DK173162B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinante polypeptider med svinevæksthormonaktivitet, rekombinant plasmidekspressionsv - Google Patents

Description

i DK 173162 B1

Den foreliggende opfindelse. angår en fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant polypeptid med svinevæksthormon (pGH) aktivitet. Opfindelsen angår yderligere en rekombinant plasmidekspressionsvektor 5 samt en E^_ coli celle bærende en sådan vektor.

Væksthormon, der er et polypeptidhormon, syntetiseres i hypofysens forlap som et større precursor-molekyle. I naturen omsættes precursormolekylet ved spaltning til opnåelse af den biologisk aktive form af 10 hormonet. Væksthormon, der er anerkendt som et generelt anabolisk middel, aktiverer en myriade af fysiologiske virkninger gennem livscyklusen. Som det ligger i navnet, er det en vækstpromotor, der er ansvarlig for knoglevækst, og det er et middel, der fremmer protein-15 syntese, væksthormon udviser også insulinforstærkende egenskaber, har svag lactogen virkning og spiller en rolle ved lipidmetabolisme og homøostatisk opretholdelse.

Væksthormon er i nogen grad artspec!fik. Bovint 20 hormon er f.eks. inaktivt i mennesker og aber, mens det vil udløse virkning i rotter og geder.

Indenfor svineopdræt fremmer administrering af væksthormon vægtforøgelse og øger kødkropskvaliteten, hvorved det øger foderomdannelsesgraden, økonomiske 25 forudsigelser viser, at kødkvaliteten forbedres sammen med produktionens effektivitet og omkostninger ved behandling af svin med væksthormon. Uheldigvis rækker forsyningen af naturligt svinehypofysehormon ikke til behovet, og i‘1be?ragtning af begrænsningerne givet ved 30 artsspecificitet kan andre naturlige homologer ikke på billig måde anvendes som substituenter.

« r i DK 173162 B1 2

Denne utilstrækkelige forsyning kan afhjælpes ved anvendelse af rekombinant DNA teknologi samt bakterier til fremstilling af analoge polypeptider, idet man følger etableret metodik. Fremgangsmåder til mikrobiel 5 produktion af svinevæksthormon er således beskrevet i EP-A-104 920, EP-A-111 389, EP-A-147 178, EP-A-173 280, EP-A-193 515 og EP-A-208 489 samt i DNA 2 (1983), 37-45. Sådanne fremgangsmåder har dog visse iboende ulemper, hvoaf en er, at eukaryotisk DNA alment er uegnet 10 til ekspression i bakterier, da det ofte indeholder ik-ke-kodende regioner eller introner, der afbryder genet.

Dette problem ses ikke ved bakterielle genomer. Andre problemer stammer fra uforligeligheden mellem eukaryo-tiske og prokaryotiske regulerende sekvenser.

15 Det er derfor et mål for opfindelsen at overvinde eller i det mindste at mildne problemerne ved den kendte teknik. Vi har især under anvendelse af de nedenfor beskrevne fremgangsmåder været i stand til at fremstille temmelig store mængder rekombinante polypeptider med 20 god svinevæksthormonaktivitet. Polypeptiderne besidder som nævnt en god aktivitet og kan benyttes in vivo som effektive erstatninger for det naturlige hormon.

I overenstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man: 25 1) i en encellet organisme indfører en rekombi nant plasmidekspressionsvektor indeholdende en DNA-sekvens kodende for dette polypeptid med pGH aktivitet, hvor denne vektor er i stand til at blive replikeret, transkriberet og translateret i 30 den encellede organisme og har en Shine-Dalgamo til ATG afstand på 14 basepar; i 3 DK 173162 B1 2) dyrker organismen, i hvilken er indført den rekombinante plasmidekspressionsvektor; og 3) eksprimerer det rekombinante polypeptid med pGH aktivitet.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særlig egnet til fremstilling af de rekombinante polypeptider pGH (met 1-190) og pGH(4-190) som nedenfor defineret.

Den nævnte rekombinante plasmidekspressionsvektor inkluderer foretrukket en trp promotor.

10 Den nævnte encellerde organisme er foretrukket E.coli. og stammen E.coli DH1 er blevet fundet som særlig velegnet.

En udførelses form for opfindelsen, ved hvilken det rekombinante polypeptid med pGH aktivitet eksprimeres 15 som et uopløseligt aggregat, er ejendommelig ved, at man yderligere: 4) isolerer de uopløselige aggregater; 5) solubiliserer de isolerede, uopløselige aggregater; og

20 6) udvinder det rekombinante polypeptid med pGH

aktivitet fra det solubiliserede aggregat.

Den rekombinante plasmidekspressionvektor til anvendelse ved de ovenfor nævnte aspekter af opfindelsen kan være en hvilken som helst egnet vektor fremstillet 25 som nedenfor beskrevet. Særligt egnede vektorer inkluderer pMG935, pMG936, pMG939 og pMG940, der beskrives detaljeret nedenfor. Mere specifikt er den rekombinante plasmidekspressionsvektor ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at den indeholder en DNA-sekvens kodende for 30 et rekombinant polypeptid med pGH aktivitet, hvor denne vektor er i stand til at blive replikeret, transkribe-ret og translateret i en encellet organisme og har en Shine-Dalgamo til ATG afstand på 14 basepar.

; DK 173162 B1 4

Det rekombinante polypeptid kodet for af DNA sekvensen indeholdt i den rekombinante plasmidekspres-sionsvektor ifølge opfindelsen er foretrukket pGH(met 1-190) eller pGH(4-190) ; den omhandlede plasmideks-5 pressionsvektor indeholder foretrukket en trp promotor; og den omhandlede plasmidekspressionsvektor er foretrukket i stand til at blive replikeret, transkriberet og translateret i E.coli.

Endelig er E.coli cellen ifølge opfindelsen ejen-10 domme lig ved, at den indeholder den omhandlede plasmidekspressionsvektor .

Trin {1)-(3) af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres ved anvendelse af velkendte fremgangsmåder, f.eks. som beskrevet i eksemplerne senere.

15 Hvor det ønskes at isolere polypeptidproduktet i overensstemmelse med trin (3), kan sædvanlige fremgangsmåder også anvendes. Efter sprængning af cellerne, f.eks. ved cellelysering, kan isolationen af polypeptidet således f.eks. udføres ved anvendelse af chromatografi 20 med ionbytterharpikser, affinitetsharpikser eller størrelses-sorterende harpikser, og/eller ved sedimentation, f.eks. centrifugering, eller ved andre kendte fremgangsmåder til oprensning af polypeptider.

I de tilfælde rekombinantpolypeptidet eksprime-25 res som et uopløseligt aggregat og/eller denatureres, kan solubilisering og/eller renaturering udføres ved sædvanlige fremgangsmåder, f.eks. som beksrevet i international patentansøgning wo 83/04418, GB patentskrift nr. 2138004 og Europæisk patentskrift nr.

30 226448.

Særligt egnede organismer til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter E. coli i 5 DK 173162 B1 stammer, især E. coli DH1, indeholdende en af de rekom-binante plasmidekspressionsvektorer pMG935, pMG936, pMG939 og pMG940, som nedenfor beskrevet.

Særligt egnede rekombinantpolypeptider fremstil-5 let ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter svinevæksthormon-varianterne pGH(met 1-190) og pGH(4-190). Begge rekombinantpolypeptider har overraskende god in vivo aktivitet i forhold til det naturligt forekommende hormon og kan anvendes i dyr, især svin, 10 f.eks. til forbedring af kødkropskvaliteten og/eller få svinene til at tage hurtigere på i vægt.

Udtrykket pGH(met 1-190) betyder, som det anvendes her, et rekombinant polypeptid med det naturligt forekommende svinevæksthormons aminosyresekvens og des-15 uden substitueret med en methioninrest ved N-terminus. Betegnelsen pGH(4-190) betyder et polypeptid med det naturligt forekommende svinevæksthormons aminosyresekvens, bortset fra at de første tre N-terminale aminosyrer (Phe-Pro-Ala-) ikke er tilstede.

20 Plasmidekspressionsvektorerne til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opnås ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i det følgende, ved disse fremgangsmåder beskrives der i almindelighed først i en serie af trin fremstillingen af plasmidvek-25 torer indeholdende DNA-sekvenser, der koder for poly-peptider med svinevæksthormon-aktivitet, hvilke sekvenser er nyttige lagringsbærere. En anden serie af trin illustrerer anvendelsen af lagringsbærere til konstruktion af plasmidekspressionsvektorer til anvendelse ved 30 fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

De beskrevne fremgangsmåder er særligt egnede for plasmidekspressionsvektorer, der kan give højniveau-ekspression af pGH(met 1-190) og pGH(4-190), v 6 DK 173162 B1 men de er alment anvendelige til fremstilling af vektorer, der eksprimerer andre svinevæksthormonvarianter.

Fremstilling af et rekombinant DNA-plasmid indeholdende en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid 5 med svinevæksthormon-aktivitet, inkluderer: tilvejebringelse af en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med svinevæksthormon-aktivitet og en plasmidvektor, og 10 ligation af DNA-sekvensen med plasmidvektoren til indføjelse af DNA-sekvensen i plasmidvektoren.

15 Den således dannede rekombinant DNA-plasmid- vektor kan indeholde en fuldstændig kopi af en region, der koder for et svinevæksthormonpolypeptid, og den kan indeholde en 3' ikke-translateret sekvens efter det strukturelle gens termineringskodon.

20 DNA-sekvensen, der koder for et polypeptid med svinevæksthormon-aktivitet, kan opnås ud fra mRNA, dvs. som cDNA. mRNA'et, f.eks. polyadenyleret mRNA, kan opnås ud fra en passende vævskilde, f.eks. isoleres fra svinehypofysevæv.

25 Fremstilling af en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med svinevæksthormon-aktivitet, inkluderer: opnåelse af mRNA, der koder for et svinevæksthormonpolypeptid fra svinehypofysevæv, 30 og ud fra dette mRNA fremstilling af en cDNA- sekvens med første og anden strenge komplementære til dette mRNA.

7 DK 173162 B1

Ekstraktionen af polyadenyleret RNA fra svinehy-pofysevæv kan udføres ved anvendelse af en guanidin-thiocyanatbehandling efterfulgt af en chromatografisk ekstraktion.

5 Trinnet til fremstilling af cDNA ud fra mRNA

Ifølge dette aspekt af den foreliggende opfindelse kan omfatte: annealing af primer oligo-dT til mRNA’et, 10 behandling af mRNA'et med revers transkriptase til dannelse af en første cDNA-streng, og behandling af den første cDNA-streng med et Kle-15 now fragment af DNA-polymerase og derefter med revers transkriptase til dannelse af en anden DNA-streng på den første streng, og behandling af produktet deraf til spaltning af 20 den kovalente binding mellem den første og den anden streng.

Spaltningstrinnet kan udføres med et passende enzym, f.eks. nuclease-Sl.

25 Plasmidvektoren til kloningen af det dobbelt strengede DNA kan være af en vilkårlig passende art, f.eks. plasmidvektoren pBR322. kloningstrinnet kan tage en vilkårlig passende form. Homopolymertailing/annea-lingsmetoden kan anvendes. I dette tilfælde kan plas-30 midekspressionsvektoren være modiflceet til dannelse af udhængende 3'-ender. pBR322 kan f.eks. digesteres med restriktionsendonucleasen Pst 1. Plasmidvektoren pBR322 kan også tilføjes ca. 15 nucleotlder af guanidinrester.

k 8 DK 173162 B1 På samme måde kan DNA-sekvensen tilføjes cyto-sinrester ved anvendelse af terminal transferase.

Til identifikation af vektorer indeholdende pGH-sekvenser kan egnede værtsceller, f.eks. E. coli, 5 transformeres med vektorerne, cellerne transformeret med vektorer indeholdende indføjede DNA-sekvenser kan udvælges ved passende fremgangsmåder, f.eks. ved resistens mod antibiotika, og indføjede pGH-sekvenser kan identificeres ved vektor DNA'ets evne til at hybridise-10 re med pGH-specifikke polynucleotidprober.

Vektorer, der blev identificeret som indeholdende pGH sekvenser, blev benævnt pGH3, pGH4 og pGH29 som beskrevet specifikt i det følgende. Som diskuteret nedenfor indeholder hvert af disse plasmider en fuldstæn-15 dig kopi af den svinevæksthormonpolypeptidkodende region, der strækker sig ud over det sidste 3'-termine-ringskodon.

Skønt sådanne rekombinant DNA-plasmider giver en nyttig lagringsbærer for DNA-sekvenser, der koder for 20 polypeptider med svinevæksthormon-aktivitet, er det imidlertid klart, at vektoren kræver yderligere proka-ryotiske værtskompatible operatorsekvenser til kontrol og fremkaldelse af ekspression af sådanne eukaryotiske gener i prokaryotiske værtsceller, dvs., at vektoren 25 skal være en ekspressionsvektor, der er kompatibel med prokaryotiske værtsceller. De rette replikations-tran-skriptions- og translationssignaler skal således være korrekt ordnet på plasmidet for at sikre, at det fremmede gen kan eksprimeres på rette måde i de transforme-30 rede celler og deres afkom.

Fremgangsmåden til fremstilling af en rekombi-nent DNA-plasmidekspressionsvektor indeholdende en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med svine- DK 173162 B1 9 væksthormon-aktivitet, og som kan replikeres, transkri-beres og translateres i en encellet organisme, inkluderer således: 5 tilvejebringelse af en gennemskåret plasmideks- pressionsvektor, og en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med svinevæksthormon-aktivitet eller en del deraf, 10 hvilken DNA-sekvens indeholder en syntetisk sek vens ved dens 5'-ende, hvilken sekvens tilfredsstiller regulatoriske krav til replikations-transkription og translation i en encellet organisme, og 15 ligering af DNA-sekvensen i plasmidekspressions-vektoren på et sådant sted, at replikations-transkription og translation af DNA-sekvensen kan ske.

20

Den således fremstillede, gennemskårne plasmid-Oekspressionsvektor kan være af en vilkårlig egnet type. En dobbelt-origovektor åf den slags, der fer beskrevet i beskrivelsen til offentliggjort GB patentansøg-25 ning nr. 2136814A foretrækkes. En dobbelt origovektor har et replikationsorigo, der er ansvarligt for stabil bevarelse af plasmidet ved lavt kopiantal, mens det andet origo, hvis replikation startes ved en ændring af temperaturen eller andre betingelser, styrer grundlæg-30 gende syntese af klonede gener. Induktion af kopiantal-forøgelse i storskalakulturer er således forholdsvis billig og simpel.

En plasmidekspessionsvektor pMG197, der er , afledt af pMG411 (beskrevet i Gene, 1984 af Yarranton i DK 173162 B1 10 et al og 1 GB patentansøgning nr. 2136814A) kan anvendes som udgangsplasmid til fremstilling af rekom-binant DNA-plasmidekspressionsvektorer ifølge dette aspekt af opfindelsen. pMG197 er et dobbelt origoplas-5 mideksprimerende met-gastrisk lipaseenzym fra trp-pro-motoren, som har en Shine-Dalgarno sekvens (SD-sekvens) 14 basepar opstrøms for AUG startkodonet.

pMGl97 kan modificeres til dannelse af en restringeret plasmidekspressionsvektor, f.eks. ved dele-10 tion af EcoRl-stedet mellem par-locuset og cl857-se-kvenserne og ved udelukkelse af met-gastrisk lipasege-net som et Bglll-EcoRl fragment. En sådan rekombinant DNA-plasmidekspressionsvektor kan fremstilles ved anvendelse af en to-trinsmetode.

15 Følgelig omfatter fremgangsmåden til fremstil ling af en rekombinant DNA plasmidekspressionsvektor ifølge opfindelen, hvor denne DNA-sekvens kun indeholder en del af DNA-sekvensen, der koder for svinevækst-hormon bestående af en syntetisk 5'-endesekvens og en 20 3'-éndesekvens yderligere: tilvejebringelse af en yderligere DNA-sekvens omfattende resten af sekvensen, der koder for 25 svinevæksthormon, spaltning af denne DNA-sekvens ved et restriktionssted mellem den syntetiske 5'-endesekvens og 3'-endesekvensen, og 30 ligering af den yderligere DNA-sekvens i restriktionsstedet.

i 11 DK 173162 B1

Fortrinsvis kan en af to almene typer oligonu-cleotider anvendes som den syntetiske 3'-endesekvens af denne DNA-sekvens. To almene typer oligonucleotider kan således konstrueres til erstatning for DNA'et, der ko-5 der for de første 17 aminosyrer (sluttende ved 3' Apal-stedet) af den pGH-kodende sekvens.

Den første type oligonucleotid, oligonucleotid met 1-17, indeholder et codon, der angiver methionin ved position 1, efterfulgt af en sekvens, der koder for 10 de første sytten aminosyrer af svinevæksthormon. De valgte codoner svarer fortrinsvis til de hyppigste tRNA-molekyler, der findes i E. coli, idet de dog koder for aminosyrerne.

Den anden type oligonucleotid, oligonucleotid 15 met 4-17, konstrueredes på samme måde, men indeholdt ikke DNA, der koder for de første tre aminosyrer af pGH: Phe, Pro, Ala. Transkription ud fra dette gen ville starte ved codonet for methionin, aminosyren, der normalt optager den fjerde stilling i pGH-polypeptid-20 kæden. Basesekvensen af de to typer oligonucleotider kan vælges indenfor den genetiske kodes regler. Til maksimering af genekspressionen har det vist sig hensigtsmæssigt at vælge værtsforetrukne codoner, der ek-sprimeres på højt niveau i E. coli. Desuden kan compu-25 teranalyse udføres til undersøgelse for og fjernelse af potentielt sekundære strukturregioner indenfor messenger RNA1 ets ribosombindingssted. Som en del af denne anden handling kan G-C-basepar, hvor det er muligt, substitueres med A-T-basepar. Gener for de i høj grad 30 eksprimerede ydre membranproteiner af E. coli indeholder overordentlig A/T-rige promotorregioner. Disse regioner, der er ansvarlige for transkriptionskontrollen, binder den DNA-afhængige RNA-polymerase, der kopierer messenger RNA'et ud fra DNA-skabelonen.

i DK 173162 B1 12

Endvidere har 5'-sekvensen, der bestemmer translationseffektiviteten, også vist sig at være overordentlig A/T-rig. Området mellem Shine-Dalgarno sekvensen og det indledende ATG formodes at fremkalde en 5 ustabilitet af sekundær strukturen og letter derved ribosombinding og efterfølgende translation langs informationen.

Eksempler på specifikke oligonucleotider, der kan fremstilles, er som følger: 10 5' GATCTATGTTTCCAGCTATGCCACTTTCTTCTCTGTTCGCTAACGCTGTTCTTCGGGCC 3'.

3' ATACAAAGCTCGATACGGTGAAAGAACAGACAAGCGATTGCGACAACAAGC 5 ’ met 1 til 17 oligonucleotider.

5* GATCTATGCCACTTTCTTCTCTGTTCGCTAACGCTGITCTTCGCGCC 3’ 3’ ATACGGTGAAACAAGAGACAAGCGATTGCGACAAGAAGG 5' met 4 til 17 oligonucleotider - Følgelig beskrives der herefter en plasmideks-pressionsvektor indeholdende en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med svinevæksthormon-aktivitet, eller 20 en del deraf, i hvilken DNA-sekvens et segment af 5'-enden er udskiftet med en syntetisk sekvens, der tilfredsstiller de regulatoriske krav til replikations-transkription og translation i en encellet organisme.

Den regulatoriske sekvens kan vælges blandt met 25 1-17 oligonucleotider og met 4-17 oligonucleotider som beskrevet ovenfor, herunder de specifikt nævnte sekvenser.

Til anvendelse med gennemskåret pMG197, beskrevet ovenfor, som ikke indeholder Bglll-EcoRl-fragmen-30 tet, kan den syntetiske oligonucleotidsekvens således ligeres til et Apal-EcoRl-fragment af DNA-sekvensen opnået ud fra pGH29. Denne indeholder DNA, der koder for aminosyrerne 88-190 af pGH. Disse mellemtrinsplasmid- i 13 DK 173162 B1 ekspressionsvektorer benævnes pMG933 og pMG934, som beskrevet specifikt i det følgende. Mellemtrinsplas-midekspressionsvektorerne indeholder henholdsvis de syntetiske met 1-17 oligonucleotider og met 4-17 oli-5 gonucleotider som beskrevét specifikt i det foregående.

Den således fremstillede syntetiske sekvens kan dernæst forenes med den gennemskårne ekspressionsvektor (Bglll-EcoRI).

10 Det resterende fragment af DNA-sekvensen, der koder for svinevæksthormon og omfatter en DNA-midter-sektion, der koder for aminosyrerne 18-87, kan derefter inkorporeres. Et lille Apal-Apal-fragment kan isoleres fra et Apal-digesteringsprodukt af plasmidekspressions- 15 vektoren pGH29. Mellemtrinsplasmidekspressionsvektoren pMG93 3 eller pMG9 34 kan overskæres ved Apal-restriktionsstedet, og Apal-Apal-fragmentet kan klones derind i til opnåelse af henholdsvis ekspressionsvektoren pMG935 og pMG936.

20 Den således opnåede rekombinantplasmidekspres- slonevektor kan anvendes til transformation af egnede værtsceller, og de transformerede værtsceller kan dyrkes til ekspression af svinevæksthormonpolypeptider, som beskrevet i det foregående.

25 Prøver af E. coli indeholdende plasmiderne og plasmidekspressionsvektorerne beskrevet specifikt heri, opbevares i Bunge (Australia) Pty. Ltd. Cell Collection, 87-89, Plemington Road, North Melbourne, Victoria, Australien.

30 Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere med henvisning til eksempler.

II

DK 173162 B1 14

Eksempel 1 FREMSTILLING AF pGH-cDNA Væksthormon udgør en hovedfraktion af svinehypo-5 fyseproteiner, og messenger RNA'et for pGH er ligeledes hyppigt forekommende, idet det udgør ca. 25% af det totale mRNA (John H. Nilson et al., J. Biol. Chem. 258 (1983)). Strategien for opnåelse af cDNA-kloner, der koder for pGH, var at anvende hele mRNA-populationen 10 som et templat for en cDNA-syntese og udvælge de kloner, der indeholdt svine-GH-genet fra populationen af cDNA-kloner. Sammenfattende indbefattede dette: (1) Ekstraktion af poly A indeholdende RNA fra 15 hypofyser fra voksne svin ved anvendelse af guanidiniumthiocyanatmetoden og chromatogra-fi på oligo (dT) cellulose.

(2) Syntese af cDNA ved anvendelse af både re- 20 vers transkrlptase og Klenow fragmentet af DNA-polymerase i.

(3) Kloning ind i E. coli HB101 recA- under anvendelse af Pst l-restringeret pBR322 og ho- 25 mopolymer-annealingsmetoden.

ISOLATION AF HYPOFYSE-RNA Frosne svinehypofyseforlapper homogeniseredes i en glasteflonhomogenisator i 0,5 ml 5M guanidinthiocya-30 nat, 1% sarkosyl, 20mM EDTA, 1 vol% 2-mercaptoethanol, 50mM Tris-HCl, pH 7,0. Homogenatet bragtes til et slut-volumen på ca. 3,5 ml med yderligere homogeniseringspuffer, lagdes i et lag over 1,2 ml 5,7M Cscl indehol- : l DK 173162 B1 15 dende 0,1M EDTA, pH 7,0, 1 et Spinco SW 50.1 centrifugerer og centrifugeredes i 17 timer ved 36.000 omdr./min. ved 20°C. Supernatanten fjernedes forsigtigt med en pasteurpipette, og RNA-pelletten opløstes i 5 0,5 ml sterilt H20 ved stuetemperatur, hvorefter det inkuberedes i 30 sekunder ved 60°C. RNA'et fældedes to gange ved -20eC ved tilsætning af 0,1 volumen 2M kaliumacetat, pH 5 og 2,5 volumen 95% ethanol (modificeret fra Chingwin et al. Biochem. 18, 5294 (1979)).

10 SELEKTION AF POLY(A) + RNA Messenger RNA, eller mere præcist polyadenyleret RNA, kan isoleres fra en blanding af RNA-arter ved chromatografi på oligo-dt (dT-cellulose). Oligo-dt 15 (dT-cellulose), type 77, erhvervedes fra Pharmacia. Harpiksen ækvilibreredes i steril bærerpuffer (20mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,5M NaCl, ImM EDTA, 0,1% SDS) og hældtes i en 1,0 ml kolonne. Kolonnen vaskedes tre gange med hver af a) sterilt H20, b) 0,1M NaOH/5mM EDTA og 20 c) sterilt H20) eller indtil kolonneeffluentens pH-værdi var mindre end 8). Fem volumener steril bærerpuffer ledtes dernæst gennem kolonnen. RNA'et præpareredes ved suspension i sterilt H20 og varmebehandling ved 65°C i 5 minutter. Et lige så stort volumen 2 x bærer-25 puffer sattes til RNA-prøven, som man dernæst lod afkøle til stuetemperatur, inden den ledtes til kolonnen, væsken, der strømmede gennem kolonnen, opsamledes, opvarmedes til 65eC i 5 minutter, afkøledes og ledtes igen til kolonnen. Kolonnen vaskedes dernæst med 5-10 30 kolonnevolumener bærerpuffer og derefter med 4 kolonnevolumener 20mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1M NaCl, ImM EDTA, 0,1% SDS. Det polyadenylerede RNA elueredes med 2-3 kolonnevolumener sterilt lOmM Tris-HCl (pH 7,5), ImM ED- i DK 173162 B1 16 TA, 0,05% SDS, og fældedes med 3M natriumactat og ethanol. Pelleten resuspenderedes i sterilt H20 og opbevaredes ved -70eC. Eluering af polyadenyleret DNA fulgtes ved aflæsning af den optiske tæthed ved 260 nm.

5 FREMSTILLING AF KOPI-DNA Efter selektion omdannedes polyadenyleret mRNA til dobbeltstrenget cDNA, som indføjedes i et bakterie-plasmid (ifølge "A Laboratory Guide to Molecular 10 Cloning" - Maniatais et al. (1982) Cold Spring Harbour Laboratories). Kort sagt omfattede dette syntese af den første streng med revers transkriptase (RNA-afhængig DNA-polymerase), fjernelse af RNA-templatet ved alkalisk digestion, syntese af den anden streng med både 15 revers transkriptase og DNA-polymerase 1 (Klenow fragmentet), og til sidst fjernelse af hårnålesløjfen (der kovalent binder den første og anden streng sammen) ved enzymatisk digestion med nuclease-Sl.

20 SYNTESE AF DEN FØRSTE STRENG

Inden den enzymatiske syntese af cDNA'et udførtes, undersøgtes poly(A) + RNA'ets integritet ved (agarose-formaldehyd-) gelelektroforese. Syntese påbegyndtes ved blanding af ca. 10 yg polyadenyleret mRNA, 25 50 pmol af hver af nudeotiderne (dGTP, dCTP, dATP, dGTP), og 1 yl lOOmM methylkviksølvhydroxid. Blandingen holdtes ved stuetemperatur i 10 minutter til forøgelse af udbyttet af mRNA-skabelon med fuld længde. Inden tilsætning af revers transkriptase tilsattes 2 yl 700 30 mM 2-mercaptoethanol til sekvestrering af kviksølvionerne, som man ved inhiberer virkningen af revers transkriptase. Desuden tilsattes 1 yl RNasin (ca. 25 enheder) til inhibering af enhver nedbrydning af i DK 173162 B1 17 RNA'et. Blandingen holdtes i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur, hvorefter 40 enheder (2 pi) revers transkriptase tilsattes, og inkubation fortsattes ved 42eC i 3 timer. Reaktionen standsedes ved tilsætning af 5 2 μΐ 0,5M EDTA (pH 8,0), og 25 pi 150mM NaOH. mRNA-templatet hydrolyseredes under 1 times inkubation ved 65"C. DNA'et fældedes i 3M natriumacetat og absolut EtOH ved -70°C, centrifugeredes i 10 minutter i en Ep-pendorfcentrifuge, og pelleten tørredes.

10

SYNTESE AF ANDEN STRENG

For at sikre at der fremstilles DNA-kopier med fuld længde opnås syntese af anden streng ud fra første-strengs-skabelonen ved anvendelse af DNA-polyme-15 rase 1 sammen med revers transkriptase. idet begge enzymer hæftes til forskellige steder langs skabelonen øger deres samtidige anvendelse chancen for læsning gennem hele sekvensens længde.

Den tørrede pellet af 1-strengs-cDNA resuspende-20 redes i 50 pi sterilt H20 og lige så stort volumen 2 x 2.-strengs puffer (0,2M HEPES (pH 6,9); 20mM MgCl2; 5mM dithiothreitol; 0,14 KCl; ImM DTTP; ImM dCTP; ImM dATP; ImM dGTP) tilsattes. Reaktionen startedes ved tilsætning af 40 enheder Klenow fragment af DNA-25 polymerase 1 og forløb ved 15°C i 20 timer. Efter 20 timer inaktiveredes DNA-polymerase 1 ved tilsætning af 2,0 pi 0,5M EDTA (EDTA chelatbinder de divalente magnesiumioner, der er afgørende bestanddele af et aktivt enzymkompleks). Prøven ekstraheredes med lige store vo-30 lumener phenol/chloroform og ds cDNA'et skiltes fra ikke-inkorporerede dNTPer ved chromatografi på Sepha-dex® G-50. DNA'et fældedes med 3M natriumacetat og absolut ethanol ved -70eC, tørredes og resuspenderedes i 18 DK 173162 B1 derefter i 40 μΐ sterilt vand, 20 yl af cDNA'et udtoges, og til dette sattes 5 yl 1M Tris-HCl (pH 8,3), 7 yl 1M KC1, 2yl 250mM MgCl2, 25 yl 20mM (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 2 yl 700 mM 2-mercaptoethanol, 7 yl H20 og 5 2 yl (40 enheder) revers transkriptase. Reaktionsblandingen inkuberedes ved 42eC i 1 time, hvorefter reaktionen standsedes ved tilsætning af 2 yl 0,5M EDTA. Blandingen ekstraheredes med et lige så stort volumen phenol og chloroform, hvorefter der udførtes chromato-10 grafi på Sephadex G-50 til fjernelse af det ikke inkorporerede dNTPa. DNA'et fældedes med 3M natriumacetat og ethanol ved -70eC.

DIGESTION MED NUCLEASE-Sl 15 Ved afslutningen af syntese af første og anden streng blev de to strenge bundet kovalent ved hjælp af en enkeltstrenget sløjfe. Denne fjernes let ved digestion med nuclease-Sl. Ca. 0,5 yg dobbeltstrenget cDNA suspenderedes i 50 yl ImM Tris-HCl) (pH 7,6) 0,lmM 20 EDTA. 10 yl 10 x nuclease-Sl-puffer (2M NaCl, 0,5M natriumacetat (pH 4,5), lOmM ZnS04, 5% glycerol) tilsattes, og reaktionsblandingen bragtes til 100 yl med sterilt vand. Reaktionen startedes ved tilsætning af 5 enheder nuclease-Sl og fortsattes ved 37*C i 30 minutter, 25 hvorefter enzymet inaktiveredes med 11 ml 0,5mM EDTA.

Digestion med nuclease-Sl giver dobbeltstrengede sekvenser med forskellige udhængende sekvenser. Fragmenterne gøres stumpendede ved genparring med Klenow fragmentet af E. coli DNA-polymerase 1 (2 enheder), og 30de fire deoxyribonucleotider (25mM stamopløsning).

DNA’et skilles fra ikke-inkorporerede nucleotider ved chromatografi på Sephadex® G-50.

19 DK 173162 B1 KLONING AF DOBBELTSTRENGET DNA pGH cDNA1 et forsynes med en homopolymerhale af cytosinrester ved hjælp af terminaltransferase. Enzymkoncentration og tid bestemtes for en kædelængde på ca.

5 15 nucleotider. På samme måde digesteredes plasmidvek-toren pBR322 med restriktionsendonucleasen Pst l (der danner udhængende 3'-ender), og den forsynedes med en hale af ca. 15 nucleotider af guanidinrester.

Dobbeltstrenget cDNA og lineariseret plasmid DNA 10 behandledes som følger: DNA, suspenderet i 55 yl sterilt vand, sattes til et lige så stort volumen 2 x "tailing"-puffer (0,4M kali-umcacodylat, 50mM Tris-HCl (pH 6,9), 4mM dithiothrei-15 tol, ImM CoCl2, 2mM (3H)dGTP (for plasmid DNA*et) eller 2mM (3H)dCTP (for cDNA'et), 500 yg/ml BSA). En delmængde på 10 yl anvendtes til bestemmelse af det nødvendige tidsrum for tilføjelse af ca. femten nucleotider. Det resterende lineære plasmid DNA inkuberedes i 10 minuter 20 ved 37eC. Reaktionen standsedes ved afkøling til 0°C efterfulgt af tilsætning af 10 yl 0,5M EDTA (pH8).

Efter en ekstraktion i et lige så stort volumen phenol. og chloroform, skiltes DNA med homopolymerhale fra forureninger med lav molekylvægt ved chromotografi på 25 Sephadex G-100 (ekvilibreret i et 1 x annealingspuffer: 1M NaCl, 0,1M Tris.Cl (pH 7,8), ImM EDTA).

Vektor DNA'et og pGH-cDNA’et blandedes og fældedes med 3M natriumacetat og ethanol ved -70eC. Det tørrede DNA resuspenderedes i 50 yl ligasepuffer (30 mM 30 Tris-HCl (pH8), 4 mM MgCl2, 1/2 mM EDTA, 1,0 mM di-thiothreitol og 50 yg/ml BSA). Reaktionen katalyseredes med 2 yl T4 DNA-ligase (Pharmacia) og holdtes ved 10eC i 16 timer. En delmængde på 25 yl af reaktionsblandin-

L

DK 173162 B1 20 gen transformeredes ind i E. coli HB101 som beskrevet i det følgende: 100 yl L-urt (1% gærekstrakt, 1% trypton, 0,5%

NaCl) inokuleredes med 1 ml af en overnattet bakterie-5 kultur (E. coli, HB101). Cellerne dyrkedes ved 37eC i 3 timer på et rystebord. Efter 3 timer afkøledes cellerne, og de centrifugeredes i en bordcentrifuge i 5 minutter ved 4eC. Supernatanten fjernedes. Cellerne resu-spenderedes i 50 ml af en iskold, steril opløsning af 10 50 mM CaCl2 og 10 mM Tris-HCl (pH 8) og holdtes i is i 15 minutter. Cellerne høstedes dernæst ved centrifugering i en bordcentrifuge, resuspenderedes i 6,5 ml af en iskold, steril opløsning af 50 mM CaCl2 og 10 mM Tris-HCl (pH 8), og delmængder af 0,2 ml fordeltes i forkølede 15 rør. Cellerne opbevaredes ved 4°C i 24 timer til forbedring af transformationseffektiviteten. Efter 24 timer tilsattes plasmid DNA resuspenderet i TE-puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA) til cellerne, der blandedes, og blandingen holdtes på is i 30 minutter.

20Cellerne og DNA'et udsattes dernæst for varmechok ved 42’C i 2 minutter. 1,0 ml L-urt sattes til hvert rør, og der inkuberedes ved 37°C i 30 minutter. I løbet af dette tidsrum kommer bakterierne sig, og de begynder at eksprimere antibiotikaresistens. Efter 30 minutter blev 25en række af fortyndinger af hver 100 yl udpladet ved udstrygning på agarplader tilsat tetracyklin eller am-picillin.

Medens alle bakterieceller indeholdende det intakte plasmid, pBR322, gror på ampicillin og tetracy-30klin, gror bakterieceller indeholdende rekombinantplas-midet med pGH-cDNA'et klonet ind i Pst 1-stedet af pBR322 kun på tetracyklin, mens ampicillinresistensen tabes ved denne rekombination. Kolonier, der kun groede i 21 DK 173162 B1 på tetracyklin screenedes yderligere med en enkelts-trenget, radiomærket cDNA-gruppe syntetiseret ud fra det totale svinehypofyse poly A+-RNA (svinevæksthor-moninformation udgør ca. 25% af det polyadenylerede 5 RNA). På basis heraf udvalgtes de kolonier, der var mærket i størst udstrækning. Tetracyklinresistente kolonier udpladedes på nitrocellulosefilterskiver i en ordnet rækkefølge. Cellevæggene lyseredes under alkaliske betingelser til frigivelse af DNA’et, som dernæst 10 fikseredes til filtrene ved varmebehandling ved 80eC i 2 timer. Radiomærket total svinehypofyse cDNA inkuberedes med filtrene ved 37 eC i 16 timer. Filtrene vaskedes i 2 x SSC, tørredes og autoradiograferedes. Positive kolonier isoleredes og underkastedes restriktionsanaly-15 se med et antal på 4 og 6 baseafklipningsenzymer. Et partielt restriktionskort sammenlignedes med offentliggjorte sekvensdata (figur 1), og pGH-kloner udvalgtes.

Af de tre positive kloner (pGH3, pGH4 og pGH29), viste plasmid pGH29 (figur 2) sig at være bedst egnet til 20 yderligere manipulation. pGH29 indeholdt en fuldstændig kopi af svinevæksthormon cDNA'et, strækkende sig ud over 3'-stopcodonet.

KLONING IND I DOBBELT ORIGOVEKTOREN PMG197 25 1. Syntese af oligonucleotider.

Inden ligering af svinevæksthormon cDNA'et ind i plasmidet, pMG197 (figur 3) var det nødvendigt at modificere vektoren til inkorporering af passende prokaryo-30 tiske regulationssekvenser, der kunne smeltes sammen med 5'-enden af det eukaryotiske gen, pGH-cDNA.

• I almindelighed bærer cDNA af genomt, eukaryo tiske DNA ikke de rette regulatoriske signaler, som 22 DK 173162 B1 (når det gælder endogent, prokaryotisk DNA) ville sikre effektiv transkription og translation af genet. Denne mangel kan overvindes ved konstruktionen af syntetiske oligonucleotider, der kan udformes til at passe med 5 værtsstammens foretrukne codonsekvens og indeholde unikke restriktionssteder.

To sæt af oligonucleotider konstrueret til at blive ligeret til 5' Apal-restriktionsstedet af pGH-genet var nødvendige til ekspression af både pGH met 10 (1-190) og pGH (4-190) i det anvendte dobbeltorigo- plasmid. Disse syntetiseredes ved phosphotriesterkemi (Patel, et al., (1982) Nucleic Acids Res. 10, 5605-5620).

5’ GATCTATGTTTCCAGCTATGCCACTTTCTTCTCTGTTCGCTAACCCTGTTCTTCGGGCC 3' 15 3* ATACAAAGGTCGATACCGTGAAAGAAGAGACAAGCCATTGCGACAACAACC S' met 1 til 17 oligonucleotider 5' GATCTATGCCACTTTCTTCTCTGTTCGCTAACCCTGTTCTTCCCGCC 3' 20 3' ATACGGTGAAAGAAGAGACAACCGATTGACACAAGAAGC 5' met 4 til 17 oligonucleotider 2. Strategi for indføjelse af pGH-cDNA i pMG197.

25 Vektorer til ekspression af hybridsvinevækst- hormonpolypeptider konstrueredes som følger:

De respektive, syntetiske oligonucleotider (Bglll-Apal) behandledes med kinase, ligeredes og restringeredes dernæst med Apal og Bglll. De korrekte 30 fragmenter isoleredes fra en agarosegel og ligeredes dernæst til Apal-EcoRI-fragmenter (der kodede for ami-• nosyrerne 88-190) opnået ud fra pGH29. Det linearisere-de fragment blev bundet til den Bglll-EcoRl-restringe- DK 173162 B1 23 rede ekspressionsvektor (Bgl2-EcoRI), transformeret ind i E. coli stamme DH1, forstærket og udvalgt. Dette mellemprodukt indeholdt både 5’- og 3'-enderne af pGH-genet, men manglede den midterste del, der kodede for 5 aminosyrerne 18-87 af pGH. Et lille Apal-Apal-fragment (ca. 200bp, kodende for aminosyrerne 18-87) isoleredes fra et Apal-digestionsprodukt af pGH29 og klonedes ind i Apal-stedet af mellemtrinsvektoren til fuldendelse af svinevæksthormongenet (figur 4). Plasmiderne med den 10 korrekte orientering identificeredes, hvorved man opnåede de to ekspressionsplasmider pMG935 (met 1 til 190 pGH) og pMG936 (4 til 190pGH). Plasmiderne transformeredes ind i E. coli DH1-værtsstamme, og de konstruerede sekvenser undersøgtes efter forstærkning i L-urt-me-15 dium tilsat ampicillin ved restriktionsanalyse og sekvensering ved Sangermetoden.

3. pGH-genets DNA-sekvens.

Sekvenseringen udførtes ved sanger-dideoxymeto-20 den ved anvendelse af restriktionsfragmenter af pGH-plasmiderne subklonet ind i M13-phag. Kun et af pGH-plasmiderne, pMG936 (pGH 4 til 190), sekvenseredes fuldstændigt, idet hovedparten af pGH-sekvensen var' fælles for begge konstruerede sekvenser. Det andet 25 pGH-plasmid, pMG935 (pGH met 1 til 190), sekvenseredes derfor kun ved 5'-enden af pGH-genet gennem bindeledsfragmenterne.

ANALYSE AF DATA

To restriktionsdigestioner var nødvendige til 30 opnåelse af alle de overlappende fragmenter, der var nødvendige til sekvensering af begge DNA-strenge. Genet er lokaliseret mellem Hpal og EcoRl-restriktionsste-derne (se figur 5). Digestion "1" var en tripeldige- i DK 173162 B1 24 stion under anvendelse af Hpa i, Sma 1 og EcoRl, som gav to pGH-genfragmenter på ca. 470 bp og ca. 300 bp. Digestion "2" var en dobbeltdigestion med Hind III og Apa 1 og gav tre pGH-relaterede fragmenter på ca. 220 5 bp, 1000 bp og 1500 bp. Alle disse fragmenter oprense-des fra geler og behandledes med Sl-nuclease til dannelse af stumpendede fragmenter. Fragmenterne klonedes dernæst ind i bakteriophag Ml3-vektoren, som i forvejen var digesteret med EcoRV og behandlet med phosphatase.

10 Hver klon sekvenseredes til opnåelse af indtil 300 baser af sekvensen. Overlappende restriktionsfragmenter valgtes til opnåelse af den fuldstændige DNA-sekvens på begge strenge.

Sekvensen viste sig at stemme overens med den, 15 der er publiceret, bortset fra en baseudskiftning af en A til en G ved position 446 (figur 6). Denne udskiftning ændrer imidlertid ikke proteinsekvensen, idet begge codoner (GAA og GAG) giver glutaminsyre. Denne forskel i DNA-sekvenserne afspejler sandsynligvis allel 20 variation i pGH-genet.

De samme restriktionsdigestioner udførtes på pMG935, men kun fragmenterne mærket ** og *** i figur 5 klonedes og sekvenseredes. Fragmenterne med mærket *** sekvenseredes fordi de dækker den anderledes 5'-ende af 25 pGH (met 1 til 190) genet, mens fragmenterne mærket ** sekvenseredes til bekræftelse af, at baseudskiftningen fundet i pMG936 også fandtes i pMG935. De opsamlede data var nøjagtig som forventet, herunder baseændring ved position 446.

i DK 173162 B1 25 OPTIMERING AF RIBOSOMBINDINGSSTEDER OG UDVÆLGELSE AF DE BEDSTE PLASMIDER Forskellige DNA-manipulationer har været rapporteret at øge akkumulationsniveauet for heterologe pro-5 teinprodukter i E. coli. Ved de fleste af disse modifikationer søger man at øge omfanget af genekspressionen, og man focuserer på genets 5'-ikke-kodende region. Foruden ændringer af promotorsekvenserne, kan man også udføre ændringer, der ændrer messenger RNA'ets struk-10 tur. Disse ændringer har indflydelse på, hvorledes ribosomet vekselvirker med messenger RNA'et og ændrer hastigheden, med hvilken translation af messenger RNA'et til proteinet initieres. Især har variation af afstanden mellem sekvensen komplementær til 3'-enden af 15 16S ribosomalt RNA (Shine-Delgarno sekvensen) og ATG-codonet ved starten af det strukturelle gen hyppigt bemærkelsesværdige virkninger på genekspression (Roberts et al., P.N.A.S., USA, 76^, 760-764, 1979). En mere fuldstændig beskrivelse af fremgangsmåderne, der 20 kan føre til maksimering af genekspression, kan findes i Old and Primrose, Principles of Gene Manipulation, 3. udgave, side 138-182, 1985).

Afstanden fra Shine-Delgarno til ATG (SD til ATG) i E. coli-gener. der eksprimeres kraftigt, er 25 sædvanligvis mellem 6 og 12 baser. Den optimale sekvens er ikke let at forudse, idet messenger RNA'ets konfor-mation også bestemmer ekspressionsniveauet, og denne konformation bestemmes af hydrogenbinding mellem sekvenserne på messenger RNA'et både opstrøms og nedstrøms 30 for ribosombindingsstedet. Disse omfatter sekvenser indenfor det strukturelle gen for proteinet.

Den mest effektive fremgangsmåde til bestemmelse af de bedste sekvenser er at konstruere en række i DK 173162 Bl 26 beslægtede plasmider og screene disse for det højeste niveau af proteinakkumulering.

MODIFIKATION AF RIBOSOMBINDINGSSTEDET 5 De oprindelige plasmider eksprimerende pGH (met 1 til 190) og pGH (4 til 190) konstrueredes specielt til at lette konstruktionen af en sådan familie af plasmider. Begge havde oprindeligt en SD til ATG afstand på 14 basepar. De syntetiske oligonucleotider 10 anvendt til konstruktion af pMG935 og pMG936 indeholdt en sekvens, der havde unikke restriktionsenzymspaltningssteder for enzymerne Cla i og Bglll:

SHINE-DALGARNO SEKVENS FØRSTE CODON AF pGH

15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1* LA ,g.S CTATCCAIACATCI A T C 3' TTCCCATACCTATCTACATAC5* £ll l t&izz 20 Disse enzymer overskærer ekspressionsplasmidets dobbeltstrengede DNA asymmetrisk til opnåelse af enkeltstrengede regioner. Disse kan enten fjernes (under anvendelse af Sl-nuclease) eller fyldtes ud (under anvendelse af Klenow fragmentet af DNA-polymerase l).

25 Det behandlede DNA kan dernæst ligeres til opnåelse af en serie af plasmidmolekyler med SD til ATG-afstande på mellem 5 og 12 basepar. En enkelt digestion efterfulgt af udfyldning ville forlænge SD-ATG'et. udfyldningsreaktioner har således kun været anvendt, når to enzym-30 digestioner udførtes. N.B. optimeringer udførtes på henholdsvis plasmid pMG935 og pMG936. Det viste sig, at plasmiderne pMG935 (met 1 til 190) og pMG936 (4 til 190) Indeholdt et overflødigt EcoRI-fragment fra den i 27 DK 173162 B1 lipasekodende sekvens. Denne fjernedes til opnåelse af henholdsvis pMG939 og pMG940. Plasmiderne fik ikke ændret deres pGH-gener eller ekspressionssekvenser.

En fuldstændig liste over alle kombinationer af 5 udførte enzymbehandlinger og de forventede produkter heraf er vist i figur 7.

Udfyldning af udhængende, enkeltstrengede ender ved overskæringsstedet ved DNA-polymerase 1-udfyldning er sædvanligvis nøjagtig, men Sl-nucleasedigestion er 10 meget mere vanskelig at kontrollere. Sl-nuclease er et enkeltstrenget, specifikt enzym, der virker i begge retninger. Når en enkeltstrenget ende er fjernet, skulle den tilbageblevne dobbeltstrengede ende ikke dige-steres. Idet strengene kun holdes sammen af hydrogen-' 15 bindinger, er der imidlertid en tendens til at terminalbaserne digesteres, idet hydrogenbindingerne brydes og gendannes i termodynamisk ligevægt. Konsekvensen af dette er, at ekstra rester kan fjernes, især når det terminale basepar er A:T, idet dette par kun har to hy-20 drogenbindinger sammenlignet med de tre bindinger i et G:C-par.

Figur 8 og 9 viser et program for plasmidmodi-fikation under anvendelse af enten pMG 939 eller pMG 940 til opnåelse af andre plasmider ifølge opfindelsen, 25 som kan have andre SD til ATG-afstande end moderplasmi-derne.

N-TERMINAL AMINOSYRESEKVENS AF REKOMBINANT pGH (met 1 til 190) 30 En mængde på 5 nmol rekombinant pGH (met 1 til 190) anvendtes til udførelse af 24 nedbrydningscykluser i et ABl-proteinsekvenseringsapparat. Resultatet var konsistent med den tidligere offentliggjorte pGH-se- 28 DK 173162 B1 kvens (plus Met ved N-terminusen), dvs.:

Met-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-Ser-Leu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-X-Gln-Leu. (X » usikker) 5

Nogen bedømmelse af "preview", en indikator for N-terminal proteolyse, kan foretages ud fra størrelserne af PTH-methionintoppene ved analyser under tidlige cykluser, hvor PTH-met-baggrunden var negligerbar, og 10 ud fra størrelserne af PTH-Leu-toppe med fratrækkelse af baggrund. Vurderingen er, at mindre end 2% af pGH (met 1 til 190) molekylerne mangler en aminosyrerest.

En anden vurdering ud fra PTH-alanintoppe uden fratrækkelse af baggrund gav ca. 5% molekyler, der mangle-15 de en aminosyre, men dette er sandsynligvis overvurderet på grund af den manglende fratrækkelse af baggrund.

PROTEINEKSPRESSION

Småskalakulturer af PMG935/E. coll DHl og 20 PGH936/E. coli DH 1 dyrkedes ved 30*C i 1½ time. Forøgelsen af plasmidantallet og genekspressionen induceredes ved ændring af temperaturen til 42eC. Prøver blev udtaget med entimes intervaller før og efter induktion og analyseret ved elektroforese på SDS-25 polyacrylamidgeler (SDS-PAGE). Efter farvning med Coomassieblå fandtes væsentlige mængder af et varmein-ducerbart protein med den korrekte tilsyneladende molekylvægt for både pGH met (1-190) og pGH (4-190). Proteinindholdene nåede maksimale niveauer 7 timer 30 efter induktion. Disse bånd bekræftedes som værende væksthormon ved Western blot-analyse af en identisk SDS-PAGE-gel ved anvendelse af et pGH-specifikt, monoklonalt antistof 21-51.

->·* i DK 173162 B1 29

BIOLOGISK AKTIVITET

Svinevæksthormon opnået ud fra rekombinant piasmider i E. coli har været sammenlignet med naturligt svinevæksthormon isoleret fra svinehypofyser. Ækviva-5 lente mængder af proteinet injiceredes i hypofyseekto-miserede rotter (Long-Evans) over en fire dages periode. 24 timer efter den sidste injektion blev rotterne aflivet, og den højre tibia isoleredes. Benet blev renset og flækket ved den proksimale ende i midtsagittal-10 planet. Ipifysebrusken kan skelnes fra det omgivende ben efter farvning med sølvnitrat. Resultaterne er udtrykt som procentvise forøgelser:

KONTROLLER . REKOMBINANTER

15 -ve +ve 4-190 1-190

Middel' 1,7 4,4 3,9 4,1 % forøgelse 0 158% 129% 141%

-ve kontrol: hypophysektomiseret rotte + puffer 20 +ve kontrol: hypophysektomiseret rotte + naturlig GH

4-190 : rekombinant GH fra pMG936 1-190 : rekombinant GH fra pMG935 25

Eksempel 2

Fremstilling af pGH(met 1-190) og pGH(4-190).

30 (a) Fermentering.

Seks liter medium indeholdende glycerol (15 9/1), (5,0 g/1), NaH2P04 (6,24 g/1) og sporelementopløsning (20 ml/1) steriliseredes i en 101 fermentor.

i DK 173162 B1 30

Mediet inokuleredes med 200 ml af en rystefla-skekultur af E. coli-celler indeholdende pMG935 og dyrkedes ved 34 °C under beluftning og omrøring. pH-vær-dien holdtes på 7,0 med ammoniumhydroxidopløsning. Ste-5 rilt glycerol tilsattes med mellemrum til bevarelse af et overskud under fermenteringen.

Efter ti timer Induceredes pGH-dannelse ved hævelse af dyrkningstemperaturen til 42*C i 10 minutter og derefter afkøling til 38"C. Denne temperatur fast-10 holdtes i yderligere 6 timer.

Slutbiomassen var 26g tørcellevægt/1 og fasekontras tmikroskopi viste inklusionslegemer i cellerne. Cellerne høstedes ved centrifugering i 15 minutter ved 5.000 omdr./min. i 11 flasker i en Beckman J6-centri-15 fuge og opbevaredes ved -13°C indtil brug.

En anden fermentering udførtes under samme betingelser, bortset fra at E. coli celler indeholdende pMG936 anvendtes.

20 (b) Homogenisering af celler, udvinding og solublli- serlng af pGH, rensning og genfoldning.

(i) Cellehomogenisering.

25 Prøver af cellepasta (E. coli pMG935 og pMG936 fremstillet ifølge afsnit (a), suspenderedes i 390 ml 50mM natriumphosphatpuffer indeholdende 5mM EDTA, 0,5M NaCl og 0,lmM PMSP ved pH7. Cellerne lyseredes ved anvendelse af en French 30 trykcelle (1 passage ved 1200 psi). Ca. l mg DNase I sattes til hver suspension til digestering af DNA frigivet ved cellelyse.

i DK 173162 B1 31 (ii) Udvinding af uoplosellgt, denatureret pGH ved centrifugering pGH (met 1-190) 5

Cellehomogenatet centrifugeredes ved 5.000 omdr./min. 1 35 minutter til udvinding af inklusionslegemer i en særligt renset form. pelleten (13 g) resuspenderedes i 160 ml natriumphosphat-10 puffer med pH 7 og Indeholdende 5mM EDTA, 0,5M

NaCl og 0,lmM PMSF og centrifugeredes igen. Supernatanterne kastedes bort efter SDS-PAGE, som viste at pGH var til stede i pelleten.

15 PGH (4-190)

Cellehomogenatet centrifugeredes ved 12.000 omdr./min. i 5 minutter. Pelleten (10 g) vaskedes adskillige gange med Triton®-X-l00, og super-20 natanterne kasseredes bort.

(iii) Solubillsering og renaturering af pGH

Hver pellets indeholdende pGH-inklusionslegemer 25 og fremstillet i afsnit (ii) solubiliseredes i 50mM Tris pH θ,9, 7M guanidin-HCl, ImM EDTA, lOOmM 2-mercaptoethanol (7 ml/g pellet). Efter klaring chromatograferedes 28 ml af hver opløsning på en Sephacryl® S300 kolonne (2,2 x 85 cm),

30 som var ekvilibreret med 50mM Tris pH 8,9, 7M

guanidin-HCl, ImM EDTA, 50mM 2-mercaptoethanol.

Ved pGH (4 til 190) udførtes to forsøg. Eluatet for hver kolonne opsamledes i fraktioner og ana- i 32 DK 173162 B1 lyseredes ved absorbansen ved 280 run. Delmængder af kolonnefraktioner dialyseredes ind i 25mM Tris-HCl pH7, 8M urinstof, 0,1 vol% 2-mer-captoethanol, og analyseredes ved SDS-PAGE.

5

Fraktioner indeholdende de krævede polypeptider hældtes sammen, og hver samlet blanding dialyseredes mod 4 portioner af et 20 ganges overskud af 15mM Tris HCl pH9, 7M urinstof, 50mM 2-mer-10 captoethanol. Den tilbageholdte fraktion (50 ml

af pGH met 1 til 190 eller 180 ml pGH 4 til 190) indstilledes til pH 7 med 1M HCl inden anbringelse på en DEAE-cellulose (DE 52) kolonne (4,4 x 11 cm). Ionbyttermaterialet ekvilibrere-15 des med 15mM Tris-HCl pH 7, 7,5M urinstof, 50mM

2-mercaptoethanol. En proteintop elueredes fra kolonnen med 2 lejevolumener af ekvilibrerings-puffer. Denne top viste sig at indeholde pGH ved SDS-PAGE. Gelscanning viste, at pGHmet (met 1 20 til 190) var ca. 95% rent, mens pGH(4-190) kun var 45% rent, sandsynligvis på grund af overbelastning af DE52-kolonnen. Dette materiale rensedes derfor yderligere ved et andet DE52-trin.

25

Sammenhældte fraktioner fra ionbytterchromato-grafi dialyseredes mod 3 portioner af en 25 ganges overskud af 25mM Tris pH 10, 1% (vægt/vol) mannitol, under anvendelse af 30 "visking tubing". Hvert protein genfoldedes ved denne langsomme fjernelse af denatureringsmiddel og reduktionsmiddel.

DK 173162 B1 33

De dialyserede fraktioner deltes dernæst i portioner af 2 ml, de blev frosset med nitrogen og opbevaret ved -70eC. Fraktionernes proteinkoncentration måltes ved anvendelse af Bio-Rad pro-5 teintesten med absorbansen aflæst ved 595 nm.

Ca. 100 mg genfoldet svinevæksthormon (met 1 til 190) opnåedes ud fra 13 g (våd vægt) cellepasta.

60 mg genfoldet pGH (4-190) udvandtes fra 26 g (våd vægt) cellepasta.

10

Yderligere analyse udførtes for at bekræfte ægtheden af produkterne: (iv) FPLC anvendtes til at vise, at rekombinant 15 pGH-præparaterne havde den korrekte molekylvægt og ikke indeholdt nogen aggregater, såsom dimere. En Superose 12 kolonne (30 x 1,0 cm) ækvilibreredes med lOOmM Tris-HCl pH 8,0 og kalibreredes med en række af kendte molekylstan-20 darder. De følgende elueringstider opnåedes med pGH: autentisk pGH 27,7 min.

25 rec pGH (met 1 til 190) 27,5 min.

rec pGH (4 til 190) 27,0 min.

blandet injektion 27,2 min.

30

En enkelt top observeredes i hvert tilfælde. Kolonnens evne til at opløse pGH-dimere vistes ved anvendelse af ovalbumin, der har den samme i 34 DK 173162 B1 molekylvægt som en pGH dimer, dvs. 44.000 daltons.

Molekylvægtsfastsættelser af FPLC-topfraktioner 5 bekræftedes ved SDS-PAGE.

(v) Til bekræftelse af, at 22 kD-materialet var pGH-relateret udførtes Western blotting-analyse ved anvendelse af et pGH-specifikt, monoklonalt mu- 10 seantistof 21-51. En reduceret 15% SDS-polya- crylamidgel af hvert rekombinant polypeptid og hver autentisk standard elektroelueredes på et nitrocellulosefilter og undersøgtes med det monoklonale pGH-museantistof. Dette undersøgtes 15 dernæst med polyklonalt kaninantimuseantistof og påvistes med 125l mærket protein A. Det resulterende autoradiografi viste binding til 22Kd båndet. Rekombinant materialet var til sidst så rent som den autentiske standard ved dette kri-20 terium.

(vi) Radioreceptorbinding undersøgtes til .opnåelse af in vitro beviser for biologisk aktivitet af pGH (met l til 190).

25

Autentisk pGH mærkedes med 125I og inkuberedes natten over med levermembraner fra drægtige kaniner. Binding måltes ved centrifugering af receptoerne og tælling af pelleten i en gamma-30 tæller. Fortrængning af markøren med kold auten tisk pGH var dosisafhængig. Rekombinant pGH (met 1 til 190) viste sig også at fortrænge 125I-pGH, hvilket viser, at rekombinantpolypeptidet er i l 35 DK 173162 B1 stand til at konkurrere med det autentiske pGH om receptorstederne.

i

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekom-binant polypeptid med svinevaeksthorπιοn (pGH) aktivitet, kendetegnet ved, at man: 1. i en encellet organisme indfører en rekombi- 5 nant plasmidekspressionsvektor indeholdende en DNA-sekvens kodende for dette polypeptid med pGH aktivitet, hvor denne vektor er i stand til at blive replikeret, transkriberet og translateret i den encellede organisme og har en Shine-Dalgarno 10 til ATG afstand på 14 basepar; 2. dyrker organismen, i hvilken er indført den rekombinante plasmidekspressionsvektor; og 3. eksprimerer det rekombinante polypeptid med pGH aktivitet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendeteg net ved, at det rekombinante polypeptid med pGH aktivitet er pGH(met 1-190) eller pGH(4-190).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, ken detegnet ved, at plasmidekspressionsvektoren • 20 inkluderer en trp promotor.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at den encellede organisme er E.coli.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg-25 net ved, at den encellede organisme er E.coli DH1.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, hvor det rekombinante polypeptid med pGH aktivitet eksprimeres som et uopløseligt aggregat, kendetegnet ved, at man yderligere: 30 4) isolerer de uopløselige aggregater; 5. solubiliserer de isolerede, uopløselige aggregater; og 6. udvinder det rekombinante polypeptid med pGH aktivitet fra det solubiliserede aggregat. l DK 173162 B1

7. Rekombinant plasmidekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-sekvens kodende for et rekombinant polypeptid med pGH aktivitet, hvor denne vektor er i stand til at blive replike- 5 ret, transkriberet og translateret i en encellet organisme og har en Shine-Dalgarno til ATG afstand på 14 basepar.

8. Vektor ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det rekombinante polypeptid er pGH(met 1-190) 10 eller pGH(4-190).

9. Vektor ifølge krav 7 eller 8,kendetegne t ved, at den inkluderer en trp promotor.

10. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 9, kendetegnet ved, at den encellede 15 organisme er S.COlJL-

11. E.coli celle, kendet egnet ved, at den indeholder en vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10. i