DK172463B1 - Anvendelse af oncostatin-A eller derivater deraf til in vitro diagnostisk detektion af tumorceller - Google Patents

Description

i DK PR 172463 B1

Denne opfindelse angår anvendelse af oncostatin-A eller et derivat, som har en aminosyresekvens i det væsentlige ækvivalent med i det mindste en portion deraf, og som udviser oncostatin-A-aktivitet ved et assay for afgivelse 5 af p52 protein fra tumorceller, til en in vitro diagnostisk detektion af tumorceller blandt et større antal celler ved, at man bringer et større antal celler i kontakt med oncostatin-A eller det nævnte derivat deraf og detekterer den inducerede sekretion af p52 protein.

10

Opfindelsens baggrund

Kompleksiteten af reguleringen af hæmatopoietiske cellers differentering og celledeling bliver stadig mere klar, 15 efterhånden som listen over isolerede faktorer, som styrer disse begivenheder, vedvarende forøges. For størstedelens vedkommende er disse faktorer til stede i yderst små mængder i forbindelse med talrige andre proteiner, som har en lang række forskellige funktioner. Faktorer, 20 som er blevet isoleret og påvist at have aktivitet, inkluderer sådanne polypeptider og proteiner som y-interferon, blodpladeafledt vækstfaktor, kolonistimulerende faktor, interleukin-2, erythropoietin såvel som talrige andre lymphokiner. Der er væsentlig interesse for isolerin-25 gen, rensningen og karakteriseringen af disse blodkomponenter på grund af deres mulige anvendelse til behandling såvel som til opklaring af sådanne sygdomme som cancer.

Der er mange faldgruber ved isolering af en naturligt 30 forekommende faktor. Der må udvikles et udskillelsessystem, som adskiller den ønskede faktor fra andre tilstedeværende faktorer, som kan have lignende egenskaber. For det andet må der tilvejebringes et eller andet middel til prøvning af de forskellige fraktioner, som specifikt el-35 ler i hovedsagen specifikt karakteriserer det materiale, som har interesse, i modsætning til andre materialer, som DK PR 172463 B1 2 er til stede. Hvor det interessante polypeptid har yderst høj aktivitet, forøges vanskeligheden ved isolering af det ønskede produkt i høj grad. For det tredje må man tilvejebringe en procedure, som ikke virker skadeligt på 5 det interessante produkt, idet man især må undgå denaturering. Desuden er der hyppigt andre materialer i blandingen, som kan virke på det interessante materiale og ændre det, således at det produkt, som til sidst opnås, selv om det kan have noget af den ønskede aktivitet, ikke 10 er det naturligt forekommende materiale. Endelig må man efter isolering af den ønskede komponent i tilstrækkelig ren form derefter forsøge at karakterisere polypeptidet fysisk, f.eks. ved aminosyresekvensbestemmelse, glycosy-leringstal, disulfidbroer og lignende. Man må yderligere 15 karakterisere materialet med hensyn til dets fysiologiske egenskaber.

Endelig kan karakteriseringen af forbindelsens fysiologiske aktivitet, selv efter isolering af den rensede for-20 bindelse, ofte vise sig at være vanskelig at gå til. Da aktiviteten i mange situationer kan være afhængig af tilstedeværelsen af en eller flere andre forbindelser, et snævert koncentrationsområde, særlige værtsceller eller lignende, kræves der ofte væsentlig intuitiv evne såvel 25 som udstrakte forsøg for at opdage en forbindelses fysiologiske aktivitet og påvise de parametre, der påvirker dens aktivitet.

Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:5989-30 5992, beskriver rensningen af epithelcellevækstinhibito- rer. Nelsen-Hamilton and Holley, ibid. (1983) 80:5636- 5640, beskriver virkningen af en vækstinhibitor og epidermal vækstfaktor ved inkorporeringen af radiomærket methionin i proteiner secerneret af celler fra den afri-35 kanske grønne abe (BSC-1). Morgan et al., Thromb. Hae-most. (1980) 42:1652-60 giver aminosyresekvensen for hu- 3 DK PR 172463 B1 man-blodplade-faktor 4. Dawes et al., Thromb. Res. (1983) _29 :569-81 og Schernthaner et al.. Acta Med. Austriaca [suppl.] (1979) 6:375-9 rapporterer polyklonale antistoffer over for blodplade-faktor 4. Lawler, Thromb. Res.

5 (1981) 2J1:121-7 sammenligner sekvenserne og strukturerne af β-thromboglobulin og blodplade-faktor 4.

Sammenfatning af opfindelsen 10 En række polypeptidpræparater, som har en aminosyrese-kvens i det væsentlige ækvivalent med mindst en del af et polypeptid, der kan isoleres fra pattedyrblodplader og betegnes oncostatin-A, er i stand til at inducere sekretion af et 52 kDal protein fra tumorceller som vist ved 15 det i det følgende beskrevne assay. Ifølge opfindelsen anvendes oncostatin-A og sådanne derivater deraf til en in vitro diagnostisk detektion af tumorceller blandt et større antal celler ved, at man bringer et større antal celler i kontakt med oncostatin-A eller det nævnte deri-20 vat deraf og detekterer den inducerede sekretion af p52 protein.

Kort figurforklaring 25 Fig. 1 er et sammenlignende kurvediagram, som viser virkningen af oncostatin-A på væksten af en tumor hos athymi-ske mus.

Detailbeskrivelse af de specifikke udførelsesformer 30

Der tilvejebringes polypeptider og sammensætninger indeholdende sådanne polypeptider, som frembringer inhibering af væksten af pattedyrneoplasmaceller. De omhandlede po-lypeptider er beslægtede med et naturligt forekommende 35 polypeptid i den fraktion, der opnås ved ekstraktion af blodplader med ethanolisk HC1, der i litteraturen kaldes 4 DK PR 172463 B1 blodplade-faktor 4 og i det følgende betegnes som onco-statin-A. Polypeptiderne er stabile ved moderate temperaturer (0 - 25 °C), ved lav pH-værdi, almindeligvis under ca. pH 3, sædvanligvis ved pH 2. Polypeptiderne har en 5 molekylvægt i området fra omkring 5000 til omkring 8000, mere nøjagtigt i området fra omkring 6000 til omkring 7500, og nærmere bestemt omkring 7000. Dette polypeptid opnås ud fra blodplader fra højere pattedyr, især primater, og nærmere bestemt mennesker.

10

De polypeptidforbindelser, som anvendes, vil indeholde fra omkring 15 til omkring 80 aminosyrer, hvor de naturligt forekommende polypeptider og mimetiske analoge dertil vil indeholde fra omkring 60 til omkring 75 aminosy-15 rer, og mere sædvanligt fra omkring 65 til omkring 72 aminosyrer, medens fragmenter almindeligvis vil ligge i området fra omkring 15 til omkring 60 aminosyrer, mere sædvanligt fra omkring 15 til omkring 35 aminosyrer. Af særlig interesse er polypeptider med fra omkring 68 til 20 omkring 72 aminosyrer, nærmere bestemt 69, 70 eller 71 aminosyrer. Disse polypeptider kan sammenføjes med andre forbindelser, såsom antigener, receptorer, mærker eller lignende.

25 Polypeptiderne vil indeholde mindst én biologisk aktiv sekvens, f.eks. immunologisk eller epitopisk, og kan indeholde mere end én biologisk aktiv sekvens, hvor en sådan sekvens kan kappes med et naturligt forekommende produkt om den biologiske egenskab.

30

Forbindelser af interesse vil have en sur (anionisk) N-terminus og en basisk (kationisk) C-terminus, hvor de la-déde områder vil være på 6 - 15 aminosyrer, sædvanligvis 6-12 aminosyrer, hvor området vil inkludere en aminosy-35 resekvens på 6 - 8 aminosyrer, hvor mindst 50 antalsprocent, sædvanligvis mindst 60 antalsprocent, og sædvanlig- 5 DK PR 172463 B1 vis højst 90 antalsprocent er ioniske aminosyrer. De ioniske aminosyrer er: basiske, K og R; sure, D og E.

De forbindelser, som indeholder mindst ca. 60 aminosyrer, 5 vil have de ladningsbærende domæner adskilt af mindst 25 aminosyrer, sædvanligvis mindst 40 aminosyrer, og færre end omkring 70, sædvanligvis færre end omkring 65 aminosyrer. Den forbindende aminosyresekvens, som adskiller de ladningsbærende domæner, vil sædvanligvis have et over-10 skud af kationiske i forhold til anioniske aminosyrer, sædvanligvis i et forhold på fra omkring 1,5:1 til omkring 3:1, sædvanligvis omkring 2:1, hvor forbindelsens pK ligger i området fra omkring 6,5 til omkring 8, især omkring 7,4.

15

Der vil sædvanligvis være to disulfidbroer i den forbindende sekvens, hvor de brodannende disulfider er fra omkring 20 til omkring 45 aminosyrer, sædvanligvis 22 - 40 aminosyrer fra hinanden, fortrinsvis adskilt af omkring 20 25 og 39 aminosyrer. Cysteinerne proximale til den N- terminale ende vil være fra omkring 8 til omkring 16 aminosyrer fra den N-terminale ende med cysteinerne proximale til den C-terminale ende omkring 12 - 45 aminosyrer, sædvanligvis 16-40 aminosyrer, fra den C-terminale en-25 de.

Forbindelser af interesse vil sædvanligvis have en sekvens proximal til den N-terminale ende, som har formlen for pentapeptidet E-A-E-E-D, mere sædvanligt decapeptidet 30 E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C, hyppigt pentadecapeptidet E-A-E-E-D- G-D-L-Q-C-L-C-V-K-T, og hyppigst har den følgende formel: E-A-E-E-D-G-D-L-Q-C-L-C-V-K-T-T-S-Q-V-R-P-R-H-, hvor bogstaverne har den følgende betydning i overensstemmelse med konventionen: 35 6 DK PR 172463 B1 A - alanin M - methionin C - cystein N - asparagin D - asparaginsyre P - prolin E - glutaminsyre Q - glutamin 5 F - phenylalanin R - arginin G - glycin S - serin H - histidin T - threonin I - isoleucin V - valin K - lysin W - tryptophan 10 L - leucin Y - tyrosin

Forbindelser af interesse vil sædvanligvis proximalt til den C-terminale ende have en sekvens med formlen K-K-I-I-K-K, mere sædvanligt en sekvens med formlen 15 K-K-I-I-K-K-L-L, og fortrinsvis P-L-Y-K-K-I-I-K-K-L-L-E-S.

Det er underforstået, at bevarende udskiftninger af aminosyrer kan foretages. Bevarende ændringer inkluderer ud-20 skiftninger, der involverer D og E; F og Y; K og R; G og A; N og Q; V, I og R; og lignende. I nogle tilfælde Vil ikke-bevarende udskiftninger være ønskelige, f.eks. udskiftning af K eller R med N eller Q. Denne udskiftning er af særlig interesse, hvor der er et dibasisk-25 aminosyre-proteasespaltningssted til stede, f.eks. K-R, hvor udskiftningen beskytter stedet mod proteolytisk spaltning.

Ligeledes kan der være involveret indsætninger eller de-30 letioner, hvor indsætninger eller deletioner sædvanligvis vil involvere 1-2 aminosyrer, især 1 aminosyre.

Aminosyrerne kategoriseres som følger: 35 7 DK PR 172463 B1 alifatiske neutrale

ikke-polære C, A, P, V, L, I

polære S, T, M, C, N, Q

5 sure D, E

basiske K,R

aromatiske Γ , 11, Y , W

Som det fremgår af de ovenstående formler, kan der fore-10 tages forskellige bevarende udskiftninger i de ovenstående sekvenser uden væsentlig påvirkning af den fysiologiske aktivitet. Ligeledes kan der anvendes deletioner og indsætninger på 1 - 2 aminosyrer. Sædvanligvis vil der ikke blive foretaget mere end 5, og fortrinsvis ikke mere 15 end 3 ændringer (udskiftning, deletion eller indsætning) i den ovenstående sekvens.

Af særlig interesse til anvendelse i forbindelse med den foreliggende opfindelse er forbindelser med den følgende 20 sekvens:

Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gin Cys Leu Cys Val Lys

Thr Thr Ser Gin Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu

Val Ile Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gin Leu Ile

Ala Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gin 25 Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser eller analoge dertil, især analoge eller fragmenter, som inkluderer de fire cysteinrester ved tilnærmelsesvis deres respektive positioner og de 12 aminosyrer ved eller 30 proximalt til den C-terminale ende, især de 10 aminosyrer proximalt til den C-terminale ende, og nærmere bestemt de 8 aminosyrer proximalt til den C-terminale ende, som inkluderer 4 basiske og 4 neutrale alifatiske aminosyrer.

Analoge til den ovenstående forbindelse vil sædvanligvis 35 have mindst omkring 80 %, mere sædvanligt mindst omkring 85 %, og fortrinsvis mindst omkring 90 % af de samme ami- 8 DK PR 172463 B1 nosyrer som i den ovenstående sekvens eller portionen af den ovenstående sekvens.

De naturligt forekommende polypeptidpræparater, som an-5 vendes ifølge denne opfindelse, kan opnås i høj renhed som fastslået ved følsomme bioprøvninger. De naturligt forekommende polypeptidpræparater vil indeholde mindre end ca. 20 vægt-%, mere sædvanligt mindre end ca. 10 vægt-%, og fortrinsvis mindre end ca. 5 vægt-% af andre 10 polypeptider end den hovedbestanddel, som findes i præparatet, hvilke kontaminerende polypeptider er forbundet med blodplader.

De omhandlede polypeptidpræparater udviser en række for-15 skellige fysiologiske aktiviteter. De kan anvendes til at inhibere tumorvækst in vitro og in vivo. De kan også anvendes til at stimulere autophosphorylering af pp60 src.

De pågældende præparater kan således tjene som substrat for pp60 src enzymet og kan phosphoryleres ved tyrosin-20 positionen (rest 60) i polypeptidet. Ligeledes kan tumor-celler induceres til at frigøre et 52 kDal protein, når de behandles med oncostatin-A. Desuden kan oncostatin-A eller analoge dertil eller fragmenter deraf eller fusionsproteiner indeholdende subsekvenser (fragmenter) med 25 kompetitive immunologiske egenskaber anvendes til at producere monoklonale antistoffer eller virke som reagens ved diagnostiske prøvninger til detektion af oncostatin-A eller immunologisk kompetitive forbindelser eller tilstedeværelsen af celleoverflade- receptorer for oncostatin-30 A.

De pågældende forbindelser har høj aktivitet med hensyn til tumorinhibering. De pågældende præparater kan anvendes in vitro eller in vivo til at reducere væksthastighe-35 den af neoplastiske celler. Polypeptidpræparaterne kan i 1 ng niveauer tilvejebringe mindst omkring. 20 % inhibe- 9 DK PR 172463 B1 ring af tumorcellevækst, især af carcinomer og sarcomer, f.eks. i lungen, brystet-, huden osv. Fortrinsvis vil po-lypeptidpræparaterne tilvejebringe mindst omkring 40 %, og mere foretrukkent mindst omkring 50 %, inhibering af 5 tumorcellevækst i overensstemmelse med den koloniinhibe-ringsprøvning, som er beskrevet i den eksperimentelle del.

De omhandlede præparater kan anvendes in vivo ved at ind-10 gives en vært, som mistænkes for at have neoplasma. De omhandlede præparater kan påføres et neoplastisk sted, f.eks. et melanoma, for at reducere celledelingshastigheden. Påføringsmetoderne kan inkludere injektion, indførelse med kateter, direkte påføring eller lignende, af-15 hængigt af tumorens sted, sammensætningen af det omhandlede præparat, doseringsniveauet og lignende. Doseringen vil variere afhængigt af, om den er systemisk eller lokal, idet doseringskoncentrationerne almindeligvis er fra omkring 0,1 til omkring 1000 pg/kg, og totale doseringer 20 for store pattedyr, herunder primater, fra omkring 0,01 til 10 mg pr. behandlingsdosis.

Oncostatin-A-lignende materialer, inklusive oncostatin-A og dets artsfæller (forbindelser, som har mindst én af 25 oncostatin-A's fysiologiske egenskaber og inkluderer mindst én aminosyresekvens med i det væsentlige den samme aminosyresekvens som oncostatin-A, idet artsfællen kan indeholde et større eller mindre antal aminosyrer end oncostatin-A), kan sammensættes i fysiologisk acceptable 30 bærere, såsom phosphatpufret saltopløsning, destilleret vand, excipienter eller lignende, eller kan anvendes rene.

Oncostatin-A og dets artsfæller kan anvendes direkte til 35 detektering af tilstedeværelsen af neoplastiske celler.

Hvor cellerne udsættes for koncentrationer af det aktive 10 DK PR 172463 B1 middel på fra omkring 1 til omkring 500 ng/ml, fortrinsvis fra omkring 50 til omkring 350 ng/ml, secerneres et 52 kDal protein (p52) af de neoplastiske celler. Således vil man kunne detektere tilstedeværelsen af neoplastiske 5 celler ved detektering af sekretionen af p52 til det ydre medium, f.eks. næringsmedium, blod, urin eller en anden fysiologisk væske. Oncostatin-A kan derfor anvendes til at kontrollere en værts tilstand og forekomsten eller fraværet af en neoplastisk tilstand. Oncostatin-A kan an-10 vendes til at diagnosticere, om en tumor eksisterer, til at kontrollere kirurgi, niveauer af metastase eller lignende. Det oncostatin-A-lignende stof vil blive indgivet in vitro eller in vivo (kulturmedium eller vært) i en tilstrækkelig mængde til at inducere sekretionen af p52.

15 Væske forbundet med systemet vil derpå blive kontrolleret for tilstedeværelsen af p52 som en indikation af tilstedeværelsen af neoplastiske celler.

Oncostatin-A-lignende materialer kan også anvendes til at 20 stimulere immunsystemet, enten i sig selv, men fortrinsvis sammen med andre lymphokiner, f.eks. interferon, nærmere bestemt γ-interferon. Således kan de oncostatin-A-lignende materialer sammensættes med andre polypeptider og indgives en vært, som er immunoundertrykt, for således 25 at stimulere immunsystemet, y-Interferon vides at inducere la-ekspression i monocyter og makrofager såvel som andre væv, såsom endothelium og fibroblaster. De oncostatin-A-lignende materialer inducerer la-ekspression og stimulerer γ-interferon-Ia-induktion, hvorved de forhøjer 30 effektiviteten af en given dosis af γ-interferon. Der vil almindeligvis blive anvendt en mængde oncostatin-A-lignende materialer, som tilvejebringer en koncentration i mediet i området fra omkring 1 til omkring 200 ng/ml, fortrinsvis fra omkring 2 til omkring 70 ng/ml. Mængden 35 af y-interferon vil være konventionel med hensyn til dets anvendelse som lymphokin og vil almindeligvis være i om- 11 DK PR 172463 B1 rådet fra omkring 0,5 til omkring 200 ng/ml. Forøgelser i ekspressionen af la på mindst omkring 1,5 gange, og sædvanligvis mindst 2 gange, kan opnås med oncostatin-A-lignende materialer, når de anvendes for sig selv eller 5 sammen med andre lymphokiner. Indgivningen kan foretages som beskrevet tidligere.

De oncostatin-A-lignende materialer kan også anvendes sammen med kinaser, især pp60 src, til at ændre enzymets 10 substratspecificitet. Især kan der, ved at enzymet brin ges i kontakt med små mængder af et oncostatin-A-lignende materiale, især i koncentrationer på fra omkring 0,05 til omkring 50 pg/ml, frembringes en forhøjelse af kinaseak-tiviteten, herunder en ændring i de iagttagne aminosyrer, 15 som phosphoryleres; især phosphoryleres foruden tyrosin også serin. På denne måde kan kombinationen med pp60 src eller analoge kinaser anvendes til at modificere polypep-tider indeholdende tyrosin- og serinrester ved at tilvejebringe phosphorylering af både tyrosin og serin med 20 forhøjet hastighed.

De omhandlede oncostatin-A-lignende materialer kan også anvendes som haptener eller antigener, f.eks. haptener forbundet med en immunogenisk forstærker, f.eks. et anti-25 gen, en partikel eller lignende, til produktion af mo-noklonale antistoffer eller polyklonale sera. Antistofferne kan finde udbredt anvendelse, især til diagnostiske formål. Antistofferne kan anvendes i sig selv eller sammen med oncostatin-A-lignende materialer som reagenser 30 til detektion af oncostatin-A og oncostatin-A-receptorer, herunder antistoffer over for oncostatin-A.

En lang række forskellige forskrifter og teknikker er til rådighed til bestemmelse af analytter af interesse. Disse 35 teknikker involverer en række forskellige mærker, herunder enzymer, radionuclider, fluorescensfrembringere, che-

O

12 DK PR 172463 B1 miluminescensfrembringere, enzymsubstrater, enzyminhibitorer, partikler og lignende. Fremgangsmåderne kan involvere et adskillelsestrin (heterogent) eller intet adskillelsestrin (homogent). Mærket kan være kovalent bundet 5 til enten det oncostatin-A-lignende materiale eller antistoffet over for det oncostatin-A-lignende materiale (anti-oncostatin-A) eller kan konjugeres til et antistof rettet mod anti-oncostatin-A, f.eks. mod Fc-kæden af anti-oncostatin-A. Hele antistoffet kan anvendes eller 10 fragmenter deraf, inklusive Fab, F(ab)'2·, Fv eller lignende. Der er udstedt et antal US patenter, som beskriver en lang række forskellige diagnostiske teknikker, som kan anvendes ved udøvelsen af denne opfindelse. Eksempler på nogle få af disse patentskrifter er US patentskrifterne 15 nr. 3 766 162, 3 791 932, 3 817 837, 3 996 345 og 4 233 402. Særlige typer af prøvninger inkluderer RIA, EIA, EMIT , ELISA, SLFIA og FIA, der alle har fundet kommerciel anvendelse, og for hvilke reagenser er til rådighed for andre analytter. De forskellige reagenser kan 20 leveres i sæt, hvor reagensernes art og deres relative mængder er udvalgt med henblik på optimering af prøvningens følsomhed.

Antistofferne kan fremstilles på konventionelle måder i 25 overensstemmelse med fremstillingen af monoklonale antistoffer eller polyklonale sera. I hvert tilfælde vil en passende vært blive indiceret med et immunogen, som har et eller flere epitopiske steder af interesse, sædvanligvis efterfulgt af en eller flere booster-injektioner. Med 30 henblik på polyklonale antisera må værten blodtappes, og globulinfraktionen isoleres. Globulinfraktionen kan renses yderligere ved affinitetschromatografi. Med henblik på monoklonale antistoffer vil værten blive immuniseret som før, men i dette tilfælde vil milten normalt blive 35 udtaget og sammensmeltet med en passende fusionspartner.

Efter selektion af hybridomer, som udtrykker det ønskede 13 DK PR 172463 B1 antistof, vil hybridomerne blive underkastet begrænsende fortynding, efterfulgt af selektion og kloning og yderligere karakterisering.

5 Antistofferne ifølge opfindelsen kan være enhver af de typer, som forekommer naturligt, såsom IgA, IgD, igE og IgM, især IgM og de forskellige undertyper af IgG, dvs.

IgGl, 2, 3 eller 4.

10 De resulterende monoklonale antistoffer kan anvendes som immunogener til fremstilling af anti-idiotype antistoffer, som vil have konformationslighed med materialerne af oncostatin-A-type. Disse kan derpå anvendes som erstatningsreagenser for materialer af oncostatin-A-type ved en 15 række anvendelser.

Oncostatin-A kan opnås ved ekstraktion af blodplader med tilnærmelsesvis 0,3 M ethanolisk hydrogenchlorid. Som inhibitorer over for nedbrydning kan der også inkluderes 20 phenylmethylsulfonylfluorid og aprotinin, det førstnævnte i niveauer på fra omkring 1 til omkring 10 vægt-% af den ekstraherende blanding, og det sidstnævnte i niveauer på fra omkring 0,1 til omkring 1 TIU/mg (TIU: trypsininhibe-ringsenheder) af den ekstraherende blanding. Efter forhø-25 jelse af pH-værdien til omkring 5 under anvendelse af vandigt ammoniumhydroxid tilsættes en lille mængde ammoniumacetat, og opløsningen klares ved centrifugering eller på anden hensigtsmæssig måde.

30 Proteinet udfældes derpå ved successiv anvendelse af koldt ethanol (95 %) og ether, bundfaldet opsamles og dialyseres med 0,1 - 0,5 N eddikesyre under anvendelse af en dialysemembran med en afskæring under ca. 3000 Mr. Resten lyophiliseres, gensuspenderes i 1 N eddikesyre, kla-35 res og er derefter parat til yderligere rensning ved gel-permeationschromatografi under anvendelse af Biogel P-10.

14 DK PR 172463 B1

Produktet elueres med omkring 1 M eddikesyre, og de forskellige fraktioner kontrolleres under anvendelse af en passende prøvningsteknik, f.eks. tumorvækstinhibering.

5 Fraktionerne, som har den vækstinhiberende aktivitet, lyophiliseres, gensuspenderes i fortynder vandig trifluo-reddikesyre, pH 2 - 3, klares og chromatograferes derefter på en højtryksvæskechromatograf, hvor siliciumdioxid-pakningen har et overtræk af en lang alifatisk kæde på 10 fra omkring 16 til omkring 20 carbonatomer, f.eks. 18 carbonatomer. Søjlen ækvilibreres med fortynder trifluoreddikesyre (0,02 - 0,1 %), og produktet elueres med en acetonitrilgradient på op til 60 % acetonitril i fortyndet (0,01 - 0,1 %, sædvanligvis fra omkring 0,04 - 0,05 15 %) trifluoreddikesyre. Der anvendes en relativt langsom gennemstrømningshastighed, almindeligvis på fra omkring 0,5 til 1 ml/min ved stuetemperatur. Fraktionerne kan prøves ved den tidligere angivne bioprøvning eller andre bioprøvninger. Til yderligere rensning kan det fra søjlen 20 opnåede produkt renses under anvendelse af højtryks-geleksklusions-chromatografi.

Hovedtoppen af oncostatin-A-aktivitet udskilt ved Novapak C1B revers fase væskechromatografi lyophiliseres og gen-25 suspenderes i 100 μΐ 40 % acetonitril indeholdende 0,1 % trifluoreddikesyre. Prøven injiceres i en hydroxyleret-polyether-gelsøjle (Bio Rad TSK-250) og elueres med en mobil fase bestående af 40 % acetonitril i 0,1 % trifluo-reddikesyre. Aliquoter af hver fraktion lyophiliseres og 30 prøves for oncostatin-A-aktivitet; tumorcelleinhiberings-aktiviteten elueres sammen med peptid-hovedtoppen (Rf 0,9), som også i molekylvægt svarer til molekylvægten af den 6000 Mr insulinmarkør, som anvendes til at kalibrere dette chromatografiske system.

35 15 DK PR 172463 B1

Produktet opnået fra søjlen kan underkastes elektroforese under anvendelse af SDS-PAGE. Båndet ved en molekylvægt på 6000 - 8000 isoleres. Båndet vises at have stærk væk-stinhiberende aktivitet over for neoplastiske pattedyr-5 celler.

I stedet for at isolere oncostatin-A fra naturlige kilder eller syntetisere polypeptidet eller dets artsfæller på en fast bærer, kan oncostatin-A fremstilles ved hybrid-10 DNA-teknologi. Strukturgenet for oncostatin-A kan opnås fra værtscellegenomet under anvendelse af sonder fremstillet på basis af aminosyresekvensen. Et genomisk bibliotek kan gennemsøges under anvendelse af sonden (som kan være passende redundant), hybridiserende fragmenter 15 isoleres, og fragmenterne reduceres i størrelse og karakteriseres ved restriktionskortlægning og sekvensbestemmelse.

Alternativt kan en DNA gennemsøges analogt med det geno-20 miske bibliotek, og hvis fuldstændige eller delvise strukturgener isoleres, kan disse anvendes, i sidstnævnte tilfælde ved anvendelse af et tilpasningsstykke til at erstatte de manglende codoner.

25 Hensigtsmæssigt kan der syntetiseres et syntetisk gen.

Ved anvendelse af et syntetisk gen opnås væsentlig fleksibilitet derved, at der kan anvendes af værten foretrukne codoner og kan indføres unikke eller sjældne restriktionssteder. Restriktionsstederne tilføjer en grad af 30 fleksibilitet ved modificering af forskellige portioner af genet til indførelse af deletioner, flytninger, ombytninger, indsætninger og lignende. Der udformes en strategi under anvendelse af enkeltstrengede overlappende fragmenter, som kan blandes sammen i et hybridiserende lige-35 ringsmedium uden forstyrrende heteroduplex-dannelse. Det resulterende dobbeltstrengede gen kan derpå klones og 16 DK PR 172463 B1 renses. Et eksempel på en sekvens er anført i den eksperimentelle del.

Ønskeligt er genets ender forskellige for at sikre den 5 rette orientering efter indsætning. Genet kan indsættes i en passende ekspressionsvektor til ekspression. Et stort antal vektorer er til rådighed til ekspression i proka-ryoter og eukaryoter, såsom svampe, f.eks. gær, eller pattedyrceller, f.eks. museceller, primatceller osv. Re-10 plikationssystemet kan afledes fra plasmider, virus eller chromosomer. Belysende replikationssystemer inkluderer ColEl, λ, RSF1010, 2 pm plasmid, SV40, adenovirus, okse-papillomavirus osv.

15 Foruden mindst ét replikationssystem, hvor der ønskes episomal opretholdelse (der kræves intet replikationssystem, hvis der ønskes integration), vil der sædvanligvis være en markør til stede, som muliggør selektion af værten indeholdende det ønskede gen. Markøren vil sædvanlig-20 vis tilføres biocidresistens, f.eks. antibiotica eller tungmetaller eller komplementering af prototrofi til en auxotrof vært. En eller flere markører kan være til stede, sædvanligvis ikke mere end tre.

25 Strukturgenet vil blive lokaliseret, sædvanligvis ved indsætning i en polylinker (en sekvens med flere restriktionssteder), mellem transcriptions- og translationsstart og -afslutningsregulerende områder, der genkendes af ekspressionsværten. Ved passende valg af transcriptions-30 startområdet kan transcriptionen være konstitutiv eller inducerbar. Et stort antal promotorområder er blevet isoleret og vist at være nyttige, såsom E. coli trp og lac promotoren, 1PL og P„ promotorerne, gær-glycolytiskenzym-promotorerne, de tidlige og sene promotorer fra SV40 og 35 adenovirus og lignende.

17 DK PR 172463 B1

Desuden kan der fremstilles et sammensmeltet gen ved tilvejebringelse af en 5'-sekvens til strukturgenet, som koder for et sekretorisk leder- og forarbejdningssignal.

Belysende sekretoriske ledere, som er blevet beskrevet, 5 inkluderer de sekretoriske ledere for penicillinase, a-faktor, immunoglobuliner, T-celle-receptorer, ydre membranproteiner og lignende. Ved fusion i rigtig aflæsningsramme kan det modne oncostatin-A eller artsfællen secerneres til mediet.

10

Konstruktionen indeholdende strukturgenet og flankerende områder, der tilvejebringer reguleringer af ekspressionen, kan indføres i ekspressionsværten ved ethvert hensigtsmæssigt middel, f.eks. transformation med f.eks.

15 calcium-phosphatfældet DNA, transfektion, transduktion, konjugation, mikroinjektion osv. Værten kan derpå dyrkes til en høj tæthed i et passende næringsmedium. Hvor promotoren er inducerbar, vil der derefter blive anvendt fremmende betingelser, f.eks. temperaturændring, udpining 20 eller overskud af et metabolisk produkt eller næringsstof eller lignende.

Hvor produktet tilbageholdes i værten, indhøstes cellerne, lyseres, og produktet isoleres og renses ved ekstrak- 25 tion, udfældning, chromatografi, elektroforese osv. Hvor produktet secerneres, kan næringsmediet opsamles, og produktet isoleres på konventionel måde, f.eks. ved affini-tetschromatografi.

30 Foruden at blive anvendt til ekspression kan strukturgen-sekvenserne anvendes som sonder til hybridisering og de-tektion af duplexerende sekvenser. F.eks. kan tilstedeværelsen og mængden af mRNA detekteres i værtsceller.

35 De følgende eksempler tjener til belysning af opfindelsen.

18 DK PR 172463 B1

Eksperimentel del

Forkortelser: DMEM = Dulbecco's modificerede Eagle's medium; PBS = phosphatpufret saltopløsning; P/S - penicil-5 lin/streptomycin (0,57 mg/ml, hver); FCS = føtalt kalveserum; SDS-PAGE » natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese.

RENSNING AF 0NC0STATIN-A

10

Syre-ethanol-ekstraktion fra humane blodplader

Friske eller frosne blodplader (50 g våd vægt) optøet ved stuetemperatur blev gensuspenderet i to volumener af: 375 15 ml ethanol (95 %), 7,5 ml kone. HC1, 33 mg phenyl methylsulfonylfluorid og 1 ml aprotinin (23 TIU/ml; fra oksetunge, Sigma Chemical Co. A6012). Blandingen blev omrørt ved 4 °C natten over, centrifugeret med 8000 omdr./min i Beckman type 19 rotor i 30 minutter, og su-20 pernatanten udtaget. Supernatantens pH-værdi blev ind stillet med koncentreret ammoniumhydroxid til 4,0, og pH-værdien blev hævet til 5,2 under anvendelse af en 1:10 fortynding af koncentreret ammoniumhydroxid. Efter tilsætning af 1 ml 2 M ammoniumacetat (pH 5,2) pr. 0,1 liter 25 supernatant blev opløsningen centrifugeret ved 8000 omdr./min i type 19 rotor i 30 minutter. Supernatanten blev udtaget, der tilsattes et 2 X volumen koldt 95 % ethanol, efterfulgt af et 4 X volumen kold diethylether, og blandingen fik lov at stå natten over ved 0 °C. Bund-30 faldet blev opsamlet ved centrifugering ved 8000 omdr./min i type 19 rotor i 30 minutter, og pillen blev suspenderet i omkring 10 - 20 ml 1 M eddikesyre. Eddikesyredispersionen blev dialyseret i udstrakt grad over for 5 liter X 2 udskiftninger af 0,2 M eddikesyre i et Spec-35 trapor-dialysemembran (nr. 3)-rør (afskæring 3500 Mr) (American Scientific Products). Ekstrakten blev lyophili- 19 DK PR 172463 B1 seret, gensuspenderet i 7,5 ml 1 M eddikesyre, efterfulgt af centrifugering ved 30000 omdr./min.

Gelpermeationschromatografi 5

Biogel P-10 (partikelstørrelse svarende til maskevidde 37 - 74 μπι; Bio Rad Labs) blev opkvaeldet natten over i 1 M eddikesyre, afgasset fuldstændigt og derpå hældt i en 100 x 2,5 cm siliconeovertrukket glaskolonne og fik lov at 10 ækvilibrere natten over med 1 M eddikesyre. Alle opløsninger blev afgasset før brugen.

De syre-ethanol-solubiliserede peptider (50 - 70 mg protein) fra 25 g humane blodplader blev opløst i 7,5 ml 1 M 15 eddikesyre og sat på den ovenstående kolonne. Fraktioner (3,5 ml) blev opsamlet, og aliquoter blev lyophiliseret og prøvet for inhibering af 5-125I-iod-2'-deoxyuridin-inkorporering i A549 humane lungecarcinoma-celler.

20 Revers- fase høj tryksvaeskechromatoqrafi

Fraktionen indeholdende toppen af tumorvækstinhiberende aktivitet (omkring 200 ng protein) fra den ovennævnte kolonne blev lyophiliseret og gensuspenderet i 0,05 volu-25 men-% trifluoreddiesyre. Kolonnen blev derpå elueret med en lineær 0,60 % gradient af acetonitril i 0,045 trifluo-reddikesyre med en strømningshastighed på 0,8 ml/min ved 23 °C. Aliquoter af hver fraktion blev lyophiliseret og prøvet tredobbelt, som beskrevet ovenfor.

30

Fraktionerne indeholdende den inhiberende aktivitet blev derpå opløst i 40 % acetonitril indeholdende 0,1 % tri-fluoreddikesyre og påsat en hydroxyleret-polyether-gel-kolonne (Bio Rad TSK-250) og elueret med en mobil fase af 35 40 acetonitril i 0,1 trifluoreddikesyre. Fraktioner blev opsamlet, lyophiliseret og prøvet tredobbelt for vækst- 20 DK PR 172463 B1 inhiberende aktivitet. Aktiviteten elueres i den fraktion, hvor insulinmarkøren elueres, og svarer til en molekylvægt på 6 - 8 kDal.

5 De fraktioner, som havde den højeste aktivitet, blev derpå underkastet elektroforese under anvendelse af SDS-PAGE som følger:

Peptidet svarende til hoved-oncostatin-A-aktiviteten fra 10 revers-fase HPLC-rensningstrinnet blev lyophiliseret, gensuspenderet og kogt (2 min) i 0,03 ml af en prøvepræparationspuffer indeholdende 12,5 mM "Tris"-Cl pH 6,7, 4 % SDS, 10 % β-mercaptoethanol, 20 % glycerol og 0,01 bromphenol-blåt. Prøven blev sat på en 5 % polyacrylamid-15 stabelgel hældt over en 17 - 27 % polyacrylamidgradient-pladegel indeholdende 0,1 % SDS, ved pH 8,8. Gelen blev kørt ved 10 mA, indtil prøverne vandrede igennem stabel-gelen, og ved 20 mA, indtil farvefronten vandrede til bunden af gelen. Gelerne blev fikseret og farvet natten 20 over i en opløsning af 0,2 % Coomassieblåt, 50 % methanol og 9 % eddikesyre. Følgende affarvende, Coomassie-positi-ve bånd blev lokaliseret under anvendelse af et Hoffer-densitometer. Markører inkluderede insulin (6000 Mr), trypsinogen (24500 Mr), RNAse (13700 Mr) og aprotinin 25 (6500 Mr). Hovedpeptidet vandrede sammen med 6500 Mr aprotininstandarden under disse elektroforesebetingelser.

Den anvendte prøvning var som følger: på den anden dag om morgenen blev der opsat A549-celler (humant lungecarcino-30 ma) i Nunc 96 hullers plader (Kamstrupvej 90, DK-4000

Roskilde, Danmark). Disse celler blev videreført, når der var færre end 30. I alle undtagen de perifere huller blev der indført 45000 celler/50 μΐ/hul (9 x 104 celler pr. ml DMEM med 10 % FCS, P/S, glutamin). De perifere huller 35 modtog 50 μΐ PBS, og hele pladen blev inkuberet ved 37

°C. Om eftermiddagen blev prøverne gensuspenderet i DMEM

21 DK PR 172463 B1 med 10 % FCS, P/S, glutamin til tredobbelt prøvning. I hvert prøvehul blev der indført 50 μΐ, medens kontrolhuller modtog 50 μΐ DMEM, og pladen blev inkuberet ved 37 °C i 3 dage. På den fjerde dag blev der i hvert hul indført 5 50 ml af en opløsning af 125I-iod-2'-deoxyuridin (4 Ci/mg; 0,5 mCi/ml) (1 μΐ isotop/ml DMEM indeholdende 10 % FCS, P/S, glutamin), og pladen blev inkuberet ved 37 °C natten over. På den femte dag blev mediet suget op fra hullerne, og de blev vasket 1 X med PBS, tilsat 100 μΐ methanol, 10 methanolet fik lov at stå i 10 minutter efterfulgt af opsugning af methanolet. Til hullerne sattes derpå 200 μΐ 1 M natriumhydroxidopløsning, pladen blev inkuberet i 30 minutter ved 37 °C, og derpå blev natriumhydroxidopløsningen fjernet med Titertek propper (Flow Labs). Propper-15 ne blev derpå talt for radioaktivitet i en γ-tæller.

For at påvise effektiviteten af det ovenfor fremstillede oncostatin-A blev der udført følgende prøvning. Prøvningen betegnes som koloniinhibering i blød agar. De anvend-20 te materialer er 5 % agar (3,75 g Nobel-agar (Difco)), 75 ml destilleret vand autoklaveret i en 125 ml Wheatonfla-ske, DMEM med 10 % FCS, 100 U penicillin, 100 U streptomycin, 200 mM glutamin og humane melanomaceller (A375).

25 Materialerne, som prøves, lyophiliseres i et sterilt 12 x 75 mm reagensglas. Der fremstilles en 1:10 fortynding af den 5 % agar med DMEM, og den opvarmes til 46 °C i et vandbad. Der fremstilles et basislag ved pipettering af 1 ml 0,5 % agaropløsning i hvert hul på en 6-hullers kul-30 turplade (35 x 14 mm). Laget får lov at stå ved stuetemperatur, indtil det størkner. SA6-celler fremstilles ved trypsinering, og antallet af celler tælles. Cellerne fortyndes til en slutkoncentration på 1 x 104 celler pr. ml, og 0,35 ml celler sættes til hvert prøvningsreagensglas.

35 22 DK PR 172463 B1 I hvert af 10 prøvningsreagensglas pipetteres 0,750 ml af en 0,5 % agaropløsning, blandingen omrystes let, og indholdet af prøvningsreagensglasset (prøve, celler, agar) hældes ud på basislaget og får lov at stå i omkring 20 5 minutter ved stuetemperatur, indtil agaren størkner. Pladerne kan derpå opbevares ved 37 °C i en befugtet inkuba-tor med 5 % carbondioxid.

Pladerne undersøges for inhibering af kolonivaekst efter 3 10 dage og op til 10 dage afhængigt prøvematerialets styrke.

Antallet af kolonier tælles i 8 tilfældige lavstyrkemikroskopi- felter . Når pladerne skal holdes længere end 5 dage, lægges endnu et 1 ml lag af 0,3 agaropløsning over prøvelaget for at forhindre udtørring af prøvelaget.

15

Den ovenstående procedure blev anvendt med forskellige koncentrationer af det rensede oncostatin-A. Den følgende tabel viser resultaterne, idet den angivne mængde oncostatin-A er den lyophiliserede mængde indført i reagens-20 glasset. Resultaterne er anført som % maksimal inhibering.

TABEL I

25 Oncostatin-A

lopiong Maksimal inhibering 0,8 45 30 0,26 73 20 81 60 100

Det fremgår klart af de ovenstående resultater, at det pågældende polypeptid er en kraftig inhibitor af celle- 35 23 DK PR 172463 B1 vækst. Baseret på de iagttagne resultater med melanoma-cellerne er omkring 1 ng tilstrækkeligt til at give omkring 50 % inhibering. Den pågældende forbindelse kan derfor finde bred anvendelse til inhibering af celle-5 vækst, herunder neoplastisk cellevækst. F.eks. kan den pågældende forbindelse også inhibere en lang række dyrkede humane tumorceller, men ikke normale ikke-neoplastiske humane forhudsfibroblaster som vist i den følgende tabel.

10 TABEL II

Virkning af oncostatin-A på in vitro DNA- _syntese i dyrkede humane celler_

Cellelinie % Maksimal* inhibering af ,Z5I-deoxyuridin- _inkorporering_

Transformeret

Humant carcinoma fra lunge (A549) 100

Humant adenocareinoma fra lunge (H125)

Humant melanoma (A375) 67

Humant carcinoma fra bryst (MCF-7) 37

Ikke-transformeret

Human forhuds-fibroblast (HuF pS) 0 * Under anvendelse af de beskrevne prøvningsbetingelser overskrider den maksimale inhibering af l25I-deoxyuri-15 din-inkorporering i A549-celler, som iagttages ved mætningskoncentrationer af oncostatin-A (100 ng/hul), ikke 50 % i forhold til ubehandlede kontrolkulturer.

Virkninger af oncostatin-A på væksten af humane cancer-20 celler i athymiske mus

Unge (8-10 uger) athymiske mus blev indiceret subcutant i det inguinale område med 5 x 106 humane lungecarcinoma-celler (A549) suspenderet i 100 μΐ phosphatpufret saltop- 24 DK PR 172463 B1 løsning (PBS). Syv dage efter indpodningen udvikledes palpatoriske tumorer på 2,5 - 3,0 mm i diameter; tumorbærende mus blev tilfældigt udvalgt fra denne population og på den 7. dag indiceret subcutant på tumorstedet med 50 5 μΐ PBS indeholdende 0,30 pg oncostatin-A renset til homogenitet fra humane blodplader, som tidligere beskrevet. Injektion af tumorbærende kontrolmus med PBS uden onco-statin-A påvirkede ikke tumorvæksten. Tumorbærende mus blev derefter injiceret med en ækvivalent dosis oncosta-10 tion-A i 50 μΐ PBS på den 11. dag og den 16. dag efter indpodningen af A549-celler. Disse doser af oncostatin-A blev injiceret direkte i tumormassen under anvendelse af en 30 1/2"g nål. Tumorstørrelsen blev kontrolleret på de angivne dage ved måling af tumorer i både vandret og lod-15 ret dimension med en krumpasser. Resultaterne er afbildet i fig. 1, hvor tumorstørrelsen langs ordinaten repræsenterer produktet af disse to dimensioner.

Specifik afgivelse af et 52000 Mr polypeptid fra oncosta-20 tin-A-behandlede humane lungecancerceller

Humane lungecarcinomaceller (A549) blev behandlet med oncostatin-A (200 ng/ml kultur), og virkningen på polypep-tider afgivet til cellekultursupernatanten blev bestemt.

25 Behandlede kulturer og kontrolkulturer (intet oncostatin-A) blev pulseret med 1S-methionin (5 pCi/ml S.A.; 800

Ci/mmol) ved tiden 0 (tilsætning af oncostatin-A eller medium alene (kontrol). Tolv timer senere blev kultursu-pernatanterne fjernet og klaret først ved lav hastighed 30 (1500 x G i 15 minutter) derpå ved høj hastighed (30000 x G i 1 time). Polypeptider blev udfældet fra de klarede supernatanter med trichloreddikesyre (TCA) efterfulgt af PAGE på 12,5 % acrylamid-pladegeler.

Radioautografi af gelen påviste tilstedeværelsen af et 52000 Mr 1S-methionin-mærket polypeptid i supernatanter 25 DK PR 172463 B1 fra A549-celler behandlet med oncostatin-A, medens ubehandlede cancerceller kun frigjorde minimale mængder af dette protein (en forøgelse på mindst 10 gange blev set efter oncostatin-A-behandling). Ingen andre kvalitative 5 eller kvantitative forskelle blev set mellem behandlede kulturer og kontrolkulturer.

Stimulering af pp60 src autophosphorylering ved hjælp af oncostatin-A

10 pp60 src blev renset ved immunoaffinitetschromatografi som beskrevet (Erickson et al., Proc. Nalt. Acad. Sci.

USA (1979) 76:6260-6264; Erickson et al., Cold Spring

Harbor Symp. Quant. Biol. (1979) 44:902-917. 5 μΐ renset 15 enzym tilnærmelsesvis 0,47 pmol) blev inkuberet med 100 ng renset homogent oncostatin-A i et endeligt reaktionsvolumen på 30 μΐ indeholdende 20 mM ATP, 5 mM MgCl2, 10 mM "Tris"-Cl pH 7,2 i 30 minutter ved 30 °C. Reaktionerne blev afsluttet ved tilsætning af 2 x prøvepuffer og 20 analyseret ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese som beskrevet (Laemmeli, U.K., Nature (1970) 227:680-685). Autoradiografi af pladegelerne viste øjensynligt en 10 ganges stimulering i autophosphorylering af pp60 src. Forøgelsen i phosphorylering var ikke begrænset til tyrosin-25 rester, men fandtes også i serinpositioner i src enzymet.

Virkninger af oncostatin på makrofag la antigenekspression 30 Wehi-3 er en muse-makrofag-cellelinie, som kan induceres af γ-interferon (γ-IFN) til at udtrykke H2 klasse II antigener. Trækkene ved denne induktion er blevet undersøgt af flere laboratorier og vist at være en nøjagtig gentagelse af normal makrofag-induktion. Disse celler blev 35 dyrket enten med eller uden en lav mængde γ-IFN med flere koncentrationer af blodplade-oncostatin-A. Både i nærvær 26 DK PR 172463 B1 og i fravær af γ-IFN viste oncostatin-A en dosisafhængig forhøjelse af klasse II antigen målt ved direkte immu-nofluorescens på en FACS. Størrelsesordenen af oncosta-tin-A-virkningen var almindeligvis en fordobling ved de 5 anvendte koncentrationer (omkring 2 til omkring 70 ng/ml).

FREMSTILLING AF MONOKLONALE OG POLYKLONALE ANTISTOFFER SPECIFIKKE FOR ONCOSTATIN-A

10

Tværbinding af oncostatin-A til bakterielipopolysaccharid

Proceduren for tværbinding af oncostatin-A til bakterielt lipopolysaccharid er en modifikation af den metode, der 15 er udviklet af Primi and Cazenave, J. Immunol. (1982) 129(3):1124-1129.

10 ng oncostatin-A og 12,5 ng bakterielt lipopolysaccharid (LPS; Sigma No. L-263) blev fortyndet til et volumen 20 på 500 μΐ med destilleret vand. Der blev tilsat 50 μΐ 2,5 % glutaraldehyd i PBS, og blandingen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 50 μΐ 2 M glycin i PBS og inkubering af blandingen ved stuetemperatur i 1 time. Oncostatin-A/LPS-25 konjugatet blev fortynder med 10 ml blandet-lymphocyt-konditioneret medium, og et filter blev steriliseret til anvendelse ved en in vitro immunisering.

In vitro immunisering af Balb/c splenocyter med oncosta-30 tin-A/LPS-konjugat_

Ikke-immune splenocyter blev immuniseret in vitro under anvendelse af en modifikation af den procedure, der er beskrevet af Reading, Immunol. Meth. (1982) 53:261-269.

35 27 DK PR 172463 B1

Blandet-lymphocyt-konditioneret (MLC) medium blev fremstillet ved dyrkning af lige store antal Balb/c og C57 sort-mus-thymocyter i DMEM indeholdende 2 % kaninserum ved 4 x 106 celler/ml i 48 timer. Mediet blev opsamlet og 5 opbevaret ved -20 :C.

Peritoneal-exudat-celler (PEC) blev opsamlet ved skylning af en thioglycollat-behandlet Balb/c mus med steril PBS. PEC-cellerne blev anbragt i kultur med 1 museækvivalent 10 splenocyter og 10 ml MLC-medium indeholdende 10 ng onco-statin-A/LPS-konjugat. Cellerne blev dyrket i 7 dage.

Produktion af monoklonale antistoffer 15 Immun-splenocyterne blev opsamlet og sammensmeltet med SP2/0 myelomaceller i et forhold på 1:1 til frembringelse af hybridomer, som syntetiserer oncostatin-A-specifikke monoklonale antistoffer. Hybridomerne blev prøvet for produktion af oncostatin-A-antistoffer ved en enzym- for-20 bundet immunoprøvning (ELISA). Positive hybridomer blev klonet to gange ved begrænsende fortynding. Klonerne blev ekspanderet, prøvet for immunoglobulinklasse og indiceret i Balb/c mus til ascites-produktion.

25 40 positive hybridoma-kloner blev ekspanderet fra starten og prøvet igen for anti-oncostatin-A-aktivitet. Syv af de mest reaktive kloner blev anvendt til at producere asci-tesvæske i Balb/c mus. De resterende kloner blev ekspanderet og frosset. Ascitesvæsken blev prøvet for specifΙ-ΒΟ citet over for oncostatin-A, et oncostatin-A-peptid/KLH-konjugat og BSA ved en ELISA. Ascitesvæsken reagerede med både oncostatin-A og i mindre udstrækning oncostatin-A-peptid i fortyndinger på 1:3000. Immunoglobulinerne blev renset ved caprylsyrefældningsmetoden beskrevet af Russo 35 et al., Anal. Biochem. (1982) 65:269-271. Paragon-analyse af immunoglobulinerne og dobbeltdiffusions Ouchterlony- 28 DK PR 172463 B1 analyse viste, at alle immunoglobulinerne var af typen IgM.

ELISA-prøvning for oncostatin-A 5

Oncostatin-A blev fortynder i 0,1 M eddikesyre, og 10 ng/hul blev pipetteret ned i en 96 hullers Dynatech Im-mulon-plade. Opløsningen blev tørret ned natten over ved stuetemperatur. Pladen blev blokeret ved inkubation af 10 hullerne med 2,5 % BSA, 2,5 % føtalt okseserum (FCS) i PBS ved 37 °C i 1 time. Pladen blev derpå vasket to gange med 2,5 % FCS i PBS. Hybridomamediet, immunoglobulinet eller antiserummet tilsattes derpå i den passende fortynding. Pladerne blev derefter inkuberet ved 37 °C i 2 ti-15 mer og vasket tre gange med 2,5 % FCS i PBS. Avidin-biotin-HRP ELISA-reagenser fra Vector Labs. blev anvendt ifølge producentens anvisninger. Hullerne blev vasket med 2,5 % FCS i PBS mellem hvert trin. De positive huller blev visualiseret ved tilsætning af 0,4 mg/ml ortho-20 phenylendiamin i 0,1 M natriumcitratopløsning indeholden de 4 μΐ 30 % hydrogenperoxid/10 ml opløsning. Reaktionen fik lov at fortsætte i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 50 μΐ 1,4 N H2S04/hul.

25

Produktion af polyklonalt anti-oncostatin-antiserum

Balb/c mus blev immuniseret med nitrocellulose-immobili-seret oncostatin-A. Formålet med denne immuniserings-30 forskrift er at undgå hurtig fjernelse af polypeptidet hos værten. På denne måde kan immunisering frembringes med meget små mængder oncostatin-A.

En opløsning af oncostatin-A i 0,1 M eddikesyre blev 35 prikket på små stykker nitrocellulose (Schleicher &

Schuell, 0,45 μπι) og fik lov at tørre. Stykkerne af ni- 29 DK PR 172463 B1 trocellulose blev anbragt i peritonealhulrummet hos tre Balb/c mus til den begyndende immunisering (0,375 ng/mus). (Musene blev også givet en intraperitoneal injektion af 0,1 ml "complete Freund's adjuvant) Musene 5 blev forstærkningsimmuniseret to gange ved 2 ugers intervaller med nitrocellulose-immobiliseret oncostatin. Til forstærkningerne blev nitrocellulosen hakket, homogeniseret med 0,1 ml vand og 0,1 ml "incomplete Freund's adjuvant" og indiceret subcutant (0,125 ng/mus). Museserae-10 ne blev prøvet for specificitet over for oncostatin-A ved den tidligere beskrevne ELISA-prøvning med peberrodpero-xidase-konjugeret protein A anvendt som reagenset i andet trin. Seraene blev prøvet over for oncostatin-A-pep-tid/KLH-konjugat og en blokeret plade for at vise speci-15 ficitet.

Den følgende DNA-sekvens blev fremstillet på konventionel måde: 30 DK PR 172463 B1

Ncol Pscl

BssHII BKlH

GG TAC CTT CGA CTT CTT CTG CCT CTA GAC GTC ACG

CGC GCC ATG GAA CCT CAA CAA CAC CCA CAT CTG CAG TCC -39 _ met glu ala glu glu asp gly asp leu gin cys 5 / NH2

Stul

GAC ACG CAT TTT TGA TGA AGA CTC CAT TCC GGA GCA GTG

CTG TGC GTA AAA ACT ACT TCT CAG CTA ACG CCT CCT CAC -73 ^ leu cys val lys thr thr ser gin. val arg pro arg his

Xhol Nael

TAG TGT AGT GAG CTC CAT TAC TTT CGG CCG GGC GTG ACG CGC

ATC ACA TCA CTC GAG CTA ATC AAA CCC GGC CCG CAC TGC CCC -120 15 Uu thr ser ieu glu val ilu lys ala gly pro his cys pro

PvuII Nrul

TCA CCA GTC GAC TAG CGC TCA CAC TTT TTG CCA CCA TTC

ACT GCT CAG CTC ATC GCC ACT CTG ΛΑΛ AAC CCT CGT AAG -159 20 thr ala gin leu ilu ala chr leu lys asn gly arg lys

Belli Xbal Pscl

TAG ACA GAT CTG GAC GTC CGA GGC CAC ATG TTT ΤΪΓ TAC

ATC TGT CTA GAC CTG CAG CCT CCG CTG TAC AAA AAA ATC

25 ilu cys leu asp leu gin ala pro leu cyr lys lys ilu

AfIII BamHI

TAG TTT TTT GAC GAC CTT AGA ATT CCT AG

ATC AAA AAA CTG CTG GAA TCT TAA G -223 30 Hu lys lys leu leu glu ser *** \

C00H

Sekvensen er beregnet til anvendelse i E. coli, og et an-35 tal restriktionsenzym-genkendelsessteder blev udformet for at muliggøre let modifikation af kodesekvensen.

31 DK PR 172463 B1

Enkeltstrengede overlappende sekvenser blev fremstillet, kombineret i et sammensmeltende medium og ligeret til dannelse af det komplette gen med passende ender til indsætning i en ekspressionsvektor i aflæsningsfase for at 5 fremstille et fusionsprotein, hvorfra oncostatin-A kunne isoleres. De enkeltstrengede segmenter 5'-phosphoryleres med T4-polynucleotid-ligase og sammensmeltes ved kombinering af 200 pmol af hvert segment i et 30 μΐ reaktionsvolumen (30 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 1 ng/ml spermi-10 din, 100 mM "Tris"-HCl, pH 7,8 og T4-DNA-ligase. Den dobbeltstrengede DNA nedbrydes med BssHII og BamHI og renses på en 7 % nativ polyacrylamidgel.

Plasmidet ptrpED5-l (Hallewell and Entage, Gene (1980) 15 9:27; Tacon et al., Mol. Gen. Genet. (1980) 177:427) ned brydes med endonucleaserne BssHII og BamHI, og et i det væsentlige fuld-længde-fragment, som mangler trpD-genet og indeholder et afkortet trpE-gen, isoleres ved præparativ gelelektroforese.

20

Oncostatin-A-genet ligeres til det lineariserede ptrpEDS-1-plasmid til dannelse af plasmidet ptrp(Onc-A), og ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli HB101 celler. Transformanter selekteres ved ampicillinre-25 sistens, og plasmiderne analyseres ved restriktionsendo-nuclease-nedbrydning. Transformanterne dyrkes ved 37 “C til omkring 108 celler/ml i Luria-væske, og der tilsættes 3-indolyleddikesyre (IAA) til omkring 1 mM, og dyrkningen fortsættes I omkring 1 time. Aliquoter (1 ml) centrifuge-30 res i nogle få sekunder i en Eppendorf-centrifuge, og pillerne suspenderes i 500 μΐ 7 % myresyre Indeholdende 5 mg/ml cyanbromid. Efter 24 timer ved stuetemperatur fortyndes aliquoter 10 gange i vand, og de fortyndede prøver prøves for oncostatin-A. Da oncostatin-A ikke har nogen 35 indre methioninrest, giver en N-terminal methioninspalt- 32 DK PR 172463 B1 ning af fusionsproteinet oncostatin-A med den samme ami-nosyresekvens som naturligt forekommende oncostatin-A.

Det fremgår klart af de ovenstående resultater, at de om-5 handlede forbindelser finder bred anvendelse. Især kan forbindelserne anvendes til diagnose og behandling af ne-oplastiske tilstande. I terapien kan forbindelserne nedsætte hastigheden af tumorcellevækst, således at de kan anvendes i forening med andre behandlingsmåder til øde-10 læggelse af tumorceller. Til diagnose findes de omhandlede forbindelser at inducere produktion af p52, således at forhøjede niveauer af p52 efter indgivning af de omhandlede forbindelser til en vært vil være et tegn på tilstedeværelsen af tumorceller. Dette kan være meget vigtigt 15 under behandlingen af en neoplastisk tilstand for at bestemme, om fjernelsen af tumorcellerne har været heldig, eller der er opstået metastaser. De omhandlede forbindelser kan også anvendes som reagenser ved diagnostiske prøvninger for tilstedeværelsen af oncostatin-A eller on-20 costatin-A-receptorer.

Claims (3)

1. Anvendelse af oncostatin-A eller et derivat, som har en aminosyresekvens i det væsentlige ækvivalent med i det 5 mindste en portion deraf, og som udviser oncostatin-A-aktivitet ved et assay for afgivelse af p52 protein fra tumorceller, til en in vitro diagnostisk detektion af tumorceller blandt et større antal celler ved, at man bringer et større antal celler i kontakt med oncostatin-A el-10 ler det nævnte derivat deraf og detekterer den inducerede sekretion af p52 protein.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor derivatet er en analog til oncostatin-A med 60-75 aminosyrerester. 15

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor derivatet har en aminosyresekvens svarende til mindst 60 aminosyrerester af sekvensen af oncostatin-A.