DK173397B1 - Fremgangsmåder til fremstilling af liposomer samt fremgangsmåde til forøgelse af homogeniteten af en population af liposome - Google Patents

Description

i DK 173397 B1

Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåder til fremstilling af liposomer, især ekstrusionsmetoder til hurtig produktion af unilamellare liposomer. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til forøgelse af homoge-5 niteten af en population af liposomer til opnåelse af liposomer med definerede størrelsesfordelinger.

Som det er velkendt, er liposomer lukkede vesikler bestående af en lipidisk tolags membran, der omgiver en vandig 10 kerne. Generelt er der blevet produceret liposomer af de følgende tre typer: 1) multilamellare vesikler (MLV’er), hvori hver vesikel indeholder flere koncentriske tolags membraner, som er stablet inden i hinanden i et arrangement som et løgs skaller, 2) små unilamellare vesikler 15 (SUV’er), der kun har en enkelt tolags membran pr. vesikel, og som har diametre, på op til ca. 50 nm, og 3) store unilamellare vesikler (LUV1 er), der igen kun har en enkelt tolags membran pr. vesikel, men som i dette tilfælde har diametre på over ca. 50 nm, typisk af størrelsesorde-20 nen 100 nm og derover.

En gennemgang af disse tre typer af liposomer, herunder metoder til deres fremstilling og forskellige anvendelser af de færdige liposomer, kan findes i "Liposomes", Marc 25 J. Ostro ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983. Se også Szoka, Jr., et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. £, 467 (1980).

Andre typer af liposomer, der er blevet udviklet, omfat-30 ter stabile flerlamellare vesikler (SPLV'er), monofase vesikler (MPV'er) og stéroide liposomer. Disse vesikler og metoder til deres fremstilling kan findes i US patentskrifterne nr. 4 522 803, nr. 4 588 578 og nr. 4 721 612.

35 En af de primære anvendelser af liposomer er som bærere for forskellige materialer, såsom lægemidler, kosmetiske midler, diagnostiske reagenser, bioaktive materialer og 2 DK 173397 B1 lignende. Liposomer har også fundet udbredt anvendelse som videnskabelige modeller for naturligt forekommende biologiske membransystemer.

5 Ved enhver af disse anvendelser er det vigtigt at have tilgængelige populationer af liposomer, som har definerede gennemsnitlige diametre og definerede størrelsesfordelinger omkring disse gennemsnitsværdier. Nærmere bestemt er det vigtigt at have tilgængelige populationer af lipo-10 somer, som har en i det væsentlige unimodal fordeling omkring en udvalgt gennemsnitlig diameter.

Ved kommercielle anvendelser og især ved farmaceutiske anvendelser er sådanne populationer nødvendige til for-15 bedring af effektiviteten og sikkerheden af liposom-ind-kapslede lægemidler og lignende materialer. Endvidere ville adgangen til nøjagtigt definerede populationer af liposomer gøre det væsentligt lettere at opnå godkendelse af llposomholdige præparater hos sådanne myndigheder som 20 United States Food and Drug Administration. Med hensyn til andre anvendelser af liposomer, herunder videnskabelige undersøgelser, ville en let adgang til velkarakteriserede populationer af liposomer føre til mere standardiserede produkter og bedre reproducerbare forsøg.

25

Den foreliggende opfindelse angår således forbedrede fremgangsmåder til fremstilling af liposomer. Opfindelsen angår nærmere bestemt 1) en fremgangsmåde til fremstilling af unilamellare liposomer af både store og små ty-30 per, 2) en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer uden anvendelse af opløsningsmidler, detergenter eller andre fremmed-materialer og 3) en fremgangsmåde til forøgelse af homogeniteten af en population af liposomer med henblik på fremstilling af liposomer med definerede stør-35 relsesfordelinger.

3 DK 173397 B1

Forud for den foreliggende opfindelse blev store unila-mellare liposomer (LUV'er) i almindelighed fremstillet ved én af de følgende tre metoder: 1) revers-fase-ind- dampning, 2) detergent-fortynding eller 3) infusionspro-5 cedurer under anvendelse af forskellige opløsningsmidler, jf, "Liposomes” (se ovenfor), kapitel 1, side 37-44.

Ved revers-fase-inddampningsmetoden indføres en vandig puffer i en blanding af phosphorlipid og et organisk op-10 løsningsmiddel til dannelse af "inverterede miceller", dvs. smådråber af vand, der er stabiliseret i det organiske opløsningsmiddel ved at være omgivet af et phospho-lipid-monolag. Afdampning af opløsningsmidlet bevirker, at micellerne smelter sammen og danner de ønskede lipo-15 somer, jfr. f.eks. Szoka, Jr., et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 75, 4194 (1978) og US patentskrift nr.

4 235 871.

Ved detergent-fortyndingsmetoden blandes et detergent og 20 en vandig opløsning og behandles sonisk til dannelse af de ønskede vesikler. Separationsmetoder, såsom gelfiltrering, anvendes derefter til at fjerne detergentet og således danne de færdige liposomer.

25 Ved infusionsmetoden opløses et lipid i et opløsningsmiddel, f.eks. pentan eller diethylether, og lipid-opløsnin-gen infuseres i en vandig opløsning under betingelser, der bevirker, at opløsningsmidlet fordamper og således danner de ønskede liposomer. Se f.eks. Deamer, Annals New 30 York Academy of Sciences 308, 250-258 (1978).

Andre metoder, som er blevet anvendt til fremstilling af LUV'er, omfatter sammensmeltningsmetoder, hvorved en population af SUV'er behandles således, at de enkelte 35 SUV'er bringes til at smelte sammen med hinanden til dannelse af LUV'er. F.eks. beskrives der i US patentskrift nr. 4 078 052 en metode, hvorved calciumioner anvendes 4 DK 173397 B1 til at smelte SUV'er sammen til sneglehusformede cylindre, og hvor cylindrene derefter behandles med et cal-cium-chelateringsmiddel, såsom EDTA, til dannelse af de ønskede LUV'er. Hurtig frysning af SUV'er, efterfulgt af 5 langsom optøning, er også blevet anvendt til fremstilling af LUV'er ved sammensmeltning, jf. f.eks. U. Pick, Archives af Biochemistry and Biophysics 212, 186 (1981).

Med hensyn til fremstillingen af SUV'er er der ligesom 10 med LUV'er blevet anvendt forskellige metoder, jf. "Liposomes" (se ovenfor), kapitel 1, side 33-36. Den tidligste metode omfattede sonisk behandling indtil klaring af en suspension af lipid 1 en vandig opløsning under anvendelse af en sonde- eller bad-lydbehandlingsenhed.

15 Andre metoder har omfattet infusionsprocedurer af lignende art, som de, der er anvendt til fremstilling af LUV'er, men med ethanol som opløsningsmiddel (se S.

Batzri og E. Korn, Biochimica et Biophysica Acta 298, 1015 (1973)), og en metode med anvendelse af flere passa- 20 ger af MLV'er gennem en French-presse ved et tryk på ca.

2 1400 kg/cm (se f.eks. Hamilton, Jr., et al., Journal of Lipid Research 21, 981 (1980) og Barenholz et al., FEBS Lett. 99, 210 (1979)).

25 Foruden de grundlæggende metoder, der er anvendt til fremstilling af liposomer, er der blevet udviklet forskellige hjælpemetoder til efterbehandling af liposomer til forbedring af deres egenskaber, især, som nærmere omtalt nedenfor, har mange af de ovenfor beskrevne LUV-me-30 toder krævet en sortering af de færdige liposomer ved filtrering under anvendelse af f.eks. en række polycarbo-natfiltre, se "Liposomes" (se ovenfor), kapitel 1, side 37-39 og 45 og Szoka et al., Biochimica et Biophysica Acta 601, 559 (1980). Serier af polycarbonatfiltre er og-35 så blevet anvendt til sortering af MLV'er, se F. Olson et al., Biochimica et Biophysica Acta 557, 9 (1979); og

Bosworth et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 71, 5 DK 173397 B1 806 (1982).

Selv om enhver af de ovenfor anførte metoder kan anvendes til fremstilling af liposomer, er ingen af disse metoder 5 helt tilfredsstillende. F.eks. involverer enhver af de almindeligt anvendte LUV-metoder en forening af komponenterne, der danner liposomerne, med et lipid-solubilise-rende middel, dvs. enten et organisk opløsningsmiddel eller et detergent. Som det er velkendt, kan opløsnlngsmid-10 ler og detergenter give en uheldig påvirkning af mange materialer, såsom enzymer, som man kan ønske at indkapsle i liposomer, og disse metoder kan derfor ikke anvendes til disse materialer. Også ved sådanne anvendelser som dannelse af lægemiddel-bærersystemer, er den mulige til-15 stedeværelse af disse potentielt toksiske stoffer uønskelig.

Endvidere kræver disse metoder ofte langvarige dialyseprocedurer, der aldrig fuldstændig kan fjerne opløsnings-20 midlet eller detergentet, som er anvendt. Se f.eks. Allen et al., Biochimica et Biophysica Acta 601, 328 (1980). Endvidere kræves der forskellige særlige foranstaltninger i afhængighed af llpidets art. F.eks. kræver den begrænsede opløselighed af visse lipider (f.eks. cholesterol, 25 phosphatidyl-ethanolamin (PE) og phosphatidylserin (PS)) 1 ether eller ethanol en modificering af metoderne, hvor disse opløsningsmidler anvendes. Alternativt er deter-gent-dialyseprocedurer, hvorved der anvendes ikke-ioniske detergenter, såsom octylglucosid, besværlige at anvende, 30 da de kan kræve flere dages dialyse. Nødvendigheden af at separere lipid-solubiliseringsmidlerne fra de færdige liposomer nedsætter i væsentlig grad anvendeligheden af disse metoder.

35 Ligeledes har de kendte LUV-metoder i almindelighed givet liposomer med forskellige størrelser samt aggregater af liposomer, hvilket nødvendiggør, at der yderligere fore- 6 DK 173397 B1 tages en sortering af de færdige liposomer ved hjælp af en serie af filtre. Dette gør igen den samlede proces mere tidskrævende og kompliceret.

5 Fusionsmetoderne har lignende ulemper. F.eks. involverer calciumion/calciumchelateringsmiddel-metoden, ligesom opløsningsmiddel- og detergent-metoderne, anvendelse og efterfølgende fjernelse af materialer ud over de, der danner de færdige liposomer, i dette tilfælde chelate-10 ringsmidlet og de tilsatte calciumioner. Ligesom opløsningsmidlerne og detergenterne udgør disse materialer mulige kilder til forurening, begrænser anvendeligheden af metoden og gør metoden mere kompliceret. Denne metode kræver også, at liposommaterialet indeholder en vis mæng-15 de phosphatidylserin.

Med hensyn til frysning-optønings-metoden lider denne metode af den ulempe, at den specifikke indfangningskapacitet af liposomerne fremstillet ved denne metode falder 20 brat ved phospholipidkoncentrationer over ca. 20 mg/ml.

Der er lignende problemer ved SUV-metoderne. F.eks. kan en sonisk højenergibehandling forårsage oxidation og nedbrydning af phospholipider og beskadige molekyler af op-25 løst stof, som man ønsker at indfange i det indre af liposomerne. Desuden kan en sådan højenergibehandling, når den gennemføres med en lydbehandlings-sonde, medføre sondeerosion, og hvis den gennemføres ved bad-lydbehandling i kombination med radioaktive materialer, kan den give 30 anledning til dannelse af en potentialt farlig aerosol.

Sonisk lavenergibehandling er langsom, kan virke destruerende på phospholipidmolekyler og kan ikke anvendes til fremstilling af store mængder af liposomer. Endvidere giver lydbehandlingen en lav indfangningseffektivitet.

SUV-procedurer af infusionstypen lider under de samme problemer som LUV-infusionsprocedurerne. Højtryksmetoden 35 7 DK 173397 B1 ved hjælp af en French-presse har sit eget sæt af problemer, herunder vanskeligheder med at gøre metoden reproducerbar, nødvendigheden af en efterfølgende filtrering til fjernelse af MLV'er, som ikke er blevet omdannet til 5 SUV'er, nødvendigheden af at anvende et dyrt og omfattende udstyr, der er 1 stand til at modstå de høje anvendte tryk, og forurening af produktet ved den nedbrydning af apparatkomponenter, der forekommer under behandlingen af liposomerne. Se f.eks. Bosworth et al.. Journal of 10 Pharmaceutical Sciences 71, 806 (1982). Denne metode kan også kun give små liposomer med ringe indfangningseffektivitet.

Med hensyn til størrelsesfordelingsaspekterne har man 15 Ifølge den kendte teknik undersøgt forskellige procedurer i et forsøg på at finde en metode til at kontrollere både liposomstørrelse og -fordeling. Alle disse procedurer har været utilstrækkelige på den ene eller anden måde. F.eks. beskrives der af Ching-Hsien Huang, Biochemistry 8, 344 20 (1969), en flertrins metode til fremstilling af en homo gen population af små ynilamellare liposomer (SUV'er), der Involverer sonisk behandling af en lipidsuspension i en puffer i 2 1/2 time, centrifugering af det fremkomne produkt ved 105.000 g i 1 time til fjernelse af udisper-25 geret lipid, filtrering af den ovenstående væske gennem et grundigt vasket 0,1 Mm Sartorius-filter, molekylsigte-chromatografi af filtratet på en "Sepharose 4B"-søjle, der i forvejen er mættet med lipidsuspensionen og vasket og ækvilibreret med pufferen og opsamling af den anden 30 fraktion, der elueres fra søjlen. Selv om denne procedure giver en population af liposomer med en defineret størrelsesfordeling, er den tydeligvis kompliceret og tidskrævende, den giver kun SUV'er, og der er risiko for kemisk ændring af liposomerne eller deres indhold under en-35 ten den langvarige lydbéhandling eller under kontakten med "Sepharose 4B"-søjlen.

8 DK 173397 B1 I et forsøg på at overvinde nogle af problemerne ved Huang-metoden udviklede Barenholz et al., Biochemistry 16, 2806 (1977) en metode, hvorved molekylsigtechromato-grafi blev erstattet med højhastighedscentrifugering.

5 Ifølge denne metode behandles en lipiddispersion sonisk i en puffer i 30 minutter og centrifugeres i 15-30 minutter ved 100.000 g til fjernelse af multilamellare liposomer og sondepartikler, og den ovenstående væske fra centrifugeringen ved 100.000 g centrifugeres igen ved 159.000 g i 10 et tidsrum på 1 til 4 timer afhængigt af lipiderne, puffersammensætningerne og den anvendte temperatur. Den sidstnævnte centrifugering giver tre zoner, hvoraf den øverste indeholder den ønskede homogene population af liposomer og skal fjernes forsigtigt, uden at der medta-15 ges en del af den anden zone. Selv om denne metode eliminerer anvendelsen af "Sepharose 4B"-søjler, er den stadig langvarig og kompliceret, giver stadig kun SUV'er og har stadig de problemer, der hidrører fra lydbehandlingen. Tilsvarende beskrives der af Watts et al.. Biochemistry 20 17, 1792 (1978), fremstilling af en homogen population af SUV'er ud fra dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) ved lydbehandling efterfulgt af centrifugering ved 105.000 g i 10 minutter ved 4 °C.

25 Ud over forsøgene, der har været rettet på dannelse af homogene populationer af SUV'er, er der blevet gjort adskillige forsøg på at danne homogene populationer af større liposomer, dvs. liposomer med diametre over ca. 50 ns. Størstedelen af disse forsøg har involveret anvendel-30 se af en serie af polycarbonatfiltre med faldende pore-størrelse .

F.eks. beskriver Olson et al., Biochimica et Biophysica Acta 557. 9 (1979), en successiv ekstrusion af store mul-35 tilamellare liposomer gennem polycarbonatfiltre med pore-størrelser på 1,0; 0,8; 0,6; 0,4 og 0,2 μΐπ. Se også

Brendzel et al., Biochimica et Biophysica Acta 596. 129 9 DK 173397 B1 (1980). I artiklen af Olson et al. beskrives anvendelsen af metoden til sortering af store unilamellare liposomer fremstillet ved revers-fase-inddampning. Se Biochimica et Biophysica Acta 601, 559 (1980). I dette tilfælde anven-5 des der filtre med porestørrelser på 0,4; 0,2; 0,1 og 0,08 um.

Selv om Olson-metoden som rapporteret i litteraturen synes at give unimodale populationer af store liposomer (se 10 f.eks. fig. le og 3d i artiklen fra 1979 og fig. ID, 2D og 3D i artiklen fra 1980), som beskrevet detaljeret i eksempel 10 nedenfor, har det overraskende vist sig, at når kvasi-elastisk lysspredning anvendes som metode til bestemmelse af størrelsesfordelinger, udviser liposomer 15 fremstillet ved Olson-metoden ikke er unimodal fordeling.

Ved kommerciel produktion af liposomer i stor skala er kvasielastisk lysspredning i øjeblikket den eneste kendte fysiske "real-time"-metode til definering af størrelsesfordelinger, og méd Hensyn til kommercielle anvendelser 20 kan Olson-metoden derfor ikke siges faktisk at give en population af liposomer, der er unimodal.

Ud over Olson-metoden med anvendelse af successive poly-carbonatflltre er andre metoder blevet forsøgt i håbet om 25 at opnå en homogen population af relativt store liposomer. F.eks. beskriver Schullery et al-, Chemistry and Physics of Lipids 12, 75 (1973) anvendelsen af "Millipo-re"-filtre med porestørrelser på 8,0; 1,2; 0,80; 0,65 og 0,45 μπι til sortering af store multilamellare phosphati-30 dylcholin-liposomer.

Rhoden et al., Biochemistry 18, 4173 (1979) beskriver fremstilling af liposomer med diametre mellem 34 og 128 nm ved solubiliserlng af phosphatidylcholin og choleste-35 rol i en natriumcholatopløsning og efterfølgende fjernel se af detergentet ved hulfiberdialyse. Størrelsen af li-posomerne varieres ved justering af phospholipid/chole- 10 DK 173397 B1 sterol-forholdene og justering af pH-værdien og ionstyrken af dialysatet. Det blev observeret, at der fremkom bredere fordelinger for større liposomer.

5 Ifølge Bosworth et al.. Journal of Pharmaceutical Sciences 71^, 806 (1982) blev størrelsessorteringsmetoden med successive polycarbonatfiltre kombineret med dialyse over den samme type af filtre. Liposomerne blev fremstillet ved mekanisk omrøring eller ved French-presse-metoden 10 ifølge Barenholz et al., FEBS Lett. 99, 210 (1979). Liposomerne, der fremstilles ved mekanisk omrøring, sorteres under anvendelse af filtre med porestørrelser mellem 0,2 og 1,0 um, idet liposomerne ledes to gange gennem det mindste filter og, i nogle tilfælde to gange gennem hvert 15 af filtrene. Til dialysen anvendes filtre med porestørrelser mellem 0,05 og 3 um.

Enoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 145 (1979) beskriver fremstilling af liposomer med diametre på 100 20 nm ved detergentbehandling af sonisk behandlede vesikler efterfulgt af gelfiltrering på "Sepharose 4B". Hamilton et al., Journal of Lipid Research 21, 981 (1980) beskriver fremstilling af liposom-populationer med forskellige størrelser ved anvendelse af en French-presse i kombina-25 tion med ultra-centrifugering og gelchromatografi på søjler af 2 eller 4% agarose. Reeves et al., J. Cell. Physiol. 73, 49 (1969) beskriver fremstilling af en population af meget store liposomer (omkring 1200 nm), der har en logaritmisk normalfordeling, men vesikler på under 30 1000 nm blev målt med vanskelighed, og vesikler på under 500 nm blev slet ikke målt.

En gennemgang af nogle af de ovenfor beskrevne procedurer kan findes i Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. £, 35 467 og 493-494 (1980). Se også "Liposomes", Marc J. Ostro ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1.

11 DK 173397 B1 På baggrund af den ovenfor omtalte kendte teknik er det tydeligt, at der fortsat foreligger et væsentligt behov for en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af unila-mellare liposomer af både SUV- og LUV-type.

5

Endvidere er det tydeligt, at der i hvert fald siden 1969 har været udfoldet vedvarende bestræbelser på at fremstille populationer af liposomer med definerede størrelsesfordelinger. Mange af disse bestræbelser har været 10 rettet mod fremstilling af populationer med gennemsnitlige diametre på over ca. 50 nm. Sideløbende med ønsket om populationerne i sig selv har der foreligget et parallelt ønske om en generelt anvendelig og enkel metode, der på reproducerbar måde giver populationer af den ønskede type 15 til et bredt udvalg af forarbejdningsbetingelser.

I overensstemmelse hermed er det et af formålene med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af en population af i det 20 væsentlige uni 1 amel 1 are liposomer. Det er især et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en simpel reproducerbar fremgangsmåde til fremstilling af uni-lamellare liposomer, hvilken fremgangsmåde kan gennemføres med let tilgængeligt og relativt billigt udstyr, har 25 et minimalt antal trin, giver en høj produktion af liposomer pr. tidsenhed og ikke kræver, at komponenterne, der danner liposomerne, behandles sonisk eller kombineres med opløsningsmidler, detergenter eller andre fremmes-materialer.

30

Det er et andet formål med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer af både unilamellare og multilamellare typer, der ikke kræver anvendelse af opløsningsmidler, detergenter eller andre 35 fremmed-materialer.

12 DK 173397 B1

Det er et yderligere formål med opfindelsen at tilvejebringe populationer af liposomer, der har definerede størrelsesfordelinger. Det er endvidere et formål med opfindelsen at tilvejebringe en simpel fremgangsmåde til 5 fremstilling af sådanne populationer.

Til opfyldelse af de ovennævnte og andre formål tilvejebringes der ifølge opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af en population af i det væsentlige unilamella-10 re liposomer, der er ejendommelig ved at involvere gentagne ekstrusioner ved moderate tryk af forud dannede multilamellare liposomer gennem et filter med en porestørrelse under en kritisk øvre grænse, nærmere bestemt under 100 nm.

15 På denne måde opnås der ifølge opfindelsen flere fordele i forhold til hidtil kendte systemer til fremstilling af unilamellare liposomer, herunder følgende: 20 1) mulighed for dannelse af unilamellare vesikler ud fra et stort udvalg af llpider, 2) mulighed for anvendelse af høje lipidkoncentrationer (f.eks. af størrelsesordenen 300 μΐηοΐ/ml), således at der let opnås høje indfangnings-effektiviteter, 3) mulighed for at opnå en reproducerbar 25 og meget hurtig fremstilling af unilamellare vesikler, især store unilamellare vesikler, ved anvendelse af høje ekstrusionsstrømningshastigheder og automatisk eller halvautomatisk recirkulering af liposomerne gennem filteret, 4) mulighed for fremstilling af liposomer med en 30 ønsket størrelse ved anvendelse af et filter med en enkelt porestørrelse med minimale filtertilstopningsproblemer, 5) mulighed for at undgå anvendelse af organiske opløsningsmidler og detergenter og 6) mulighed for at opnå en proces, der alt i alt er relativt skånsom.

35 I nogle tilfælde er det, i stedet for at omdanne en population af multilamellare liposomer fuldstændigt til en 13 DK 173397 B1 population af unilamellare liposomer, ønskeligt blot at nedsætte lamellariteten af populationen, uden at det rent unilamellare stadium nås. Ifølge dette aspekt af opfindelsen anvendes der stadig filtre med en porestørrelse på 5 højst 100 nm, men der anvendes et nedsat antal passager gennem filteret.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer direkte ud fra lipidpulver el-10 ler -pellets, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man blot forener dette pulver eller disse pellets med en vandig puffer og derefter udøver et tilstrækkeligt tryk på lipid/puffer-blandingen, således at den gentagne gange bliver ledt gennem et filter. Hvis filteret har en 15 porestørrelse på under 100 nm, fås der liposomer, der i det væsentlige er unilamellare. Hvis filteret har en porestørrelse, der er væsentligt over 100 nm, f.eks. af størrelsesordenen 200 nm, fås der multilamellare liposomer. Det er væsentligt, at liposomerne i begge tilfælde 20 er fuldstændig opløsningsmiddelfri, idet ikke engang chloroform, som hidtil er blevet anvendt til fremstilling af MLV'er, er nødvendigt ved fremstillingen af liposomer ifølge disse aspekter af opfindelsen.

25 Ifølge et andet aspekt tilvejebringes der ifølge opfindelsen populationer af liposomer, der i det væsentlige har unimodale fordelinger omkring gennemsnitlige diametre, der er større end 50 nm.

30 Opfindelsen tilvejebringer desuden en fremgangsmåde til forøgelse af homogeniteten af en population af liposomer, hvilken fremgangsmåde omfatter gentagne passage af liposomer gennem et eller flere filtre med konstant porestør-, relse, indtil størrelsesfordelingen af populationen i det 35 væsentlige er unimodal.

14 DK 173397 B1

Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende i sammenhæng med beskrivelsen af de foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.

5 Fig. 1A og IB på tegningen er skematiske diagrammer af et apparatur, der er egnet til udøvelse af opfindelsen. I fig. 1A recirkuleres liposomsuspensionen manuelt gennem filteret, medens recirkuleringen i fig. IB er delvis automatiseret.

10 31

Fig. 2 viser P-NMR-signalintensiteten hidrørende fra multilamellare vesikler af æg-phosphatidylcholin (EPC) (i nærværelse af 5 mM MnCl2) som funktion af antallet af ekstrusioner gennem polycarbonatfiltre med porestørrelser 15 på 100 nm (cirkler) og 200 nm (kvadrater). De anførte "error bars" viser standardafvigelserne (n - 6 for punktet ved 10 ekstrusioner gennem 100 nm filteret; n - 3 for punktet ved 30 ekstrusioner). Alle andre datapunkter er gennemsnittet af to særskilte forsøg. Lipidkoncentratio-20 nen er i alle tilfælde mellem 30 og 60 »»mol/ml.

Fig. 3 viser fire fryse-fraktur-mikrofotografier af vesikler fremstillet ved gentagen ekstrusion af multilamellare vesikler med forskellig lipidsammensætning gennem 25 polycarbonatfiltre; a) soj a-phosphatidylcholin-MLV'er ekstruderet gennem et 100 nm filter; b) soja-PC/soja-PS-(l:l)-MLV'er ekstruderet gennem et 100 nm filter; c) soja-PE/soja-PS-(1:1-MLV'er ekstruderet gennem et 100 nm filter; og d) soja-PC-MLV'er ekstruderet gennem et filter 30 med en porestørrelse på 200 nm. Pilen 1 fig. 3d viser krydsfraktur, der afslører indre lameller. Alle mikrofo-tografier har den samme forstørrelse, og skygningsretningen er vist med pilen i neder s te højre hjørne af hvert billede. I alle tilfælde gentages ekstrusionsproceduren 35 10 gange på lipidsystemer indeholdende 40-70 μΐηοΐ/ml phospholipid.

15 DK 173397 B1

Fig. 4 viser størrelsesfordelingen af søja-PC-vesikler fremkommet efter 10 ekstrusioner gennem et polycarbonat-filter med en porestørrelse på 100 nm. Vesikeldiametrene måles på frysefraktur-mikrofotografier under anvendelse 5 af metoden ifølge van venetie et al., J. Micros. 118, 401-408 (1980). De udfyldte og skraverede søjler repræsenterer henholdsvis vesikler, der er underkastet frys-nings-optønings-cycler, og vesikler, der ikke er underkastet frysnings-optønings-cycler.

10

Fig. 5 viser den kalorimetriske opførsel af hydratiseret dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) i store multilamel-lare vesikler (MLV'er) og i store unilamellare vesikler fremstillet ved ekstrusionsmetoden Ifølge den foreliggen-15 de opfindelse (LUVET'er). MLV'erne dannes ved at hvirvle en tør lipidfilm i bunden af et reagensglas i nærværelse af en NaCl-puffer ved 5ΐ> °C, medens LUVET'erne dannes ved gentagen ekstrusion (10 gange) af MLV'er (50 mg lipid pr. ml) gennem polycarbonatfiltre med en porestørrelse på 100 20 nm ved 50 °C. Der anvendes en scanningshastighed på 2,0 °K/min.

Fig. 6 viser indfangningseffektiviteten som funktion af lipidkoncentrationen for liposomer fremstillet ifølge den 25 foreliggende opfindelse både med (åbne cirkler) og uden 14 (udfyldte cirkler) frysning-optøning. Der anvendes C-inulin som indfangnings-mærkestof.

31

Fig. 7 viser p-NMR-signalintensiteten hidrørende fra 30 multilamellare vesikler af æg-phosphatidylcholin (i nærværelse af 5 nM MnCl2) som funktion af antallet af ekstrusioner gennem polycarbonatfiltre med porestørrelser på 50 nm (åbne cirkler) og 30 nm (udfyldte cirkler). Lipidkoncentrationen er i alle tilfælde 100 mg/ml.

35

Fig. 8 og 9 viser fryse-fraktur-mikrofotografier af ve-siklerne ifølge fig. 7 forarbejdet gennem henholdsvis 50 16 DK 173397 B1 ran og 30 nm filtre. I begge tilfælde viser den øverste figur (fig. 8A og 9A) et præparat efter én esktrusion (lx) gennem to stablede polycarbonatfiltre, og den ne-derste figur (fig. 8B og 9B) et præparat efter 10 ekstru-5 sioner (lOx).

125

Fig. 10 viser den såkaldte clearance af I-tyraminyl-125 inulin ( ITI) indfanget i æg-phosphatidylcholin-chole- sterol-(1:l)-LUVET’er fra kredsløbet hos rotter (cirkler) 10 og den efterfølgende udskillelse i urinen (kvadrater).

LUVETTer fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse og injiceres i halevenen hos Wistar-hunrotter på 150-175 g i et dosisniveau på 0,5 amol phospholipid i 100 al HBS.

Urinen opsamles i metabolisme-bure. Der udtages blod, og 15 dyrene aflives på de anførte tidspunkter, hvorefter den 125 totale mængde ITI i blodet beregnes, idet der antages en blodmængde på 4,9 ml pr. 100 g rotte. Resultaterne udtrykkes som procentdele af den totale mængde Injiceret 125 ITI + standardafvigelsen (n » 4).

20

Fig. 11 viser langtids-vævsfordelingen af LUVET'er ifølge fig. 10. Symbolerne svarer til lever (cirkler), krop (trekanter) og milt (kvadrater). Resultaterne udtrykkes 125 som procentdele af totalt ITI in vivo (totalt injice-125 25 ret ITI minus udskilt mængde) + standardafvigelsen (n - 4).

Beskrivelse af foretrukne udførelsesformer 30 Som ovenfor beskrevet tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse ekstrusionsmetoder til fremstilling af dels populationer af i det væsentlige unilamellare li-posomer, og dels populationer af liposomer med I det væsentlige unimodale fordelinger (i det følgende omtalt som 35 de "unilamellare" og "unimodale" aspekter af opfindelsen). Desuden muliggør opfindelsen fremstilling af liposomer uden anvendelse af opløsningsmidler, detergenter 17 DK 173397 B1 eller andre fremmed-materialer (i det følgende omtalt som de "opløsningsmiddelfri" aspekter af opfindelsen).

Populationerne af i det væsentlige unilamellare liposomer 5 fremstilles ved at underkaste i forvejen dannede liposomer flere ekstrusioner ved moderate tryk gennem et filter med en porestørrelse på højst 100 nm.

De i forvejen dannede liposomer kan have forskellige sam-10 mensaetninger og kan være fremstillet ved enhver af de metoder, der er kendte nu eller er udviklet sidenhen til fremstilling af liposomer.

F.eks. kan de forud dannede liposomer være dannet ved den 15 konventionelle metode til fremstilling af MLV'er, dvs. ved afsætning af et eller flere udvalgte lipider på in-dervæggene af en egnet beholder ved opløsning af lipider-ne i chloroform og efterfølgende afdampning af chlorofor-men, tilsætning af den vandige opløsning, der skal ind-20 kapsles, til beholderen, hydratisering af lipidet med den vandige opløsning, og omrøring eller hvirvling af den fremkomne lipldsuspension til dannelse af de ønskede liposomer. Ved denne metode anvendes de mest skånsomme betingelser, det simpleste kendte udstyr og de simpleste 25 procedurer til fremstilling af liposomer. Ved denne metode undgår man også specielt problemerne med sonisk behandling eller anvendelse af detergenter, opløsningsmidler (ud over chloroform) eller andre fremmed-materialer som ovenfor diskuteret.

30

Alternativt, ifølge de opløsningsmiddelfri aspekter af den foreliggende opfindelse, kan liposomerne, der skal ekstruderes gentagne gange gennem filteret, fremstilles ved blot at blande lipid-pulver eller pellets og puffer 35 sammen og derefter direkte ekstrudere denne blanding gennem filteret. Hvis filteret har en porestørrelse på mindre end 100 nm, giver denne procedure unilamellare lipo- 18 DK 173397 B1 somer, medens der fås multi lamel lare liposomer, hvis porestørrelsen er væsentligt over 100 nm. I begge tilfælde undgår man ved denne procedure anvendelse af ethvert opløsningsmiddel, herunder chloroform.

5

Med hensyn til fremstillingen af populationer af liposomer med i det væsentlige unimodale fordelinger kan lipo-somerne, der udgør populationen, have forskellige sammensætninger, og de kan have form af multilamellare, unila-10 mellare eller andre typer af liposomer eller, mere generelt, lipidholdige partikler, som er kendte nu eller er udviklet sidenhen. F.eks. kan de lipidholdige partikler have form af steroide liposomer, stabile flerlamellare liposomer (SPLV'er), monofase-vesikler (MPV'er) eller li-15 pid-matrlx-bærere (LMC'er) af typerne beskrevet i US patentskrifterne nr. 4 522 803, nr. 4 588 578 og nr.

4 721 612.

Den gennemsnitlige diameter af populationen vil afhænge 20 af den måde, hvorpå liposomerne skal anvendes. F.eks. foretrækkes der, som kendt af fagmanden, generelt gennemsnitlige diametre i området 100 til 500 nm til diagnostiske anvendelser, medens større diametre, f.eks. af størrelsesordenen 500-1000 nm, foretrækkes til deponering 25 af lægemidler, og mindre diametre, f.eks. af størrelsesordenen 50 til 100 nm, foretrækkes, hvor endocytose er ønskelig. Lignende intervaller er fastlagt inden for teknikken til andre anvendelser, se f.eks. "Liposomes" (se ovenfor).

30

Gennemsnitlige diametre af populationer af liposomer kan måles ved forskellige kendte metoder, herunder fryse-fraktur og kvasi-elastisk lysspredning. Som ovenfor nævnt og nærmere omtalt nedenfor foretrækkes kvasi-elastisk 35 lysspredning i sammenhæng med de unimodale aspekter af den foreliggende opfindelse, og værdierne af liposomdia-metrene, der er anført i den foreliggende beskrivelse i 19 DK 173397 B1 forbindelse med disse aspekter, er målt under anvendelse af denne metode.

Den i det væsentlige unimodale population af liposomer 5 fremstilles ved gentagen passage af forud dannede liposo-mer gennem filtre med konstant porestørrelse, indtil størrelsesfordelingen af populationen i realiteten er unlmodal. Det har overraskende vist sig, at gentagne passager gennem filtre med en konstant porestørrelse bevir-10 ker, at bimodale aspekter af den oprindelige størrelsesfordeling såvel som højere-modale aspekter efterhånden forsvinder. For at metoden skal fungere, er det imidler-j tid nødvendigt kun at anvende én porestørrelse og at an vende denne gentagne gange.

I 15

De forud dannede liposomer kan fremstilles ved enhver af de metoder, der er kendt i øjeblikket eller er blevet ud-Viklet sidenhen til fremstilling af liposomer. F.eks. kan de forud dannede liposomer fremstilles ved den ovenfor 20 omtalte, konventionelle metode til fremstilling af multi-I Γ låmellare liposomer (MLV'er).

Alternativt kan metoder anvendt til fremstilling af store unllamellare liposomer (LUV*er), såsom revers-fase-ind-25 dampning, infusionsprocedurer og detergent-fortynding, anvendes til fremstilling af de forud dannede liposomer.

En gennemgang af disse og andre metoder til fremstilling af liposomer kan findes i teksten "Liposomes" (se ovenfor), hvortil der henvises. Som andre alternativer kan de 30 forud dannede liposomer fremstilles ifølge procedurerne beskrevet i de ovennævnte US patentskrifter nr.

4 522 803, nr. 4 588 578 og nr. 4 721 612. Der kan også i stedet for liposomer i sig selv anvendes andre lipidhol-dige partikler ved udøvelsen af den foreliggende opfin-35 delse. I sådanne tilfælde vil den fremkomne unimodale population i almindelighed ikke være en population af liposomer, men snarere en population med lignende egenska- 20 DK 173397 B1 ber som de oprindeligt anvendte lipidholdige partikler.

Ved udvælgelsen af en metode til fremstilling af de forud dannede liposomer er det vigtigt at vælge en metode, der 5 ikke giver et betydeligt antal liposomer, som har en væsentlig mindre diameter end porestørrelsen, der er valgt til dannelse af den unimodale population. Ellers kan det være nødvendigt at anvende et ekstremt stort antal passager gennem filteret for at inkorporere de små 10 liposomer i den unimodale population.

Da størrelsesfordelinger for populationer af liposomer er relativt lette at bestemme, kan en fagmand let udvælge en metode, der opfylder dette krav.

15 I stedet for at anvende forud dannede liposomer som udgangsmateriale kan den i det væsentlige unimodale population af liposomer om ønsket fremstilles ved anvendelse af den ovenfor omtalte opløsningsmiddelfri metode, dvs.

20 populationen af liposomer kan fremstilles direkte ud fra lipid-pulver eller -pellets og puffer ved blot at blande disse bestanddele sammen og derefter direkte føre denne blanding gennem filtre med en udvalgt porestørrelse et tilstrækkeligt antal gange til, at der opnås den ønskede 25 unimodalitet.

Filtrene, der anvendes til fremstilling af de unilamella-re liposomer eller den unimodale fordeling af liposomer, er fortrinsvis af den type, der har lineære gennemgående 30 kanaler. Polycarbonatfiltre af denne type fremstillet af Nuclepore, Inc., Pleasanton, CA, har vist sig at fungere med godt resultat ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse. Ved en typisk procedure kan det være nødvendigt at udskifte filteret efter de første to eller tre 35 passager af liposomsuspensionen på grund af tilstopning af porerne. Tilstopningen afhænger i almindelighed af sådanne variable som lipidsammensætning, -renhed og 21 DK 173397 B1 -koncentration samt af de anvendte tryk og strømningshastigheder .

Den mest kritiske parameter ved fremstillingen af unila-5 me11are liposomer ifølge den foreliggende opfindelse er størrelsen af filterets kanaler. Det har vist sig, at unilamellare liposomer ikke kan fremstilles ud fra multi-lamellare liposomer, ligemeget hvor mange gange MLV'erne ledes gennem filteret, hvis filterets porestørrelse er 10 væsentligt over 100 nm, f.eks. hvis porestørrelsen er ca.

200 nm (se eksempel 2 nedenfor). I overensstemmelse hermed kan kun filtre med en porestørrelse på mindre end eller lig med 100 nm anvendes i sammenhæng med dette aspekt af opfindelsen.

15

Som illustreret i eksempel 6 nedenfor afhænger størrelsen af de fremstillede unilamellare liposomer af det anvendte filters porestørrelse, idet den gennemsigtige diameter i almindelighed er noget mindre end porestørrelsen. Om øns-20 ket kan liposomernes gennemsnitlige diameter samt deres indfangede volumener (al pr. amol phospholipid) let forøges ved anvendelse af den ovenfor omtalte frysnings-optøningsprocedure (se også eksempel 4 nedenfor). Det er vigtigt at bemærke, at da denne procedure ikke involverer 25 anvendelse af opløsningsmidler, detergenter eller andre fremmed-materialer, sker forøgelsen af liposomstørreisen ikke på bekostning af, at der indføres urenheder eller opstår nedbrydningsproblemer. Vesikelstørrelsen og indfangningsvolumenerne kan også manipuleres ved at variere 30 andre parametre i systemet, såsom lipidsammensætningen.

Antallet af passager gennem filteret, som er nødvendigt til dannelse af de ønskede unilamellare liposomer afhænger af filterets karakteristika (porestørrelse, sammen-35 sætning og geometri) og af materialerne, hvoraf liposo-merne skal fremstilles. Som illustreret i eksempel 2 nedenfor er det typisk nødvendigt at anvende 5 eller flere 22 DK 173397 B1 passager gennem et dobbelt stablet polycarbonatfilter med en porestørrelse på 100 nm for at opnå unilamellare lipo-somer. Der kan kræves færre passager ved mindre porestørrelser. F.eks. er det med 30 og 50 nm filtre 1 alminde-5 lighed tilstrækkeligt at anvende 2 til 4 passager for at opnå en i det væsentlige unilamellar population af lipo-somer (se eksempel 6 nedenfor). Der kræves også færre passager, hvis målet kun er at reducere lamellariteten af populationen snarere end i alt væsentligt at opnå unila-10 mellaritet. Et passende antal passager for ethvert bestemt system kan let bestemmes af en fagmand ved blot at undersøge de færdige liposomer til bestemmelse af, hvornår den ønskede grad af lamellar!tet er opnået.

15 Med hensyn til de unimodale aspekter af opfindelsen er porestørrelsen den primære afgørende faktor for den gennem den primære afgørende faktor for den gennemsnitlige diameter af den færdige population. I almindelighed, inden for omkring 15 til 50%, er den gennemsnitlige dia-20 meter tilnærmelsesvis lig med porestørrelsen. Ved porestørrelser under ca. 100 nm har den gennemsnitlige diameter af populationen imidlertid en tilbøjelighed til at flade ud ved ca. 75 nm som målt ved kvasi-elastisk lysspredning uafhængigt af den anvendte porestørrelse. Som 25 ovenfor omtalt viser de færdige liposomer ved porestørrelser under ca. 100 nm sig at være i det væsentlige unilamellare i afhængighed af lamellariteten af den oprindelige population. Ved porestørrelser over 100 nm forbliver multilamellare liposomer multilamellare, og unilamellare 30 liposomer forbliver unilamellare.

Antallet af passager gennem filteret, som er nødvendigt til dannelse af en i det væsentlige unimodal population, afhænge af filterets karakteristika (porestørrelse, sam-35 mensætning og geometri) og materialerne, ud fra hvilke liposomerne skal fremstilles. I nogle tilfælde er tre til fem passager gennem dobbelte stablede polycarbonatfiltre 23 DK 173397 B1 tilstrækkeligt til dannelse af en unimodal population. Generelt vil 25 passager gennem dobbelte stablede poly-carbonatfiltre give den ønskede unimodale fordeling for de fleste lipisompræparater. Det rette antal passager for 5 ethvert bestemt system kan let bestemmes af en fagmand ved blot at undersøge de færdige liposomer til bestemmelse af, hvornår der i alt væsentligt er opnået unimodali-tet.

10 Passagen af liposomerne gennem filteret til dannelse af unimodale, unilamellare eller både unimodale og unilamel-lare populationer gennemføres under tryk. Der kan anvendes tryk af forskellig størrelse afhængigt af typen og sammensætningen af liposomerne, der skal fremstilles, de 15 særlige karakteristika af det anvendte udstyr og den hastighed, hvormed liposomerne skal produceres.

De maksimale tryk er generelt begrænset af porestørrelsen af understøtningen, der anvendes til at holde filteret.

20 Med en filterunderstøtning med en porestørrelse på ca. 30 2 vm har tryk mellem ca. 7 og ca. 50 kg/cm vist sig at give gode resultater. Disse tryk giver intakte liposomer, høje strømningshastigheder (af størrelsesordenen 20-60 ml/min. for et dobbelt stablet polycarbonatfilter med en 25 porestørrelse på 100 nm) og homogene størrelsesfordelinger, f.eks. liposomer med en diameter på 60-100 nm ved anvendelse af et 100 nm filter. Med en filterunderstøtning med en porestørrelse under 30 Mm kan der anvendes højere tryk. _______________ 30

Ligesom med antallet af passager gennem filteret kan det rette tryk for et bestemt system let bestemmes af en fagmand ved undersøgelse af de færdige liposomer til bestemmelse af, om de i det væsentlige er intakte og har den 35 ønskede unimodale fordeling og/eller unilamellar!tet.

9 24 DK 173397 B1

Tryk i området 7-50 kg/cm foretrækkes også, fordi de muliggør ekstrusion af opløsninger med lipidkoncentrationer af størrelsesordenen ca. 300 umol phospholipid pr. ml uden væsentlig filtertilstopning. Ved kendte metoder til 5 sortering af liposomer under anvendelse af polycarbonat- 2 filtre er der blevet anvendt tryk på mindre end 7 kg/cm , og de har derfor været begrænset til lipidkoncentrationer på 60 umol/ml. Anvendelsen af høje lipidkoncentrationer har medført indfangnings-virkningsgrader af størrelsesor-10 denen 30% ved den foreliggende opfindelse. Høje ekstru-sionshastigheder af størrelsesordenen 20 ml/min. og derover opnås stadig ved sådanne høje lipidkoncentrationer, 2 når der anvendes tryk i området ca. 20-35 kg/cm .

15 Strømningshastigheder af størrelsesordenen 20-60 ml/min. er ikke de maksimale strømningshastigheder, der kan opnås ved den foreliggende opfindelse, men er blot hastigheder, der giver en bekvem opsamling af det ekstruderede materiale. De maksimale strømningshastigheder er følsomme for 20 koncentrationen af lipld, prøvens historie (dvs. om den er blevet ekstruderet en eller flere gange), det anvendte tryk og naturen af lipiderne selv. F.eks. kan lipider i geltilstand ikke ekstruderes. Sådanne lipider (f.eks. dipalmitoyl-phosphatidylcholin (DPPC)) skal opvarmes til 25 over temperaturen for overgang fra gel til flydende krystaller (41 °C for DPPC), før ekstrusionsprocessen kan forløbe.

Ved forhøjede tryk kan ekstrusionen være yderst hurtig, 30 f.eks. er 5 ml dispersion af 50 mg/ml æg-phosphatidylcho- lin (EPC) blevet ekstruderet gennem et filter med en porestørrelse på 100 nm på mindre end 2 sekunder ved 35 2 kg/cm , svarende til en hastighed på mindst 150 ml/min.

Denne hastighed vil blive forøget yderligere ved højere 35 tryk eller temperatur.

• - I — 1 25 DK 173397 B1

Et egnet apparat til udøvelse af den foreliggende opfindelse ér vist i fig. 1A og IB. Som vist i fig. 1A indføres en liposomsuspension 4, der skal ekstruderes gennem et filter 6, i et trykkammer 2 via en lndsprøjtningsåb-5 ning 8. Indsprøjtningsåbningen tjener også som trykaflastningsventil. Trykkammeret 2 er dannet af en øvre del 10 og en nedre del 12, der er forbundet med f.eks. bolte 14. En O-ring 16 danner en forsegling mellem disse dele og filteret 6. Kammeret er fortrinsvis fremstillet af 10 klar plast, således at ekstrusionen af suspensionen fra kammeret kan observeres visuelt. Filteret understøttes i kammeret 2 af en filterunderstøtning 18. I praksis har det vist sig at være bekvemt at anvende to stablede poly-carbonatfiltre til dannelse af filteret 6.

15

Kammeret 2 bringes under tryk via en ledning 20, der er forbundet med en tryk-kilde, f.eks. en beholder med nitrogen under højt tryk (ikke vist). Ledningen 20 indeholder en ventil og en regulator 22 til indstilling af tryk-20 ket i kammeret 2. Materialet, der ekstruderes fra filteret 6, fjernes fra kammeret 2 via en ledning 24 og opsamles i en samlebeholder 26. I praksis lukkes ventilen 22, før al suspensionen er blevet ekstruderet fra kammeret 2, for at forhindre, at gas under højt tryk strømmer gennem 25 systemet og blæser suspensionen ud af samlebeholderen 26.

Efter at være blevet opsamlet i beholderen 26 føres det ekstruderede materiale gentagne gange tilbage til kammeret 2 via indsprøjtningsåbningen 8, indtil den oprindelige population af liposoniér er passeret gennem filteret 6 30 et tilstrækkeligt antal gange til, at dens unimodalitet og/eller unilamellarltet er er forøget væsentligt.

Fig. IB viser en modifikation af apparatet ifølge fig.

1A, hvori recirkuleringen af det ekstruderede materiale 35 er delvis automatiseret. Apparatet vist i denne figur anvendes på følgende måde.

26 DK 173397 B1

Der installeres først et filter 6 i apparatet ved fjernelse af en holde-prop med gevind 5, et filterunderstøtningshus 9 og en O-ring 16 fra aluminiumhuset 7. Et filter anbringes derefter på filterunderstøtningen, og kom-5 ponenterne samles igen, idet proppen 5 tilspændes, indtil O-ringen er trykket mod det indre plexiglashus 11, der findes inden i det ydre aluminiumhus 13. Om ønsket kan der placeres en porøs afløbsskive (ikke vist) under filteret.

10

En prøve indføres derefter i et modtagelseskammer 3 ved at dreje tilførsels/recirkulerings/fraførsels-ventilen 15, indtil tilførsels/fraførsels-røret 17 er på linie med indløbsåbningen 19, og ved at dreje tryk/udluftnings-ven-15 tilen 23, indtil udluftningsåbningen 25 er på linie med udløbsåbningen 21. En prøve kan derefter indføres i modtagelseskammeret gennem tilførsels/fraførsels-røret 17.

Dette gøres mest bekvemt ved at fastgøre et kort stykke fleksibelt rør og en injektionssprøjte til tilfør-20 sels/fraførsels-røret 17.

Når prøven er blevet indført i modtagelseskammeret, overføres den til trykkammeret 2 ved nedtrykning af overførsels-ventilen 27. Prøven er nu klar til ekstrusion gennem 25 filteret 6. Til gennemførelse af ekstrusionen drejes tryk/udluftnings-ventilen 23, indtil gasindløbsåbningen 31 er på linie med trykåbningen 33, og tilførsels/recir-kulerings/fraførsels-ventilen 15 drejes til en position, hvor recirkuleringsåbningen 37, der er dannet i ventilen 30 15, er på linie med indløbsåbningen 19 ved den ene ende og med omløbsåbningen 29 ved den anden ende. Gasindløbsåbningen 31 er forbundet med en åbning med gevind 35, der tjener til at forbinde apparatet med en ydre kilde til gas med højt tryk, f.eks. en beholder med nitrogen under 35 højt tryk (ikke vist), der er forsynet med en ventil og en regulator.

27 DK 173397 B1

Trykkammeret 2 sættes derefter under tryk, hvilket bevirker, at prøven passerer fra dette kammer til modtagelseskammeret 3 via filteret 6, omløbsåbningen 29, recirkuleringsåbningen 37 og indløbsåbningen 19. Herved sker der 5 én ekstrusion af prøven gennem filteret. Strømmen fra trykkammeret 2 til modtagelseskammeret 3 kan observeres visuelt gennem plexiglashuset 11, og trykket kan indstilles således, at der fås en rolig strøm.

10 Når al prøven er overført til modtagelseskammeret 3, lukkes ventilen på den ydre trykkilde, og tryk/udluftnings-ventilen 23 drejes således, at den først bringer udluftningsåbningen 25 på linie med udløbsåbningen 33, hvorved både modtagelseskammeret 3 og trykkammeret 2 udluftes.

15 Prøven kan nu igen indføres i trykkammeret 2 ved blot at nedtrykke overførselsventilen 27. Når prøven er indført i trykkammeret 2, kan ekstrusionsprocessen gentages ved anvendelse af den procedure, der er beskrevet ovenfor for den første ekstrusion. Det skal bemærkes, at når prøven 20 er i modtagelseskammeret og begge kamre er blevet udluftet, kan der om ønsket installeres et nyt filter ved anvendelse af den ovenfor beskrevne procedure.

Når modtagelseskammer-trykkammer-modtagelseskammer-cyclen 25 er blevet gentaget det ønskede antal gange, fjernes prøven fra apparatet gennem tilførsels/fraførsels-røret 17 ved først at bringe gasindløbsåbningen 31 på linie med udløbsåbningen 21 og bringe tilførsels/fraførsels-røret 17 på linie med indløbsåbningen 19 og derefter sætte sy-30 stemet under tryk ved hjælp af den ydre trykkilde. I

praksis afbrydes det ydre tryk, før al prøven har forladt kammeret 3, således at man undgår en høj gasstrøm ved slutningen af udtømningen. I stedet for at anvende tilførsels/fraførsels-røret 17 kan man også fjerne prøven 35 ved at aftage holde-proppen med gevind 5, filterunder støtningshuset 9 og O-ringen 16 fra aluminiumhuset 7 og derefter nedtrykke overførselsventilen 27, således at 28 DK 173397 B1 prøven løber ind i trykkammeret og ud af bunden af appa-ratet.

Om ønsket kan apparatet vist i fig. IB eller et ækviva-5 lent apparat udstyret med konventionelt automatisk flui-dumhåndteringsudstyr og kontrolorganer, således at der fås en fuldstændig automatiseret proces. Trykkamrene i det anvendte udstyr kan også opvarmes ved anvendelse af en vandkappe eller lignende anordning, således at det 10 bliver muligt at holde temperaturen af prøven over temperaturen for overgang fra gel til flydende krystaller af de anvendte lipider.

Den foreliggende opfindelse beskrives nærmere i de føl-15 gende eksempler. Materialerne og metoderne, der er fælles for de forskellige eksempler nedenfor, beskrives i det følgende.

Materialer og metoder 20

Lipider JEg-phosphatidylcholin (EPC) og soja-phosphatidylcholin (SPC) isoleres ved anvendelse af standardprocedurer 25 (Singelton et al.. Journal of the American Oil Chemical Society 42, 53 (1965)). De tilsvarende former af phospha-tidylethanolamin (PE) og phosphatidylserin (PS) fremstilles ud fra EPC og SPC til dannelse af EPE, SPE, EPS og SPS (se P. Comfurius og R.F.A. Zwaal, Biochim. Biophys.

30 Acta 488. 36-42 (1977)). Lipiderne fra soja-kilden er betydelig mere umættede end lipiderne fra EPC på grund af det høje indhold af linolsyre i SPC (se C.P.S. Tilcock og P.R. Cullis, Biochim. Biophys. Acta 641, 189-201 (1981)).

Alle lipider har en renhed på mere end 99% som bestemt 35 ved tyndtlagschromatografi (TLC). Sure phospholipider (PS) omdannes til natriumsaltformen som beskrevet af M.J.

Hope og P.R. Cullis, Biochim. Biophys. Res. Commun. 92, i 29 DK 173397 B1 846-852 (1980). Cholesterol (Sigma, St. Louis) anvendes uden yderligere rensning.

Bestemmelse af indfangede volumener 5

Til bestemmelse af indfangede volumener fremstilles mul-tilamellare vesikler i overensstemmelse med proceduren beskrevet i eksempel 1 nedenfor, men i nærværelse af 1 μΟΙ 22Na eller 14C-inulin (NEN, Canada). Der fremstilles 10 derefter unilamellare liposomer ud fra de multilamellare liposomer, igen ifølge proceduren beskrevet i eksempel 1.

En portion (100 ni) anbringes derefter på en "Sephadex G- 50"-søjle pakket i en 1 ml engangssprøjte, og vesiklerne 15 elueres ved centrifugering af søjlen ved 500 g i 3 min.

Se U. Pick, Arch. Biochem. Biophys. 212, 186-194 (1981).

22 Når der anvendes Na, er dette tilstrækkeligt til at fjerne alt ikke-indfanget materiale. Til fjernelse af alt ikke-indfanget inulin gennemfører man imidlertid enten 20 denne procedure en gang til eller anvender en enkelt passage gennem en "Ultragel"-søjle (LKB - ACA34). Portioner af det eluerede materiale undersøges for llpidphosphor ved metoden Ifølge C.J.F. Bottcher, C.M. Van Gent og C.

Pries, Anal. Chim. Acta 24, 203-204 (1961). Indfanget 22 25 Na bestemmes ved anvendelse af en Beckman 8000-gamma- 14 tæller, og indfanget C-inulin vurderes ved anvendelse af en Phillips PW-4700-væskescintillationstæller. Indfangede volumener beregnes derefter som μΐ indfanget volumen pr. μΐηοΐ phospholipid.

30 31 P-Kernemaqnetisk resonans 31 P-NMR anvendes til at give en indikation af det omfang, i hvilket vesikelpræparaterne er unilamellare. Der sættes 2+ 35 Mn til vesikeldispersionen (3 ml, 30-60 μΐηοΐ phospholipid pr. ml i et NMR-rør med en diameter på 15 mm) i til- 31 strækkelige mængder (5 mM) til, at P-NMR-signalet fra 30 DK 173397 B1 phospholipiderne, der vender mod det ydre medium, udbredes så meget, at det ikke detekteres. Hvis vesiklerne er store og unilamellare, skal der være ca. 50% af signalet 2+ tilbage efter tilsætning af Mn . Impermeabiliteten af 5 vesiklerne for Mn2+ er demonstreret ved at følge det tidsmæssige forløb af signalintensiteten, der for de undersøgte PC-systemer viser sig at være stabil i flere dage. Spektrene optages med et Bruker WP 200 NMR-spektro-meter ved 81 MHz. Akkumulerede fri-induktions-henfald 10 svarende til 100ο transienter registreres ved anvendelse af en 15 usek. 90° radiofrekvens-puls, gated proton-de-kobling og en 20 KHz sweep-bredde. En eksponential multiplikation svarende til en 50 Hz linieudbredning anvendes før Fourier-transformation. Signalintensiteter måles ved 15 udskæring og vejning af spektre med triphenylphosphit (i et lille centralt kapillarrør i NMR-røret) som reference.

Bestemmelse af vesikel-størrelsesfordelinger 20 Vesikelstørrelsesfordelinger for eksemplerne 1-7 og en del af eksempel 8 bestemmes ved fryse-fraktur. Vesikel-præparaterne blandes med glycerol (25 vol-%) og fryses i en blanding af flydende og frosset freon. Prøverne frak-tureres, og der dannes replikaer deraf ved anvendelse af 25 et Balzer BAF 400D-apparat. Mikrofotografier af replika-erne tages med et Phillips 400-elektronmikroskop. Vesikelstørrelsesfordelingerne bestemmes ved måling af diameteren af de frakturerede vesikler, der er skygget 50% ved proceduren ifølge van Venetie et al., J. Micros.

30 118, 401-408 (1980).

Vesikelstørrelsesfordelingerne for en del af eksempel 8 og eksempel 9-10 bestemmes ved anvendelse af kvasi-elas-tisk lysspredning, der også er kendt som dynamisk lys-35 spredning eller foton-korrelations-spektroskop!.

31 DK 173397 B1

Som det er kendt, involverer denne metode passage af kohærent lys, f.eks. fra en helium-neon-laser, gennem en prøve af de suspenderede vesikler og måling af de tidsafhængige fluktuationer af lyset, som spredes af vesikler-5 ne. En autokorrelationsfunktion beregnes derefter ud fra disse data. Som det kan vises teoretisk, er denne autokorrelationsfunktion direkte relateret til diffusionskoefficienterne af vesiklerne i prøven, der igen er en funktion af de hydrodynamiske radier af vesiklerne. I 10 overensstemmelse hermed vil forskellige vesikelstørrel-sesfordelinger give forskellige autokorrelationsfunktioner.

I praksis fås der ikke entydige partikelstørrelsesforde-15 linger direkte ud fra autokorrelationsfunktionerne. Der antages derimod en fordeling for vesiklerne, og der udføres derefter en bestemmelse af, hvor godt autokorrelationsfunktionen beregnet ud fra de målte data stemmer overens med den autokorrelationsfunktion, man ville få, 20 hvis vesiklerne i prøven faktisk havde den antagne fordeling.

Hvis det nærmere bestemt antages, at den intensitetsvæg- tede fordeling af diffusionskoefficienterne af vesiklerne 25 er en unimodal gauss-fordeling, kan det vises teoretisk, at en andenordens polynomium, dvs. et polynomium med 2 eksponenter af t op til t , vil stemme nøjagtigt overens med den naturlige logaritme af autokorrelationsfunktionen. Se D.E. Koppel, Journal of Chemical Physics 57, 4814 30 (1972). I overensstemmelse hermed er det omfang, hvori et andengrads polynomium faktisk stemmer overens med den naturlige logaritme til autokorrelationskoefficienten for en bestemt prøve, et nøjagtigt mål for det omfang, hvori diffusionskoefficienterne af vesiklerne i prøven har en 35 unimodal gauss-fordeling. Som anvendt i teknikken betegnes denne procedure ofte en kumulativ analyse af autokorrelationsfunktionen .

32 DK 173397 B1

Som det er kendt Inden for teknikken, er det ligetil at 1) bestemme den naturlige logaritme af en autokorrelationsfunktion, 2) at tilpasse et andengrads polynomium til den naturlige logaritme og 3) at bestemme graden af 5 overstemmelser mellem polynomiet og denne logaritme. I overensstemmelse hermed er gauss-fordelingsmetoden i øjeblikket den mest praktiske måde af karakterisere og sammenligne populationer af vesikler på, og det er derfor denne metode, der anvendes i sammenhæng med de unimodale 10 aspekter af den foreliggende opfindelse.

Nærmere bestemt betragter man i overensstemmelse med disse aspekter en population af liposomer som i det væsentlige unimodal, når logaritmen til dens autokorrelations-15 funktion stemmer godt overens med et andengrads polynomium. 1 eksemplerne nedenfor fås autokorrelationsfunktionerne ved anvendelse af en Nicomp Model 200 Laser Particle Sizer (Nicomp Instruments, Inc., Santa Barbara, Califonien). Dette udstyr anvender mindste kvadraters me- 20 tode til kurvetilpasning og angiver tilpasnings-godheden 2 som en chi -værdi beregnet ud fra afvigelserne mellem logaritmen til autokorrelationsfunktionen og værdierne 2 forudsagt af andengradspolynomiet. Værdierne af chi i området 0-2 viser en god tilpasning af dataene ved den 2 25 antagne unimodale gauss-fordeling, medens høje chi -værdier viser en dårlig tilpasning.

For en god tilpasning kan et estimat for standardafvigelsen af fordelingen beregnes ud fra kvadratroden af 30 koefficienten til andengradsleddet af polynomiet. For fordelinger med god tilpasning er dette estimat angivet i eksemplerne, medens det ikke er angivet for dårlige tilpasninger. Selv om der kan beregnes en værdi, tjener en sådan værdi nemlig ikke i realiteten som et estimat af 35 standardafvigelsen.

33 DK 173397 B1

Andre kemikalier

Inulin, periodsyre, natrium-m-arsenit, tyramin, "Sephadex G-25", natriumcyanoborhydrid, natriumborhydrid og chole- 5 sterol fås fra Sigma. "Ultrogel Ac34" fås fra Pharmacia, 125 bærerfrit Na I (100 mCi/ml) fås fra Amersham, og iodo-gen fås fra Pierce. Alle andre kemikalier er analysekvaliteter.

10 EKSEMPEL 1

Fremstilling af unilamellare liposomer

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af store unila-15 mellare liposomer ved anvendelse af ekstrusionsmetoden ifølge den foreliggende opfindelse. For nemheds skyld betegnes liposomerne fremstillet ifølge denne metode LUVET’er (Large Unilamellare Vesicles by Extrusion Techniques).

20

Store multilamellare vesikler fremstilles ved den konventionelle metode som følger. Først tørres et lipid opløst i chloroform og afsættes som en film på indersiden af et reagensglas. MLV’erne dannes derefter ved blot at sætte 25 en vandig puffer af 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH-værdi 7,5, til reagensglasset og hydratisere lipidet ved hvirvelblanding.

Den fremkomne MLV-dispersion (2-10 ml) overføres til 30 trykkammeret i apparatet vist i fig. 1A, der er udstyret med to stablede 25 mm standard-polycarbonatfiltre med en porestørrelse på 100 nm (Nuclepore, Inc., Pleasanton,

Califonien, katalognummer 110.605). Kammeret sættes under nitrogentryk via en standard-gascylinder udstyret med en 2 35 højtryksregulator (0-80 kg/cm ). Vesiklerne ekstruderes 2 gennem filteret under et tryk på 7-50 kg/cm , hvorved der fås strømningshastigheder på 20-60 ml/min., hvorefter de 34 DK 173397 B1 opsamles og genindsprøjtes. Ved at gentage ekstrusions-proceduren 5 gange eller mere opnås der produktion af store unilamellare liposomer med diametre på ca. 70 nm målt ved frysefraktur. Den samlede ekstrusionsproces in-5 klusive recirkulering tager i almindelighed 15 minutter eller mindre.

I de følgende eksempler beskrives der detaljeret størrelse, multilamellaritet, indfanget volumen, indfangningsef-10 fektivitet og indflydelse af forskellige lipidsammensæt-ninger på liposomerne fremstillet ved den ovennævnte procedure. Virkningerne af en frysnings-optøningsprocedure på det indfangede volumen og den kritiske betydning af filterporestørrelsen er også illustreret.

15 EKSEMPEL 2

Den kritiske betydning af filterporestørrelsen 20 Dette eksempel illustrerer den kritiske betydning af filterporestørrelsen på fremstillingen af unilamellare lipo-somer og især den kritiske betydning af at anvende et filter med en porestørrelse på højst 100 nm.

25 EPC-MLV'er fremstilles ifølge proceduren beskrevet i eksempel 1 og ledes derefter gentagne gange gennem polycar-bonatfiltre med porestørrelser på 100 og 200 nm. Unila- mellariteten af de fremkomne liposomer bestemmes ved an- 31 vendelse af den ovenfor beskrevne P-NMR-metode. Resul-30 taterne er vist i fig. 2.

Som vist i denne figur for vesikler, der har passeret gennem 200 nm filteret, falder signalintensiteten til ca.

65% efter 5 passager gennem filteret og forbliver der-35 efter relativt konstant. På den anden side falder signalet til ca. 50% efter 5 eller flere passager gennem 100 nm filteret.

35 DK 173397 B1

Da et fald af signalintensiteten til ca. 50% viser, at liposomerne i det væsentlige er unilamellare, medens et fald til kun 65% viser en væsentlig multilamellaritet, viser resultaterne, at 100 nm filteret giver unilamellare 5 liposomer som ønsket, medens 200 nm filteret fortsætter med at producere væsentlige mængder af multilamellare li-posomer uafhængigt af antallet af passager gennem filteret.

10 Denne konklusion bekræftes af frysefraktur-mikrofotogra-fierne vist i fig. 3. Som det fremgår af denne figur, udviser vesikler dannet af SPC, SPC-SPS (1:1) og SPE-SPS (1:1) (fig. 3a, 3b og 3c) med et 100 nm filter ikke noget væsentligt antal krydsfrakturer (mindre end 0,1%), hvil-15 ket viser et fravær af indre lameller. I modsætning hertil observeres der let krydsfrakturer for SPC-vesikler fremstillet gennem et 200 nm filter (fig. 3d).

Disse resultater demonstrerer klart, at unilamellariteten 20 ' i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse afhæn ger af anvendelsen af et filter med en porestørrelse af størrelsesordenen 100 nm eller mindre.

EKSEMPEL 3 25 LUVET-Diametre, indfangede volumener og unilamellar!tet

Dette eksempel demonstrerer, at procedurerne ifølge den foreliggende opfindelse under anvendelse af 100 nm filtre 30 reproducerbart medfører dannelse af en relativt homogen population af LUV'er med forskellige lipidbestanddele. Vesikeldiametre og indfangne volumener bestemmes ved de ovenfor beskrevne metoder. Resultaterne er vist i fig. 4 og tabel I nedenfor.

De skraverede søjler i fig. 4 viser vesikeldiametrene målt for SPC-LUVET'er, som er fremstillet ved 10 ganges 35 36 DK 173397 B1 passage af MLV'er fremstillet ifølge eksempel 1 gennem to (stablede) filtre med en porestørrelse på 100 nm. Tabel I viser sammenfattende de målte gennemsnitlige diametre og de gennemsnitlige indfangede volumener for denne og andre 5 lipidsammensætninger. Som kontrol fremstilles EPC-LUV'er ved to procedurer (octylglucosid-detergent-dialyse og revers- fase-inddampning), som er almindeligt anerkendte til fremstilling af unilamellare vesikler, og de således fremstillede LUV'er ekstruderes derefter 10 gange gennem 10 to (stablede) filtre med en porestørrelse på 100 nm. Se L.T. Mimms, G. Zampighi, Y. Nozaki, C. Tanford og J.A. Reynolds, Biochemistry 20, 833-840 (1981), og F. Szoka og D. Papahadjopoulos, Ann. Rev. Bioeng. 9, 467-508 (1980). Resultaterne af disse kontroller er også vist i tabel I.

15 Det er interessant med hensyn til den generelle anvendelighed af den foreliggende opfindelse at bemærke, at når octylglucosid-proceduren anvendes til fremstilling af vesikler bestående af EPC/cholesterol (1:0,25), dannes der multilamellare vesikler, medens der ved fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen i det væsentlige dannes unilamellare vesikler med de samme bestanddele.

Vesikeldiameter-fordelingen vist i fig. 4 kan anvendes til bestemmelse af beregnede værdier for indfangne volu- 25 mener og mængden af indre monolags-phospholipid, når der skønnes 1) et areal pr. phospholipidmolekyle, f.eks. 0,6 2 nm (se H. Schieren, S. Rudolph, M. Finkelstein, P.

Coleman og G. Weissman, Biochim. Biophys. Acta 542, 137-153 (1978)); 2) en dobbeltlagstykkelse, f.eks. 4 nm (se 30 A.E. Blaurock, Biochim. Biophys. Acta 650. 167-207 (1982)) og 3) at vesiklerne er unilamellare. Disse beregnede værdier kan derefter sammenlignes med de eksperimentelt observerede indfangne volumener og mængder af indre monolags-phospholipid til bestemmelse af andelen af til-35 stedeværende unilamellare vesikler.

37 DK 173397 B1

Ved anvendelse af denne metode på vesikelstørrelsesforde-1 i ngen vist i fig. 4 (skraveret) fastslås det, at en sådan vesikelpopulation (hvis den er unilamellar) vil have en "indre monolags"-signalintensitet (efter tilsæt-5 ning af Mn2+) på ca. 43% af den oprindelige intensitet, og at det indfangede volumen vil være ca. 1,6 μΐ/μΐηοΐ.

Dette er i rimelig overensstemmelse med de målte værdier af sekvestreret phospholipid (48%) og indfanget volumen (1,2 + 0,2 μΐ/umol) i betragtning af antallet af antagel-10 ser og især i betragtning af vanskelighederne ved at skønne arealet pr. phospholipidmolekyle, der i høj grad kan påvirke det indfangne volumen udtrykt som μΐ pr. μΐηοΐ phospholipid.

15 En sammenligning af den beregnede værdi af det indfangne volumen på 1,6 μΐ/μπιοί med forsøgsresultaterne vist i tabel I viser, at LUVET'er sammensat af SPC og EPC udviser mindre indfangne volumener end forventet, medens der opnås det teoretiske indfangne volumen, hvis der er et 20 ladet phospholipid, såsom phosphatidylsering, til stede.

To mulige årsager til de observerede lave indfangne volumener for EPC- og SPC-LUVET'er er, at der er et væsentligt antal multilamellare vesikler til stede i populationen, eller at der er en større andel af små vesikler til 25 stede end skønnet ud fra fryse-fraktur-mikrofotografier-ne. Fryse-fraktur-resultaterne tyder på, at antallet af multilamellare vesikler ér meget lille (mindre end 2%), selv hvis det antages, at kun 5% af de frakturerede multilamellare systemer udviser en krydsfraktur (se R.G.

30 Miller, Nature 287, 166 (1980)). På den anden side er en undervurdering af antallet af små vesikler sandsynlig.

Endvidere, som vist i tabel I, er de indfangede volumener, som er målt for EPC-LUV’er fremstillet ved octylglu-35 cosid-detergent-dialyseproceduren og revers-fase-inddamp-ningsproceduren og derefter ekstruderet 10 gange gennem et filter med en porestørrelse på 100 nm, sammenlignelige 38 DK 173397 B1 med de indfangede volumener, der fås for EPC-LUVET'er.

Disse observationer viser samlet, at størstedelen af ve-siklerne fremstillet ved ekstruslonsmetoden ifølge den 5 foreliggende opfindelse er unilame11are, selv om det målte Indfangede volumen i visse tilfælde er mindre end den beregnede værdi.

For at fastslå, at procedurerne ifølge den foreliggende 10 opfindelse ved anvendelse af filtre med en porestørrelse på 100 nm giver LUV'er, i modsætning til SUV'er gennemføres der kalorimetriske undersøgelser med MLV'er og LUVET'er sammensat af 16:0/16:0-PC (dipalmitoylphosphati-dylcholin — DPPC).

15 SUV'er sammensat af mættede phospholipider, såsom DPPC, vides at udvise en nedsættelse af deres temperaturer (T ) for overgangen fra gel til flydende krystaller og en udbredning af overgangen på grund af deres stærkt krum-20 mede membraner. Denne høje krumning betragtes i almindelighed som uønsket, fordi den medfører en forøget uorden i membranens carbonhydridområde (se J.R. Schuh, U. Banerjee, L. Muller og S.I. Chan, Biochim. Biophys. Acta 687, 219-225 (1982)).

25

For at konstatere, om LUVET'er fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er tilstrækkelig store til, at der undgås problemer på grund af stærkt krummede membraner, måles der kalorimetrisk T -værdier for MLV'er og 30 LUVET'er fremstillet ved procedurerne ifølge eksempel 1. Resultaterne er vist i fig. 5.

Som vist i denne figur, udviser MLV'er og LUVET’er værdier af T , der er meget lig hinanden. Disse værdier stem-35 mer overens med de værdier, der er angivet i litteraturen. Se B.D. Ladbrooke og D. Chapman, Chem. Phys, Lipids 3, 304-367 (1969). De står i direkte modsætning til den 39 DK 173397 B1 opførsel, der observeres for sonisk behandlede DPPC-ve-sikler, der udviser en udbredning af overgangen fra gel til flydende krystaller, der sker ca, 4 °C under smelte-temperaturen af de multilamellare systemer. Se P.W.M. van 5 Dijck, B. de Kruijff, P.A.M.M. Aarts, A.J. Verkleij og J. de Gier, Biochim. Biophys. Acta 506, 183-191 (1978). Det er derfor korrekt at klassificere de unilamellare liposo-mer, der er fremstillet ved procedurerne ifølge den foreliggende opfindelse under anvendelse af filtre med en 10 porestørrelse på 100 nm, som LUV'er snarere end som SUV'er.

Til undersøgelse af den strukturelle integritet af lipo-somerne fremstillet ved ekstrusionsprocessen ifølge den 15 foreliggende opfindelse fremstillet LUVET'er ved procedurerne ifølge eksempel 1, men med en puffer, der har en NaCl-koncentration på 1 M i stedet for 150 mM. Efter fremstillingen anbringes liposomerne i destilleret vand, hvilket skaber en stor osmotisk trykforskel over liposo-20 nemes membraner. Ved anvendelse af "arenazo III" som msrkestof for liposom-lækning findes der praktisk taget ingen lækning under disse strenge prøvebetingelser.

EKSEMPEL 4 25

Anvendelse af frysnings-optønlngs-cycler til forøgelse af indfanget volumen

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af en frysnings-30 optønings-procedure til forøgelse af de indfangede volumener af de unilamellare liposomer fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

SPC- og EPC-LUVET'er fremstillet ved procedurerne ifølge 35 eksempel 1 underkastes to frysnings-optønings-cycler (under anvendelse af flydende nitrogen) og derefter ekstru-slon gennem nye filtre med en porestørrelse på 100 nm.

40 DK 173397 B1 Nærmere bestemt anbringes LUVET'erne i en plastampul, og ampullen anbringes i flydende nitrogen i ca. 1 minut. De frosne LUVET'er optøs derefter i vand ved stuetemperatur i ca. 5 minutter. Den optøede opløsning ekstruderes 3 5 gange gennem nye 100 nm filtre, hvorefter frysnings-optø-nings-ekstruderingsproceduren gentages endnu en gang.

Resultaterne heraf er sammenfattet i tabel I. Detaljer vedrørende størrelsesfordelingen af de frysnings-optø-10 nings-behandlede SPC-LUVET'er er anført i fig. 4 (udfyldte søjler).

Som vist i fig. 4 forøges den gennemsnitlige diameter af SPC-LUVET'erne med ca. 20 nm. Det beregnede indfangede 15 volumen for denne vesikelfordeling er 2,3 wl/wmol, hvilket stemmer udmærket overens med den målte værdi på 2,2 +_ 0,1 μΐ/nmol (tabel I).

Endnu højere indfangede volumener opnås ved anvendelse af 20 et soja-PC-system, hvor frysning-optøning af LUVET'er fremstillet ved ekstrusion (10 gange) gennem filtrene med en porestørrelse på 100 nm og derefter ekstrusion (3-4 gange) gennem filtre med en porestørrelse på 200 nm medfører indfangede volumener af størrelsesordenen 10 25 »»1/μπιοΙ phospholipid.

EKSEMPEL 5 LUVET-indfangninqs-effektivitet 30

En vigtig parameter for LUV-præparater er deres indfangningseffektivitet. Dette er især tilfældet, når midlerne, der skal indfanges, enten er kostbare, således som det er tilfældet med mange lægemidler, eller har lave opløselig-35 heder.

41 DK 173397 B1 I sammensætning med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at der ved den samlede proces kan opnås indfangningseffektiviteter af størrelsesordenen 30%, til trods for de relativt lave indfangede volumener af de 5 fremstillede vesikler, ved blot at forøge lipidkoncentra-tionen af opløsningerne anvendt til fremstilling af LUVET’erne.

Denne effekt er demonstreret i fig. 6, hvor procentdelen 10 af vandigt volumen indfanget i LUVET'er er afsat mod li-pidkoncentrationen for LUVET'er fremstillet ved procedurerne Ifølge eksempel 1 (udfyldte cirkler) og ved anvendelse af frysnings-optønings-proceduren ifølge eksempel 4 (åbne cirkler).

15

Fremstillingen af LUVET'er ved lipidkoncentrationer på 300 umol/ml sker let og giver indfangningseffektiviteter af størrelsesordenen 30% som vist i figuren. Det er interessant at bemærke, at frysnings-optønings-cyclen kun 20 giver en væsentlig forøgelse af indfanget volumen pr. μ mol lipid ved lipidkoncentrationer under 200 μmol/ml.

Lignende observationer er rapporteret af U. Pick, Arch.

Biochem. Biophys. 212, 186-194 (1981)).

25 EKSEMPEL 6

Anvendelse af filtre med porestørrelser under 100 nm

Dette eksempel illustrerer virkningerne af at anvende 30 filtre med porestørrelser under 100 nm på størrelsen af de fremstillede liposomer og på det antal passager gennem filteret, der er nødvendigt for i alt væsentligt at opnå unilamellaritet. 1 MLV'er fremstilles ved procedurerne ifølge eksempel 1 under anvendelse af æg-PC i en koncentration på 100 mg/ml og en puffer af 150 mM NaCl og 20 mM Hepes (pH-værdi 42 DK 173397 B1 7,5). Dispersionen ledes 10 gange gennem to stablede polycarbonbatfiltre med en porestørrelse på enten 50 eller 30 run under anvendelse af apparatet ifølge fig. 1A.

Der udtages portioner efter 1 og efter 10 passager gennem 5 ekstruslonsapparatet, og disse anvendes til fremstilling af frysefraktur-mikrofotografier som ovenfor beskrevet.

Der tages også prøver (4 ml, 25 mg phospholipid pr. ml) efter forskellige antal passager, og disse analyseres ved 31 2+ P-NMR under anvendelse af Mn som ovenfor beskrevet.

10 Resultaterne er vist i fig. 7-9.

Som vist i fig. 7 mister vesikler ekstruderet én gang 31 gennem 50 nm filtre 37% af deres P-NMR-signal ved tilsætning af Mn^+, medens vesikler ekstruderet én gang gen-15 nera 30 nm filtre mister 47,5%. Dette viser, at vesik-lerne, der har passeret gennem 50 nm filtrene, er større og/eller mere multilamellare end vesiklerne, der har passeret gennem 30 nm filteret, og resultatet bekræftes af frysefraktur-mikrofotografierne vist i fig. 8 og 9. Ved 20 sammenligning af de øvre dele af disse figurer (fig. 8A og 9A), ses det, at liposomerne, der har passeret én gang gennem 50 nm filtrene, er større og mere uregelmæssige end liposomerne, der har passeret én gang gennem 30 nm filtrene.

25 31

Efter 10 passager falder P-NMR-signalintensiteterne med henholdsvis 53 og 56% for 50 og 30 nm filtrene. Heraf ses det, at begge filtre producerer liposomer med i det væsentlige samme partikelstørrelse. Dette bekræftes ved 30 analyse af frysefraktur-mikrofotografier, der viser, at begge populationer har en gennemsnitlig diameter på 44 + 14 nm, dvs. en diameter, der er karakteristisk for SUV'er. Som illustreret i fig. 8B og 9B er den fremstillede population i begge tilfælde homogen.

35

En sammenligning af kurverne i fig. 7 med kurven for 100 31 nm filteret i fig. 2 viser, at P-NMR-signalerne har en 43 DK 173397 B1 tendens til at flade hurtigere ud for filtrene med små porestørrelser. Der kræves følgelig færre passager gennem ekstrusionsapparatet for at opnå en population af i det væsentlige unilamellare liposomer ved anvendelse af 5 filtrene med mindre porestørrelse.

EKSEMPEL 7

In-vivo-fordeling af unilamellare liposomer 10

Dette eksempel illustrerer anvendelsen af liposomer fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse til afgivelse af indfanget materiale in vivo. Det illustrerer nærmere bestemt for et rotte-modelsystem indgivelsen og den på- 125 15 følgende fordeling in vivo af I-tyraminyl-inulin-(1ITI)-holdige LUVET’er fremstillet ifølge eksempel 1 ovenfor.

Tyraminyl-inulin fremstilles på følgende måde: 1,0 g inu-20 lin opløses i 90,0 ml destilleret vand og afkøles til 4 °C. 10 ml frisk 0,1 M periodsyre tilsættes, og opløsningen inkuberes ved 4 °C i 15 minutter i mørke. Periodat-forbruget bestemmes ved arsenitmetoden og viser ca. 2 oxidationer pr. inulinmolekyle (se J. Dyer, Methods of 25 Biochemical Analysis, P. Glick ed., bind 3, side 111, Interscience (1956)). Reaktionen standses ved neutralisation med BaiOH^, og periodat- og iodatsaltene fjernes ved centrifugering. Til den ovenstående væske sættes 4,3 g Nal^PO^ og 0,55 g tyramin, og pH-værdien indstilles til 30 7,5 med 1,0 M saltsyre. Derefter tilsættes der 0,25 g

NaBHgCN, og opløsningen omrøres i 4 timer ved stuetemperatur. Tilbageværende aldehydgrupper reduceres ved forsigtig tilsætning af 0,2 g NaBH^, og opløsningen omrøres i yderligere 1 time ved 27 °C. Portioner på 25 ml afgas-35 ses under formindsket tryk og anbringes på en 1,5 x 80 cm "Sephadex G-25"-søjle, der i forvejen er ækvilibreret med vand ved 4 eC. Strømningshastigheden indstilles til 10 44 DK 173397 B1 ml/time, og der opsamles fraktioner på 4 ml. Fraktionerne undersøges for tyramin ved overvågning af absorbansen ved 279 wn og for sukker ved anvendelse af anthron-reagensme-toden (se J.H. Roe, J. Bio. Chem. 212, 335-343 (1955)).

5 Den sukkerholdige fraktion elueres i tomrumsvolumenet og har et konstant tyramin/inulin-molforhold på 0,6. Additionsproduktet skilles fuldstændigt fra det frie tyramin og de andre salte som bestemt ved rechromatografi på "Sephadex G-25". Top-fraktionerne frysetørres, hvorved 10 der fås et udbytte på 80%, beregnet på inulin.

Tyramin-inulin-adduktet ioderes på følgende måde: 2,5 g af tyramin-inulin-adduktet opløses i 0,2 ml HEPES (20 mM), NaCl (145 mM), pH-værdi 7,4 (HEPES-pufret saltopløs- 15 ning, HPS) og anbringes i en 1,5 ml tilproppet ampul, hvori der i forvejen er afsat 40 »g iodogen fra 300 al 125 chloroform. Der tilsættes derefter bærerfrit Na I (4 mCi, 100 mCi/ml), og reaktionen får lov at forløbe i 45 minutter ved stuetemperatur. Opløsningen overføres der- 20 efter til en beholder indeholdende 10 al 0,1 M Na2S20g, 0,5 M Kl, som derefter anbringes på en "G-25"-søjle (1 x 20 cm) ækvilibreret med HBS. Der opsamles fraktioner på 125 0,5 ml, og de I-holdige fraktioner, der elueres i tomrumsvolumenet (2,5 ml), samles. Den fremkomne opløsning 125 125 25 af I-tyramin-inulin ( ITI) indeholder rutinemæssigt 1 aCI/al aI, hvor mindre end 0,01% er på fri iodidform (mindre end 0,01% kan ekstraheres med chloroform ved indstilling til 1,2% H202 og 0,4% Kl), og over 99% af materialet elueres som én top i tomrumsvolumenet ved 30 rechromatografi på "Sephadex G-25". Ved alle forsøg anvendes materialet inden for 2 uger efter fremstilling. 1 i

Liposomer ladet med ITI fremstilles ifølge de ovenfor beskrevne procedurer. Nærmere bestemt tørres 30 μπιοί æg-35 phosphatidylcholin (EPC) og 30 amol cholesterol ud fra chloroform. Den fremkomne lipidfilm dispergeres i 1 ml

12S

HBS indeholdende 1 mCI ITI ved hvirvelblanding. De 45 DK 173397 B1 således fremstillede multilamellare systemer ekstruderes derefter 10 gange gennem to (stablede) "Nuclepore"-poly- carbonatfiltre (porestørrelse 100 nm) under nitrogentryk 2 (14-28 kg/cm ). Portioner på 0,1 ml af de fremstillede 5 LUVET'er anbringes på en "ultrogen Ac34"-søjle (1 ml), der i forvejen er ækvilibreret med HBS, De lipidholdige fraktioner samles, og rechromatografi viser, at mere end 125 97% af ITI er indfanget i vesiklerne. Det fremkomne liposomprasparat har et indfangningsvolumen på 0,9 μΐ/umol 10 phospholipid som beregnet ud fra lipidphosphatanalyse og 125 indfanget ITI (se C.H. Fiske og Y. Subbarrow, J. Biol.

Chem. 66, 375-379 (1925)). Den gennemsnitlige radius af 125 disse vesikler er 70 nm. LUVET'er Indeholdende ITI fortyndes til 0,5 μπιοί phospholipid i 200 ni HBS, oplag-15 res ved 4 °C og anvendes inden for 2 dage efter fremstillingen .

Disse LUVET'er indgives til Wistar-hunrotter (150-200 g), som fodres ad libitum før og under forsøgene, ved let 20 anæstetisering af dyrene med ether og injektion af 200 al HBS indeholdende ca. 0,5 uCi 125ITI indkapslet i LUVET'er (0,5 amol phospholipid) via halevenen. Rotterne får lov at komme til sig selv i metabolisme-bure, hvor urin og fæces opsamles. På forskellige tidspunkter efter injek-25 tionen anæstetiseres rotterne med ether og aflives ved afblødning via vena cava. Blod opsamles i en sprøjte indeholdende 200 al 200 mM EDTA, og genvindingen er ca. 85% under antagelse af en værdi på 4,9 ml blod/100 g rotte.

Hjerte, lever, lunge, milt og nyre fjernes, og urinen i 30 blæren opsamles. Kroppen opløses derefter i 200 ml 9 M NaOH natten over ved 70 °C. Portioner af det nedbrudte kropsmateriale og vævsprøver undersøges for tilstedeværelse af 125ITI.

35 FIg. 10 illustrerer clearance af LUVETs fra cirkulationen og den efterfølgende fremkomst af inulin i urinen. Som vist i figuren henfalder det indkapslede materiale I cir- 46 DK 173397 B1 kulationen til at begynde med hurtigt til ca. 40% af injektionsniveauet og henfalder derefter med en meget længere halveringstid (ca. 3 timer). Endvidere genfindes kun 30% af den injicerede dosis efterhånden i urinen, 5 selv efter 3 dage. Det sidstnævnte resultat viser klart vævsoptagelsen og tilbageholdelsen af LUVET-indkapslet 125ITI.

Den faktiske vævsfordeling er vist i fig. 11, hvor ca.

125 10 50% af in-vivo- ITI akkumuleres i leveren, ca. 10% i 125 milten og resten findes i kroppen. Mindre end 3% ITI findes i hjerte, lunge og nyre på noget som helst tidspunkt efter injektionen (data ikke vist).

15 De observerede vævsfordelinger ligner dem, der er observeret tidligere med liposomer fremstillet ved andre metoder (se f.eks. R.M. Abra og C.A. Hunt, Biochim. Biophys.

Acta 666, 493-503 (1981)), hvilket viser, at liposomeme fremstillet ifølge opfindelsen er ækvivalente med kendte 20 liposomer med hensyn til in-vivo-opførslen.

EKSEMPEL 8

Opløsningsmiddelfri fremstilling af liposomer 25

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af liposomer direkte ud fra lipid-pulver eller -pellets og puffer uden anvendelse af opløsningsmidler eller andre fremmed-mate-rialer.

30 100 mg EPC, fremstillet som ovenfor beskrevet, anbringes 1 et reagensglas, der tilsættes 1,0 ml HEPES-puffer, og blandingen inkuberes ved 20 "C i 10 minutter. Blandingen hvirvles kort i 2 minutter, henstilles 5 minutter og 35 hvirvles i 2 minutter, og den fremkomne opløsning sættes til trykkammeret i apparatet vist I fig. 1A, der er udstyret med to stablede polycarbonatfiltre med en pore- i DK 173397 B1 47 . størrelse på 100 nm. Opløsningen ekstruderes 10 gange gennem filtrene ved en temperatur på 20 °C. De anvendte 9 tryk er af størrelsesordenen 14-21 kg/cm , og de resulterende strømningshastigheder er af størrelsesordenen ca.

5 30 ml /min.

Frysefraktur-mikrofotografier af det fremkomne produkt fremstilles ifølge procedurerne beskrevet ovenfor. Produktet viser sig at være en homogen population af i det 10 væsentlige unilamellare liposomer med en gennemsnitlig diameter på ca. 70 nm som målt ved frysefraktur. Om ønsket kan denne gennemsnitlige diameter forøges ved anvendelse af frysnings-optøningsprocedurerne ifølge eksempel 4 ovenfor.

15

Procedurerne beskrevet ovenfor gentages under anvendelse af 200 nm filtre i stedet for 100 nm filtre. I dette til- 2 fælde anvendes der tryk af størrelsesordenen 7 kg/cm , hvilket igen giver strømningshastigheder på ca. 30 20 ml/min. Der fås igen en homogen population af liposomer, men i dette tilfælde er en væsentlig del af populationen multilamellar snarere end unilamellar. Den gennemsnitlige diameter af denne population er ca. 158 nm som målt ved kvasi-elastisk lysspredning med en Nicomp Model 200 Laser 25 Particle Sizer (Nicomp Instruments, Inc., Santa Barbara,

Califonien).

EKSEMPEL 9 30 Fremstilling af en 1 det væsentlige unimodal population af liposomer

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af en population af liposomer, de har en i det væsentlige unimodal 35 størrelsesfordeling.

48 DK 173397 B1

Store multilamellare vesikler (MLV’er) fremstilles ved den konventionelle metode som følger: Først opløses EPC fremstillet som beskrevet ovenfor i chloroform og tørres og afsættes som en film på indersiden af et reagensglas.

5 Der dannes derefter MLV'er ved blot at sætte en vandig puffer af 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH-værdi 7,5 til reagensglasset og hydratisere lipidet ved hvirvelblanding.

Den fremkomne MLV-dispersion overføres derefter til tryk-10 kammeret af apparatet vist i fig. 1A, der er udstyret med to stablede standard-polycarbonatfiltre (25 mm) med en porestørrelse på 200 nm (Nuclepore, Inc., Pleasanton, Califonien, katalognummer 110606). Dispersionen ekstruderes 25 gange gennem filtrene ved en temperatur på 20 eC.

2 15 De anvendte tryk er af størrelsesordenen 7 kg/cm , og de resulterende strømningshastigheder er af størrelsesordenen 30 ml/min. Proceduren er tilendebragt på mindre end ca. 15 minutter, og de fremkomne liposomer viser sig i alt væsentligt at være intakte trods deres mange passager 20 gennem filtrene.

Størrelsesfordelingen af populationen efter de 25 passager bestemmes ved den kvasi-elastiske lysspredningsmetode, der er beskrevet ovenfor. Resultaterne er vist i 25 tabel II nedenfor.

2

Som vist i tabellen har populationen en chi -værdi på 1,42, der viser, at der opnås en god tilpasning til et andengradspolynomium, og at vesiklernes diffusionskoeffi-30 cienter således har en unimodal gauss-fordeling. Den be regnede gennemsnitlige diameter for denne population er 168 nm, dvs. ca. 15% mindre end porestørrelsen på 200 nm, der anvendes ved ekstrusionen, og standardafvigelsen omkring middelværdien er relativt lille, nemlig 55 nm.

35 EKSEMPEL 10 49 DK 173397 B1

Fremstilling af liposomer ved anvendelse af en sekvens af polycarbonatfiltre 5

Dette eksempel demonstrerer betydningen af at anvende filtre med en konstant porestørrelse, i modsætning til en række af filtre med faldende porestørrelser, således at der fås en population af liposomer med en i det væsent-10 lige unlmodal størrelsesfordeling.

MLV'er fremstilles som i eksempel 9, men i stedet for at blive ekstruderet 25 gange gennem filtre med samme pore-størrelse, ekstruderes de én gang gennem en serie af fil-15 tre med følgende porestørrelser: 1000 nm, 800 nm, 600 nm, 400 nm og 200 nm (Nuclepore, Inc., Pleasanton, Callfonien, katalognummer 110610, 110609, 110608, 110607 og 110606). Ligesom i eksempel 9 anvendes apparatet vist 1 fig. 1A, der i dette tilfælde blot er udstyret med et 20 enkelt filter for hver filterstørrelse. Trykkene, strømningshastighederne og behandlingstemperaturen er de samme som i eksempel 9.

Størrelsesfordelingen af liposomerne fremstillet på denne 25 måde, som bestemt ved kvasi-elastisk lysspredning, er anført i tabel II. I dette tilfælde beregnes der en høj 2 chi -værdi på 368, hvilket betyder, at et andengradspolynomium ikke passer til de opnåede data, og at liposomerne diffusionskoefficienter ikke har en unimodal gauss-forde- 30 ling.

En sammenligning af dette resultat med resultaterne fra eksempel 9 viser klart, at flere passager af liposomer gennem filtre med konstant porestørrelse overraskende gi-35 ver en væsentligt anderledes størrelsesfordeling end den, der fås ved passage af den samme type af liposomer gennem en serie af filtre med faldende porestørrelse.

50 DK 173397 B1

Selv om specifikke udførelsesformer for opfindelsen er blevet beskrevet og illustreret ovenfor, vil det forstås, at der kan foretages modifikationer inden for opfindelsens rammer. F.eks. kan opfindelsen udøves med mange for-5 skellige membrandannende materialer og indkapslelige opløste materialer, der er forskellige fra dem, der er illustreret i eksemplerne. På lignende måde kan der anvendes forskellige typer af andet apparatur end det, der er illustreret i den foreliggende beskrivelse, til 10 udøvelse af den foreliggende opfindelse. Især fordi hvert af trinnene er let af kontrollere, er fremgangsmåden ifølge opfindelsen særligt egnet til gennemførelse på en helt automatiseret måde, og en sådan gennemførelsesmåde er specifikt omfattet af opfindelsen. På tilsvarende måde 15 kan andre typer af udstyr anvendes til opnåelse af auto-korrelationsfunktioner, og andre numeriske metoder kan anvendes til bestemmelse af, om autokorrelationsfunktionen er af den type, der fås ud fra en gauss-fordeling.

20 25 30 35

TABEL I

51 DK 173397 B1

Fysiske karakteristika af vesikler fremstillet ved ekstrusion af forskellige lipidblandinger gennem filtre med 100 nm porestorrelse 5 --

GENNEM- GENNEMSNITLIGT SNITLIG INDFANGET

DIAMETER VOLUMEN** LIPID % INTENSITET* + a (nm) + o (al/nmol) 10 EPC 48 71 + 24 1,1 + 0,1 (64) SPC 48 70+23 1,2+0,2(13) EPC/EPS (2:1) 46 73 +25 1,5 (2) SPC/SPS (2:1) ND 73 + 20 2,4 (2) SPE/SPS (2:1) ND 79+36 2,0 (2) SPS ND ND 2,3 (2) EPS ND ND 2,2 (2) 15 —--- EPC 51 77+16 2,2+0,5(17) (Frysning-optoning) SPC 48 94 + 26 2,2 + 0,1 (12) (Frysning-optoning) EPC 49 ND 1,2 + 0,1 (3) (Octylglucosid) 20 EPC (REV) 50 ND 1,2 (2) 31 2+ *) Intensitet af resterende P-NMR-signal i nærværelse af 5 mM Mn .

25 **) »il/nmol phospholipid (antal forsog i parentes).

30 35

TABEL II

52 DK 173397 B1

Egenskaber af liposomepopulationer målt ved kvasielastisk lysspredning* 5

Konstant Faldende porestørrelse porestørrelse

Gennemsnitlig diameter (nm) 168 630

Chi2 1,42 368

Standardafvigelse (nm) 55 **

Lipidkoncentration (mg/ml) 10 10 15 2 *) Værdierne af den gennemsnitlige diameter, chi og standardafvigelsen er bestemt ved anvendelse af en Nicomp Model 200 Laser Particle Sizer (Nicomp Instruments, Inc., Santa Barbara, CA 93111). Der an-2q vendes følgende parametre: temperatur 20 °C, viskosi tet 1,002 cP, brydningsindeks 1,330, laserbølgelængde 632,8 nm og sinus til halv vinkel 0,7070. Ved begge sæt af målinger anvendes instrumentet i "delayed baseline mode". Ved målingerne med konstant porestør- __ relse (eksempel 9) anvendes en forsøgstid på 6,33 x 25 6 10 msek., hvilket giver en total tælleværdi på 9,08

O

x 10 , og der anvendes en kanalbredde på 20 usek., hvilket giver en autokorrelationsfunktion, der har 1,98 henfald. Ved målingerne med faldende porestør- relse (eksempel 10) anvendes en forsøgstid på 6,58 x 30 5 10 msek., hvilket giver en total tælleværdi på 8,01

O

x 10 , og der anvendes en kanalbredde på 70 usek., hvilket giver en autokorrelationsfunktion, der har 1,85 henfald.

35 2 **) Ikke angivet på baggrund af chi -værdien (se teksten) .

Claims (10)

53 DK 173397 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en population af i 5 det væsentlige unilamellare liposomer, kende tegnet ved, at den omfatter følgende trin: a) fremstilling af multilamellare liposomer og 10 b) gentagen passage af liposomerne under tryk gennem et filter, der har en porestørrelse på højst 100 nm.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at liposomerne ledes mere end to gange gennem filte- 15 ret.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at filteret har direkte gennemgående kanaler.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter et trin, hvor liposomerne underkastes en frysnings-optøningscyclus til forøgelse af deres indfangede volumener.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af liposomer uden an vendelse af opløsningsmidler, detergenter eller andre fremmed-materialer, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: 30 a) fremstilling af en blanding af lipid-pulver eller -pellets og en vandig puffer og b) gentagen passage af blandingen under tryk gennem et filter.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at filteret har direkte gennemgående kanaler. 35 54 DK 173397 B1

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den omfatter et yderligere trin, hvor liposomerne underkastes en frysnings-optøningscyclus til forøgelse af deres Indfangede volumener. 5

8. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at filteret har en porestørrelse på højst 100 nm, at blandingen ledes roere end to gange gennem filteret, og at de fremkomne liposomer i det væsentlige er unilamellare. 10

9. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den gentagne passage af blandingen gennem filteret giver liposomer, der har en i det væsentlige unimodal fordeling omkring en gennemsnitlig diameter på over 50 15 nm.

10. Fremgangsmåde til forøgelse af homogeniteten af en population af liposomer, kendetegnet ved, at den omfatter gentagen passage af liposomerne gennem et 20 eller flere filtre, der alle har den samme porestørrelse, idet antallet af passager gennem filteret eller filtrene er tilstrækkeligt til at give en i det væsentlige unimodal fordeling af liposomernes diametre omkring en gennemsnitsværdi. 25 30 35