DK173763B1 - Vektor for udtrykkelse i gær med en PyK promotor og en fremgangsmåde til syntese af hepatitis B virus overfladeantigen ved hjælp af en sådan vektor - Google Patents

Description

i DK 173763 B1 5 For maksimal udtrykkelse af fremmede gener i mikrobiologiske systemer er det sædvanligvis hensigtsmæssigt at anvende homologe reguleringselementer inden for udtrykkel-sesvektoren. Effektiviteten af udtrykkeisen (produktdannelsen) antages at være en funktion af og proportional 10 med styrken af den anvendte promotor. Endvidere vil regulering af gen-udtrykkelsen ved hjælp af ernæringsfaktorer under kontrol af forsøgsudøveren tilvejebringe endnu et velegnet manipulatorisk værktøj. De glycolytiske enzymgener for gær, dvs. sådanne som koder for pyrodruesyre-15 kinase (PyK) , besidder de ovennævnte værdifulde egenskaber, dvs. høj grad af udtrykkelse (og er således ved interferens meget effektive promotorer) og susceptibilitet til regulering ved komponenter af vækstmediet.

20 Opfindelsen vedrører således isolation, produkter og anvendelsen af gærudtrykkelses-plasmider af DNA-fragmenter, svarende til de 5'-ikke-kodende regioner af de regulerbare gener PyK i gær. Disse fragmenter, som indeholder DNA-sekvenser med stærk transscriptionspromoverende aktivi-25 tet, kaldes "promotorer". Disse er ideelle komponenter af DNA-vektorer til teknisk fremstilling af store mængder proteiner, kodet af fremmede gener under deres trans-scriptionelle kontrol. Det fremmede gen er hepatitis B overfladeantigen eller dele deraf.

30

Endvidere angår opfindelsen gær-udtrykkelsesplasmider, som omfatter en egnet terminator til at danne en "kassette" af promotor-fremmed gen-terminator. Tilstedeværelse af terminatoren forøger udtrykkeisen af det fremmede DNA.

DK 173763 B1 2

Et tidligt forsøg på at udtrykke fremmed DNA i gær er svigtet (Beggs, J.D. et al., Nature (1980) 283:285) . I

denne rapport blev haemoglobin DNA (indført sammen med sin egen promotor) transscriberet, men der~var"iliké-"spTéjset 5 RNA. En række forklaringer for dette resultat er mulige, f.eks. en ukorrekt beliggenhed for initiering af transscription og/eller en dårlig evne får gærcellerne til at udføre splejsning af berørte sekvenser (introner).

10 PyK-genet er blevet klonet, men kun ved genetisk komple-mentering (ingen strukturstudier er udført) (Kawasaki, G. and Fraenel, D.G., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1982) 108:1107). Andre gærpromotorer, f.eks. for alkohol-dehy-drogenase I (Valenzuela, P. et al., Nature (1982) 298:347 15 og Hitzeman, R.A. et al., Nature (1981) 293:717) og phos-phoglycerat-kinase (Tuite, M.F. et al., EMBO J. (1982) 1_: 603 og Hitzeman, R.A. et al., Science (1983) 219:620) er blevet knyttet til fremmede gener til fremstilling af gærudtrykkelse, men der har ikke været anvendt terminato-20 rer. Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte promotorer for gær-udtrykkelsessystemer, hvorved der opnås fordele ved højt udtrykkelige promotorer, kombineret med forbedret udtrykkelse, som er fundet med passende ligerede terminatorer.

25

Publiceret europæisk patentansøgning (EP 072 318) offentliggør konstruktionen af et gær-udtrykkelsessystem som, ved induktion, udtrykker hepatitis B virus overfladeantigen (HBsAG) S-protein under kontrol af gær 30 alkohol dehydrogenase I (ADH-I) promotoren.

Den foreliggende opfindelse angår således en vektor for udtrykkelse i gær og af den i indledningen til krav 1 angivne art.

DK 173763 B1 3

Vektoren er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte. Vektoren koder for hepatitis B virus (HBV) overfladeantigen (HBsAg), der er under trans-5 scriptionel kontrol af en gær-PyK-promotor. Terminatorer kan også være tilknyttet på passende måde. Udtrykkel-sesvektoren har typisk en gær-replikationsoprindelse og en bakteriel replikationsoprindelse og er i stand til at replicere i begge celletyper. Udtrykkelsesvektoren, an-10 vendt til at transformere gærceller, vil give væsentlige mængder af proteinet, der er kodet af segmentet af fremmed DNA. Udtrykkelse af HBsAg under kontrol af gær-PyK-promotor giver overraskende højt udbytte, jvnf. eksempel 4 og tabel 1.

15

Opfindelsen skal forklares ved hjælp af tegningen, hvor fig. 1 nucleotid-sekvens af pyrodruesyre-kinase (PyK)-gen, og 20 fig. 2 strukturen for gær-udtrykkelsesplasmid indeholdende PyK-promotor-region.

I princippet har gær-udtrykkelsesplasmider særlige forde-25 le, herunder de i det efterfølgende angivne. Gær kan dyrkes i stor målestok ved velkendte produktionsbetingelser. Derimod er bakterier, dyrket som kultur i stor målestok, udsat for det hyppigt forekomne problem med "phage-out".

Gær synes også at have samme evne som animalske eller hu-30 mane celler at kunne tilføre carbonhydratgrupper til nylig syntetiserede proteiner, en evne bakterier ikke er i besiddelse af. Da cDNA-sekvenser er let tilgængelige, kan problemet med udtrykning af gener, der har introner, let undgår.

DK 173763 B1 4

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til udtryk-kelse af det i vektoren indeholdte DNA-kodningssegment i gær, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i den 5 kendetegnende del af krav 6 anførte.

Den omhandlede vektor omfatter promotorer med usædvanlig høj effektivitet. En promotor er heri defineret som et DNA-segment, der kan fungere ved at indlede transscripti-10 on af et tilsluttet DNA-segment. Transscription er syntesen af RNA (her defineret som messenger RNA eller mRNA), der er komplementært til den ene streng af det i promotor-regionen tilsluttede DNA. I eukaryoter katalyseres messenger RNA-syntese ved et enzym betegnet RNA-polymera-15 se II. De minimale essentielle elementer af promotorfunktionen er følgende: for at tilvejebringe et udgangspunkt for initieringen af transscription og danne et bindingssæde for at gøre det muligt at udvælge den aktuelle streng af DNA som en støbeform for messenger RNA-syntese.

20 Endvidere fungerer en eukaryotisk promotor til at regulere den relative effektivitet af transscription af kodningssegmenter under kontrol heraf. En aktiv promotor er en, som frembringer syntese af forholdsvis store mængder mRNA, der er komplementært med en streng af det tilslut-25 tede DNA-kodningssegment.

De strukturmæssige korrelationer for promotor-funktion er endnu ikke tydeligt opklaret. Et promotor-segment kan sædvanligvis identificeres som en region, der ligger nær 30 ved 5'-enden af et givet strukturelt gen. (Referencerne til 5'- og 3'-enderne af et gen vil forstås til at injicere de tilsvarende respektive ender af mRNA, der er transscriberet derfra, og disse korrelerer med henholdsvis NHc- og -COOH-endegrupperne i det kodede protein).

DK 173763 B1 5

Sammenligninger af nucleotid-sekvenserne for promotorer for forskellige gener fra forskellige arter har kun afsløret nogle få korte regioner af nucleotidsekvens med stor indbyrdes lighed. Mest bemærkelsesværdig for disse 5 er "TATA Box", der er et segment på 5-10 nucleotider, anbragt generelt ca. 70-230 nucleotider i retning fra sædet fra transscription-initiering, og med en sekvens generelt lignende TATAA. En oversigt af strukturmæssig sammenligning fremgår af Breathnach, R. og Chambon, P., Ann. Rev.

10 of Biochem. (1981) 50:349. TATA Box antages at fungere ved initiering af transscription.

Det fremmede gen vil være frit for eller i det væsentlige frit for codoner fra det normale strukturelle gen, knyt-15 tet til promotoren. Sædvanligvis vil det fremmede gen være sluttet til en ikke-kodende 3'-ende af den regulerende region, der omfatter promotoren, og således være fri for de aminosyrer ved N-terminus af endogent gen, der naturligt er associeret med den regulatoriske region.

20 Dvs. at færre end 3 codoner (9 nucleotider) vil være tilbageholdt med den regulatoriske region, når den er sluttet til det fremmede gen.

Tilstedeværelsen af terminator-sekvensen ved 3’-enden af 25 kodningssegmentet forhøjer udtrykkeisen. Effekten er i almindelighed tilsvarende tilsætning af rho-faktoren til prokaryotiske transscriptionssystemer, hvori hastigheden af frigivelsen af RNA-polymerase er forøget til at producere en forøgelse af hastigheden af reinitieringen af 30 transscription. Det vil forstås, at medens terminator-sekvenserne ikke kræves til påviselig udtrykkelse af fremmede DNA-segmenter, foretrækkes det på passende måde at knytte dem til forhøjet udtrykkelse. Terminatorregion- DK 173763 B1 6 en kan være naturligt associeret med det samme eller forskellige strukturelle gener som promotor-regionen.

Den mest velegnede DNA-vektor for PyK-konstruktion ifølge 5 opfindelsen er en skyttel-vektor. Disse vektorer kan veksle som en skyttel mellem en bakteriestamme, f.eks. E. coli, og gær, fordi de har en bakteriel replikationsop-rindelse og en gær-replikationsoprindelse, se f.eks. Ammerer, G. et al., Recombinant DNA, Proc. Third Cleveland 10 Symposium Macromolecules (Walton, A.G., ed.), p. 195,

Elsevier, Amsterdam (1981). En typisk bakteriel replika-tionsoprindelse er f.eks. afledt af pBR322. Den mest egnede gær-replikationsoprindelse er fundet i det ekstra-chromosomale genetiske element, der er kendt som 2 mi-15 cron-cirkel. I laboratoriestammer har 2 mikroplasmid DNA vist sig at være til stede i tilnærmelsesvis 50 kopier pr. celle og opretholdes stabilt. En oversigt heraf fremgår f.eks. af Curr. Topics Micro. Imm. (1982) 96:119.

Dette gærplasmid er også blevet bestemt (Hartley, J.L. et 20 al., Nature (1980) 286:860).

Repræsentative prøver af plasmiderne og værtscellerne, der anvendes ved strukturen ifølge opfindelsen, er deponeret hos American Type Culture Collection, 12301 Park-25 lawn Drive, Rockville, Maryland. Plasmid pPyK 9.1.1 og gærcelletransformanter 2150-2-3/pHBS-56 og 2150-2-3/pHBS56PyK blev deponeret 18. februar 1983 og har fået ATCC-registreringsnumrene 40061 og 20666.

30 Mange af de i de efterfølgende eksempler omtalte teknikker, reaktioner og adskillelsesprocedurer er i og for sig velkendte. Alle enzymer, med mindre andet er angivet, kan tilvejebringes fra en eller flere kommercielle kilder, såsom New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Colla- DK 173763 B1 7 borative Research, Waltham, Massachusetts; Miles Laboratories, Elkhart, Indiana; Boehringer Biochemicals, Inc., Indianapolis, Indiana og Bethesda Research Laboratories, Rockville, Maryland. Puffere og reaktionsbetingelser for 5 enzymprocesser blev valgt efter anbefaling fra leverandøren af hvert enkelt enzym, med mindre andet er angivet. Standardmetoder for andre enzymreaktioner, gel-elektrofo-rese-separationer og E. coli transformation er beskrevet i Methods in Enzymology, (1979) 6j3. Transformation af 10 gærprotoplaster kan udføres som beskrevet af Beggs, Nature (1978) 275:104.

Stammen af E. coli, der egner sig til transformation, omfatter X1776; K12-stammen 294 (ATCC no. 31446); RR.1 og 15 HB101. Gærstammer XV610-8c med genotypen (a ade2 ade6 leu2 lysi trpl canl) og GM-3C-2, genotype: (Leu2 Trpl

His4 CYC1-1CYP3-1) (Faye, G. et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. (1981) 78:2258) kan typisk anvendes til gærtransfor-mationer. Det vil dog forstås, at praktisk taget enhver 20 gærart er velegnet til transformation. Bakterie kan dyrkes og udvælges i overensstemmelse med en procedure, som er beskrevet af Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972) . Gær kan dyrkes på følgende medier: 25 YEPD med 1% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) pepton og (w/v) glucose; og, i tilfælde af plademedium, 3% (w/v) agar.

YNB plus CAA indeholder 6,7 g gærnitrogenbase (Difco Laboratories, Minneapolis, Minnesota), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 g casaminosyrer (CCA) (Difco), 20 g glucose; og 30 i tilfælde af plademedier, 30 g agar pr. liter. Udvælgelse af tryptophanprototrofi kan ske på plader indeholdende 6,7 g gærnitrogenbase (mangel-aminosyre), supplementær med alle vækstbetingelser for den stamme, der skal transformeres, med undtagelse af tryptophan.

DK 173763 B1 8 EKSEMPEL 1

Kloning af gær-pyrodruesyre-kinase-gen 5

Pyrodruesyre-kinase-genet blev klonet ved komplemente-ring. En gær-pyrodruesyre-kinase minus mutant blev transformeret med en portion rekombinant YEp24 plasmider indeholdende gær-genomisk DNA. Gærstammerne S288C {genotype: 10 SUC2, mal, ga!2, CUP1) og PyK 1-5 (genotype a, adel, leul, met!4, ura3, pykl-5) blev leveret fra Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics, University of California, Berkeley. Den anvendte gær-genombank består af et partielt Sau3A præparat af total DNA fra stammen S288C 15 klonet i BamHI-sædet af "skyttel"-vektor YEp24. Vektoren YEp24 indeholder pBR322-sekvenser til udvælgelse og vækst i bakterier, gær URA3-genet til udvælgelse i gær og et EcoRI-fragment af gær 2 μ cirkel til sikring af plasmid-replikation og segregering i gær. Portionen omfatter til-20 strækkeligt uafhængige rekombinant-plasmider til at repræsentere hele gær-genomet.

Stammen pykl-5 er ikke i stand til at gro på medium indeholdende glucose eller manglende uracil på grund af muta-25 tioner i denne stamme ved henholdsvis PyKl og URA3-sæder-ne. Transformation af denne stamme med YEp24 genomisk bibliotek og udvælgelse for transformanter, der kan gro på et medium, som mangler uracil og indeholder glucose, udvælger sådanne celler, som har erhvervet YEp24, indehol-30 dende pyrodruesyre-kinase-genet. Transformation af 3,5 x 109 pykl-5 gærceller med 10 ug YEp24 rekombinant-plasmid-DNA gav 5 uafhængige transformanter, som voksede i fraværelse af uracil og i nærværelse af glucose.

DK 173763 B1 9

Karakterisation af det indsatte DNA i disse transforman-ter ved restriktionsenzym-analyse angav, at de indeholdt overlappende DNA-indsætninger. Der er fokuseret på en enkelt transformant, pPyK 9,1, som indeholdt en 7,0 kb ind-5 sats. Pyrodruesyre-kinase-genet blev lokaliseret inden for denne indsætning ved bestemmelse hvilken indsætningsspecifik restriktions-fragmenter, som hybridiserede til et mRNA på ca. 1,7 kb, hvilket er forventet for pyrodrue-syre-kinase-mRNA. Lokalisering af PyK-genet blev bekræf-10 tet ved underkloning af passende regioner af det indsatte DNA og iagttagelse af komplementering af funktion i pykl- 5-mutant. En underklon pPyK 9.1.1, som indeholdt PyK-ge-net på en 4,4 kb indsætning blev rækkebestemt og anvendt til udtrykkelse af plasmidstrukturer.

15 EKSEMPEL 2

Sekvens af gær-pyrodruesyre-kinase-gen 20

Ialt 2885 nucleotider af PyK-genet er blevet rækkebestemt, omfattende 1497 nucleotider i en enkelt åben kæde, 911 nucleotider af 5'-ikke-translaterede region og 477 nucleotider af 3'-ikke-translaterede region (se fig. 4) .

25 Genet forkoder for et polypeptid med 499 aminosyrer til opnåelse af en monomer molekylvægt på 54,608 dalton, hvilket er i god overensstemmelse med den ventede værdi for gær-PyK. Aminosyrekompositionen, afledt fra nucleo-tidsekvensen svarer også nøje til den, som er målt for 30 det isolerede gær-protein. Nucleotidsekvensen forudsiger en carboxy-terminalvalin, som er fundet for gær-pyrodrue-syre-kinase.

DK 173763 B1 10 EKSEMPEL 3

Struktur for gær-udtrykkelses-plasmider under anvendelse af pyrodruesyre-kinase-promotor-region 5

To forskellige strukturer blev fremstillet: pHBS16 PyK og pHBS56 PyK. Proceduren er den i fig. 5 illustrerede.

Plasmidet pPyK 9.1.1, som indeholder gær-PyK-genet klonet 10 i pBR322 blev omsat med Xbal, og de udragende ender blev fyldt op med deoxynucleotider ved hjælp af DNA-polymerase I. Produktet blev omsat med BamHI for endeligt at isolere et 912 bp BamHI-afstumpet fragment, indeholdende PyK-pro-motor og 8 baser fra PyK-kodningsregion. Dette fragment 15 blev legeret til plasmid-pHBS-6 (indeholder HBsAg-genet/ hvori den 5'-ikke-kodende region er blevet fjernet, klonet i pBR322), forud omsat med Ncol, fyldt ind ved hjælp af DNA-polymerase og omsat med BamHI. Efter transformation af E. coli blev pHBS-6PyK isoleret. Dette plasmid in-20 deholder PyK-promotor med codoner for 3 ekstra aminosyrer, smeltet i fase med HBsAg-kodningssekvens, ATGTCTAG CATG .

I_I 1_I

25 pHBS-6PyK blev omsat med BamHI til afslutning og delvis reageret med EcoRI til isolering af 1750 bp BamHI-EcoRI-fragment, indeholdende PyK-promotor, smeltet til HBsAg-genet. Dette 1750 bp-fragment blev ligeret til det store 30 fragment, som er opnået efter omsætning af pHBS-16 (ATCC register No. 40043, plasmid, beskrevet i USA patentansøgning nr. 442 687, med benævnelsen "Adenovirus Promotor in Yeast", med BamHI og EcoRI og anvendt til transformering af E. coli. Der opnåedes gær-udtrykkelsesplasmidet pHBS- DK 173763 B1 11 16PyK. Dette pHBS-16PyK blev omsat til afslutning med Sphl og Xbal, og et 1200 bp SphI-Xbal-fragment (indeholdende 200 bp af pBR322, PyK-promotoren og 100 bp af 5f-region af HBsAg-genet) blev isoleret. Dette 1200 bp Sphl-5 Xbal-fragment blev ligeret til et 1070 bp Xbal-Sphl-frag-ment (isoleret fra pHBS-56) indeholdende 3’-enden af HBsAg-genet og ADH-l-terminatoren. Efter omsætning med Sphl isoleredes et SphI-Sphl 2300 bp-fragment (kassette) indeholdende PyK-promotor, HBsAg-gen og ADH-l-terminator.

10 Dette kassette-fragment blev klonet i pHBS-56, som forud var omsat med Sphl. Gær-udtrykkelsesplasmid pHBS-56 PyK blev opnået. Dette plasmid blev anvendt til at transformere gærstammen AB102 (se eksempel 2) eller stammen 2150- 2-3 (se eksempel 2).

15 EKSEMPEL 4

Syntese af HBsAg i gær under PyK-promotor-kontrol 20 100 ml Kulturer af stammen AB102, indeholdende plasmid pHBS-56 PyK blev dyrket til optisk tæthed ved 650 nm af 1-2. Cellefrit lysat blev fremstillet ved omrøring med glaskugler og fjernelse af celle-debris ved centrifugering. HBsAg blev målt ved Abbott Ausriall radioimmunoprø-25 ver, og protein-koncentrationen blev bestemt ved Coomas-sie-blåt-bindingsmetoden. Resultaterne fremgår af tabel 2. De viser, at PyK-promotor er mindst to gange mere effektiv end ADH-1-promotor for udtrykkelse af proteinproduktet i gær.

30

Tilsvarende resultater blev opnået ved at benytte gærstammen 2150-2-3 i stedet for stammen ABI02 og i øvrigt gentage eksempel 4.

DK 173763 B1 12

I- I

5 I TABEL 1: Syntese af HBsAG i gær | I-1

j (a) fra pHBS-56 (kontrol, ADH-I promotor) J

I Spec. I

IExp# sAq protein aktivitet | 10 I (pg/ml) (mg/ml) (pgsAg/mg protein) |

I I

I 1 8, 2 24 0, 34 | I 2 7, 2 24 0, 32 |

1 3 4, 7 27 0,23 I

15 I I

I (b) fra pHBS-56 PyK (PyK-promotor) | I Spec. [

[Exp# sAg protein aktivitet I

I (pg/ml) (mg/ml) (pgsAg/mg protein) |

20 I I

j 1 18 2,5 0, 68 I

] 2 10, 6 22 0, 48 I

j 3 15, 2 27 0, 56 | i__________i 25

Tilsvarende resultater blev opnået ved at benytte gær stammen 2150-2-3 i stedet for stammen AB102 og i øvrigt gentage eksempel 4.

Claims (9)

1. Vektor for udtrykkelse i gær, bestående af et fremmed DNA-segment, der er under kontrol af en gær-pyrodruesyre-kinasepromotor, kendetegnet ved, at segmentet er orienteret korrekt for transscription og har færre end tre codoner fra gær-pyrodruesyre-kinase ved 5’-enden af 10 det nævnte fremmede DNA, som koder for hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf.

2. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter en terminator, knyttet til 3*-enden af seg- 15 mentet med fremmed DNA.

3. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter gær 2 micron plasmid-DNA eller en del deraf.

4. Plasmid pHBS-56 PyK, der har ATCC nummer 20666.

5. Fremgangsmåde til udtrykkelse af et DNA-kodningssegment i gær, kendetegnet ved, 25 (a) at kodningssegmentet indsættes i en gær-udtryk- kelsesvektor, hvilken vektor omfatter et DNA-segment, som indeholder gær-pyrodruesyre-kinase-promotor, der har færre end tre codoner fra 5'-enden af gær-pyrodruesyre-kinase, hvilken promotor er knyttet til 5'-enden af det 30 indsatte DNA-kodningssegment og således orienteret, at transscriptionen, der initieres i den nævnte promotor, omfatter kodningssegmentet, således at der opstår en kodningssegment-udtrykkelsesvektor, hvori DNA-segmentet DK 173763 B1 koder for hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf. (b) at gærcellerne med kodningssegment-udtrykkelses- 5 vektoren transformeres.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvektoren yderligere omfatter en terminator, der er knyttet til 3’-enden af det indsatte

10 DNA-kodningssegment.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvektoren yderligere omfatter en bakteriecelle-replikation og er i stand til at replikere 15. en bakteriecelle.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den nævnte terminator omfatter alkohol-dehydroge-nase I terminator fra gær. 20

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den nævnte terminator består af PyK-terminator fra gær.