DK172052B1

DK172052B1 - Antitumor-aktivt stof, fremgangsmåde til dets fremstilling, lægemiddel indeholdende stoffet, gen kodende for stoffet, vektor indeholdende genet samt rekombinant mikroorganisme transformet med en sådan vektor

Info

Publication number: DK172052B1
Application number: DK586685A
Authority: DK
Inventors: Kiyoshi Ishii; Yasuo Yanagihara; Yoshikatsu Hirai; Satoru Nakai; Mayumi Kaneta; Kazuyoshi Kawai; Yoshikazu Kikumoto; Yeong-Man Hong; Setsuko Takegata
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-17
Publication date: 1997-09-29
Also published as: DE3586050D1; EP0187991B1; DK586685A; KR930012106B1; EP0187991A2; US4898818A; DK586685D0; DE187991T1; EP0187991A3; KR860005022A

Description

DK 172052 B1

Opfindelsen angår et antitumor-aktivt stof benævt GIF. Opfindelsen angår endvidere et gen kodende for GIF, en GIF-genekspressionsvektor indeholdende genet, en rekombinant mikroorganisme transformeret med ekspres-5 sionsvektoren, en fremgangsmåde til fremstilling af GIF samt et farmakologisk præparat indeholdende GIF som aktivt middel.

Det er kendt, at der i det levende legeme er stoffer, der indvirker direkte på tumorceller, idet de ud-10 viser aktivitet i henseende til selektivt at hæmme væksten af sådanne celler og eliminere dem fra det levende legeme. Disse hidtil rapporterede antitumor-aktive stoffer omfatter for eksempel interferon (IFN), lymfotoxin (LT), tumor-necrotiserende faktor (TNF) osv., (Evans, 15 C.H., Cancer Immunol. Immunother, 1^2, 181 (1982)). Sådanne antitumor-aktive stoffer, der har aktivitet i henseende til af hæmme væksten af tumorceller, menes at være anvendelige som antitumormidler, og strukturerne af de gener, der svarer til dem, er under opklaring. Omfattende 20 forskning foregår vedrørende fremstilling af disse stoffer ved genteknik (Nature, bind 312, 20/27, side 721 (1984), samme, bind 312, 20/27, side 724 (1984), osv.).

Et formål for den foreliggende opfindelse har været at tilvejebringe et hidtil ukendt antitumor-aktivt 25 stof, der afviger fra de ovennævnte tidligere rapporterede antitumor-aktive stoffer i henseende til egenskaber, karakteristika, osv..

Det anføres i Rev. Infect. Dis., 6 (1984), 51-95, at aktiviteten af naturlige dræberceller (NK-celler) forøges 30 ved tilsætning af interleukin-1 (IL-1). Endvidere angives i Nature, 315 (1985) , 641-647, en aminosyresekvens for et humant interleukin-1/3.

Imidlertid har det overraskende vist sig, at en erstatning af Cys i nævnte sekvens med Ser medfører 35 en højere stabilitet i humant serumalbumin.

2 DK 172052 B1

Dette antitumor-aktive stof ifølge opfindelsen (i det følgende betegnet som "GIF") har aktivitet i henseende til at hæmme vækst af tumorceller (i det følgende betegnet som "GIF-aktivitet"), som påvist ved 5 metoden beskrevet nedenfor, og er ejendommeligt ved, at det som proteinbestanddel indeholder polypeptid A med følgende primærstruktur (formel 1) .

H Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cy$ Thr Leu Arg io Asp Ser Gin Gin Lys Ser Leu Val Met Ser G ly

Pro Tyr G lu Leu Lys Ala Leu His Leu Gin G ly

Gin Asp Met Glu Gin Gin Val Val Phe Ser Met

Ser Phe Val Gin G ly Glu Glu Ser Asn Asp Lys

Ile Pro Val Ala Leu G ly Leu Lys Glu Lys Asn is Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys

Pro Thr Leu Gin Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys

Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe

Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu

Glu Phe Glu Ser Ala Gin Phe Pro Asn Trp Tyr 20 Ile Ser Thr Ser Gin Ala Glu Asn Met Pro Val

Phe Leu G ly Gly Thr Lys Gly Gly Gin Asp Ile

Thr Asp Phe Thr Met Gin Phe Val Ser Ser OH.

Peptider? og aminosyrer: er her repræsenteret 25 ved symboler ifølge nomenklaturen for aminosyrer vedtaget af IUPAC eller ved symboler repræsenterende amino-syrerester og alment benyttet på området. Nucleinsyrerne i basesekvenser er tilsvarende repræsenteret.

Ved GIF ifølge opfindelsen er primærstrukturen af 30 dets protein fundamentalt set polypeptid I (med formlen (I)) anført nedenfor og med 153 aminosyrer i sekvens, mens den primære struktur af proteinet ved den N-terminale ende af polypeptid I kan have et ønsket peptid med 1 til 85 aminosyrer i sekvens eller en aminosyre 35 (Asp-), 3 DK 172052 B1

Som nedenfor beskrevet/ kan GIF ifølge opfindelsen isoleres fra immunologt kompetente celler fra pattedyr som et naturligt GIF. Genetisk analyse har vist/ at der findes en precursor for det naturlige GIF.

5 Aminosyresekvenserne for polypeptid A med formlen (1) er bestemt ved hjælp af resultatet fra den genetiske analyse.

GIF . ifølge opfindelsen vil blive beskrevet detaljeret nedenfor med henvisning til en fremgangsmåde 10 til dets fremstilling.

GIF ifølge opfindelsen stammer fra og fremstilles ved dyrkning af immunologt kompetente celler fra pattedyr. De immunologt kompetente celler, der skal anvendes, er ikke specifikt begrænsede, forudsat at de 15 stammer fra pattedyr. Anvendelige pattedyr er heller ikke begrænset og omfatter menneske, okse eller ko, svin, ged, hest, kanin, mus, osv. Typiske eksempler på immunologt kompetente celler er T-celler, B-celler, nul-celler, naturlige dræberceller og lignende lymphocyter, mononu-20 cleare celler, macrophager og lignende mononucleare celler, og celleliner af sådanne celler. Eksempler på lym-phocyter er dem, der er fjernet fra milt, mandler, lunge, blod, lymfekirtler eller lymfevæv fra ovennævnte pattedyr. Sådanne immunologt kompetente celler kan fraskilles 25 ved en sædvanlig metode, for eksempel ved at knuse et væv indeholdende de ønskede celler, frafiltrere uvedkommende materiale og indsamle cellerne ved centrifugering.

Den foreliggende forskning har vist, at GIF-akti-30 viteten ikke har nogen arts-specificitet uanset arten af immunologt kompetente celler, der er anvendt som startceller, eller arten af pattedyr, der leverer cellerne.

De udgangsceller, der skal anvendes til fremstilling af det omhandlede GIF, er derfor ikke begrænsede, og i den-35 ne henseende er opfindelsen fordelagtig til anvendelse på terapiområdet.

OK 172052 B1 4

De forskellige immunologt kompetente celler omtalt ovenfor inkuberes under anvendelse af dyrkningsmedier, der er almindeligt anvendt til dyrkning af sådanne celler, fortrinsvis i nærværelse af et antitumorstof-5 inducerende middel. Stoffet ifølge opfindelsen vindes i supernatanten fra dyrkningen. Eksempler på anvendelige dyrkningsmedier er CEM-medium, CMRL-1066-medium, DM-16O-medium, Eagle's MEM, autoklaverbart MEM, Fischer's medium, F-10- og F-12-medier, L-15-medium, NCTC-109-me-10 dium, RPMI-164O-medium og lignende. Disse medier anvendes alene, eller mediet kan, om ønsket, indeholde serum, såsom foetalt kvægserum (FCS), eller en serum-komponent, såsom albumin. Til inkubation anvendes immunologt kom- 4 petente celler fortrinsvis i en mængde på ca. 1x10 til η 15 ca. 1x10 celler/ml baseret på mediet.

Antitumorstof-inducerende midler, der kan inkorporeres i cellesuspensionen, er dem, der er almindeligt benyttede, såsom 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), phytohemagglutinin (PHA), concanavalin A (ConA), 20 bakterielt lipopolysaccharid (LPS), kermesbærplante-mitogen (PWM), protein A (ProteinA) og lignende. Disse midler anvendes sædvanligvis i en koncentration på 0,0001 til 0,1% (vægt/vol.% ligesom i det følgende), fortrinsvis ca. 0,001%. Inkubation kan foretages ved en sæd-25 vanlig metode, for eksempel ved at anvende CO -inkubator. Inkubation gennemføres ved ca. 30 til ca. 40 C, fortrinsvis ca. 37°C, i 1 til 5 dage. Efter inkubationen fraskilles kultur-supernatanten på sædvanlig måde, såsom ved centrifugering.

30 GIF ifølge opfindelsen kan fraskilles fra su- pernatanten i det væsentlige ved den samme metode, som er almindeligt anvendt til fraskillelse af et proteinlignende stof fra et sådant biologisk stof. For eksempel kan der anvendes forskellige fremgangsmåder, der gør 35 brug af det ønskede GIF's fysiske eller kemiske egenska- 5 DK 172052 B1 ber. (Se for eksempel "Biological Data Book II"/ side 1175-1259/ 1. udgave, 1. tryk, 23. juni, 1980, udgivet af Kabushiki Kaisha Tokyo Kagakudojin). Eksempler på anvendelige fremgangsmåder er behandling under anvendelse 5 af et sædvanligt protein-fældende middel, ultrafiltrering, molekularsigte-chromatografi (gel-filtrering), væskechromatografi, centrifugering, elektroforese, affi-nitets-chromatografi, dialyse og kombinationer af sådanne fremgangsmåder.

10 Ifølge en foretrukket fraskillelsesmetode bliver det ønskede GIF skilt fra supernatanten som partielt renset. Denne partielle rensning gennemføres for eksempel ved en behandling, hvor der som protein-fældende middel anvendes et organisk opløsningsmiddel, såsom ace-15 tone, methanol, ethanol, propanol eller dimethylformamid (DMF), eller et surt reagens, såsom eddikesyre, perchlor-syre (PCA) eller trichloreddikesyre (TCA), en behandling, hvor der anvendes et udsaltende middel, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat eller natriumphosphat, og/eller 20 ultrafiltrering, hvor der anvendes en dialysemembran, flad membran, hulfibermembran eller lignende. Disse behandlinger gennemføres på samme måde som sædvanligt og under sædvanlige betingelser.

Det således vundne groft rensede produkt under-25 kastes derefter gelfiltrering, hvorved der opsamles en fraktion, som udviser det ønskede stofs aktivitet. Anvendelige gelfiltreringsmidler er ikke specifikt begrænsede. Sådanne midler omfatter dem, der er lavet af dex-trangel, polyacrylamidgel, agarosegel, polyacrylamid-aga-30 rosegel, cellulose eller lignende. Eksempler på anvendelige midler, der er kommercielt tilgængelige, er Sepha-dex®G-type, Sephadex^H-type, Sepharose®type, Sephacry^ type (alle produkter fra Pharmacia), Cellofin (Chisso Corporation), Biogel P-type, Biogel A-type (begge pro-35 dukter fra LKB), TSK-G-type (produkt fra Toyo Soda Mfg.Co., Ltd.), osv.

6 DK 172052 B1

Gelfiltreringsmetoden giver en fraktion på 10.000 til 25.000 i molekylvægt og udvisende det omhandlede stofs aktivitet.

Stoffet ifølge opfindelsen kan isoleres fra frak-5 tionen som et homogent stof, for eksempel ved at underkaste fraktionen affinitets-chromatografi under anvendelse af en hydroxyapatit-søjle, ionbyttersøjlechromatogra-fi, såsom ved DEAE-metoden, en chromatofokuseringsmetode, omvendt-fase-HPLC eller lignende, eller en kombination 10 af sådanne metoder.

Chromatofokuseringsmetoden kan gennemføres på forskellige kendte måder. Som søjlen kan for eksempel anvendes PBE94 (Pharmacia) eller lignende, som startpuffer for eksempel imidazol-saltsyre eller lignende, og 15 som elueringsmiddel for eksempel en blanding af Poly-buffer 74 (Pharmacia) og saltsyre (pH 4,0) eller lignende .

Omvendt-fase-HPLC kan gennemføres for eksempel med Hi-Pore reverse-phase HPLC-søjle (Bio-Rad Labo-20 ratories) eller lignende, under anvendelse af acetoni-tril, trdfluoreddikesyre (TFA), vand eller lignende eller en blanding af sådanne opløsningsmidler som elue-ringsmiddel.

Det således vundne GIF er af den naturlige type 25 (dvs. modent GIF) indeholdende polypeptid I som proteinkomponent .

GIF ifølge opfindelsen kan også fremstilles ved genteknik under anvendelse af et gen, der koder for GIF, dvs. ved at indføre genet i en vektor fra 30 en mikroorganisme, efterfulgt af replikation, transkrip-tion og translation inden i mikroorganismeceller. Denne fremgangsmåde har den fordel at være egnet for produktion i stor mængde.

Det gen, der skal anvendes til fremstilling af 35 GIF ved genteknik, er ejendommeligt ved, at det koder for GIF . Den foreliggende opfindelse tilveje- 7 DK 172052 B1 (dvs. modent GIF) indeholdende polypeptid I som proteinkomponent .

bringer dette hidtil ukendte gen.

Selvom der typisk er tale om et gen, der koder 5 for polypeptid A, navnlig polypeptid I, er det anvendelige gen ikke begrænset hertil. Der kan anvendes ethvert gen, der koder for GIF ifølge opfindelsen, og som kan anvendes til ekspression og fremstilling af GIF. Forskellige kendte genetiske koder kan også anvendes.

10 Anvendelige gener omfatter dem, der er fremstil let ud fra messenger-RNA (i det følgende betegnet som "mRNA") adskilt fra humane lymfecellerækker, og som er karakteriseret ved, at DNA-kæden deraf har steder, hvor den skal kløves med restriktionsenzymer Mspl, Hindlll og 15 PvuII, og som er anbragt i denne rækkefølge.

Fremgangsmåden til fremstilling af det gen, der skal anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er ikke specifikt begrænset, men kan være enhver af de følgende fremgangsmåder. cDNA fremstillet for eksempel 20 ud fra mRNA vundet fra lymfecellerækker med evnen til at fremstille GIF, forbindes til en egnet vektor, såsom plasmid fra E.coli, og formeres i celler af en mikroorganisme for at isolere kloner, der er i stand til at eksprimere GIF, og cDNA fraskilles fra plasmiderne inde-25 holdt i de isolerede kloner. En anden tilgængelig metode er kemisk syntese, såsom phosphit-triestermetoden (Nature, 310, 105 (1984)) . Fremgangsmåden gennemføres baseret på den heri indeholdte information vedrørende GIF og dets gen. Disse metoder kan anvendes i kombination.

3C Ved de ovennævnte metoder kan den genetiske kode udvælges som ønsket på sædvanlig måde, idet man for eksempel betragter hyppigheden af codon-anvendelse i værten. Substitution af en del af aminosyresekvensen og ændring af aminosyresekvensen hos GIF-genet foregår pas-35 8 DK 172052 B1 sende på sædvanlig måde, for eksempel positionsspecifik mutagenese beskrevet i Proc. Natl. Acad. Sci., 81.

5662-5666 (1984) .

Fremgangsmåden til fremstilling af genet ud fra 5 mRNA vil blive beskrevet mere detaljeret nedenfor.

Egnede startceller til fremstilling af genet ifølge opfindelsen er immunologt kompetente celler stammende fra pattedyr og med evnen til at producere GIF (dvs. GIF-producerende celler). Eksempler på egnede celler er 10 allerede nævnt.

RNA indeholdende mRNA, der koder for GIF, ekstraheres fra GIF-producerende celler på sædvanlig måde. Forud for ekstraktion bliver de GIF-producerende celler sædvanligvis underkastet GIF-producerende betin-15 gelser, dvs. at cellerne inkuberes i et medium, der er almindeligt benyttet til inkubation af celler af denne type, fortrinsvis i nærværelse af et antitumor stof-inducerende middel. Egnet medium, mængde af celler i forhold til mediet, inducerende middel, mængde deraf, inkubations-20 metode, osv., kan bestemmes på basis af det allerede beskrevne. RNA ekstraheres fra de vundne celler omtrent på det tidspunkt, hvor GIF-aktivitet viser sig i kultur-supernatanten.

RNA ekstraheres ved partielt eller fuldstæn-25 digt at nedbryde og opløseliggøre cellerne under anvendelse af et egnet detergens, såsom SDS, NP-40, triton X100, deoxycholinsyre eller lignende, eller en homogeniserings-, fryse-tø-metode eller lignende fysiske metode, og derefter ituskære chromosom-DNA i en vis grad under 30 anvendelse af POLYTRON model CH-6010 (produkt fra Kine-matica, Schweitz), eller lignende blander eller sprøjtecylinder, hvorefter en nucleinsyrefraktion skilles fra protein. Almindeligt anvendt til denne proces er CsCl-metoden (Glisin, V. et al.. Biochemistry, 13^, 2633 35 (1974)) under brug af phenolchloroform-ekstraktion eller ultracentrifugering (Chirgwin, J.M. et al., Bioche- 9 DK 172052 B1 mistry, 18, 5294 (1979)).

For at hindre destruktion af RNA med RNase ved ovennævnte metode er det ønskeligt at tilsætte en RNase-inihibitor, såsom heparin, polyvinylsvovlsyre, diethyl-5 pyrocarbonat, vanadyl-ribonnucleosid-kompleks, bentonit,

Macalid eller lignende.

mRNA kan fraskilles fra den resulterende RNA-ekstrakt ved en portionsvis metode eller ved anvendelse af en adsorptionssøjle, såsom Oligo dT-Cellulose (Colla-10 borative Research Inc.), Poly U-Sepharose^Pharmacia), Sepharose^B (Pharmacia) eller lignende.

Det ønskede mRNA kan vindes ud fra det resulterende mRNA i en ren koncentreret form og identificeres, for eksempel ved udfældning af mRNA fra polysomet ved anven-15 delse af et antistof over for GIF. Alternativt kan tilstedeværelse af det ønskede mRNA bekræftes ved fraktionering af mRNA ved sucrose-vægtfyldegradientcentrifu-gering eller lignende, translation af fraktionen til protein ved injektion i Xenopus laevis-oocyt eller ved 20 anvendelse af celle-frit system, såsom kanin-reticulocyt-lysater eller hvedekimekstrakter og checkning af proteinet for GIF-aktivitet. Ifølge et andet alternativ kan det ønskede mRNA identificeres ved en immunologisk metode under anvendelse af et antistof over for GIF.

25 Det således vundne rene mRNA, der sædvanligvis er ustabilt, omdannes til stabilt komplementært DNA (cDNA) og forbindes til en replicon stammende fra en mikroorganisme for at muliggøre formering af det ønskede gen. Omdannelsen af mRNA til cDNA, dvs. syntese af cDNA, in 30 vitro kan i almindelighed gennemføres på følgende måde.

Først bliver der, under anvendelse af oligo dT som primer (der kan være frit oligo dT eller oligo dT allerede bundet til en vektor-primer) og under anvendelse af mRNA som skabelon, fremstillet et enkelt-strenget 35 cDNA komplementært med mRNA i nærværelse af dNTP (dATP, dGTP, dCTP eller dTTP) under anvendelse af én omvendt 10 DK 172052 B1 transcriptase. Det næste trin afviger som følger, alt efter om der til ovennævnte trin er anvendt frit oligo dT eller det andet oligo dT.

Når førstnævnte anvendes, dekomponeres det som 5 skabelon anvendte mRNA med et alkali eller lignende og fjernes, og dobbeltstrenget DNA fremstilles med en transcriptase eller DNA-polymerase under anvendelse af det enkeltstrengede DNA som skabelon. Dette efterfølges af behandling af begge ender af det dobbeltstrengede DNA 10 med exonuclease, påsætning af et egnet linker-DNA eller en kombination af baser, der kan "anneales" til hver ende, og inkorporering af det hele i en egnet vektor, såsom EK-type plasmidvektor (af den stringente type eller re-laxtypen) eller Xgt-phag-vektor.

15 Når sidstnævnte anvendes, kan der fremstilles et fuldstændigt plasmid-DNA ved at "anneale" et lineari-seret plasmid, hvortil der er bundet samme linker som ovenfor, og linker-DNA (der anvendes ofte et DNA-fragment, der har en region, som kan replikeres autonomt i 20 dyreceller, og en transkription-promotor-region for mRNA) til dannelse af cirklen, samtidigt med at skabelon-mRNA får lov til at forblive, og erstatte dette n®NA med DNA-streng i nærværelse af dTNP, RNase og DNA-polymerase.

Det således vundne DNA indføres i en værtmikroor-25 ganisme for vektoren med henblik på transformation.

Anvendelig værtmikroorganisme er typisk E.coli, men andre kan anvendes. Der kan også anvendes Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, osv.

DNA'et kan ved en almindeligt anvendt metode ind-30 føres i værten med henblik på transformation. For eksempel indsamles celler hovedsageligt i den logaritmiske vækstfase og behandles med CaC^ for at gøre dem rede til at acceptere DNA spontant. For at gennemføre transformation med forbedret effektivitet kan denne metode prakti-35 seres yderligere i nærværelse af MgClg eller RbCl, som almindeligt kendt. Det er også muligt at omdanne cellen 11 DK 172052 B1 til en spheroplast eller protoplast forud for transformation .

Stammen indeholdende DNA for det ønskede GIF kan udvælges fra de således vundne transformanter ved for 5 eksempel nedennævnte metoder.

(1) Screening-metode under anvendelse af en syntetiseret oligonucleotid-sonde.

Når aminosyresekvensen af det ønskede protein er kendt helt eller delvis (enhver region af det ønskede 10 protein, forudsat at sekvensen er en specifik række af aminosyrer), fremstilles et oligonucleotid svarende til aminosyrerne (i dette tilfælde enten af basesekvensen udledt med hjælp af codon-brugsfrekvens, eller flere kombinationer af mulige basesekvenser; i sidstnævnte til-15 fælde kan kombinationsantallet reduceres ved inkorporering af inosin). Det oligonucleotid, der tjener som son-32 35 de (mærket med P eller S), hybridiseres med et nitro-cellulosefilter, hvortil DNA'erne fra transformanter er fikseret efter denaturering, og den resulterende positi-20 ve stamme genfindes til udvælgelse.

(2) Screening-metode, hvor GIF produceres i dyreceller.

Denne metode indebærer, at transformanten inkuberes med henblik på formering af genet, genet transfice-res i dyreceller (dvs. plasmider, der kan replikeres au-25 tonomt og indeholder mRNA-transkription-promotor-region, eller plasmider, der vil integrere i dyrecellers chromo-som) for at bringe cellerne til at producere det i genet indkodede protein,og kultur-supernatanten eller ekstrakten fra de inkuberede celler checkes for GIF-akti-30 vitet, eller GIF derfra påvises ved anvendelse af et antistof over for GIF Ved at gentage denne metode for de originale transformanter kan der identificeres en stamme, der har cDNA som koder for det ønskede GIF.

(3) Metode til udvælgelse af induktions-specifik trans-35 formant.

12 DK 172052 B1

Som allerede beskrevet, induceres produktion af GIF af et antitumorstof-inducerende middel, såsom LPS, TPA eller lignende.

En induktions-specifik stamme udvælges ved som 5 kolonihybridiserings-prober at anvende mRNA fra en stamme, hvori intet GIF induceres (induktion minus), og formeret mRNA, der inducerer GIF ved anvendelse af midlet (induktion plus) og koder for GIF (mRNA kan erstattes med cDNA fremstillet der ud fra). Disse mRNA hybridi-10 seres for at bestemme den stærkeste af de to til udvælgelse af den induktions-specifikke stamme (plus-minus-metode).

Endvidere hybridiseres induktions-minus mRNA (eller cDNA fremstillet der ud fra) og cDNA fremstillet ud 15 fra induktions-plus mRNA (eller mRNA per se), og koloni-hybridisering gennemføres derefter under anvendelse af det ikke-hybridiserede mRNA (eller cDNA) som probe for at udvælge en induktions-specifik stamme (selektiv hy-bridiseringsmetode).

20 Den ønskede stamme kan udvælges med reference til cDNA eller mRNA.

(4) Metode til udvælgelse ved anvendelse af antistof over for GIF.

cDNA inkorporeres i en vektor, der er i stand til 25 at eksprimere protein i transformanten, transformanterne bringes til at producere protein deri, og den GIF-produ-cerende stamme påvises ved anvendelse af et antistof over for GIF og et andet antistof over for antistoffet.

(5) Metode ved anvendelse af selektivt hybridiserings- 30 translations-system.

cDNA vundet fra transformanten udplattes på et nitrocellulosefilter eller lignende, mRNA fra GIF-produ-cerende celler hybridiseres dermed, og mRNA svarende til cDNA indsamles, og translateres derefter til protein yed 35 anvendelse af et protein-translationssystem, for eksem- 13 DK 172052 B1 pel ved injektion i Xenopus laevis-oocyter eller anvendelse af et cellefrit system, såsom kanin-reticulocyt-lysater eller hvedekimekstrakter. Proteinet checkes derefter for GIF-aktivitet, eller det pågældende protein 5 påvises ved anvendelse af et antistof over for GIF, hvorved den ønskede stamme kan identificeres.

Det for GIF kodende DNA kan indsamles fra den ønskede transformant ved en kendt metode, for eksempel ved at fraskille en fraktion svarende til plasmid-DNA 10 fra cellerne og udskære cDNA-regionen fra plasmid-DNA

Nucleotid-sekvensen for cDNA for GIF kan bestemmes for eksempel ved den kemiske modifikationsmetode ifølge Maxam og Gilbert (Meth.Enzym. 6_5, 499-560 (1980)) og dideoxynucleotid-kædeterminationsmetoden under anven-15 delse af Ml3-phag (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 19, 269-276 (1982)).

En af de således vundne transformanter er E.coli 1776-transformant husende plasmid pGIF-α, der indehol- Λ der cDNA for GIF. Denne transformant, betegnet Escheri-20 chia coli 1776/pGIF-a, er deponeret med deponeringsnum- Λ meret FERM BP-948 i Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, siden 12. December 1985. GIF-genet kan følgelig fremstilles let og fordelagtigt ved anvendelse af denne transformant.

25 En stor mængde GIF kan vindes ved genmanipula tionsteknik under anvendelse af genet, der koder for GIF. Teknikken tilvejebringer et rekombinant DNA, der kan eks-primere genet i værtcellen ved en konventionel metode. Rekombinant-DNA kan let fremstilles baseret på den 30 genetiske information vedrørende GIF omtalt heri. De specifikke fremgangsmåder til fremstilling vil, skønt allerede delvis beskrevet, blive beskrevet mere detaljeret nedenfor.

Anvendelige værtceller kan enten være eukaryotiske 35 eller prokaryotiske celler. De eukaryotiske celler omfatter celler fra hvirveldyr, gærarter, osv. Almindeligt anvendt 1 4 DK 172052 B1 som celler fra hvirveldyr er for eksempel Cos-celler, der er celler fra abe (Y. Gluzman, Cell, 23_, 175-182 (1981)), dihydrofolinsyrereduktase-manglende stamme af kinesisk hamster-ovariecelle (G. Urlaub og L.A. Chasin, Proc.

5 Natl.Acad.Sci., U.S.A., 77_, 4216-4220 (1980)), osv., men anvendelige celler er ikke begrænset til disse celler. Anvendelige ekspressionsvektorer fra hvirveldyrceller er dem, der har en promotor anbragt opstrøms for det gen, der skal eksprimeres, RNA-splejsningssteder, 10 polyadenyleringssted, transkriptions-terminations-se-kvens, osv. Disse vektorer kan yderligere have en duplikations-kilde, om ønsket. Eksempler på egnede ekspressionsvektorer omfatter pSV2dhfr med en indledende promotor for SV40 (S. Sabramani, R. Mulligan og P. Berg, 15 Mol. Cell. Biol., 1, 854-864), der imidlertid ikke er begrænsende.

Gærarter finder vid anvendelse som eukaryotiske mikroorganismer, og blandt disse er dem fra slægten Saccharomyces almindeligvis anvendelige. Eksempler på 20 populære ekspressionsvektorer fra gærarter og lignende eukaryotiske mikroorganismer omfatter pAM82 med en promotor for syrephosphatase-gen (A. Miyanohara et al.,

Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 130, 1-5 (1983)), osv.

E.coli og Bacillus subtilis er almindeligt an-25 vendt som prokaryotiske værter. Den foreliggende opfindelse benytter for eksempel plasmidvektorer, der er i stand til duplikation i værten. Til at eksprimere GIF-genet i vektoren kan der anvendes ekspressionsplasmider, der har en promotor og SD(Shine-Dalgarno)-basesekvens 30 opstrøms for GIF-genet og ATG, der kræves til initiering af proteinsyntese. Vidt anvendt som vært-E.coli er E.coli K12-stamme. pBR322 er en vektor, der er almindeligt anvendt. Disse er imidlertid ikke begrænsende, og forskellige kendte stammer og vektorer kan anvendes.

35 Eksempler på promotorer, der kan anvendes, er trypto-phan-promotor, PL~promotor, lac-promotor, Ipp-promotor, 15 DK 172052 B1 osv.. GIF-genet kan eksprimeres under anvendelse af enhver af disse promotorer.

Til beskrivelse af fremgangsmåden gældende for det tilfælde, hvor der anvendes tryptophan-promotor, an-5 vendes der som ekspressionsvektor vektor pTMl (Fumio Imamato, Metabolism, bind 22, 289 (1985)) med tryptophan-promotor og SD-sekvens. Et gen, der koder for GIF og har ATG, om nødvendigt, forbindes til stedet for restriktionsenzym Clal, der findes nedstrøms fra SD-sekvensen.

10 Angivet mere specifikt bliver, til fremstilling af for eksempel polypeptid I ved denne metode, plasmid pGIF-α, anført i nedenstående eksempel og med cDNA for GIF, kløvet med restriktionsenzymer Accl og Mspl til opnåelse af et isoleret DNA-fragment med en større del af det gen, 15 der koder for polypeptid I, og en del af 3'-ikke-trans-lations-region. Dette DNA-fragment mangler den gen-region, der koder for ti aminosyrerester mod amino-termi-nalen af polypeptid I. Ved ovennævnte fremgangsmåde bliver der derfor derefter fremstillet en syntetisk DNA-20 linker, der kan forbindes til stedet for restriktionsenzym Clal i ekspressionsvektor pTMl, der har tryptophan-promotor, har translations-startcodon ATG og er i stand til at kode for de ti aminosyrerester ved den amino-ter-minale ende af polypeptid I. Ved anvendelse af linkeren 25 bliver genet for polypeptid I indført nedstrøms fra tryptophan-promotoren til fremstilling af et ekspres-sionsplasmid. Ved transformation indføres plasmidet i E.coli, der er gjort rede for DNA-modtagelse ved behandling med CaClj. Den Ønskede transformant inkuberes ved 30 en sædvanlig metode til opnåelse af polypeptid I. Inkubationen af transformanten gennemføres i almindelighed under anvendelse af M9 minimum-medium, hvori er inkorporeret casaminosyre for at sikre virkningen af tryptophan-promotor. Det er også muligt på et passende tids-35 punkt under inkubationen til mediet at sætte et kemikalium, såsom indolacrylsyre, for at intensivere virk- .

, ningen af tryptophan-promotoren. En stor mængde polypep- i 16 DK 172052 B1 tid I fremstilles og akkumuleres i således inkuberet E.coli.

De andre fremgangsmåder ifølge opfindelsen end den ovennævnte til fremstilling af GIF kan praktiseres 5 tilsvarende.

Det GIF, der er produceret inden i eller uden for cellerne af den ønskede rekombinante mikroorganisme, kan fraskilles på sædvanlig måde og isoleres og renses yderligere ved forskellige metoder under anvendelse af fy-10 siske eller kemiske egenskaber hos GIF, som allerede ovenfor eksemplificeret.

Det ved den foreliggende fremgangsmåde vundne GIF er anvendeligt, som det er, som et antitumor-middel til mennesker og andre dyr på grund af dets GIF-aktivitet 15 og virkning i henseende til specifikt at hæmme væksten af forskellige tumorceller. Det er med fordel anvendeligt til kemoterapi af cancere, navnlig til remissionsintensiverende terapi og remissions-bevarende terapi i kombination med forskellige lægemidler til behandling af 20 ondartede tumorer. GIF er på grund af dets meget lave toxicitet fordelagtigt til ovennævnte anvendelse.

Til anvendelse som antitumor-middel indarbejdes GIF i farmakologiske præparater indeholdende en effektiv mængde af GIF og en sædvanlig ikke-toxisk bærer.

25 .Præparatet indgivesad en vej, der er egnet for dettes form. Sådanne præparater foreligger for eksempel i form af sædvanlige flydende præparater omfattende opløsning, suspension, emulsion og lignende, der sædvanligvis gives oralt, intravenøst, subcutant eller 30 intramuskulært. Præparatet kan også foreligge som et tørt præparat, der kan rekonstitueres som en brugsvæske ved tilsætning af en egnet sædvanlig bærer. Selvom præparatmængden, der skal gives, er forskellig alt efter patientens alder og køn, sygdomsgraden, osv., gives 35 præparatet fortrinsvis i en dosis på ca. 0,1 til ca.

100 mg/kg/dag, beregnet som protein, hvilken dosis kan opdeles.

17 DK 172052 B1

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler.

GIF-aktiviteten blev bestemt ved følgende metode. Bestemmelse af GIF-aktivitet 5 Portioner (0/1 ml) af test-opløsningen fortyndet til forskellige koncentrationer blev anbragt i rummene af en 96-rums-mikroplade (Corning Co., Ltd.), 0,1 ml Eagle's MEM-suspension indeholdende 10% FCS indeholdende 4 humane melonoma-celler A375 i en mængde på 2x10 cel-10 ler/ml blev derefter anbragt i hvert rum, og cellerne blev inkuberet i en CC^-inkubator (Napco Co., Ltd.) i 4 dage. Efter inkubationen blev 0,05 ml 0,05% Neutral Red (Wako Junyaku Co., Ltd.) anbragt i hvert rum efterfulgt af inkubation ved 37°C i 2 timer. Efter fjernelse af 15 supernatanten blev 0,3 ml phosphorsyrepuffer-saltopløsning forsigtigt hældt i hvert rum til vask. Efter fjernelse af vasken blev 0,1 ml af en blanding af natrium-dihydrophosphat og ethanol i lige mængder anbragt i hvert rum, pladen blev rystet i flere minutter med en 20 mikromixer, og mængden af pigment optaget i cellen mål-r tes ved en absorptionsevne for 540 πιμ under anvendelse af et fotometer for 96-rums-mikrotiterplader (Ti ter check multiscane, Flow Lab.) for at bestemme væksthæmningsaktivitet. Den testgruppe, der udviste 50% af 25 kontrolgruppens cellevækst-hæmning, dvs. den testgruppe, der udviste 1/2 af den absorptionsevne, der måltes for kontrolgruppen, blev identificeret. Den reciprokke værdi af antallet af fortyndingsgange for testgruppen blev taget som GIF-aktivitetsenheden. Når GIF-aktiviteten for 30 eksempel er 10 enheder, har testopløsningen følgelig, ved 10 ganges fortynding, stadig aktivitet til at hæmme cellevækst 50%.

Eksempel 1 (I) Fremstilling af naturlig type GIF.

35 Humane perifert-blod-lymfocyter blev suspenderet DK 172052 B1 1 8 i RPMI-1640 indeholdende 2% FCS for at fremstille en g cellesuspension indeholdende 1x10 celler/ml.

PHA-P (snittebønnelectin, produkt fra Difco), der tjener som antitumorstof-inducerende middel, blev sat 5 til suspensionen i en koncentration på 0,2% efterfulgt af inkubation i en CC^-inkubator (NAPCO5300, Napco Co.,

Ltd.) ved 37°C i 3 dage. Kulturen blev centrifugeret (2000 g x 10 min.) til opnåelse af en supernatant, der derefter anvendtes som start-væske.

10 Startvæsken blev fraktioneret ved ammoniumsulfat- fældningsmetoden (Nippon Seikagakukai edited, "Seikagaku Jikken Koza", bind 1. Tokyo Kagakudojin).

Et bundfald med GIF-aktivitet fandtes i fraktioner med en ammoniumsulfatkoncentration på 50-80%.

15 Bundfaldet blev underkastet AcA54 (LKB)-gel-chro- matografi (80 cm x 4,4 cm (diam.), mobil fase: phosphat-puffer-saltopløsning indeholdende 0,02% polyethylengly-col (mol. vægt 6000), strømningshastighed 30 ml/time), hvorved vandtes en fraktion med en molekylvægt på 20 10.000 til 25.000, der havde GIF-aktivitet. Denne frak tion udviste ingen TNF-, IFN- eller CSF-aktivitet.

Fig. 1 viser resultaterne fra gelchromatografi.

I diagrammet er fraktionsnummeret anført som abscisse versus de fysiologiske aktiviteter, og absorptionsevnen 25 med OD2qq som ordinat, yderligere viser diagrammet molekylvægten svarende til hver fraktion sammen med en pil.

I diagrammet er SCF-aktiviteten repræsenteret ved kurve (1), IFN-aktivitet ved kurve (2), IL-2-aktivitet ved kurve (3), GIF-aktivitet ifølge opfindelsen ved kurve 30 (4), BCDF-aktivitet ved kurve (5), TNF-aktivitet ved kurve (6) og absorptionsevne ved kurve (7).

Bestemmelse af aktivitet

Fysiologiske aktiviteter blev bestemt ved følgende metoder: 35 19 DK 172052 B1

* GIF

Ved den ovennævnte metode.

* TNF

Ved metoden ifølge A. Khan et al. (Human Lympho-5 kines, Academic Press, side 23-32, (1982)) under anvendelse af L929-cellestamme.

* IFN

Ved metoden ifølge Sudo et al (Tetsuo Sudo, Reiko Ohkubo, Masahiko Iizuka og Shigeyasu Kobayashi, 42nd 10 Virus Yokusei Inshi Kenkyukai, 1982; Kohase, M., S. Kohno og S. Yamazaki (1982), Potency standardization of human IFN preparation for clinical trials. In the clinical potential for interferons, edt. by Kohno, side 299, Tokyo University press.) under anvendelse af et system 15 indeholdende humane amino-afledte FL-celler og Sindbis virus.

* CSF (koloni-stimulerende faktor)

Ved metoden ifølge J.J. Farrar et al (J. Immunol., 127, 1983 (1981)) under anvendelse af myeloide celler 20 fra BALB/c mus.

* LAF (lymphocyt-aktiveringsfaktor)

Ved metoden ifølge J.J. Oppenheim et al. (J. Immunol., 116, 1466 (1976)) under anvendelse af thymo-cyter fra C3H/HeJ mus.

25 * IL-2 (interleukin-2)

Ved metoden ifølge S. Gillis og K.A. Smith (J. Immunol., 120, 2027 (1978)) under anvendelse af IL-2-afhængige muse-T-celler (CTLL2).

* BCDF (B-celle-differentieringsfaktor) 30 Ved metoden ifølge Kishimoto et al. (J. Immunol., 127, 412 (1981)) under anvendelse af CESS-cellestamme.

Derefter blev den ovennævnte fraktion chromato-fokuseret under anvendelse af PBE94-gel (Pharmacia).

Nærmere angivet blev den ovennævnte fraktion fraktione-35 ret under anvendelse af 0,025M imidazol-saltsyre (pH 4) som startpuffer og Polybuffer 74-saltsyre (pH 4) som 20 DK 172052 B1 elueringsmiddel. Når de resulterende fraktioner blev checket for GIF-aktivitet, fandtes denne aktivitet at være til stede i regionen for isoelektriske punkter (PI) fra 6,4 til 6,6.

5 Fig. 2 viser resultaterne fra chromatofokusering.

I diagrammet er fraktionsnummeret afsat som abscisse.

Som ordinat er afsat absorptionsevnen med 0°28o (rePræ“ senteret ved kurve (1)), BCDF-aktivitet (kurve (2)), GIF-aktivitet ifølge opfindelsen (kurve (3)) og pH 10 (kurve (4)).

Den GIF-aktive fraktion blev yderligere underkastet omvendt-fase-HPLC (C^ Highpore reverse-phase column (RP304), produkt fra Bio-Rad, 250 mm x 4,6 mm (diam.), mobil fase: A-væske = 0,1% TFA og B-væske = 0,1% TFA + 15 70% acetonitril, koncentrationsgradient: ændring fra 100% A-væske til 100% B-væske over en periode på 80 minutter, strømningshastighed: 1 ml/min.), hvorved vandtes en fraktion på 44 - 3% acetonitril. Denne fraktion udviste ingen IL-2-aktivitet. GIF-aktivitet stemte ikke overens 20 med LAF-aktivitet.

Fig. 3 viser resultaterne fra den chromatogra-fiske analyse. I diagrammet er retentionstiden afsat som abscisse. Som ordinat er afsat acetonitril-koncentration repræsenteret ved kurve (1), absorptionsevne for protein 25 (OD 280) ved 280 run repræsenteret ved kurve (2), GIF-aktivitet ifølge opfindelsen repræsenteret ved kurve (3), LAF-aktivitet repræsenteret ved kurve (4) og IL-2-aktivi-tet repræsenteret ved kurve (5).

Den naturlige type GIF ifølge opfindelsen var så-^ ledes isoleret.

(II) Fremstilling af naturlig type GIF.

Humane perifert-blod-lymphocyter blev sat til RPMI-1640-medium indeholdende 1% FCS, 0,1 yg/ml indome-thacin, 20mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N1-2-ethansulfon-^ syre (HEPES) og 10 yg/ml LPS (Difco) til fremstilling af g en cellesuspension med en koncentration på 1 x 10 cel-ler/ml.

21 DK 172052 B1

Suspensionen blev inkuberet i en CC^-inkubator (NAPCO 5300, Napco Co., Ltd.) ved 37°C i 20 til 24 timer, kulturen blev centrifugeret (10000 rpm x 30 minutter) , hvorved vandtes 24300 ml supernatant, og superna-5 tanten blev koncentreret til 10 gange koncentrationen under anvendelse af pericon-membran (molekylvægt-afskæring 10000, produkt fra Millipore). Det vundne koncentrat vil i det følgende blive omtalt som "startvæske".

Startvæsken blev fraktioneret ved ammoniumsulfat-10 fældningsmetoden som under fremgangsmåde (I) med isafkøling. Fraktioner med en ammoniumsulfatkoncentration på 50 til 80% fandtes at indeholde et GIF-aktivt bundfald. Bundfaldet blev opløst i saltopløsning og derefter dialyseret med saltopløsning.

15 Den resulterende ammoniumsulfatfraktion blev op delt i fire portioner, og hver portion blev underkastet gelchromatografi ved 4°C under anvendelse af Ultragel AcA54 (LKB) under følgende betingelser.

Søjle : 88 cm x 4,4 cm (diam.) 20 Elueringsmiddel: phosphatpuffer-saltopløsning (PBS) indeholdende 0,02% polyethylenglycol (mol.vægt 6000) og 0,02% NaN^ Strømningshastighed: 30 ml/time Fraktionsvolumen: 15 ml/30 min./rør 25 Med hver portion havde fraktioner (nr. 57 til nr.

65) med en molekylvægt på ca. 10.000 til 25.000 GIF-akti-vitet, og de aktive fraktioner blev indsamlet.

Den kombinerede fraktion blev derefter koncentreret med isafkøling under anvendelse af YM-5-membran 30 (Amicon) og under anvendelse af 50mM natriumacetat (pH

5,5) som opløsningsmiddel. Koncentratet blev filtreret med Milex GV (0,22 jjm, produkt fra Millipore).

Den vundne koncentratprøve blev opdelt i to portioner, og hver portion blev underkastet ionbytter-chro-35 matografi (CM-HPLC) ved anvendelse af Gilson-HPLC-system 22 DK 172052 B1 under følgende betingelser: Søjle: IEX-535CM (6,0 x 150 mm, Toyo Soda

Mfg. Co., Ltd.)

Elueringsmiddel A: 50mM natriumacetat (pH 5,5) 5 Elueringsmiddel B: 50mM natriumacetat (pH 5,5) inde holdende 0,5M NaCl Strømningshastighed: 0,5 ml/min.

Fraktionsvolumen: Retentionstid: 0-60 min.....2 ml/4 min/rør 10 60-120 min...0,5 ml/min/rør

120-180 min..2 ml/4 min/rør Koncentrationsgradient: tid (min) % B

0 0 40 0 15 120 20 140 100 165 100 170 0 CM-HPLC-metoden resulterede i en GIF-aktiv frak-20 tion med en retentionstid på 90 til 91 minutter.

Den aktive fraktion (nr. 45) blev derefter underkastet omvendt-fase-HPLC under følgende betingelser: Søjle: Highpore reverse-phase column (RP304, Bio-Rad, 250 mm x 4,6 mm 25 (diam.)

Elueringsmidler: A-væske=0,l% TFA

B-væske=acetonitril-l% TFA (9:1) Strømningshastighed: 1 ml/min.

Diagramhastighed: Retentionstid: 30 0-50 min.....5 min/cm 50-80 min....2 min/cm

Koncentrationsgradient: tid (min) % B

0 0 5 0 35 15 20 (fortsættes).

23 DK 172052 B1

tid (min) % B

75 45 80 100 85 100 90 0 5 Fraktionsvolumen: 2 ml/2 min/rør

Fig. 4 viser resultaterne fra chromatografien. I diagrammet er retentionstiden (min.) afsat som abscisse, og som ordinat er afsat GIF-aktiviteten (kurve 1), proteinabsorptionsevne (A280' kurve 2) ved 280 nm og kon-10 centrationsgradient (%B, kurve 3) for eluatet.

En fraktion med en retentionstid på 63,9 til 65,3 minutter udviste en enkelt proteinabsorptionsevnespids overensstemmende med den for GIF.

Den specifikke aktivitet var 2,1 x 10^ enheder/mg 15 protein.

SDS polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)

Det ved fremgangsmåden (II) vundne GIF blev underkastet DSD-PAGE ved metoden ifølge Laemmli, U.K. (Nature, 277, 680 (1970)) under følgende betingelser.

20 Prøve: En 10 yl portion af den GIF-aktive fraktion blev tørret fuldstændigt, derefter opløst i Laemmli-prøvepuffer (indeholdende 2-mercapto-ethanol i en mængde på 1/20 af puffervolu-minet) og behandlet ved 100°C i 4 minutter.

25 Gel: 15% Polyacrylamidgel 0,75 mm i tykkelse

Apparat: PROTEAN, produkt fra Bio-Rad

Elektro- forese: 20 mA konstant strøm i 2 timer.

Den fra elektroforesen resulterende gel blev far-30 vet med Silver Stain Kit (Bio-Rad) med de i Fig. 5 viste resultater.

Idet der henvises til Fig. 5 resulterede bane (1) fra de følgende molekylvægtmarkører, bane (2) fra GIF-prøven, og bane (3) fra 10 yl af 0,1% TFA anvendt i 35 stedet for den GIF-aktive fraktion og behandlet på samme måde som prøven.

24 DK 172052 B1

Molekylvægtmarkører for bane (1): 94K : Phosphorylase b 67K : Albumin 43K : Ovalbumin 5 3OK : Kulsyreanhydrase 20,1K : Trypsin-inhibitor 14,4K : a-Lactalbumin

Fig. 5 viser, at GIF er elektroforeseret som et enkelt bånd ved en molekylvægt på ca. 18K.

10 Isoeletrofokusering (IEF)

Det ved fremgangsmåden (II) vundne GIF blev underkastet IEF under anvendelse af amphorin PAG-plade (LKB) 3,5 til 9,5 i pH-område og Model 1415 (Bio-Rad) under følgende betingelser.

15 Prøve: En 10 yl portion af den GIF-aktive fraktion fortyndet fem gange med 25mM natriumphosphatpuffer (pH 7,4). Elektrodeopløsninger: Anodeopløsning = 1M H^PO^

Katodeopløsning = 1M NaOH

20 Elektroforese: Med konstant effekt på lW/cm gel bredde med afkøling (10°C) i 90 minutter

Farvning: Med Silver Stain Kit

Fig. 6 viser resultaterne fra elektroforesen. Med 25 henvisning til tegningen stammede baner (1) og (4) fra 20 pi af molekylvægtmarkør, bane (2) fra 50 μΐ af GIF-prøven, og bane (3) fra 50 μ1 af en fortynding fremstillet ud fra 10 μΐ af 0,1% TFA på samme måde som prøven med brug af pufferen.

30 Gelen resulterende fra elektroforesen blev op skåret med mallemram på 5 mm eller 2 mm, underkastet ekstraktion ved anvendelse af 1 ml 10% FCS-holdig RPMI 1640 under rystning (i to dage) og derefter checket for GIF-aktivitet. Det isoelektriske punkt blev beregnet ud fra 35 pH-målingen efter elektroforesen.

DK 172052 Bl 25

Fig. 7 viser resultaterne. Med henvisning til Fig.

7 er gelopskæringsnummeret afsat som abscisse versus pH-gradienten (vist ved brudt linie) og GIF-aktivitet (fuld linie) som ordinat.

5 Fig. 6 og 7 viser, at GIF har et isoelektrisk punkt (PI) på 7,02 til 6,88 og viser sig som et enkelt bånd ved denne position.

Aminosyre-sammensætningsforhold

Det ved fremgangsmåden (II) vundne GIF blev hydro-10 lyseret (med 4N methansulfonsyre i 24 timer) og derefter analyseret ved o-phthalaldehyd(OPA)-metoden under anvendelse af et aminosyreanalyseapparat (Hitachi Ltd.).

Analysen viste, at GIF indeholder de følgende aminosyrer i det nedenfor, på basis af Phe, anførte mol-15 forhold.

Under de ovennævnte analysebetingelser kan Pro og Cys ikke bestemmes. Det er endvidere kendt, at Ser og Thr i almindelighed dekomponerer ca. 5 til ca. 10% under de ovennævnte betingelser.

20 Aminosyre Mol-forhold

Asp og/eller Asn 17,6

Ser 12,1

Thr 5,7

Glu og/eller Gin 23,1 25 Gly 8,1

Ala 5,2

Val 11,8

Met 5,6

Ile 4,8 30 Leu 15,4

Tyr 3,9

Phe (g) i*ys 15,3

His 1,1 35 Trp 0,8

Arg 3,0 26 DK 172052 B1

Aminosyresekvens

Den N-terminale aminosyresekvens for det ved fremgangsmåden (II) vundne GIF blev bestemt med en gasfase-sekvensbestemmer (Applied Bio System).

5 GIF'et viste sig at have følgende sekvens på 20 aminosyrer ved N-terminalen.

Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn -10 Cys “ Thr - Leu - Arg - Asp - Ser - Gin -

Gin - Lys - Ser - Leu - Val - Met 15 Den ottende aminosyre fra N-terminalen blev vur deret at være Cys, da den ikke blev påvist som PTH-ami-nosyre.

Fysiologisk aktivitet

Det ved fremgangsmåden (II) vundne GIF blev tes-20 tet for fysiologiske aktiviteter med det resultat, at der ikke fandtes nogen af aktiviteterne TNF, INF, CSF, IL-2 og BCDF. Dette viser, at GIF afviger tydeligt fra stoffer med sådanne fysiologiske aktiviteter. GIF fandtes også at være meget homogent.

25 Affinitetsteste for lectln-søjler

For at checke de ved fremgangsmåderne (I) og (II) vundne GIF’er for sukkerkæde-specificitet blev egenskaberne af disse stoffer i henseende til at binde til lectinsøjler bestemt ved affinitetschromatografi under 30 anvendelse af de nedennævnte lectiner under følgende betingelser.

Prøve: 3624 enheder/0,06 mg/0,5 ml

Gelvolumen: 1 ml

Vaskeopløsning: PBS -0,005% PEG (eller 0,05M Tris-0,15M

35 NaCl, pH 8,7 for SJA) 27 DK 172052 B1

Elueringsmiddel: Opløsning af sukkeret ifølge Tabel I i vaskeopløsningen.

Tabel I nedenfor viser resultaterne. Lectinerne blev leveret af E.Y. Laboratories.

5

Tabel I

Lectin

ConA Concanavalin A

WGA Hvedekim-agglutinin 10 UEA - I Ulex europeus-agglutinin DBA Dolichos biflorus-agglutinin WFA Wistaria floribunda-agglutinin PNA Jordnød-agglutinin SBA Sojabønne-agglutinin 15 SJA Sophora japonica-agglutinin

Lectin Elueringsmiddel_

ConA 0,1M a-Methylmannopyranosid WGA 0,2M N-Acetylglucosamin 20 UEA - I 0,5M Fucose DBA 0,1M N-acetylgalactosamin WFA Samme PNA 0,2M Galactose SBA Samme 25 SJA Samme

Lectin Sukker observeret_

ConA α-Man > a-Glc WGA GlcNAc 31-4GlcNAc 30 EUA - I Samme DBA a-GalNAc WFA Samme PNA 3-Gal SBA α-GalNAc > 3-GalNAc 35 SJA β-GalNAc > B-Gal 28 DK 172052 B1

De resultater, der blev opnået med GIF vundet ved fremgangsmåden (I), er vist i Fig. 8. Afsat som ordinat i diagrammet er aktivitetsmængden indeholdt i den fraktion (W) , der passerede gennem hver lectinsøjle uden at 5 blive adsorberet deraf, og aktivitetsmængden indeholdt i fraktionen (E) adsorberet af søjlen og fjernet ved opløsning med elueringsmidlet, hvorhos aktivitetsmængderne er i forhold baseret på GIF-aktiviteten af den prøve, der er sat som 100%. Fraktionerne (W og E) fra søjlerne 10 er afsat som abscisse.

Fig. 8 viser, at GIF'et ikke har nogen affinitet for nogen af lectinerne. Dette viser, at disse almene sukkerkæder ikke bindes til GIF'et.

Det ved fremgangsmåden (II) vundne GIF viste sam-15 me resultater, som vist i Fig. 8.

Stabilitet

De ved fremgangsmåderne (I) og (II) vundne GIF'er blev testet for stabiliteter, som nedenfor beskrevet. De to stoffer var ensartede med hensyn til de opnåede re-20 sultater.

a. Temperaturstabilitet.

GIF'et blev behandlet under de i Tabel II anførte betingelser og checket for temperaturstabilitet. Gelfiltreringsfraktionen (3503 enheder/ml) blev inkuberet ved 25 den anførte temperatur og derefter checket for resterende aktivitet (%) i forhold til kontrolgruppen. Tabel II viser de opnåede resultater.

Tabel II

Behand1ingsbetingelser Resterende aktivitet (%) 30 37°C, 1 time 97 56°C, 30 min. 0 70°C, 30 min. 0 80°C, 30 min. 0 4°C, 1 time 100 (Kontrol)_ 35 b. pH-Stabilitet.

é 29 DK 172052 B1 GIF blev behandlet tilsvarende under de i Tabel III anførte betingelser (ved konstant temperatur på 4°C) og derefter checket tilsvarende for pH-stabilitet. Tabel III viser resultaterne.

5 Tabel III

BehandlingsbetingeIser Resterende aktivitet (%) pH 7,4, 5 timer 100 (Kontrol) pH 2,0, 5 timer 60 pH 4,0, 5 timer 80 10 pH 6,0, 5 timer 90 pH 8,0, 5 timer 95 pH 9,5, 5 timer 75_ c. Stabilitet over for proteaser.

På samme måde som under a. ovenfor blev GIF 15 checket for stabilitet over for proteaser under betingelserne anført i nedenstående tabel IV. Trypsin type III (12700 BAEE enheder/mg protein, produkt fra Sigma) anvendtes ved en koncentration på 1 mg/ml som trypsin. Pronasen (45000 p.u.k/g protein) fremstillet af Kaken 20 Kagaku Co., Ltd., anvendtes ved en koncentration på Img/ml som pronase.

Tabel IV

Behandlingsbetinge1s er Resterende aktivitet (%)

Med phosphat-pufret 25 saltopløsning (pH 7,4) 100 (Kontrol) ved 37°C i 2 timer

Med trypsin ved 37°C 0 i 2 timer 30

Med pronase ved 37°C 0 i 2 timer _ ~ 1_

Tabel IV yiser, at GIF inaktiveres, både når det behandles med trypsin og med pronase.

35 30 DK 172052 B1

Dosis-respons-kurve for GIF-aktivitet (a) GIF-prøven (144,6 enheder/ml, 723 ng/ml i proteinkoncentration) vundet ved fremgangsmåden (I) anvendtes til at bestemme dosis-respons-kurve for GIF-aktivitet 5 ved varierende fortyndinger. Fig. 9 viser resultaterne.

I diagrammet er antallet af fortyndingsgange afsat som abscisse, og den procentuelle tumorcellevækst-inhibition (GIF-aktivitet) er afsat som ordinat.

Fig. 9 viser, at GIF opnår ca. 50% aktivitet 10 ved en dosis på flere ti-værdier ng/ml.

(b) Antitumor-aktivitet af den naturlige type GIF vundet ved fremgangsmåden (II) på forskellige cancerceller blev bestemt ved følgende koloni-inhibitionstest og vækst-inhibitionstest.

15 Koloni-inhibitionstest I rummene på en 12-rums vævskulturplade (produkt fra Coster) indførtes en suspension af testcancerceller 1 10% FCS-holdig RPMI 1640 ved en koncentration på 2 2 2 x 10 til 5 x 10 celler/rum (500 yl/rum).

20 GIF-prøven blev indført i hvert rum i en slutkon- centration på 1,6 til 1000 enheder/ml. Yderligere blev der fremstillet en kontrol uden anvendelse af nogen GIF-prøve.

Suspensionen blev inkuberet i nærværelse af 5% 25 carbondioxidgas i 1 uge. Mediet blev derefter fjernet med en suger, hvert rum blev vasket med PBS indeholdende CaC^ (PBS+) to gange, og de resulterende kolonier blev fikseret med 100% methanol, farvet ved giemsa-farvning og derefter talt.

30 Procentuel koloni-inhibition blev beregnet ud fra følgende ligning

Koloni-inhibition (%) - (i - £££ * g&l·) * 10« 35 31 DK 172052 B1

Fig. 10 viser resultaterne opnået ved anvendelse af A-549 (humane lungecancerceller, ATCC CCL185). På tegningen er GIF-koncentrationen (enheder/ml) afsat som abscisse versus den procentuelle koloni-inhibition som 5 ordinat.

Vaks t-inhibitionstes t I rummene på en 96-rums vævskulturplade (produkt fra Corning) indførtes en suspension af testcancerceller i 10% FCS-holdig RPMI 1640 i en koncentration på 2 x 103 10 til 5 x 103 celler/rum (100 yl/rum) .

GIF-prøven indførtes i hvert rum i en mængde på 100 yl ved en slutkoncentration på 1 til 10000 enheder/ml medium. En kontrol blev også fremstillet uden anvendelse af nogen GIF-prøve.

15 Cellerne blev inkuberet ved 37°C i nærværelse af 5% carbondioxidgas i 4 til 5 dage, 50 yl 0,05% Neutral Red blev derefter sat til hvert rum, og cellerne blev inkuberet yderligere ved 37°C i nærværelse af 5% carbondioxidgas i 1 time. Hvert rum blev derefter vasket med 20 PBS uden indhold af CaCl2 (PBS-), 100 yl af en pigmentekstraktionspuffer indførtes i rummet, og absorptionsevnen (O.D.) for rummet blev målt ved 540 nm.

Den procentuelle vækst-inhibition blev beregnet ud fra følgende ligning.

25

Procentuel vækst-inhibition - (l - afai for kÆol) x 100

Resultaterne opnået med ACHN (human renal adenocarcinoma, ATCC CRL1611) er vist i Fig. 11, og resulta-30 terne opnået med SK-BR-3 (human bryst-adenocarcinoma, ATCC HTB30) er vist i Fig. 12. I disse diagrammer er GIF-koncentrationen (enheder/ml) afsat som abscisse versus den procentuelle vækst-inhibition som ordinat. Bestemmelse af primær struktur af GIF-protein 35 (1) Humant perifert blod blev indsamlet, hvorfra 32 DK 172052 B1 1,9 x 10^ lymphocyter vandtes ved Ficoll-Hypaque-vægt-fyldegradient-centrifugeringsmetoden (Eur.J.Immunol.

4, 808 (1974)).

En portion af lymphocyter blev suspenderet i RPMI 5 164O-medium indeholdende 5% humant serum, i en koncentra-

O

tion på 4 x 10 celler/ml. Suspensionen blev opdelt og anbragt i Petriskåle med en diameter på 9 cm, og cellerne blev inkuberet i nærværelse af 5% carbondioxidgas ved 37°C i én time. De celler, der ikke hæftede til bunden 10 af hver skål, blev fjernet og blev stimuleret med RPMI 1640-medium indeholdende 10% FCS, 0,5 ng/ral af TPA (produkt fra Sigma) og 10 yg/ml af LPS (produkt fra Difco). Efter inkubation af cellerne i 5% carbondioxidgas ved

_ Q

37°C i 4 timer vandtes 9 x 10° vedhæftede lymphocyter 15 under anvendelse af PBS og 0,02% EDTA.

De celler, der hæftede til skålbundene, blev stimuleret med 10 yg/ml af LPS under samme inkubationsbetingelser som ovenfor. Supernatanten fra kulturen blev derefter checket for GIF-aktivitet med et tidsmellemrum.

20 Fig. 13 viser resultaterne. I diagrammet er inku bationstiden (timer) afsat som abscisse versus GIF-akti-viteten (enheder/ml) som ordinat.

Fig. 13 viser, at kultur-supernatanten startede med at udvise GIF-aktivitet 4 timer efter stimulationen 25 med LPS, og at mRNA, der producerer GIF-protein, kan fremstilles ud fra humane vedhæftede celler vundet 4 timer efter stimulationen.

Q

(2) Humane vedhæftede lymphocyter (9 x 10 celler) induceret over en. periode på 4 timer med 0,5 ng/ml af TPA 30 og 10 yg/ml af LPS ved fremgangsmåden (1) blev opløst i 30 ml 6M guanidinthiocyanat-opløsning (6M guanidiniso-thiocyanat, 5mM natriumcitrat (pH 7,0), 0,1M 2-mer-captoethanol og 0,5% Sarkosy^) , og DNA'et blev derefter ituskåret med en 50 ml sprøjtecylinder med G18G-injek-35 tionsnål. En portion på 12 g cæsiumchlorid (CsCl) blev 33 DK 172052 B1 opløst fuldstændigt i opløsningen. Portioner (6,4 ml hver) af opløsningen blev anbragt oven på 4 ml 5,7M CsCl (5,7M CsCl-0,1M EDTA), og det kombinerede lag blev centrifugeret med Beckman SW-40 Ti-rotor ved 31500 rpm 5 og 25°C i 20 timer. RNA-pelletsedimentet blev vasket med 70% ethanol og opløst i TE-opløsning (lOmM tris-HCl (pH 7,5), lmM EDTA). Til opløsningen blev der sat 3M natriumacetat (pH 5,2) og ethanol i mængder på henholdsvis 1,9 og 2,2 gange mængden af opløsningen, og blandin-10 gen blev henstillet ved -70°C i én time. Blandingen blev derefter centrifugeret ved 15000 rpm og 4°C i 20 minutter for at indsamle RNA'et, der derefter blev opløst i TE-opløsning.

På denne måde blev der fremstillet ialt 250 pg

O

15 RNA ud fra ca. 9 x 10 vedhæftede lymphocyter.

Til fremstilling af mRNA ud fra RNA . blev RNA underkastet søjlechromatografi under anvendelse af oligo(dT)-cellulose (Collaborative Research Inc.).

Til absorption anvendtes en opløsning af lOmM tris-HCl 20 (pH 7,5), 0,5M NaCl og lmM EDTA, og søjlen blev vasket med samme opløsning. RNA'et blev elueret med lOmM tris-HCl (pH 7,5) og lmM EDTA.

Herved vandtes 17,5 pg mRNA.

(3) Ud fra det ved frengangsmåden (2) vundne mRNA 25 blev der in vitro syntetiseret cDNA, og rekombinant DNA blev fremstillet ved anvendelse af Okayama-Berg-plasmid-vektor (Okayama, H. og Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)) og blev transformeret i E.coli for at opnå cDNA-bibliotek. Der anvendtes de nedenfor angiven frem-30 gangsmåder

(3-1) Fremstilling af vektorprimer—og linker-DNA

DNA (400 pg) fra pBR322-SV40 (0,71-0,86) blev digereret med 700 enheder Kpnl (NEB) ved 37°C i 5 timer. Reaktionen blev afsluttet med en blanding af 40 μΐ 35 0,25M EDTA (pH 8,0) og 20 μΐ 10% SDS. Reaktionsblandin- DK 172052 Bl 34 gen blev underkastet ekstraktion med samme volumen phenol-chloroform (1:1). DNA blev fældet med ethanol efterfulgt af centrifugering og vask med 70% ethanol for at indsamle DNA. Det vundne DNA blev opløst i 200 yl 5 blanding af 140mM natriumcacodylat, 30mM trid-HCl (pH 6/8), ImM CoCl~, Ο,ΙχηΜ DTT og 0,25mM dTTP (indehol- 32^ dende 0,5 yCi a- P-dTTP). Opløsningen blev behandlet med 400 enheder terminal-transferase (TTase, PL) i 30 minutter for at forlænge dT-kæden. Reaktionen blev af-10 sluttet med 20 yl 0,25M EDTA og 10 yl 10% SDS efterfulgt af ekstraktion med phenol-chloroform 4 gange. DNA blev indsamlet ved fældning med ethanol. Herved blev dT-kæden forlænget med ca. 70 baser.

Det således vundne DNA blev digereret ved 37°C i 15 6 timer med 17 enheder Hpal (NEB) og underkastet elektro- forese med agarose (lavtsmeltende agarose, BRL, 1%), hvorved der blev indsamlet ca. 27 kb DNA-fragment.

Efter elektroforesen blev DNA farvet med 0,5 yg/ml af ethidiumbromid, agarosen indeholdende det ca.

20 2,7 kb lange fragment blev udskåret under UV-bestråling, og til agarosen blev der sat det 5-dobbelte volumen af 20mM tris-HCl (pH 8,0)-ImM EDTA for at opløse agarosen ved 65°C over en periode på 5 minutter efterfulgt af ekstraktion med phenol, derefter med phenol-chloroform 25 (1:1) og derefter med chloroform. DNA blev indsam let ved fældning med ethanol.

Derefter blev vektorprimer-DNA . renset ved oligo(dA)cellulose-søjlechromatografi. DNA blev opløst i 1 ml lOmM tris-HCl(pH 7,3)-ImM EDTA-1M NaCl-puf-30 fer. Opløsningen blev isafkølet, derefter anbragt på søjlen, der var ækvilibreret med samme puffer, hvorefter søjlen blev vasket med 1 ml af samme puffer og derefter atter bibragt stuetemperatur. Eluering foregik derefter med lOmM tris-HCl (pH 7,3)-ImM EDTA, hvorved spidsfrak-35 tionen blev indsamlet. DNA blev indsamlet ved fæld- 35 DK 172052 B1 ning med ethanol, derefter opløst i 100 yl lOmM tris- HC1 (pH 7,3)-ImM EDTA og lagret ved 4°C.

Linker-DNA blev fremstillet ved følgende metode.

pBR322-SV40 (0,19-0,32)-DNA (100 yg) blev digereret med 5 120 enheder PstI (NEB) ved 37°C i 1,5 time. Efter endt reaktion blev der ekstraheret med phenol-chloroform og fældet med ethanol. Det indsamlede DNA blev opløst i

50 yl af en blanding af 140mM natriumcacodylat, 30mM

tris-HCl (pH 6,8), ImM CoCl0, 0,lmM DTT og 0,25mM dGTP

32 ^ 10 (indeholdende 1 yCi a- P-dGTP). Opløsningen blev påvirket med 60 enheder TTase i 20 minutter, hvorved der blev tilknyttet en dG-kæde på 18 baser. Efter endt reaktion blev DNA'et indsamlet, digereret med 50 enheder Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) og underkastet elektro-15 forese med agarose (1,8%) på samme måde som ovenfor, hvorved der blev indsamlet ca. 0,28 kb DNA-fragment og vundet 2,3 yg linker-DNA.

(3-2) Syntese af cDNA og fremstilling af cDNA-bibliotek. RNA (5 yg) blev tørret i vakuum, derefter opløst 20 i 10 yl 5mM tris-HCl (pH 8,3), opvarmet ved 65°C i 5 minutter og straks afkølet til 37°C. Til reaktionsblandingen blev der sat 20 yl af en blanding af 50mM tris- HCl (pH 8,3), 8mM MgCl,, 30mM KCl, 0,3mM DTT, 2mM dNTP 32 ^ og 10 yCi a- P-dCTP. Den resulterende blanding holdtes 25 ved 37°C i 5 minutter.

Ti enheder RTase (omvendt transcriptase, produkt fra Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) blev sat til blandingen og omsat dermed ved 37°C i 15 minutter. Efter tilsætningen af 10 enheder RTase blev blandingen holdt ved samme 30 temperatur i 15: minutter.. Reaktionen blev afsluttet med 2 yl 0,25mM EDTA (pH 8,0) og 1 yl 10% SDS efterfulgt af ekstraktion med phenol-chloroform. Til ekstraktion blev der sat 20 yl 4M ammoniumacetat og 80 yl ethanol, og blandingen blev frosset ved -70°C i 15 minutter, deref-35 ter optøet ves stuetemperatur og centrifugeret ved DK 172052 Bl 36 15000 rpm og 4°C i 10 minutter. Sedimentet blev opløst i 20 yl lOmM tris-HCl (pH 7f3). Til opløsningen blev der sat 19 yl 4M ammoniumacetat og 80 yl ethanol med henblik på udfældning.

5 Bundfaldet blev indsamlet, vasket med 70% ethanol og opløst i 15 yl af en blanding af 30mM tris-HCl (pH 6,8), ImM CoCl2, 0,lmM DTT, 0,2 yg poly A og 66 yM (a-32P)dCTP (10 yCi). TTase (P.L., 18 enheder) blev tilsat til opløsningen og omsat dermed ved 37°C i 5 minut-10 ter. Reaktionsblandingen blev hurtigt afkølet til 0°C, og reaktionen blev afsluttet med 1,3 yl 0,25M EDTA og 0,65 yl 10% SDS efterfulgt af ekstraktion med phenol-chloroforra og fældning med ethanol.

Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering og 15 derefter digereret med 4 enheder Hindlll (Takara Shuzo Co., Ltd.) ved 37°C i 2 timer. Efter endt reaktion blev der ekstraheret med phenol-chloroform og fældet med ethanol. Bundfaldet blev indsamlet og opløst i 10 yl af en blanding af lOmM tris-HCl (pH 7,3) og ImM EDTA. Med 20 tilsætning af 3 yl ethanol blev opløsningen præserveret ved -20°C.

Af den således vundne prøve blev 1 yl, sammen med 5 ng linker-DNA i 10 yl af en blanding af lOmM tris-HCl (pH 7,5), ImM EDTA og 0,1M NaCl, holdt ved 65°C i 2 mi-25 nutter og derefter ved 42°C i 30 minutter og derefter afkølet til 0°C. Til blandingen blev der sat 90 yl af en blandingsopløsning af 20mM tris-HCl (pH 7,5), 4mM MgCl^, lOmM (NH4)2S04, 0,1M KCl, 0,lmM &-NAD, 50 yg/ml BSA-6 enheder/ml af E.coli-DNA-ligase, og derefter blev den 30 kombinerede opløsning holdt ved 12°C natten over.

Til opløsningen blev der sat 0,5 yl lOmM dNTP, 0,56 yl lOmM NAD, 0,5 yl E.coli-DNA-polymerase I (produkt fra Boehringer Mannheim) og 0,2 yl RNase H (PL). Blandingen holdtes ved 12°C i én time og derefter ved 35 25°C i én time og blev derefter frosset ved -20°C med 37 DK 172052 B1 henblik på præservering.

E.coli HBlOl-stamme blev inkuberet til OD,-50 på 0,45 i LB-medium (10 g bacto-trypton, 5 g bacto-gæreks-trakt og 10 g/liter af NaCl). Kulturen blev isafkølet i 5 5 minutter og derefter centrifugeret ved 4°C ved 8000 rpm i 5 minutter for at indhøste cellerne. De vundne celle-pellets blev suspenderet i en isafkølet blanding af 30mM kaliumacetat, lOOmM RbCl, lOmM CaC^, 50mM MnCl og 15% glycerol, holdt ved 0°C i 5 minutter og centrifu-10 geret ved 4°C ved 8000 rpm i 5 minutter. De indsamlede celler blev igen suspenderet i en blanding af lOmM MOPS (morpholinopropansulfonsyre), 75mM CaCl_, lOmM RbCl og 15% glycerol og holdt ved 0°C i 15 minutter for at fremstille kompetente celler, der derefter blev præserveret 15 ved -70°C.

Den frosne suspension blev optøet ved stuetemperatur. DNA-prøven (20 yl) blev sat til en 400 yl portion af suspensionen, og blandingen blev henstillet ved 0°C i 30 minutter, underkastet varmechock ved 42°C i 90 20 sekunder og derefter igen henstillet ved 0°C i 1-2 minutter. Med tilsætning af 2 ml LB-medium blev blandingen holdt ved 37°C i 30 minutter. LB-medium (50 gange blandingens volumen) blev inokuleret med blandingen efterfulgt af inkubation ved 37°C i 6 timer. Ampicillin blev 25 sat til kulturen til en koncentration på 50 yg/ml, efterfulgt af inkubation igen natten over, hvorved cDNA-bib-liotek blev fremstillet. cDNA-biblioteket blev præserveret i 50% glycerol ved -20°C.

(3-3) Fremstilling af syntetisk sonde.

30 Den følgende nucleotidsyre-sekvens blev udledt af aminosyresekvensen (20 rester fra N-terminalen) af det native GIF bestemt som oyenfor.

Ala -Pro -Val -Arg -Ser - Leu -Asn -Cys -35 5' GCC CCC GT G AGG TCC CTG AAC TGC

3' CGG GGG CAC TCC AGG GAC TTG ACG

5 38 DK 172052 B1

Thr -Leu -Arg -Asp -Ser -Gin -Gin -Lys -ACC CTG AGG GAC TCC CAG CAG AAG

TGG GAC TCC CTG AGG GT C GT C TT C

Ser -Leu -Val -Met TCC CTG GTG ATG- 3' AGG GAC CAC TAC- 5' 10 Den ovennævnte nucleotidsekvens blev bestemt iføl ge human-codon-brugsfrekvensen (Nucleic Acid Research, 9, r43-74 (1981)).

En nucleotidsekvens (vist i den nederste linie) komplementær med basesekvensen fra ovennævnte formel syn-15 tetiseres ved følgende fremgangsmåde for at anvende den komplementære sekvens som sonde til udvælgelse af en transformant med cDNA kodende for GIF. På denne måde blev det fuldt beskyttede DNA syntetiseret ved fastfase-phosphittriestermetoden, hvor N,N-dialkylmethyl-phos-20 phoramiditderivat anvendes som en kondensationsenhed (Nature, 310, 105 (1984)), under anvendelse af et automatisk synteseanlæg (380A DNA Synthetizer, Applied

Biosystems Inc., Foster City, California 94404, U.S.A.). Derefter blev det fuldt beskyttede DNA behandlet med 28% 25 vandig ammoniak ved 55°C i 10 timer, hvorved beskyttelsesgrupperne (dvs. acylgrupperne for aminogrupperne A, G og C), forskellige fra DMTr(dimethoxytrityl)-gruppen bundet til hydroxygruppen ved 5'-terminalen, blev fjernet, hvorved vandtes partielt beskyttet DNA. Derefter 30 blev det partielt beskyttede DNA renset ved omvendt-fase-HPLC under anvendelse af C^-søjle og derefter behandlet med 80% eddikesyre ved stuetemperatur i 10 minutter for at fjerne DMTr-gruppen. Det således vundne nucleotid blev renset ved elektroforese under anvendelse af 10% 35 polyacrylamidgel indeholdende 7M urinstof og ved gelfil- 39 DK 172052 B1 trering under anvendelse af Bio-gel P-30 (Bio-Rad), hvorved vandtes det ønskede DNA (6Orner) .

Det således vundne DNA (6 yg) blev omsat med 12 enheder af T4 polynucleotid-kinase (Takara Shuzo) ved 5 37°C i 1 time i 50 yl reaktionsblanding (50mM tris-HCl (pH 7,6), lOmM MgCl-, lOmM 2-mercaptoethanol, 0,2 mg/ml Z 32 af foetalt kvægthymus-DNA og 50 yCi (α- P-ATP)) for at mærke 5'-terminalen af DNA'et. For at fraskille det 32 mærkede DNA fra ikke-omsat P blev reaktionsblandingen 10 underkastet søjlechromatografi under anvendelse af Biogel P-30 (Bio-Rad). Fraktionen af det mærkede DNA blev fældet med 3M natriumacetat i 1/9 af fraktionsvoluminet og ethanol i 2,5 gange fraktionsvoluminet. Bundfaldet blev indsamlet ved centrifugering, opløst i 400 yl blan-15 ding af lOmM tris-HCl (pH 8,0) og ImM EDTA og præserveret ved -20°C.

Den specifikke aktivitet af den resulterende probe var mindst 10^ cpm/yg DNA.

(3-4) Screening af cDNA-bibliotek.

20 24 Nitrocellulosefiltre (Millipore HAIFO 8250), 80 mm i diameter, blev anbragt over LB-agarmedium indeholdende 50 yg/ml af ampicillin, og cDNA-bibliotekopløs-ningen blev spredt over filtrene således fortyndet, at 5000 kolonier blev anbragt på hvert filter, efterfulgt 25 af inkubation natten over ved 37°C.

Et frisk nitrocellulosefilter blev anbragt over filteret, hvor kolonier viste sig, for at frembringe et replika-filter.

Det oprindelige filter (stamfilter) blev præser-30 veret ved 4°C. Replika-filteret holdtes på samme agarmedium som ovenfor ved 37°C i 6 timer til inkubation og overførtes derefter på LB agarmedium indeholdende 200 yg/ml af chloramphenicol, efterfulgt af inkubation ved 37°c natten over.

35 Filteret blev behandlet med 0,5N NaOH, derefter med 1M tris-HCl (pH 8,0) og derefter med en blanding af 40 DK 172052 B1 1M tris-HCl (pH 8,0) og 1,5M NaCl. Filteret blev derefter tørret i atmosfærisk luft og derefter opvarmet i vakuum ved 80°C i 2 timer.

Det opvarmede filter blev under let rystning holdt 5 ved 68°C natten over i 20 ml opløsning af 1,2M NaCl, 0,12M trinatriumcitrat, 10 mg/ml af Ficoll, 10 mg/ml af polyvinylpyrrolodin, 10 mg/ml BSA, 0,1% SDS og 1 mg/ml af laksesperma-DNA. Opløsningen blev erstattet med en opløsning af 1,2M NaCl, 0,12M trinatriumcitrat, 10 mg/ml 10 af Ficoll, 10 mg/ml af polyvinylpyrrolidin, 10 mg/ml af BSA, 0,1% SDS og 10^ cpm/ml af proben, hvori filteret holdtes ved 42°C natten over under let rystning med henblik på hybridisering.

Efter hybridiseringen blev filteret udtaget fra 15 opløsningen, vasket med en opløsning af 1,2M NaCl, 0,12M natriumcitrat og 0,1% SDS tre gange ved stuetemperatur og derefter vasket med samme opløsning ved 60°C, indtil tællingen af filterbaggrunden blev 200 cpm bestemt med GM-intensitetsmåler.

20 Filteret blev tørret i luften og derefter under kastet autoradiografi ved -70°C i 2 dage under anvendelse af sensibiliseret papir og røntgenstrålefilm (Fuji RX).

Efter fremkaldelse af filmen blev de i signal-re-25 gionen tilstedeværende kolonier skrabet fra stamfilteret, og ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget for at isolere kolonierne med et positivt signal.

Herved blev isoleret klon 1-2, der havde et stærkt signal.

30 (3-5) Analyse af klon.

Restriktionsenzymkort for plasmid pGIF-a-cDNA indeholdt i klon 1-2 blev frembragt.

Fig. 14 viser kortet.

Fig. 14 viser, at dette cDNA har steder, der kan 35 kløves med Ncol (Nippon Gene), Hind III (Nippon Gene),

PvuII (Nippon Gene) og AccI (Nippon Gene), ét sted for 41 DK 172052 B1 hver, hvilke kløvningssteder er anbragt i nævnte rækkefølge fra 5'-terminus . Det fandtes, at cDNA har en længde på ca. 1,5 kb, hvilket er tilstrækkeligt til at kode for GIF med en molekylvægt på ca. 18 K.

5 Derefter blev basesekvensen for pGIF-a-cDNA be stemt ved den kemiske modifikationsmetode ifølge Maxam-Gilbert (Meth.Enzym.65, 499-566, 1980) og dideoxynu-cleotid-kædeterminationsmetoden under anvendelse af M13-phag (Messing, J. og Vieira, J., Gene, 19, 269-276 10 (1982)).

CTTATTACAGTGGCAAT GAGGATGACTT G

TT CTTTGAAGCT GATGGCCCTAAACAGATGAAG 15 Met Lys TGCTCCTT CCAGGACCTGGACCTCTGCCCT CTG Cys Ser Phe Gin Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu 20 GATGGCGGCATCCAGCTACGAAT CT CCGACCAC Asp Gly G ly Ile Gin Leu Arg Ile Ser Asp His CACTACAGCAAGGGCTT CAGGCAGGCCGCGTCA His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gin Ala Ala Ser 25 GTTGTTGT GGCCATGGACAAGCT GAGGAAGATG Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met.

CTGGTT CCCTGCCCACAGACCTT CCAGGAGAAT 30 Leu Val Pro Cys Pro Gin Thr phe Gin G lu Asn GACCTGAGCACCTTCTTT CCCTTCAT CTTTGAA Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe I le Phe G lu 35 GAAGAACCTAT CTTCTTCGACACATGGGATAAC Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn 42 DK 172052 B1 GAGGCTT ATGTGCACGATGCACCTGT ACGAT CA Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser 5 CT GAACTGCACGCT CCGGGACT CACAGCAAAAA Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gin Gin Lys AGCTTGGTGATGTCTGGT CCATATGAACT GAAA Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys 10 GCTCTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAA Ala Leu His Leu Gin Gly Gin Asp Met Glu Gin CAAGTGGTGTTCTCCATGTCCTTTGTACAAGGA 15 Gin Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gin Gly GAAGAAAGT AATGACAAAAT ACCTGTGGCCTTG Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu 2 0 GGCCTCAAGGAAAAGAATCTGTACCTGTCCTGC Gly Leu Lys Glu Lys Asn Lue Tyr Leu Ser Cys GTGTTGAAAGATGATAAGCCCACT CTACAGCTG Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gin Leu GAGAGTGTAGAT CCCAAAAATTACCCAAAGAAG Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys 3Q AAGAT GGAAAAGCGATTT GTCTTCAACAAGATA Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile GAAAT CAATAACAAGCTGGAATTTGAGT CTGCC Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala

35 CAGTT CCCCAACTGGTACAT CAGCACCT CTCAA

Gin Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gin 43 DK 172052 B1 GCAGAAAACATGCCCGT CTTCCTGGGAGGGACC Ala Glu Asn Met pro Val Phe Leu Gly G ly Thr 5 AAAGGCGGCCAGGATAT AACTGACTTCACCATG Lys Gly Gly Gin Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met CAATTTGTGTCTT CCTAAAGAGAGCT GTACGCA Gin Phe Val Ser Ser 10

GAGAGTCCTGTGCT GAATGT GGACTCAATCCCT AGGGCTGGCAGAAAGGGAACAGAAGGTTTTTGA 15 GTACGGCTATAGCCTGGACTTTCCTGTTGTCTA CACCAATGCCCAACTGCCTGCCTTAGGGTAGTG CT AAGACGAT CTCCTGTCCAT CAGCCAGGACAG

20

TCAGCTCTCTCCTTTCAGGGCCAAT CCCAGCCC TTTT GTTGAGCCAGGGCT CTCTCTCACCTCTCC 25 TACT CACTTAAAGCCCGCCT GACAGAAACCAGG CCACATTTTGGTTCT AAGAAACCCT CCTCTGTC ATTCGCT CCCACATT CTGAT GAGCAACCGCTT C

30

CCTATTTATTTATTTATTT GTTTGTTTGTTTTG ATTCATTGGTCTAATTTATTCAAAGGGGGCAAG 35 AAGTAGCAGTGT CTGTAAAAGAGCCTACTTTTT

5 44 DK 172052 B1

ATTAGCTAT GGAAT CAATT CAATTTGGACTGGT GTGCTCT CTTTAAAT CAAGT CCTTTAATTAAGA

CT GAAAATATATAAGCT CAGATTATTTAAATGG GAATATTTATAAATGAGCAAATAT CATACTGTT ίο CAATGGTT CT CAAATAAACTT CACTAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

15

Formlen viser, at den understregede region fra det 312. til det 371. nucleotid fra 5'-terminalen er komplementær med den syntetiserede probe. Nucleotidse-kvensen havde 75% homolog! med nucleotidsekvensen be-20 stemt ifølge human-codon-brugsfrekvenserne.

Når endvidere cDNA for pGIF blev undersøgt for den længste læseramme, fandtes denne ramme at være regionen fra det 57. til det 771. nucleotid fra 5'-terminalen. Aminosyresekvensen svarende til nucleotidse-25 kvensen fra det 312. til det 371. fandtes at være fuldstændigt identisk med de 20 aminosyrer ved N-terminalen af den naturlige type GIF. Dette viser, at cDNA for pGIF-α er cDNA, der koder for et GlF-precursorprotein.

Den ovennævnte nucleotidsekvens viser, at den na-30 turlige type GIF er indkodet i nucleotidsekvensen fra det 312. til det 771. og består af 153 aminosyrer.

Dette resultat stemte overens med de ovennævnte egenskaber hos den naturlige type GIF (molekylvægt, N-terminal aminosyresekvens og aminosyresammensætning).

35 Nedenfor er vist den således bestemte primære 45 DK 172052 B1 struktur af proteinet fra den naturlige type GIF.

Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg

Asp Ser Gin Gin Lys Ser Leu Val Met Ser G ly

Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gin Gly

Gin Asp Met Glu Gin Gin Val Val Phe Ser Met

Ser Phe Val Gin Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys

Ile pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn

Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys

Pro Thr Leu Gin Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys

Asn Tyr pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe

Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu

Glu Phe Glu Ser Ala Gin Phe Pro Asn Trp Tyr I le Ser Thr Ser Gin Ala Glu Asn Met Pro Val

Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gin Asp Ile

Thr Asp Phe Thr Met Gin Phe Val Ser Ser

Eksempel 2 20 (I) Fremstilling af rekombinant GIF (r-GIF)

Plasmid pGIF-α indeholdt i klon 1-2 vundet ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1, (II), (3-5) blev kløvet med restriktionsenzymer HgiAI (NEB) og AccI (Nippon Gene), hvorved vandtes 581 basepar(bp)-gen kodende for 25 polypeptid I. 5'-Terminalen og 3'-terminalen af genet blev afskåret med "nuclease mung bean" (Pharmacia P-L Biochemicals). Fragmentet blev indsat i Ml3-phag RFmplO ved Smal-stedet. E.coli JM 105 blev inficeret med phagen og inkuberet/ hvorved vandtes enkeltstrenget 30 (SS)-DNA.

Derefter blev DNA-polymerase I (Klenow-fragment (Takara Shuzo)), i nærværelse af M13 Universal Primer og Deoxy--NTP'er (Takara Shuzo)/ bragt til at indvirke på SS-DNA for at syntetisere dobbeltstrenget (ds)-DNA, der 35 derefter blev kløvet med restriktionsenzymer EcoRI og DK 172052 Bl 46

BainHI (Nippon Gene) , hvorved vandtes et DNA-fragment med de ønskede restriktionsenzymsteder.

Fragmentet blev indsat i ekspressionsvektor pINIIIA-3 (Bio Technology, bind 2, 81-85 (1984)) ved 5 EcoRI- og BamHI-steder, hvorved vandtes det ønskede plasmid pINIIIf-GIF-oc.

Fig. 15 viser skematisk ovennævnte fremgangsmåde.

Det vundne vektorplasmid blev indsat i E.coli HB101 til transformation, hvorved vandtes den ønskede 10 transformant.

Transformanten blev inkuberet i L-dyrkningsmedium (indeholdende 50 yg ampicillin pr. ml) under rystning ved 37°C. Da cellerne var vokset til 0Dg,-Q på 0,2, blev der til mediet sat isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid 15 (IPTG) til en slutkoncentration på 2mM. Prøver på 1 ml af kulturen blev indsamlet 2 timer, 5 timer og 6,5 timer efter tilsætningen af IPTG. Hver prøve blev centrifugeret (10000 rpm, fem minutter), og cellerne blev indsamlet, opløst i 1 ml EDTA-lysozom-Triton X100 (slutkoncen-20 tration 1%), derefter underkastes lydbehandling og checket for GIF-aktivitet.

Ovennævnte fremgangsmåde blev gentaget under anvendelse af vektorplasmid pINIIIA-3 som kontrol.

Tabel V viser resultaterne.

25 Tabel V

DNA i E.coli- Tidsforløb efter GIF-aktivitet transformant IPTG-tilsætning (enheder/ml _ (timer)_ kultur)_ pINIIIf- 2 12000 30 GIF-a 5 24200 __6_£_5_40100_ pINIIIA-3 _ 6,5 ikke påvist_

Tabel V viser, at det ønskede GIF kan fremstilles ved at inkubere transformanten med plasmid 35 pINIIIf-GIF-α.

47 DK 172052 B1

(II) Fremstilling af r-GIF

De følgende oligodeoxynucleotider (I) og (II) blev fremstillet ved de nedenfor beskrevne fremgangsmåder.

5 5’ CGATAATGGCTCCTGTACGTTCTCTGAACTGCACTCTC 3' (I) 5' CG GAGAGTG C AGT TC AG AGAA CGTA CAGG AG C C ATTAT 3' (II) 5'-O-Dimethoxytrityl- og N-beskyttet deoxynucleo-sid (Applied Biosystem Inc.) bundet til makroporøst si-10 lica anvendtes som udgangsmaterialer. Nucleotidkæden blev successivt forlænget fra 31-terminalen mod 5'-terminalen med kondensationsenhederne af 5'-O-dimethoxy-trityl- og N-beskyttet deoxymononucleosid-3'-phosphoami-dit under anvendelse af et automatisk synteseanlæg 15 (380A DNA synthesizer, Applied Biosystems Inc.). Det re sulterende produkt blev behandlet med thiophenol med henblik på demethylering og yderligere behandlet med 28% ammoniak ved stuetemperatur for at fjerne nucleotidet fra silica'et, hvorved der vandtes fuldt beskyttet oligo-20 nucleotid. Ovennævnte framgangsmåde blev gennemført helt med det automatiske synteseanlæg (Hunkapiller et al.,

Nature, 310, 105 (1984)).

Oligonucleotidet bley behandlet med 2 ml 28% vandig ammoniak ved 55°C i 10 timer for at fjerne N-be-25 skyttelsesgruppen og vinde 5'-O-dimethoxytrityl-oligo-nucleotid. En femtedel af produktmængden blev renset ved omvendt-fase-HPLC under anvendelse af ODS (Yamamura Ka-gaku Kenkyusho Co., Ltd.)-søjle og derefter behandlet med 150 yl 80% eddikesyre ved stuetemperatur i 20 minut-30 ter, hvorved vandtes råt oligonucleotid. Produktet blev renset yderligere ved omvendt-fase-HPLC med ODS-søjle, hvorved vandtes det ønskede oligonucleotid.

Det ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1, (II), (3-5) vundne plasmid pGIF-α blev kløvet med restrik-35 tionsenzymer Accl og Clal, hvorved vandtes et DNA-fragment på ca. 1,2 kilobasepar (kbp), der blev isoleret og renset ved agarosegel-elektroforese. DNA-fragmentet 48 DK 172052 B1 blev ved anvendelse af DNA-polymerase I (Klenow-frag-ment) forsynet med stumpe ender ved de ender, der var kløvet med restriktionsenzymer Accl og Clal.

På den anden side blev BamHI-linker 5 (5' CGGATCCG 3') phosphoryleret ved 5'-terminalen med T4 polynucleotid-kinase og forbundet til det stumpendede DNA-fragment med T4 DNA-ligase efterfulgt af digerering med restriktionsenzym BamHI og yderligere med restriktionsenzym Mspl. Det resulterende reaktionsprodukt blev 10 underkastet elektroforese på agarosegel, hvorved der blev isoleret renset MspI-BamHI-DNA-fragment på ca.

540 bp.

Oligodeoxynucleotiderne (I) og (II) syntetiseret ovenfor blev phosphoryleret ved 5'-terminalen med T4 po-15 lynucleotid-kinase og forbundet til MspI-BamHI-DNA-frag-mentet under anvendelse af T4 DNA-ligase efterfulgt af digerering med restriktionsenzymer BamHI og Clal. Reaktionsproduktet blev underkastet elektroforese på agarosegel, hvorved der blev isoleret renset Clal-BamHI-DNA-20 fragment på ca. 580 bp.

På den anden side blev plasmider pTMI (Fumio Imamoto, Metabolism, bind 22, 289 (1985)) kløvet med restriktionsenzymer BamHI og Clal efterfulgt af agarose-gel-elektroforese, hvorved der blev isoleret og renset 25 DNA-fragment på ca. 4,4 kbp med en trp-promotor-region. DNA-fragmentet og Clal-BamHI-DNA-fragmentet på ca. 580 bp fremstillet ovenfor blev ligeret med T4 DNA-ligase, hvorved vandtes det ønskede plasmid ptrpGIF-α.

Plasmidet blev indført i E.coli HB101 til trans-30 formation, og den ønskede transformant E.coli HBl01/ptrpGIF-a blev udvalgt ved restriktionsenzym-analyse af plasmid-DNA'erne, hvilket foregik ved kogningsmetoden (T.Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, Molecular Cloning, side 366, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)). 35 Fig. 16 viser skematisk ovennævnte fremgangsmåde.

49 DK 172052 B1

Den ved indføring af plasmidet ptrpGIF-a i E.coli 1776 fremstillede transformant er deponeret un-

X

der navnet Escherichia coli 1776/ptrpGIF-a og med de-

A

poneringsnummeret FERM BP-949 i Fermentation Research 5 Institute, Agency of Industrial Science and Technology, siden 12. december 1985.

Den ovenfor vundne transformant, dvs. E.coli HB101/ptrpGIF-a, blev inkuberet natten over yed 37°C under rystning i 10 ml LB-medium (1% trypsin, 0,5% gær-10 ekstrakt og 0,5% NaCl) indeholdende 50 yg/ml af ampi-cillin og 20 yg/ml af L-tryptophan. En portion på 1 ml af kulturen blev inokuleret i 50 ml M9-minimummedium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2PC>4, 0,05% NaCl, 0,1% NH4C1, 2mM MgS04, 0,2% glucose og 0,lmM CaCl2) indeholdende 50 yg/ml 15 af ampicilling og 1% casaminosyre og inkuberet ved 37°C under rystning. Cellerne blev indhøstet, da absorptionsevnen (O.D.) ved 550 my nåede 1,0, og suspenderet i 5 ml af en opløsning af 15% sucrose, 50mM tris-HCl (pH 8,0) og 50mM EDTA (pH 8,0). En portion på 500 yl af 10 mg/ml 20 lysozymopløsning (opløst i lOmM tris-HCl (pH 8,0)) blev sat til suspensionen, og 5 ml af en opløsning af 0,3%

Triton X100, 187,5mM' EDTA (pH 8,0) og 150mM tris-HCl (pH 8,0) blev yderligere tilsat. Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter, derefter om-25 rørt grundigt og centrifugeret, hvorved vandtes en supernatant af celleekstrakt.

Supernatanten blev checket for GIF-aktivitet med det i Tabel VI viste resultat. Den bestemte aktivitet var på 2 x 10^ enheder/ml kultur.

30 35 50 DK 172052 B1

Tabel VI

Prøve GIF-aktivitet _ ~ _(enheder/ml kultur_

Kontrol 1 (prøvemedium) ikke påvist 5 Kontrol 2 (E.coli ikke påvist HBlOl-ekstrakt) E.coli HBlOl/ptrpGIF- 2 x 10^ ekstrakt.............. ' _

Ionbytter-chromatografi (CM-HPLC) 10 Den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede cellekultur-supernatant bley dialyseret med 50mM natriumacetatpuffer (pH 5,5), og dialysatet blev underkastet ionbytterchromatografi (CM-HPLC) under anvendelse af Gilson-HPLC-system (Gilson) under de følgende betingel-15 ser: Søjle: IEX-535CM (6,0 x 150 mm, Toyo

Soda Co., Ltd.)

Elueringsmiddel A: 50mM natriumacetat (pH 5,5)

Elueringsmiddel B: 50mM natriumacetat (pH 5,5) inde- 20 holdende 0,5M NaCl.

Strømningshastighed: 0,5 ml/min.

Fraktionsvolumen: Retentionstid: 0-60 min..... 2 ml/4 min/rør 60-120 min... 0,5 ml/min/rør 25 120-180 min.. 2 ml/4 min/rør

Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

0 0 40 0 120 20 30 140 100 165 100 170 0

Omvendt-fase-HPLC

CM-HPLC-metoden resulterede i en GIF-aktiv frak-35 tion med en retentionstid på 90 til 91 minutter.

51 DK 172052 B1

Den aktive fraktion blev derefter underkastet om-vendt-fase-HPLC under de følgende betingelser: Søjle: Highpore reverse-fase-søjle (RP304, Bio-Rad, 250 mm x 4,6 mm 5 (diam.))

Elueringsmidler: A-væske=0,1% TFA

B-væske=acetonitril-l% TFA (9:1) Strømningshastighed: 1 ml/min.

Diagramhastighed: Retentionstid: 10 0-50 min..... 5 min/cm 50-80 min.... 2 min/cm

Koncentrationsgradient: Tid (min) %B

0 0 5 0 15 15 20 75 45 80 100 85 100 90 0 20 Fraktionsvolumen: 2 ml/2 min/rør

En fraktion med en retentionstid på 63,9 til 65,3 minutter gav r-GIF udvisende en enkelt protein-absorp- tionsevnespids svarende til den for nativt GIF.

7

Den specifikke aktivitet var 2,7 x 10 enheder/mg 25 protein.

Resultaterne (Fig. 3) fra omvendt-fase-HPLC af den naturlige type GIF, gennemført i Eksempel 1(1), viser, at GIF-aktiviteten af den naturlige type GIF ikke stemmer overens med LAF-aktivitet, der imidlertid obser-30 veres meget bredt i den GIF-aktive fraktion, hvorfor r-GIF vundet ovenfor også blev checket for LAF-aktivitet. Derved fandtes r-GIF at have LAF-aktivitet. SPS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE)

Molekylstørrelsen af r-GIF vundet ved fremgangs-35 måden (II) blev bestemt med SDS-PAGE ved metoden ifølge Laemmli, U.K. (Nature, 277, 680 (1970)) under følgende betingelser.

DK 172052 Bl 52

Prøve: Den GIF-aktive fraktion vundet ved CM-HPLC-metoden blev tørret fuldstændigt, derefter opløst i Laemmli-prøvepuf fer (ikke indeholdende 2-mercapto-5 ethanol (2ME**) eller indeholdende 2-mercaptoethanol i en mængde på 1/20 af puffervoluminet (2ME+)) og behandlet ved 100°C i 4 minutter.

Gel: 15% Polyacrylamidgel 1,5 mm i tykkel- 10 se.

Apparat: Protean, produkt fra Bio-Rad.

Elektroforese: 40 mA konstant strøm i 2 timer.

Den fra elektroforesen resulterende gel blev farvet med Silver Stain Kit (Bio-Rad) med de i Fig. 17 vis-15 te resultater (i tilfælde af 2ME+) og Fig. 18 (for 2ME~).

Under henvisning til disse tegninger resulterede bane (1) fra de følgende molekylvægt-markører, bane (2) til (6) fra r-GIF-prøven, og bane (7) fra naturlig type GIF-prøve. De anvendte mængder af r-GIF-prøve var 11,7 ng 20 for bane (2), 23,3 ng for bane (3), 46,6 ng for bane (4), 70 ng for åbne (5) og 117 ng for bane (6). Molekylvægt-markører for bane (1): 94K : Phosphorylase b 67K : Albumin 25 43K : Ovalbumin 30K : Kulsyreanhydrase 20,IK : Trypsin-inhibitor 14,4K : a-Lactalbumin

Resultaterne viser, at r-GIF er vandret som et 30 enkelt bånd ved positionen af ca. 17K i tilfælde af 2ME* eller af ca. 17,5K i tilfælde af 2ME~. Isoelektrofokuserinq (IEF) r-GIF blev underkastet IEF under anvendelse af PAG-plade (LKB) 3,5 til 9,5 i pH-område,. og Model 1415 35 (Bio-Rad) under følgende betingelser.

53 DK 172052 B1

Prøve: Den ved fremstillingsmetode for r-GIF (II) vundne transformant blev nedbrudt ved osmostisk trykchok, og den resulterende superna-5 tant (lOmM tris-HCl, pH 8,0) blev fortyndet 100 gange med destilleret vand.

Ti yl af fortyndingen anvendtes. Elektrodeopløsninger: Anodeopløsning = 1M H3P04 10 Katodeopløsning = 1M NaOH

Elektroforese: Med konstant effekt på lW/cm gel bredde med afkøling (10°C) i 90 minutter.

Farvning: Med Silver Stain Kit.

15 Den fra elektroforesen resulterende gel blev op skåret med mellemrum på 5 mm eller 2,5 mm, underkastet ekstraktion ved anvendelse af 1 ml 10% FCS-holdig RPMI 1640 under rystning (i to dage) og derefter checket for GIF-aktivitet. Det isoelektriske punkt blev beregnet ud 20 fra pH-målingen efter elektroforesen.

r-GIF havde et isoelektrisk punkt (PI) på ca. 6,5 til ca. 6,9 og viste sig som et enkelt bånd ved denne position.

Aminosyresammensatning 25 r-GIF (30 yl) vundet ved omvendt-fase-HPLC-meto- den (II) blev omhyggeligt anbragt i bunden af et tyk-vægget, hårdt reagensglas af Pyrex-glas på 12 mm x 120 mm og blev derefter tørret i vakuum i en exsiccator indeholdende natriumhydroxid-pellets. En portion på 50 yl 30 af 4N methansulfonsyre (indeholdende 0,2% 3-(2-aminoethyl)indol og fremstillet af Pierce) blev sat til den tørre prøve i reagensglasset. Reagensglassets indre blev afluftet ved 0,1 til 0,2 mm Hg i 1 minut og derefter forseglet. Prøven blev hydrolyseret i en op-35 varmer ved 118°C over en periode på 24 timer. Efter åb- DK 172052 Bl 54 ning af reagensglasset blev blandingen neutraliseret med 46 yl 4N natriumhydroxid og fortyndet til en mængde på 450 yl med citronsyrepuffer.

En portion på 250 yl af prøveopløsningen anvend-5 tes til aminosyreanalyse med en aminosyreanalysator (Model HITACHI 835, produkt fra Hitachi Ltd.). De fraskilte aminosyrer blev påvist ved o-phthalaldehyd-meto-den og bestemt kvantitativt på basis af kalibreringskurver fremstillet ved anvendelse af autentiske amino-10 syrer.

Tabel VII viser resultaterne udtrykt som molforholdet mellem indgående aminosyrer baseret på Phe (9 mol). Under de ovennævnte analysebetingelser er Pro og Cys ikke bestemmelige. For Ser, Thr og Met er den under 15 de ovennævnte betingelser opnåede procentuelle udvinding anført i parentes.

Tabel VII

Aminosyre Mol-forho1d_

Asp og/eller Asn 17,1 20 Ser 10,9 (80%)

Thr 5,4 (90%)

Glu og/eller Gin 23,8

Gly 8,3

Ala 5,0 25 Val 10,8

Met 5,5 (90%)

Ile 4,9

Leu 15,1

Tyr 3,9 30 Phe (9)

Lys 14,9

His 0,9

Trp 0,8

Arg 3,0 35 55 DK 172052 B1

Aminosyresekvens for r-GIF

En portion på 150 .yl af r-GIF vundet ved omvendt-fase-HPLC-metoden (II) blev analyseret med en protein-sekvensbestemmer (Applied Biosystems Inc.). Hver resulte-5 rende PTH-aminosyre blev passende fortyndet med 100 til 50 yl 33% vandig acetonitrilopløsning, og en portion på 5 yl af fortyndingen blev injiceret i en chromatografisk søjle med et autoprøveorgan, Waters 710B. Til det chro-matografiske system blev to pumper, Beckman Model 112, 10 opereret af et kontrolorgan, Model 421. Den anvendte søjle, der målte 2 mm x 250 mm og var pakket med Ultra-sphere ODS-5 ym, holdtes ved 55°C med en søjleopvarmer. Strømningshastigheden var 0,3 ml/min. En blanding af 20mM natriumacetat og acetonitril anvendtes som gradient-15 opløsning. Absorptionsevne fulgtes ved 269 nm. Analyse gennemførtes over en periode på 45 minutter.

Resultaterne fra 20 analysecycler viste, at r-GIF vundet ved fremgangsmåden (II) havde følgende sekvens af 20 aminosyrer ved N-terminalen.

20

Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met- .

Arg blev identificeret separat under anvendelse 25 af et let modificeret HPLC-system. Ser blev identificeret ved hjælp af et biprodukt og blev yderligere identificeret ved 322 nm. Cyclus 8 viste ingen signifikant spids. Der var den teori, at den pågældende aminosyre var Cys.

30 De ovenfor anførte resultater viser, at r-GIF

vundet ved fremgangsmåden (II) stemmer overens med po-lypeptid I. Molekylvægten af r-GIF beregnet ud fra ami-nosyresammensætningen er 17376,59.

Antitumor-aktivitet in vivo 35 r-GIF vundet i Eksempel 2(11) bley testet in vivo 56 DK 172052 B1 for antitumor-aktivitet som nedenfor beskrevet.

1) En million levedygtige A375-celler blev inokule-ret s.c. i en nøgen Balb/c mus på dag 0. r-GIF blev indgivet i.t. i en daglig dosis på 100000 enheder/legeme 5 fra dag 10 til 15. Seks mus anvendtes til én gruppe.

PBS alene blev givet tilsvarende til en kontrolgruppe .

Resultaterne er vist i Fig. 19, hvor linie (1) repræsenterer kontrolgruppen, og linie (2) repræsenterer 10 gruppen, der har fået r-GIF.

2) En BALB/c mus blev intracutant inokuleret med 200000 levedygtige Meth A-celler på dag 0. r-GIF blev indgivet i.t. i en daglig dosis på 100000 enheder/legeme på dag 7 og 8. Syv mus anvendtes til én gruppe.

15 PBS alene blev givet tilsvarende til en kontrol gruppe .

Fig. 20 viser resultaterne, hvor linie (1) repræsenterer kontrolgruppen, og linie (2) repræsenterer gruppen, der har fået r-GIF. Fem i test-gruppen udviste 20 regression af tumoren.

Eksempel 3

Det ønskede r-GIF, såsom polypeptid II, III eller IV, kan fremstilles ved anvendelse af plasmid pGIF-α vundet i Eksempel 1(11)(3-5) og ved anvendelse af samme 25 fremgangsmåde som i Eksempel 2.

Peptid IV for eksempel kan fremstilles ved følgende fremgangsmåde.

To DNA-fragmenter blev isoleret fra plasmid pGIF-α. Det ene er HgiAI-NcoI-DNA-fragment (ca. 0,1 kbp), 30 og det andet er NcoI-StuI-DNA-fragment (ca.0,8 kbp). Det syntetiske oligonucleotid med fire aminosyrer-codoner fra den amino-terminale region af polypeptidet IV ligeres med HgiAI-NcoI-DNA-fragment for at forbinde med trp-promotor. Det således vundne DNA-fragment og Ncol-Stul-35 DNA-fragment forbindes sekventielt med vektoren pTMl 57 DK 172052 B1 nedstrøms for trp-promotoren. Herved vandtes et plasmid, der eksprimerer polypeptid IV under styring fra trp-pro-motor i E.coli. Samme fremgangsmåde som i Eksempel 2 gentages under anvendelse af det ovenfor vundne plasmid 5 i stedet for plasmidet ptrpGIF-a, hvorved vindes polypeptid IV.

Eksempel 4 ptrpGIF-a anvendtes til fremstilling af GIF ( Ser-r-GIF) med aminosyresekvensen for polypeptid I, 10 hvor den 71. aminosyre, Cys, fra N-terminalen var erstattet med Ser, ved den positions-specifikke mutagenese-metode (Pro.Nat.Acad.Sci., 81, 5662-5666 (1984), Science, 224, 1431 (1984)).

M13 mp 11-phagvektor anvendtes som en enkelt-15 streng-DNA-template. EcoRI/BamHI-DNA-fragment blev isoleret fra plasmid ptrpGIF-α og klonet i M13 mp 11-phag ved restriktionsenzym EcoRI- og BamHI-steder, hvorved vandtes enkeltstreng(ss)-DNA (M13-GIF-a), der derefter anvendtes som mutagenese-template. Syntetisk oligonu-20 cleotid [CTGTCCTCAGTGTTG (primer)] blev phosphoryleret med T4 polynucleotid-kinase og hybridiseret med ss Ml3-GIF-a-DNA. Hybriden blev underkastet "annealing", derefter behandlet med DNA polymerase I (Klenow-fragment) og T4 DNA-ligase individuelt og inkuberet ved 15°C i 25 18 timer.

Det vundne DNA indførtes i kompetent JM105-celle til transformation. Den resulterende phag-plaque (50 kolonier) blev inokuleret over på en agarplade og inkuberet ved 37°C i 18 timer. Et filter indeholdende kulturen 30 blev behandlet med et alkali på den til denaturering sædvanlige måde, tørret og derefter opvarmet ved 80°C

i 2 timer. DNA'et blev præhybridiseret og derefter hy- 32 bridiseret ved stuetemperatur i 1 time med P-probe 32 fremstillet ved at mærke primeren med P-r-ATP. Det fra 35 hybridiseringen stammende filter blev vasket med 58 DK 172052 B1 6x SSC-puffer ved stuetemperatur i 10 minutter og yderligere ved 37°C i 10 minutter, tørret og derefter underkastet autoradiografi ved -70°C i 18 timer.

Ml3-GIF-71s blev udvalgt som en typisk klon blandt 5 fem mutante kloner, inficeret med JM105 og inkuberet til fremstilling af ssDNA og RF DNA.

M13-dideoxynucleotid-sekvensbestemmelse gennemførtes for ssDNA for at bekræfte mutation af det betragtede gen.

10 Nyligt frembragt restriktionsenzym Ddel-sted blev også identificeret i RF DNA.

EcoRI/BamHI-fragment blev fremstillet ud fra RF DNA frembragt i JM105, indført i ekspressionsplasmid som i Eksempel 2(11), hvorved vandtes det ønskede 71 15 Ser-r-GIF-ekspressionsplasmid ptrpGIF-a-71S.

En celleekstrakt-supernatant blev fremstillet ved anvendelse af plasmidet på samme måde som i Eksempel 2(11) og checket for a-GIF-aktivitet. Tabel VIII viser resultaterne.

20 Tabel VIII

Prøve GIF-aktivitet ' '......... (enheder/ml kultur)_

Kontrol (E.coli 473,8 x 103 HB101/ptrpGIF-a) 25 E.coli 434,6 x 103 HBl01/ptrpGIF-a-71S-ekstrakt_____ 30 59 DK 172052 B1

SAMMENLIGNINGSFORSØG

Forsøg 1

Man opløste 100 mg humant serumalbumin (HSA) i en puffer (pH 8,0) fremstillet ved at fortynde en blanding 5 af 100 ml 1 M HC1 og 169 ml 1 M tris med tilstrækkeligt vand til opnåelse af 1000 ml opløsning. Med denne opløsning fremstillede man opløsninger med en koncentration på 1 /xg/ml af henholdsvis rekombinant IL-10 (r-IL-10, hvor aminosyre nr. 71 var Cys) og rekombinant GIF 10 ifølge opfindelsen (r-GIF, hvor aminosyre nr. 71 var Ser) .

Portioner af hver opløsning henstod ved 37°C i henholdsvis 1, 3, 7 og 14 dage. reststyrken blev derefter bestemt ved hjælp af det følgende vækstinhibi-15 tionsforsøg under anvendelse af den humane melanoma-cellelinie A 375.

Hver opløsning fik tilsat et dyrkningsmedium (omfattende 500 ml Eagle MEM, 50 ml FBS, 12 ml Meylon og 5 ml af en 200 mM L-glutaminopløsning) til opnåelse 20 af en 1000 gange fortyndet opløsning, som blev filtreringssteriliseret og benyttet som prøveopløsning. Man fortyndede r-GIF med samme dyrkningsmedium til en koncentration på 1 ng/ml, filtreringssteriliserede og benyttede opløsningen som standardopløsning.

25 I en mikroplade med 96 brønde (i 12 søjler, 1-12, og 8 rækker, A-H) anbragte man 0,1 ml i hver brønd og satte derefter 0,1 ml prøveopløsning eller standardopløsning til hver brønd i række A, undtagen kolonne 1 (blank) og kolonne 12 (kontrol). Efter sammenblanding 30 foretog man 2-ganges-fortyndinger fra række A til H og satte så 0,1 ml af en A375 cellesuspension med 1 x 105 celler/ml til hver brønd, undtaget i kolonne 1, hvor brøndene modtog 0,1 ml af dyrkningsmediet. Cellerne blev i 4 dage inkuberet ved 37°C i nærvær af 5% carbon-35 dioxid. Efter inkuberingen satte man til hver brønd 0,1 60 DK 172052 B1 ml farveopløsning (fremstillet ved opløsning af 1 g neutralrødt i 100 ml vand og fortynding af 5 ml af denne opløsning i 100 ml Eagle MEM medium) og inkuberede i en time ved 37°C i nærvær af 5% carbondioxid. Far-5 veopløsningen blev fjernet, og hver brønd blev to gange vasket med PBS. Vaskeopløsningen i brøndene blev bort-suget med trækpapir.

Den optagne farve blev opløst i ekstraktionsopløsning (0,1 ml/brønd). Farveopløsningerne blev blandet 10 ved hjælp af en mikropladeblander, og absorbansen (OD) for hver opløsning blev bestemt ved 540 nm. Ved analyse af data blev titerværdien for en prøve defineret som den reciprokke værdi af fortyndingsforholdet for den prøve, der opviste 50% absorbans af farven, der var op-15 taget af kontrolcellerne (opviste 50% vækstinhibition). Titerværdien for prøveopløsningen blev beregnet ud fra den bestemte titerværdi for standardopløsningen.

Tabel IX nedenfor viser resultaterne. Resttiter-værdier er her angivet som procentværdier af begyndel-20 sesværdi (100%).

Tabel IX

Stabilitet (reststyrke%) ved 37°C, pH 8,0

Dag 0 1 3 7 14 25 IL-ljS 100 108 67 21 0 r-GIF 100 107 94 73 43

Resultaterne i Tabel IX viser, at IL-1/3 hurtigt blev inaktiveret i nærvær af HSA, med en aktivitets-30 reduktion til omtrent 2/3 efter 3 dages henstand og til omtrent 1/5 efter 7 dages henstand, og at det var helt inaktiveret efter 14 dages forløb. På den anden side viser Tabel IX også, at r-GIF opviste en vedholdende 61 DK 172052 B1 aktivitet, selv i nærvær af HSA, og at det mere detaljeret opretholdt 94% aktivitet efter 3 dages henstand, mere end 70% aktivitet efter 7 dages henstand og 43% aktivitet endog efter 14 dages henstand.

5

Forsøg 2

Man opløste HSA i PBS (Dulbecco's PBS) til 50 mg/ml HSA og foretog 3-gange-fortyndinger. Med de opnåede opløsninger fortyndedes r-GIF (ifølge opfindel-10 sen) og IL-1/3 til koncentrationer på 10 μg/ml, hvorefter disse opløsninger i en time blev opvarmet til 60°C.

Hver opløsning fik tilsat et dyrkningsmedium (omfattende 500 ml Eagle MEM, 50 ml FBS, 12 ml Meylon og 5 ml af en 200 mM L-glutaminopløsning) til opnåelse af 15 en 2000 eller 5000 gange fortyndet opløsning, som blev filtreringssteriliseret og benyttet som prøveopløsning.

Man fortyndede r-GIF og IL-1/3 med samme Eagle MEM dyrkningsmedium til en koncentration på 1 ng/ml, filtreringssteriliserede og benyttede opløsningerne som stan-2 0 dardopløsninger.

Man benyttede samme vækstinhibitionsforsøg som ved forsøg 1 og benyttede prøve- og standardopløsning på samme måde til opnåelse af styrkeværdier. Disse værdier er vist nedenfor i Tabel X, som viser reststyrken (i %) 25 i forhold til styrken (100%) opnået som ovenfor nævnt, men uden opvarmning af r-GIF og IL-1/3 opløsningerne. Resultaterne viser, at der i det væsentlige ikke kunne ses forskel på aktiviteter for r-GIF og IL-1/3 ved lave HSA koncentrationer. Ved sådanne over 0,1 mg/ml viste 30 IL-1/3 imidlertid et skarpt fald i reststyrke og var helt inaktiveret ved en sådan på 5,56 mg/ml. Derimod opretholdt r-GIF sin aktivitet ved HSA koncentrationer over 0,1 mg/ml og havde stadig aktivitet ved en sådan på 50 mg/ml, svarende til koncentrationen af HSA i 35 blod.

62 DK 172052 B1 cn cn O O VO VØ

rH

<N

VO

Γ* o σ lo σ\ o r* r* o σι

CN

CN <J\

00 O I VO

O

VO

CO

VØ H VO

r- o > co o VØ

O (N O

VO CN ΙΟ CO

o

X

J Γ- W η σ\ m §m vo cn vo __i__ ΙΛ co σι m

i-H

VO

in o > m - in m r* «.om CN VO N* i-1 O <J\ H o ro in ϋ C ^ oa. fa

• 0 rH Η H

Μ Ai £ i O

ΰ \ J i < Di h m

CO B

M —

Claims

63 DK 172052 B1

1. Antitumor-aktivt stof GIF, kendetegnet ved, at stoffet GIF som proteinbe s tanddel indeholder polypeptid A med følgende primærstruktur og har den aktivitet at hæmme vækst af tumorceller: H Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gin Gin Lys Ser Leu Val Met Ser G ly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gin Gly Gin Asp Met Glu Gin Gin Val Val Phe Ser Met

10 Ser Phe Val Gin Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gin Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg phe

15 Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu phe Glu Ser Ala Gin phe Pro Asn Trp Tyr I le Ser Thr Ser Gin Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gin Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gin Phe Val Ser Ser OH 20

2. GIF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er vundet ved at inkubere en rekombinant mikroorganisme, som bærer et replicon forbundet til et gen, der koder for polypeptid A ifølge krav 1.

3. Gen, kendetegnet ved, at det koder for GIF ifølge krav 1.

4. GIF-ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den indeholder genet ifølge krav 3.

5. Rekombinant mikroorganisme, kendeteg-30 net ved, at den er transformeret med en vektor ifølge krav 4.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af GIF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man inkuberer en rekombinant mikroorganisme, der bærer et replicon 3 5 forbundet til et gen, der koder for polypeptid A som defineret i krav l. 64 DK 172052 B1

7. Farmakologisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af GIF ifølge krav 1 og en farmakologisk acceptabel ikke-toxisk bærer.