok wszystkich potrzebnych do B testu odczynników zawiera zwykle substancje wzmacniajace, jak np. poliwinylopirolidon, i ewen¬ tualnie dalsze napelnlacze, jak np. mannit, sorbit albo ksylit. grodek wedlug wynalazku w postaci roztworu zawiera zwlaszcza wszystkie potrzebne do testu odczynniki. Jako rozpuszczalnik wchodza w rachu* be woda albo mieszaniny wody z rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalnikiem organicznym, jak np. metanolem, etanolem, acetonem lub dimetylofor- M mamidem. Ze wzgledu na trwalosc moze byc ko¬ rzystne rozdzielenie potrzebnych do testu odczyn¬ ników na dwa albo wiecej roztworów, które la¬ czy sie odpowiednio przy wlasciwym badaniu. m Tak wytworzone srodki po zanurzeniu w bada¬ nym plynie ustrojowym albo po dodaniu do od¬ nosnego plynu ustrojowego, umozliwiaja szybkie i proste oznaczenie obecnosci proteolitycznych en¬ zymów, szczególnie proteaz leukocytów, przez po- m wstanie zabarwienia, które mozna oceniac wizual¬ nie albo fotometrycznie, np. za pomoca fotometru reemisyjnego, albo w kiuwecie. Ze wzgledu na to, ze aktywnosc proteaz leukocytów na komórke mozna uznac w zasadzie jako wielkosc stala, z in- 3e tensywnosci powstalego zabarwienia mozna ustalic stezenie leukocytów w badanym plynie ustrojo¬ wym. Przy tym srodkiem wedlug wynalazku obej¬ muje sie zarówno nieuszkodzone jak tez rozpad- niete leukocyty, poniewaz aktywnosc proteaz leu- n kocytów zostaje w pelni utrzymana takze po roz¬ padzie leukocytów. A zatem blad rozpadu nie wy¬ stepuje.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej wynalazek.M Przyklad I. Bibule filtracyjna (np. Schleicher u. Schiill 23 SL) impregnuje sie kolejno nastepu¬ jacymi roztworami i potem suszy w temperaturze 60°C: Roztwór 1 45 0,2 molowy bufor boraks — kwas solny pH 8 10% trimorfolid kwasu fosforowego Roztwór 2 2X10-* mola/l substratu 10—* mola/l soli dwuazoniowej rozpuszczone w mieszaninie aceton/dekanol 98:2 Substraty S 1: 3-fN-(tolueno-4'-sulfonylo)-I^alanyloksy]-indol S 2: 3-[N-(tolueno^'-6ulfonylo)-Li-alanyloksy]-l- w -metoksynaftalen S 3: l-[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -metoksynaftalen S 4: l-(N-(tolueno-4'HSulfonylo)-L-alanyloksy]-4- izopropoksynaftalen m S 5: l-(N-(tolueno-47-sulfonylo)-Li-alanyIoksy]-4- pentyloksynaftalen S 6: 14N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-3-di- metyloaminobenzen S 7: ln[N^tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-3- N -dietyloaminobenzen131123 10 S 8: l-(N-(tolueno-4'^ulfonylo)-L-alanyloksy]-3,5- -diimetoksybenzen S 9: l^-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-aiamyloksy]-3- -metylo^5-nietoksybenzen Sole dwuazoniowe D 1: tetrafluorolboran 2,4-dimetoksyfoenzenodwuazo- niowy D 2: tetrafluoroboran 4^metoksynaftaleno-l-dwu- azoniowy D 3: tetrafluoroboran 2,5-dimetoksy-4-dimetyloami- nobenzenodwuazondowy D 4: tetrafluoroboran 4-dimetyloaminobenzenodwu- azoniowy Otrzymuje sie papierki, które przy zanurzeniu w moczu zawierajacym 100 leukocytów/jU w ciagu okolo 3 minut wykazuja zaibrwienia przedstawione w tablicy 1. Oceny mozna dokonywac tez za pomo¬ ca fotometru reemisyjnego.Tablica 1 10 15 Substrat S 1 S 1 S 1 1 S * S 2 S 2 S 2 | S 2 S 3 S 3 1 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 Sól dwu- azoniowa D 1 D 2 D 3 D 4 D 1 D 2 D 3 D 4 D 1 D 2 D 3 D 1 D 1 D 1 D 1 D 1 D 1 Zabarwienie czerwonobrunatne czerwonobrunatne niebieskoszare zielone czerwone jasnoczerwone fioletowe liliowe czerwonofioletowe 1 fioletowe 1 niebieskoszare liliowe liliowe jasnoczerwone jasnoczerwone czerwonofioletowe czerwonobrunatne Przyklad II. Bibule filtracyjna impregnuje sie kolejno ponizszymi roztworami i suszy w tem¬ peraturze 60°C: Roztwór 1 0,1 molowy bufor boranowy pH 8 Roztwór 2 2 X 10—• mol/l tetrachlorocyhkanu 2-mteoksy-4-(N- -(morfolino)-benzenodwuazoniowego 2 X10-» mola/l substratu * 10% trimorfolidu kwasu fosforowego w mieszaninie etanol/l-dekanol 98 : 2 * Substrat A: 3-(N^benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-indol B: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-5-me- tyloindol C: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-7-me- tyloindol 25 30 35 40 45 50 55 60 D: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-4-chlo- roindol E: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-5-bro- moindol P: 3-[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-indol G: 3-[N-(tolueno-4'-6ulfonylo)-L-alanyloksy]-5-me- toksyindol H: 3-[N-(4'-acetamidobenzenosulfonylo)-L-alany- loksy]-indol I: 3-[N-(4'-metoksytosylo)-L-alanyloksy]-indol K: [N-(tolueno-4/-sulfonylo)-Li-alanyloksy]-benzen L: l-[N^tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-nafta- len M: l-[N-(tolueno-4,-sulfonylo)-L-alanyloksy]-3-me- toksybenzen Tak otrzymanymi papierkami odczynnikowymi mozna wykazywac w moczu zawierajacym leuko¬ cyty 100 leukocytów pi.Papierki odczynnikowe o porównywalnej reak¬ tywnosci mozna takze otrzymac, gdy zamiast wy¬ mienionej wyzej soli dwuazoniowej uzyje sie: tetrafluoroboran 2-metoksy-4-(N-pirolidyno)-benze- nodwuazoniowy, tetrafluoroboran 2-metoksy-4-(N-piperydyno)-ben- zenodwuazoniowy, tetrafluoroboran 2,6^dimetoksy-4-(N-morfolino)-ben- zenodwuazoniowy, tetrafluoroboran 4Hmetoksy-2-(N-morfolino)-benze- nodwuazoniowy, tetrafluoroboran 2-metoksy-4-[N-(N'Hmetylo)-pipe- razyno]-'benzenodwuaz0niowy, tetrafluoroboran 2-metoksy-4-(N-tiomorfolino)-ben- zenodwuazoniowy.Przyklad III. Wytwarza sie nastepujace roz¬ twory podstawowe: Roztwór 1 2 X 10—» mola/1 ln[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-ala- nyloksy]-4nizopropoksynaftalenu 10—* mola/l tetrafluoToboranu 2,4-dimetoksybenze- nodwuazoniowego w mieszaninie aceton/1-dekanol Tablica 2 Aktywator bez aktywatora 4-azafluoreri chinina ibenzo-(h)-chinolina l^-bis-4-piryidylo- 1 etylen I 1-dekanol 1-tetradekanol ndtroprusydek so¬ dowy szesciocyjano- zelazian-(II)-pota- sowy Dodatek aktywatora w mg do 20 ml roztwo¬ ru 1 33 33 36 37 400 400 — roztwo¬ ru 2 — — — — — — 31 40 Czas reakcji (sek.) 54 17 32 8 34 5 I 4 1 38 30*** 11 Roztwór 2 0,2 molowy bufor boraks — kwas solny 10% trimorfolidu kwasu fosforowego.Kazdorazowo albo do roztworu 1, albo/do roz¬ tworu 2 dodaje sie podane w tablicy 2 aktywatory w podanych tam stezeniach, a potem bibuly fil¬ tracyjne nasyca roztworami 1 i 2 i kazdorazowo suszy w temperaturze 60°C.Przy badaniu w izotonicznym roztworze soli ku¬ chennej z 3ÓG Ieukocytami/jU reaguja testy w po¬ danych czasach. ' Przyklad IV. Bibule filtracyjna nasyca sie nastepujacymi roztworami i po nasyceniu kazdora¬ zowo suszy w temperaturze 60°C.Roztwór 1 2X10-* mola/l 34N^tolueno-4'-sutfonylp)-L-alany- loksy]-indolu 2 X 1°—a mola/1 tetrachlorocynkanu 2-metoksy-4- -moriolmobenzenodwuazoniowego w mieszaninie aeeton/1-dekanol 93 : 2.Roztwór 2 0,2 molowy bufor boraks — kwas solny pH 8 10% trimorfolidu kwasu fosforowego.W dalszym doswiadczeniu nie stosowano do roz¬ tworu 2 trimorfolidu kwasu fosforowego. , Próbki z trimorfolidem kwasu fosforowego po ogrzewaniu przez 2 dni w temperaturze 60°C pozo¬ staly niezabarwione i dawaly dobre reakcje z roz¬ tworami zawierajacymi leukocyty. Próbki bez tri¬ morfolidu kwasu fosforowego wykazywaly szare zabarwienie.Przyklad V. W znany sposób wytworzono tabletke odczynnikowa, zawierajaca nastepujace skladniki: 2 mg 3-[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-Lr-alanyloksy]-in*- dolu, 2 mg tetrachlorocynkanu 2-metoksy-4-(N-morfoli- no)-benzenodwuazoniowego, 1,5 mg dihydrofosforanu potasowego, 301 mg dwuwodnego^ bydrofosfosanu disodowego, 20 mg mannitu.Tabletke te rozpuszczono w 2 ml moczu zawie¬ rajacego leukocyty i dobrze wymieszano. W przy¬ padku obecnosci leukocytów wystepowalo czerwo- nofioletowe zabarwienie. Tak 100 leukocytów moz¬ na bylo oznaczyc w okolo 2 minuty.Jezeli przed dodaniem tabletki i w czasie reakcji mocz utrzymywano w temperaturze 37°C, mozna bylo w tym samym czasie oznaczyc 20 leukocytów.Przyklad VI. Wytwarzanie l-[N-(tolueno-4'- -sulfonylo)-L-alanyloksy]-3,5-Hdimetoksybenzenu w celu przeprowadzenia reakcji metoda aktywnego estr*' 14,6 g (0,06 mola) N-(tolueno-4-sulfonylo)- -alaniny i 12,2 g (0,09 mola) N-hydroksybenzotria- zolu rozpuszcza sie w 300 ml absolutnego octanu etyli*, schladza do temperatury 0°C i zadaje 12,4 g ^0,06 mola) dicykloheksylokarbodiimddu. Dla utwo¬ rzenia aktywnego estru calosc miesza sie przez 2 godziny w temperaturze 0°C, potem przez dal¬ sze 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po do¬ daniu 6,2 g (0,04 mola) 3,5-dimetoksyfenolu i 5,5 ml (0,04 mola) trietyloaminy calosc miesza sie przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Utworzony N,N'- szonym cisnieniem. Przesacz zateza sie pod zmniej- 11123 12 szonym cisnieniem przy maksymalnej temperatu¬ rze lazni 50°C. Pozostalosc przenosi sie do 200 ml octanu etylu i przemywa kolejno po 3 razy stosu¬ jac po 100 ml 5^procentowego kwasu cytrynowego f i potem odpowiednio po 100 ml 5-procentowego roztworu wodoroweglanu sodowego. Faze organicz¬ na suszy sie siarczanem sodowym i zateza pod zmniejszonym cisnieniem., Oleisty surowy produkt oczyszcza sie droga chromatografii kolumnowej na 10 kolumnie z zelu krzemionkowego stosujac jako eluent mieszanine toluen-octan etylu (4:1). Odpo¬ wiednio zebrane frakcje zateza sie, pozostalosc roz¬ puszcza w malej ilosci chlorku metylenu i wytra¬ ca przez dodanie eteru. Otrzymuje sie 5,8 g, co lf odpowiada 38% wydajnosci teoretycznej l-[N-(tolu- eno-4'^sulfonylo)-L-alanyloksy]-3,5-dimetoksybenze- nu w postaci bezbarwnych krysztalów o tempera¬ turze topnienia 110°C. aDao: —52,5° (c = 1%, aceton). 20 W analogiczny sposób, przez reakcje N-(tolueno- -4-sulfonylo)-L-alaniny z odpowiednio podstawio¬ nymi fenolami lub naftolami, otrzymuje sie na¬ stepujace substancje: ^ 6.1. [iN^tolueno^-sulfonylo^L-alanyloksypben- zen, bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 113°C u aD»: —63,8° (c = 1%, aceton) 6.2. l^[N- -dimetyloaminobenzen, bezbarwny, bezpostaciowy proszek chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: toluen-dioksan 2:1 wywolywanie: UV, wartosc RF: 0,68) 6.3. l-|[N-(tolueno-4'-sulfónylo)-L-alanyloksy]-3- -metoksybenzen, ^ bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 60—61°C Gd*: —62,9° (c = 1%, metanol) 6.4. l^[N^(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-naf¬ talen, ^ bezbarwny, gesty olej a**: —27,3° (c = 1%, metanol) chromatografia cienkowarstwowa; gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: toluen-dioksan 4:1, 50 wywolywanie: UV, wartosc RF: 0,53) 6.5. l-t[N-(tolueno-4/-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -metoksynaftalen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 136°C M aD2*: ^12,6° (c = 1%, aceton) 6.6. ln[N-(1;olueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -izopropoksynaftalen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 93—96°C an20: —38,0° (c = 1%, aceton) m 6.7. l-CN-(tolueno-4/-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -pentyloksynaftalen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 87°C Cd20: —36,9° (c = l%, aceton) 6.8. l-i[N-(toluen-4'-sulfonylo)-Lr-alanyloksyl-3- tó -dietyloaminobenzen131123 U *A bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia *3r-84°C .on,*: -^59,4° chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: ksylen-metyloety- loketon 1:1, wartosc Rr: 0,6S) 6.9, l^[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy)-3- -metylo-^Hmetoksybenzen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 79-^81°C W*: 62^° (c = l%, metanol) chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: chloroform-metanol 20 :1, wartosc RF: 0,79).Przyklad VII. Wytwarzanie 2-[N-(tolueno-4'- -sulfonylo)-L-alanyloksy]-4nmetoksynaftalenu.Roztwór 1 W celu wytworzenia chlorku kwasowego wedlug metody jednostopniowej 19,44 g (0,08 mola) N-(to- lueno-4^sulfonylo)-L-alaniny rozpuszcza sie w 100 ml absolutnego dimetyloformamidu i oziebia do temperatury —20°C. Potem przy mieszaniu i chlodzeniu dodaje sie pipeta 5,81 ml (0,08 mola) chlorku tionylu i mieszanine reakcyjna utrzymuje sie przez 30 minut w lazni ziebiacej w temperatu¬ rze —20°C.Roztwór 2 Do roztworu 6,96 g (0,04 mola) 4-metoksy-2-naf- tolu w 50 ml absolutnego dimetyloformamidu do¬ daje sie 11,0 ml (0,08 mola) trietyloaminy. Miesza¬ nine oziebia sie do temperatury —20°C.Reakcja Roztwór 1 wlewa sie do roztworu 2 i miesza z wykluczeniem wody przez okolo 4 godziny w temperaturze —20°C, po czym mieszanine pozosta¬ wia przez noc w lodówce.W celu przerobienia zateza sie roztwór reakcyjny pod zmniejszonym cisnieniem przy temperaturze lazni maksymum 50°C. Pozostalosc przenosi sie do okolo 150 ml octanu etylu i przemywa kolejno po 3 razy stosujac po 100 ml 5%-owego kwasu cytry¬ nowego i potem po 100 ml 5%-owego roztworu wo¬ doroweglanu sodowego. Po wysuszeniu siarczanem sodowym faze organiczna zateza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Surowy produkt oczyszcza sie droga chromatografii kolumnowej na kolumnie z zelu krzemionkowego stosujac jako eluent mie¬ szanine toluen-octan etylu (4:1). Po zatezeniu od¬ powiednich zebranych frakcji pod zmniejszonym cisnieniem pozostalosc przenosi sie do malej ilosci chlorku metylenu i potem wytraca mieszanine ete¬ ru i ligroiny (1 :2), Otrzymuje sie 2,8 g, co sta¬ nowi 18% wydajnosci teoretycznej 2-[N-(tolueno-4'- -sulfonylo)-L-alanyloksy]-4Hmetoksynaftalenu w po¬ staci bezbarwnych krysztalów o temperaturze top¬ nienia 119° dm: —57,9°C(c = 1%, aceton) Przyklad VIII. Wytwarzanie tetrachlorocyn- kanu2-metoksy-4-(N-morfolino)-benzenodwuazonio- wego 5-chloro-2-nitroanizol poddaje sie reakcji z 1,5-krotnym nadmiarem molowym morfoliny w toluenie jako rozpuszczalniku, przez wielogodzinne {10—14 godzin) utrzymywanie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna. Reakcje mozna tez korzyst¬ nie prowadzic w morfolinie jako rozpuszczalniku.Wówczas 5-chloro-2-nitroanizol zadaje sie 5—10- -krotna objetoscia morfóHny. Ewentualnie o lowany produkt oddziela sie przez wytrzasanie z lugiem sodowym albo metyluje sie przez reakcje 5 z ddazometanem.Otrzymany riititozwiazefc redukuje sie do alniny w zwykly sposób palladem na weglu w metanolu albo chlorkiem cyny (II) w kwasie solnyni I amine te dwuazuje. Zwia2ek dwuazoniowy w znany spo- 10 sób w roztworze kwasu solnego przeprowadza sie przez dodanie stezonego roztworu chlorku cynku w tetrachlorocynkan allbo przez dodanie kwasu tetra- fluorobórowego w tetrafluoroboran i jako taki wy¬ odrebnia. lig Temperatura topnienia 170—172°C (tetrachlorocyn¬ kan) 166—168°C (rozkl.) (tetraflu¬ oroboran) Przyklad IX. Wytwarzanie tetrafluorobora- 20 nu 4-metoksy-2-(N^morfolino)^benzodwuazoniowego 18,76 g (0,1 mola) 3-chloro-4-nitroanizolu, o tem¬ peraturze topnienia 52°C, ogrzewa sie przez 4 go¬ dziny pod chlodnica zwrotna z 87,1 g (1 mol) mor¬ foliny. Potem schlacfza sie do temperatury pokojo- re wej, dodaje do roztworu reakcyjnego 100 ml wody z lodu, odsacza wytracony, zólty produkt reakcji, przemywa schlodzonym lodem 10% kwasem octo¬ wym i suszy otrzymany produkt pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 60°C. Otrzymuje sie ^ 19,5 g mieszaniny skladajacej sie z N-(3-hydróksy- -6-nitrofenylo)Hmorfoldny i N-(3-metoksy-6-nitfofe- nylo)-morfoliny. Produkt ten rozpuszcza sie w ' chlorku metylenu i dodaje eterowy roztwór dwu- azometanu i pozostawia przez 2 dni w temperatu- 35 rze pokojowej. Po tym czasie rozklada sie nadmiar dwuazometanu przez wkroplenie 2 n kwasu octo¬ wego, faze organiczna wytrzasa sie kilkakrotnie z 2n lugiiem sodowym i oddestylowuje rozpuszczal¬ nik pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 40 19,1 g, co stanowi 80,2% wydajnosci teoretycznej, N-(3^metoksy-6-nitrofenylo)-morfoliriy, o tempera¬ turze topnienia 84—86°C. Nastepnie substancje ta zawiesza sie w 250 ml metanolu i uwodornia z do¬ datkiem 1,9 g 10% palladu na weglu w tempera- turze 20—30°C. Po odsaczeniu katalizatora przesacz zateza sie, wolna zasade przeprowadza w chloro¬ wodorek za pomoca eterowego roztworu kwasu solnego. Wykrystalizowuje 20,6 g, co stanowi 73,1% wydajnosci teoretycznej, dwuchlorowodorku N-0- -metoksy-6-aminofenylo)-morfoliny, o temperaturze topnienia 237—240°C.Produkt ten zawiesza sie, przy temperaturze —5°C w 96 ml 6n — kwasu solnego i wkrapla do niego w czasie 30 minut roztwór 6 g azotynu so- 55 dowego w 12 ml wody. Powstaly brazowo-czerwo- ny roztwór soli dwuazoniowej dodaje sie w tempe¬ raturze 0°C, przy mieszaniu do 120 ml 35% kwasu tetrafluoroborowego. Po kilka godzinnym staniu otrzymuje sie 19,5 g, co stanowi 63,5% wydajnosci teoretycznej, tetrafluoroboranu 4-metoksy-2- -morfolino)-benzenodwuazoniowego, w postaci zól¬ tych krysztalów, o temperaturze topnienia 115— 116°C (z rozkladem).W analogiczny sposób otrzymuje sie: a) z 5-chloro-2-nitroandzolu i tiomorfoliny tetra- •o131 123 15 16 fluoroboran 2-metoksy-4- dwuazoniowy, o temperaturze topnienia 106—108°C, z rozkladem.Produkt posredni dwuchlorowodorek 2-amino-5- -(N-tiomorfolino)-anizolu wytwarza sie nastepuja¬ co: Do 1 1 kolby trójszyjnej z mieszadlem wprowa¬ dza sie 100 g dwuwodzianu chlorku cynku-II, w 400 ml 6n- kwasu solnego i do tego dodaje porcja¬ mi przy mieszaniu w temperaturze pokojowej 25,4 g (1 mol) 2-nitro-5-(N-tiomorfolino)-anizolu.Po czym calosc ogrzewa sie w czasie 30 minut, w temperaturze 75°C, chlodzi do temperatury poko¬ jowej i wkrapla przy chlodzeniu lodem roztwór reakcyjny do 750 ml 30% lugu sodowego. Wolna zasade ekstrahuje sie kilkakrotnie eterem i prze¬ prowadza ja, po wysuszeniu i oddestylowaniu roz¬ puszczalnika, w chlorowodorek przez dodanie ete¬ rowego roztworu kwasu solnego. Otrzymuje sie 24,9 g, co stanowi 83,8% wydajnosci teoretycznej, dwuchlorowodorku 2-amino-5-(N-tiomorfolino)-ani- zclu, o temperaturze topnienia 218—220°C. b) z 5-chloro-2-nitroanizolu i piperydyny tetra- fluoroboran 2-metoksy-4-(N-piperydyno)-benzeno- dwuazoniowy, o temperaturze topnienia 123—125°C, z rozkladem. c) z 5^chloro-2-nitroanizolu i pirolidyny tetraflu- oroboran 2-metoksy-4-(NHpirolidyno)-benzenodwu- azoniowy, o temperaturze topnienia 137—139°C, z rozkladem. d) z 5-chloro-2-nitroanizolu i N-metylopiperazy- ny tetrafluoroborano-dihydró-tetrafluoroboran 2- jmetoksy-4-[N- dwuazoniowy, o temperaturze topnienia 163°C, z rozkladem.Przy wytwarzaniu tego zwiazku dwuazowanie przeprowadza sie azotynem amylu w metanolu.Przy tym 39,6 g (0,1 mola) dihydro-tetrafluorobo- ranu 2-amino-5-(N-metylopiperazyno)-anizolu roz¬ puszcza sie w 175 ml metanolu, dodaje 11,6 g (0,1 mola) azotynu amylu w 25 ml metanolu i powoli, przy mieszaniu w temperaturze 0°C wkrapla 35% kwas tetrafluoroborowy i pozostawia w spokoju.Wykrystalizowuje 24,8 g, co stanowi 51,7% wydaj¬ nosci teoretycznej, brazowanych krysztalów tetra- fluorOborano-dihydro-tetrafluoroboranu 2-metoksy- -4-[N-(N'-metylo)^piperazyno]-benzenodwuazonio- wego, o temperaturze topnienia 163°C, z rozkla¬ dem. e) z 5-chloro-2^nitroanizolu i morfoliny tetraflu- oroboran 2^metoksy-4^(Nnmorfolino)-benzenodwu- azoniowy, o temperaturze 166—168°C, z rozkladem.Zastrzezenie patentowe Srodek do oznaczania esterolitycznych i/albo pro¬ teolitycznych enzymów, w postaci pasków testo¬ wych na chlonnym nosniku, warstwy folii, mie¬ szanki proszkowej, liofilizatu, roztworu lub tablet- 10 ii 2t 39 35 40 45 50 51 ki odczynnikowej,, zawierajacych odpowiednia pod¬ stawe oznaczania esteraz i/albo proteaz, bufor oraz ewentualnie dalsze zwykle stosowane substancje dodatkowe, znamienny tym, ze jako podstawe oznaczania esteraz i/albo proteaz stosuje sie kom¬ binacje zlozona z soli dwuazoniowej o wzorze- ogólnym 1, w którym R2 oznacza niska grupe alki¬ lowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilo¬ merkaptanowa, grupe N-morfolinowa, N-tiomor- folinowa, N^pirolidynowa, ewentualnie N'-alkilo- wana grupe N-piperazynowa, grupe N-piperydyno- wa, atom chlorowca albo wodoru, R8 oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, grupe aryloksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, al- kiloaminowa, dialkiloaminowa, hydroksylowa, N- -morfolinowa, N-tiomorfolinowa, N-pirolidynowa, ewentualnie N'-alkilowana grupe N-piperazynowa, Nnpiperydynowa, fenyloaminowa, grupe fenylowa, ewentualnie podstawiona przez niska reszte alkilo¬ wa albo przez niska reszte alkoksylowa, dalej oznacza atom chlorowca albo wodoru, R2, R4, R5 sa jednakowe albo rózne i oznaczaja kazdorazowo niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, atom chlorowca lub wodoru, a X oznacza stabilizujacy anion, oraz: estru wybranego z grupy zwiazków o wzorze ogól¬ nym 2, w którym R^R/jR/jR/ sa kazdorazowo jednakowe albo rózne i oznaczaja kazdorazowo atom wodoru albo chlorowca, niska grupe alkilo¬ wa, niska grupe alkoksylowa, arylowa, aryloalkilo- wa, aryloalkoksyIowa, hydroksylowa, karboksylo¬ wa, karboksy-niskoalkoksylowa, aryloalkoksykar- bonylowa, aryloalkoksykarbonylo-niskoalkoksylowa, grupe nitrowa, albo niska grupe acyloaminowa, albo kazdorazowo dwa sasiadujace podstawniki oznaczaja ewentualnie podstawiona przez atom chlorowca dokondensowana reszte benzenowa, X' oznacza atom siarki albo grupe iminowa, ewentual¬ nie podstawiona przez niska reszte alkilowa, ary¬ lowa, aryloalkilowa albo przez reszte acylowa, A oznacza reszte aminokwasu albo peptydowa, B oznacza stosowana w chemii peptydów albo po¬ chodzaca od niej grupe zabezpieczajaca azot, albo estru wybranego z grupy zwiazków o wzorze ogól¬ nym 3, w którym R/', R2", R3", R4" sa jednakowe albo rózne, oznaczaja kazdorazowo atom wodoru, niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, al- kiloaminowa, dialkiloaminowa, przy czym dwa sa¬ siadujace podstawniki moga takze oznaczac dokon- densowany pierscien benzenowy, A i B maja wy¬ zej podane znaczenie, przy czym sole dwuazcniowe oraz estry uzywa sie w stezeniach 10^* mole/l do 10—1 mola/l, zwlaszcza 10—» mola/l do 10—2 mola/l roztworu impregnacyjnego — masy pokryciowej albo przeznaczonego do badania plynu i stosowane jako dodatkowe srodki pomocnicze srodki zwilza¬ jace, stabilizatory, aktywatory, srodki blonotwór- cze, galenowe substancje dodatkowe i/albo srodki wzmacniajace uzywa sie w ilosci 0—2% wagowych.131123 Ra R1 R3-V-NEN X RA R5 WZÓR WZÓR 2 R R2 O-A-B R4 R- WZOR 3 ?6 R7- P = O Rfl WZÓR 4 WZÓR 5 PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Srodek do oznaczania esterolitycznych i/albo pro¬ teolitycznych enzymów, w postaci pasków testo¬ wych na chlonnym nosniku, warstwy folii, mie¬ szanki proszkowej, liofilizatu, roztworu lub tablet- 10 ii 2t 39 35 40 45 50 51 ki odczynnikowej,, zawierajacych odpowiednia pod¬ stawe oznaczania esteraz i/albo proteaz, bufor oraz ewentualnie dalsze zwykle stosowane substancje dodatkowe, znamienny tym, ze jako podstawe oznaczania esteraz i/albo proteaz stosuje sie kom¬ binacje zlozona z soli dwuazoniowej o wzorze- ogólnym 1, w którym R2 oznacza niska grupe alki¬ lowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilo¬ merkaptanowa, grupe N-morfolinowa, N-tiomor- folinowa, N^pirolidynowa, ewentualnie N'-alkilo- wana grupe N-piperazynowa, grupe N-piperydyno- wa, atom chlorowca albo wodoru, R8 oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, grupe aryloksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, al- kiloaminowa, dialkiloaminowa, hydroksylowa, N- -morfolinowa, N-tiomorfolinowa, N-pirolidynowa, ewentualnie N'-alkilowana grupe N-piperazynowa, Nnpiperydynowa, fenyloaminowa, grupe fenylowa, ewentualnie podstawiona przez niska reszte alkilo¬ wa albo przez niska reszte alkoksylowa, dalej oznacza atom chlorowca albo wodoru, R2, R4, R5 sa jednakowe albo rózne i oznaczaja kazdorazowo niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, atom chlorowca lub wodoru, a X oznacza stabilizujacy anion, oraz: estru wybranego z grupy zwiazków o wzorze ogól¬ nym 2, w którym R^R/jR/jR/ sa kazdorazowo jednakowe albo rózne i oznaczaja kazdorazowo atom wodoru albo chlorowca, niska grupe alkilo¬ wa, niska grupe alkoksylowa, arylowa, aryloalkilo- wa, aryloalkoksyIowa, hydroksylowa, karboksylo¬ wa, karboksy-niskoalkoksylowa, aryloalkoksykar- bonylowa, aryloalkoksykarbonylo-niskoalkoksylowa, grupe nitrowa, albo niska grupe acyloaminowa, albo kazdorazowo dwa sasiadujace podstawniki oznaczaja ewentualnie podstawiona przez atom chlorowca dokondensowana reszte benzenowa, X' oznacza atom siarki albo grupe iminowa, ewentual¬ nie podstawiona przez niska reszte alkilowa, ary¬ lowa, aryloalkilowa albo przez reszte acylowa, A oznacza reszte aminokwasu albo peptydowa, B oznacza stosowana w chemii peptydów albo po¬ chodzaca od niej grupe zabezpieczajaca azot, albo estru wybranego z grupy zwiazków o wzorze ogól¬ nym 3, w którym R/', R2", R3", R4" sa jednakowe albo rózne, oznaczaja kazdorazowo atom wodoru, niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, al- kiloaminowa, dialkiloaminowa, przy czym dwa sa¬ siadujace podstawniki moga takze oznaczac dokon- densowany pierscien benzenowy, A i B maja wy¬ zej podane znaczenie, przy czym sole dwuazcniowe oraz estry uzywa sie w stezeniach 10^* mole/l do 10—1 mola/l, zwlaszcza 10—» mola/l do 10—2 mola/l roztworu impregnacyjnego — masy pokryciowej albo przeznaczonego do badania plynu i stosowane jako dodatkowe srodki pomocnicze srodki zwilza¬ jace, stabilizatory, aktywatory, srodki blonotwór- cze, galenowe substancje dodatkowe i/albo srodki wzmacniajace uzywa sie w ilosci 0—2% wagowych.131123 Ra R1 R3-V-NEN X RA R5 WZÓR WZÓR 2 R R2 O-A-B R4 R- WZOR 3 ?6 R7- P = O Rfl WZÓR 4 WZÓR 5 PL PL PL PL PL