DK173604B1 - Vektor for udtrykkelse i gær, bestående af et fremmed DNA-kodningssegment og en fremgangsmåde til udtrykkelse af DNA-kodningssegmentet i gær ved hjælp af en sådan vektor - Google Patents
Vektor for udtrykkelse i gær, bestående af et fremmed DNA-kodningssegment og en fremgangsmåde til udtrykkelse af DNA-kodningssegmentet i gær ved hjælp af en sådan vektor Download PDFInfo
- Publication number
- DK173604B1 DK173604B1 DK198305777A DK577783A DK173604B1 DK 173604 B1 DK173604 B1 DK 173604B1 DK 198305777 A DK198305777 A DK 198305777A DK 577783 A DK577783 A DK 577783A DK 173604 B1 DK173604 B1 DK 173604B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- yeast
- coding segment
- expression vector
- segment
- dna
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 16
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 30
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- 229940125668 ADH-1 Drugs 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 101000796901 Gallus gallus Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 101000832889 Scheffersomyces stipitis (strain ATCC 58785 / CBS 6054 / NBRC 10063 / NRRL Y-11545) Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-6-morpholin-4-yl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound OC1=NC(O)=C(Br)C(N2CCOCC2)=N1 GVUOPSNMFBICMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187578 Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101150052131 Pgap2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010046685 Rho Factor Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K calcium;sodium;phosphate Chemical compound [Na+].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O QXJJQWWVWRCVQT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Toys (AREA)
Description
i DK 173604 B1
For maksimal udtrykkelse af fremmede gener i mikroiologi-ske systemer er det sædvanligvis hensigtsmæssigt at anvende homologe reguleringselementer inden for udtrykkel-5 sesvektoren. Effektiviteten af udtrykkeisen (produktdannelsen) antages at være en funktion af og proportional med styrken af den anvendte promotor. Endvidere vil regulering af gen-udtrykkelsen ved hjælp af ernæringsfaktorer under kontrol af forsøgsudøveren tilveje-io bringe et velegnet manipulatorisk værktøj. De glycolyti-ske enzym-gener for gær, dvs. sådanne som koder for gly-ceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), besidder de ovennævnte værdifulde egenskaber, dvs. høj grad af udtrykkelse (og er således ved interferens meget effektive 15 promotorer) og susceptibilitet til regulering ved komponenter af vækstmediet. F.eks. kan GAPDH omfatte så meget som 5% efter tørvægten af presset gær (Krebs, E.G., J.
Biol. Chem. (1953) 200:471). Disse enzymer er desuden stærkt inducerbare. Hvis gærkulturer f.eks. skiftes fra 20 vækst på acetat til glucose, vil aktiviteten af GAPDH forøges til det 200-dobbelte i forhold til koncentrationen af sukker i mediet (Maitra, P.K. og Lobo, Z., J. Biol.
Chem. (1971) 246:475). Disse resultater viser, at det transscriptionelle maskineri af disse gener er stærkt re-25 guleret, måske ved deltagelse af DNA-sekvenser, som er til stede i 5'-ikke-kodende sidereaktioner af generne.
Opfindelsen vedrører således isolation, produkter og anvendelsen af gærudtrykkelses-plasmider af DNA-fragmenter, 30 svarende til de 5'-ikke-kodende regioner af de regulerbare gener GAPDH i gær. Disse fragmenter, som indeholder DNA-sekvenser med stærk transscriptionspromoverende aktivitet, kaldes "promotorer". Disse er ideelle komponenter af DNA-vektorer til teknisk fremstilling af store mængder 35 proteiner, kodet af fremmede gener under deres transscriptionelle kontrol.
2 DK 173604 B1
Endvidere angår opfindelsen gær-udtrykkelsesplasmider, som omfatter en egnet terminator til at danne en "kassette" af promotor-fremmed gen-terminator. Tilstede-5 værelse af terminatoren forøger udtrykkeisen af det fremmede DNA.
Et tidligt forsøg på at udtrykke fremmed DNA i gær er mislykket (Beggs, J. D. et al./ Nature (19S0T~~283~: 2 8 5 j . I io denne rapport blev hæmoglobin DNA (indført sammen med sin egen promotor) transscriberet, men der var ikke splejset RNA. En række forklaringer for dette resultat er mulige, f.eks. en ukorrekt beliggenhed for initiering af transscription og/eller en dårlig evne hos gærcellerne til at 15 udføre splejsning af berørte sekvenser (introner).
Tre GAPDH-gener af gær er blevet klonet (Holland, M. J. et al., Basic Life Science (1981) 3^9:291), men deres promotorer har ikke været anvendt til at konstruere udtryk-20 kelses-systemer i gær ved rekombinant-metoden for DNA.
Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte promotorer for gær-udtrykkelsessystemer, hvorved der opnås forbedret udtrykkelse, som er fundet med passende ligerede terminatorer.
25
Det har overraskende vist sig, at de observerede høje niveauer af udtrykkelse er knyttet til tilstedeværelsen af en relativt lang del af den 5'-flankerende region af GAPDH-genet. Det viste sig, at GAPDH-promotoren er 30 indeholdt i et stykke DNA, der er betydeligt længere end forventet 5' fra translations-initerings-codonen.
Den foreliggende opfindelse angår en vektor for udtrykkelse i gær og af den i indledningen til krav 1 angivne 35 art.
3 DK 173604 B1
Vektoren er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte.
Vektoren kan f.eks. kode for hepatitis B virus (HBV) 5 overfladeantigen (HBsAg), der er under transscriptionel kontrol af en gær-GAPDH-promotor eller en gær-PyK-promo-tor. Terminatorer kan også være tilknyttet på passende made. Udtrykkelsesvektoren har typisk en gær-replikati-onsoprindelse og en bakteriel replikationsoprindelse og 10 er i stand til at replicere i begge celletyper. Udtrykkelsesvektoren, anvendt til at transformere gærceller, vil give væsentlige mængder af proteinet, der er kodet af segmentet af fremmed DNA.
15 En foretrukken vektor er plasmidet pHBs-56GAP347/33 med deponeringsnummeret ATCC 20665; deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten.
Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til udtryk-20 kelse af det i vektoren indeholdte DNA-kodningssegment i gær, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 6 anførte. Ligeledes angår opfindelsen en fremgangsmåde til udtrykkelse af DNA-kod-ningssegmenter i gær, der koder for Hepatitis B overfla-25 deantigen eller en del deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 7's kendetegnende angivne. En fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 8 30 angivne, er ligeledes genstand for den foreliggende opfindelse. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at gær-udtrykkelsesvektoren omfatter gær 2 micron plasmid-DNA eller en del deraf.
35 Opfindelsen skal forklares ved hjælp af tegningen, hvor 4 DK 173604 B1 fig. 1 viser isolation og udformningen af GAPDH-promotor-fragment, fig. 2 er en DNA-sekvens af GAPDH-promotor-fragment, 5 fig. 3 viser strukturen af gær-udtrykkelsesplasmid, indeholdende GAPDH-promotor, , fig. 4 er en nucleotid-sekvens af pyrodruesyre-kinase 10 (PyK)-gen, fig. 5 strukturen for gær-udtrykkelsesplasmid indeholdende PyK-promotor-region.
15 I princippet har gær-udtrykkelsesplasmider særlige fordele, herunder de i det efterfølgende angivne. Gær kan dyrkes i stor målestok ved velkendte produktionsbetingelser. Derimod er bakterier, dyrket som kultur i stor målestok, udsat for det hyppigt forekommende problem med 20 "phage-out" . Gær synes også at have samme evne som animalske eller humane celler at kunne tilføre carbonhydrat-grupper til nylig syntetiserede proteiner, en evne bakterier ikke er i besiddelse af. Da cDNA-sekvenser er let tilgængelige, kan problemet med udtrykkelse af gener, der 25 indeholder introner, let undgås.
Den omhandlede vektor omfatter promotorer med usædvanlig høj effektivitet. En promotor er heri defineret som et DNA-segment, der kan fungere ved at indlede transscrip-30 tion af et tilsluttet DNA-segment. Transscription er syntesen af RNA (her defineret som messenger RNA eller mRNA), der er komplementært til den ene streng af det i promotor-regionen tilsluttede DNA. I eukaryoter katalyseres messenger RNA-syntese ved et enzym betegnet RNA-poly-35 merase II. De minimale essentielle elementer af promotorfunktionen er følgende: For at tilvejebringe et udgangs- 5 DK 173604 B1 punkt for initieringen af transscription og danne et bindingssæde for at gøre det muligt at udvælge den aktuelle streng af DNA som en støbeform for messenger RNA-syntese. Endvidere fungerer en eukaryotisk promotor til 5 at regulere den relative effektivitet af transscription af kodningssegmenter under kontrol heraf. En aktiv promotor er en, som frembringer syntese af forholdsvis store mængder mRNA, der er komplementært med en streng af det tilsluttende DNA-kodningssegment.
10
De strukturmæssige korrelationer for promotor-funktion er endnu ikke tydeligt opklaret. Et promotor-segment kan sædvanligvis identificeres som en region, der ligger nær ved 5'-enden af et givet strukturelt gen. (Referencerne 15 til 5'- og 3'-enderne af et gen vil forstås til at injicere de tilsvarende respektive ender af mRNA, der er transscriberet derfra, og disse korrelerer med henholdsvis NH-- og -COOH-endegrupperne i det kodede protein). Sammenligninger af nucleotid-sekvenserne for promotorer 20 for forskellige gener fra forskellige arter har kun afsløret nogle få korte regioner af nueleotid-sekvens med stor indbyrdes lighed. Mest bemærkelsesværdig for disse er TATA Box, der er et segment på 5-10 nucleotider, anbragt generelt ca. 70-230 nucleotider i retning fra sædet 25 for transscription-initiering, og med en sekvens generelt lignende TATAA. En oversigt af strukturmæssig sammenligning fremgår af Breathnach, R. og Chambon, P., Ann. Rev. of Biochem. (1981), 5£:349. TATA Box antages at fungere ved initiering af transscription.
30
Det fremmede gen vil være frit for eller i det væsentlige frit for codoner fra det normale strukturelle gen, knyttet til promotoren. Sædvanligvis ved det fremmede gen være sluttet til en ikke-kodende 3'-ende af den reguler-35 ende region, der omfatter promotoren, og således være fri for de aminosyrer ved N-terminus af endogent gen, der na- 6 DK 173604 B1 turligt er associeret med den regulatoriske region. Dvs. at færre end 3 codoner (9 nucleotider) vil være tilbageholdt med den regulatoriske region, når den er sluttet til det fremmede gen.
5
Tilstedeværelsen af terminator-sekvensen ved 3'-enden af kodningssegmentet forhøjer udtrykkeisen. Effekten er i almindelighed tilsvarende tilsætning af rho-faktoren til prokaryotiske transscriptionssystemer, hvori hastigheden io af frigivelsen af RNA-polymerase er forøget til at producere en forøgelse af hastigheden af reinitieringen af transscription. Det vil forstås, at medens terminator-se-kvenserne ikke kræves til påviselig udtrykkelse af fremmede DNA-segmenter, foretrækkes det på passende måde at 15 knytte dem til forhøjet udtrykkelse. Terminatorregionen kan være naturligt associeret med det samme eller forskellige strukturelle gener som promotor-regionen.
Den mest velegnede DNA-vektor for GAPDH-konstruktion 20 ifølge opfindelsen er en skyttel-vektor. Disse vektorer kan veksle som en skyttedel mellem en bakteriestamme, f.eks. E. coli, og gær, fordi de har en bakteriel repli-kationsoprindelse og en gær-replikationsoprindelse, se f.eks. Ammerer, G. et al., Recombinant DNA, Proc. Third 25 Cleveland Symposium Macromolecules (Walton, A. G., ed.), p. 185, Elsevier, Amsterdam (1981). En typisk bakteriel replikationsoprindelse er f.eks. afledt af pBR322. Den mest egnede gær-replikationsoprindelse er fundet i det ekstrachromosomale genetiske element, der er kendt som 2 30 micron-cirkel. I laboratoriestammer har 2 mikroplasmid DNA vist sig at være til stede i tilnærmelsesvis 50 kopier pr. celle og opretholdes stabilt. En oversigt heraf fremgår f.eks. af Curr. Topics Micro. Imm. (1982) 96:119.
Dette gærplasmid er også blevet bestemt (Hartley, J. L.
35 et al., Nature (1980) 286:860).
7 DK 173604 B1
Repræsentative prøver af plasmiderne og værtscellerne, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er deponeret hos American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. Plasmid pHBS-56 5 GAP347/33 blev deponeret 18. februar 1983 og har fået ATCC-registreringsnummeret 20665. Deponeringen er foretaget i overensstemmelse med Budapesttraktaten.
Mange af de i de efterfølgende eksempler omtalte teknik-10 ker, reaktioner og adskillelsesprocedurer er i og for sig velkendte. Alle enzymer, med mindre andet er angivet, kan tilvejebringes fra en eller flere kommercielle kilder, såsom New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Collaborative Research, Waltham, Massachusetts; Miles Labora-15 tories, Elkhart, Indiana; Boehringer Biochemicals, Inc., Indianapolis, Indiana og Bethesda Research Laboratories, Rockville, Maryland. Puffere og reaktionsbetingelser for enzymprocesser blev valgt efter anbefaling fra leverandøren af hvert enkelt enzym, med mindre andet er angivet.
20 Standardmetoder for andre enzymreaktioner, gel-elektrofo-rese-separationer og E. coli transformation er beskrevet i Methods in Enzymology (1971) J58. Transformation af gær-protoplaster kan udføres som beskrevet af Beggs, Nature (1978) 275:104.
25
Stammen af E. coli, der egner sig til transformation, omfatter X1776; K12-stammen 294 (ATCC No. 31446); RR1 og HB101. Gærstammer XV610-8c med genotypen (a ade2 ade6 leu2 lysi trpl canl) og GM-3C-2, genotpe: (Leu2 Trpl His4 30 CYC1-1CYP3-1) (Faye, G. et al., Proc. Natl. Acad. Aci.
(1981) 78:2258)· kan typisk anvendes til gærtransformationer. Det vil dog forstås, at praktisk taget enhver gærart er velegnet til transformation. Bakterie kan dyrkes og udvælges i overennsstemmelse med en 35 procedure, som er beskrevet af Miller, J. H., Experiments in Mulecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York 8 DK 173604 B1 (1972) . Gær kan dyrkes på følgende medier: YEPD med 1%
(w/v) gærekstrakt/ 2% (w/v) pepton og (w/v) glucose/ og, i tilfælde af plademedium, 3% (w/v) agar. YNB plus CAA
indeholder 6,7 g gærnitrogenbase (Difco Laboratories, 5 Minneapolis, Minnesota), 10 mg adenin, 10 mg uracil, 5 g casaminosyrer (CCA) (Difco), 20 g glucose; og i tilfælde af plademdier, 30 g agar pr. liter. Udvælgelse af tryp-tophanprototrofi kan ske på plader indeholdende 6,7 g gærnitrogenbase (mangel-aminosyre), supplementær med alle io vækstbetingelse for den stamme, der skal transformeres, med undtagelse af tryptophan.
EKSEMPEL 1 15 Kloning af gær-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydroqenase (GAPDH) gen
Et komplementære DNA (CDNA) indeholdende gær-GAPDH-kodningssekvenser fremstilledes på følgende made: 20
PolyA+ RNA isoleredes fra gær af stamme A364A. Dobbeltstrenget cDNA blev syntetiseret ved hjælp af AMV omvendt transcriptase og E. coli DNA-polymerase I. Poly-dC-ender blev sat til det dobbelt-kædede cDNA-molekyle ved hjælp 25 af deoxynucleotid terminal transferase. Poly-dC-afsluttet cDNA blev modnet til poly-dG-afsluttet pBR322 og anvendt til transformering af E. coli HB101. 1000 Transformanter blev screenet ved koloni-hybridisering til mærket PolyA+ RNA, og en underafdeling blev yderligere undersøgt ved 30 restriktionsendonuclease-kortlægning og DNA-rækkefølgebe-stemmelse. Tre kloner indeholdende GAPDH-sekvenser blev isoleret fra portionen. En klon (pcGAP-9) indeholdt en indsætning på 1200 basepar (bp) og blev anvendt til det videre arbejde.
35 9 DK 173604 B1
Der blev fremstillet et gen-bibliotek ved indsætning af fragmenter, opnået efter partiel nedbrydning af total gær-DNA med restriktionsendonuclease Sau3A til lambda phage Charon 28, ifølge Blattner, F. R. et al., Science 5 (1977) 196:161-169. Flere fragmenter indeholdende gær GAPDH-kodningssekvenser blev isoleret ved screening af phage-basen med mærket DNA fra pcGAP-9. Gær GAPDH-genet af en af disse kloner blev underklonet i pBR322 som et 2,1 kb Hindi 11-fragment (pGAP-1, se fig. 1) eller som et 10 3,5 kb BamHI-fragment (pGAP-2). GAPDH-promotoraktive fragmenter isoleredes fra disse kloner. HindiII-Hhal-fragmentet på ca. 800 bp ligeredes til Hhal-Hindlll-frag-ment på ca. 350 kb. Det resulterende 1061 bp Hindlll-fragment isoleredes ved gel-elektroforese og klonedes i 15 pBR322, (pGAP-347), og sekvensen bestemtes (se fig. 2).
EKSEMPEL 2
Konstruktion af gærvektorer indeholdende GAPDH-promotor, 20 aktiv til udtrykning af HBsAg
En plasmid-vektor (pHBS-56GAP347/33) for udtrykkelse af HBV-overfladeantigen i gær under anvendelse af GAPDH-promotor- fragment blev konstrueret som angivet på fig. 3.
25
Total digestion af pGAP-347 med Sphl efterfulgt af partiel digestion med Hindlll gav et tilnærmelsesvis 1700 bp SphI-HindIII-fragment med ca. 1060 bp GAPDH-promotor og en 530 bp af pBR322. 1700 bp SphI-Hindlll GAPDH-promotor-30 fragment ligeredes med 840 bp Hindlll-Hindlll-fragmentet (indeholdende HBsAg-kodningsregion, 26 baser af 5'-ikke-kodningsregion og 128 bp 3'-ikke-kodningsregion, stammende fra pHBS-56) og dernæst med 350 bp Hindlll-Sphl-fragment indeholdende ADH-l-terminationsregion (isoleret 35 fra pHBS-56). 2900 bp SphI-fragmentet (kassette) isoleredes og klonedes i pHBS-56, forud dyrket med Sphl. Plasmid 10 DK 173604 B1 pHBS-56 (ATCC registernummer 40047, deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten) er beskrevet i en samtidig ansøgning {serie nr. 402 330, indleveret 27.
juli 1982, med titlen "Synthesis of Human Virus Antigens 5 by Yeast" og indeholder hele 2 micron plasmid foruden en region med gær leu2-gen og amp-resistens locus af pBR322.
Det dannede plasmid (pHBS-56GAP347/33), hvori promotoren, genet og terminationsregionerne havde den rigtige orientering, blev isoleret og anvendt til transformering af 10 gærstammen AB102 MATa, pep4-3, leu2-3, leu2-112, ura 3- 52, his-4-580, cir°) eller stammen 2150-2-3 (MATa, adel, leu2-04, cir°) . Stammen AB102 er afledt fra SF657-9c ved behandling af 2 micron plasmider. Stammen 2150-2-3 er leveret fra en samling tilhørende Dr. Leland Hartwell fra 15 Washington Universitetet.
EKSEMPEL 3
Syntese af HBsAg i gær under GAPDH-promotorkontrol 20 (plasmid pHBS-56GAP347/33) 100 ml Kulturer af stamme AB102 indeholdende plasmid pHBS56-347/33 blev dyrket til en optisk densitet på 650 nm af 1. Cellefri lysater blev fremstillet ved omrøring 25 med glaskugler og fjernelse af celle-debris ved centrifugering. HBsAg blev målt ved hjælp af Abbott Ausraill radio immunopr øve, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af Coomassie-blåt-bindingsmetoden. Resultaterne fremgår af tabel 1. De viser, at GAPDH-promotoren er ca.
30 5 gange mere effektiv end ADH-1-promotoren for proteinud- trykkelsesproduktet i gær.
11 DK 173604 B1 TABEL 1. Syntese af HBsAg i gær.
(a) kontrol fra pHBS-56 (ADH-I promotor)
Exp# sAg Protein Spec, aktivitet (pg/ml) (mg/ml) (pg sAg/ml protein) 1 878 18 0,49 2 14 25 0, 56 3 12,4 20 0,62 (b) fra pHBS-56GAP347/33 (GAPDH-promotor)
Exp# sAg Protein Spec, aktivitet (pg/ml) (mg/ml) (pg sAg/ml protein) ΐ 36 Ϊ4 276 2 35 12 2,9 3 37 12,5 3,0
Tilsvarende resultater blev opnået ved at benytte gærstammen 2150-2-3 i stedet for stammen AB102 og ved at 5 gentage eksempel 3.
Claims (16)
1. Vektor for udtrykkelse i gær, kendetegnet ved, at den består af et fremmed DNA-kodningssegment, der 5 er under transscriptionel kontrol af en gær-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-promotor med sekvensen angivet på Fig. 2, hvilket segment er orienteret korrekt for transscription og har mindre end 3 codoner fra gær-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase ved 5'-io enden af det nævnte fremmede DNA-kodningssegment.
2. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter en terminator, knyttet til 3'-enden af segmentet med fremmed DNA. 15
3. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter gær 2 micron plasmid DNA eller en del deraf.
4. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det fremmede DNA koder for hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf.
5. Plasmid pHBS-56GAP347/33 med deponeringsnummer ATCC 25 20665.
6. Fremgangsmåde til udtrykkelse af det i vektoren ifølge krav 1 indeholdte DNA-kodningssegment i gær, k e n d e t egnet ved, 30 (a) at kodningssegmentet indsættes i en udtrykkelsesvek-tor fra gær, hvilken vektor er et DNA-segment, der indeholder en gær-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-promotor med sekvensen angivet på Fig. 2 og havende 35 mindre end 3 codoner fra 5'-enden af gær-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hvilken promotor er nabostillet DK 173604 B1 13 - til 5'-enden af det indsatte DNA-kodningssegment og således orienteret, at transscription, der initieres i den nævnte promotor, omfatter kodningssegmentet, således at der opnås en kodningssegment-udtrykkelsesvektor, og 5 (b) at gærcellerne med kodningssegment-udtrykkelsesvek-toren transformeres.
7. Fremgangsmåde til udtrykkelse af et DNA-kodniningsseg-10 ment i gær, der koder for Hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf, kendetegnet ved, at (a) at kodningssegmentet indsættes i en udtrykkelsesvek-tor fra gær til opnåelse af en kodningssegment-udtrykkel- 15 sesvektor, og (b) at gærcellerne med kodningssegment-udtrykkelsesvek-toren transformeres, 20 idet gær-udtrykkelsesvektoren omfatter en gær-glycer- aldehyd-3-phosphat-dehydrogenase promotor med sekvensen angivet på Fig. 2 og havende mindre end 3 codoner fra 5'-enden af glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, således at promotor-segmentet er orienteret korrekt for 25 transscription af kodningssegmentet.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af Hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf, kendetegnet ved, 30 (a) at gærceller, der er transformeret med kodningsseg- ment-udtrykkelsesvektoren, der omfatter et DNA-kodningssegment kodende for Hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf, dyrkes, og 35 (b) at Hepatitis B overfladeantigen eller en del deraf isoleres, DK 173604 B1 idet gær-kodningssegment-udtrykkelsesvektoren omfatter en gær-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-promotor med sekvensen angivet på Fig. 2 og havende mindre end 3 5 codoner fra 5'-enden af glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, hvilket promotorsegment er orienteret korrekt for transscription af kodningssegmentet.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene io 6-8/ kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvek- toren yderligere omfatter en terminator, der er knyttet til 3'-enden af den indsatte DNA-kodningssegment.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet 15 ved, at den nævnte terminator omfatter alkoholdehydro- genase I i terminator fra gær.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den nævnte terminator består af GAPDH terminator 20 fra gær.
12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den nævnte terminator omfatter PyK terminator fra gær. 25
13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6-8, kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvek-toren yderligere omfatter en gærcelle-replikation og er i stand til at replikere i en gærcelle. 30
14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6-8, kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvek-toren yderligere omfatter en bakteriecelle-replikation og er i stand til at replikere i en bakteriecelle. 35 DK 173604 B1
15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6-8, kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvek-toren yderligere omfatter en gærcelle-replikation og en bakteriecelle-replikation og er i stand til at replikere 5. gærceller eller bakterieceller. -
16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6-8, kendetegnet ved, at gær-udtrykkelsesvek-toren yderligere omfatter gær 2 micron plasmid-DNA eller ίο en del deraf.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK199301074A DK173763B1 (da) | 1983-02-22 | 1993-09-23 | Vektor for udtrykkelse i gær med en PyK promotor og en fremgangsmåde til syntese af hepatitis B virus overfladeantigen ved hjælp af en sådan vektor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US46858983A | 1983-02-22 | 1983-02-22 | |
| US46858983 | 1983-02-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK577783D0 DK577783D0 (da) | 1983-12-15 |
| DK577783A DK577783A (da) | 1984-08-23 |
| DK173604B1 true DK173604B1 (da) | 2001-04-23 |
Family
ID=23860419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198305777A DK173604B1 (da) | 1983-02-22 | 1983-12-15 | Vektor for udtrykkelse i gær, bestående af et fremmed DNA-kodningssegment og en fremgangsmåde til udtrykkelse af DNA-kodningssegmentet i gær ved hjælp af en sådan vektor |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (4) | EP0120551B1 (da) |
| JP (2) | JPS59210888A (da) |
| AT (3) | ATE93894T1 (da) |
| CA (2) | CA1341302C (da) |
| DE (3) | DE3482844D1 (da) |
| DK (1) | DK173604B1 (da) |
| SG (1) | SG48422A1 (da) |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
| JPS5936699A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | シヤトルベクタ− |
| JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
| US5422267A (en) * | 1984-05-22 | 1995-06-06 | Robert R. Yocum | Industrial yeast comprising an integrated glucoamylase gene |
| EP0173997A1 (en) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines and their preparation |
| CA1339912C (en) * | 1984-12-06 | 1998-06-16 | Jacques Oberto | Transformed yeasts producing lysozyme, plasmids used for this transformation, and uses thereof |
| EP0211767B1 (en) * | 1985-08-05 | 1991-03-06 | Merck & Co. Inc. | Method for increasing recombinant protein production in yeast species of the genus saccharomyces |
| DE3683821D1 (de) * | 1985-10-03 | 1992-03-19 | Green Cross Corp | Hefepromotor und verfahren zur herstellung eines heterologen proteins. |
| JPH0655155B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1994-07-27 | 株式会社ミドリ十字 | 蛋白質の製造方法 |
| DK162900C (da) * | 1985-10-24 | 1992-05-11 | Danisco | Fremgangsmaade til ekspression af gener i gaer samt dna-fragment, rekombineret dna-segment og plasmider, hvor disse indgaar til brug ved udoevelse af fremgangsmaaden |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| JPS62236496A (ja) * | 1986-04-07 | 1987-10-16 | Green Cross Corp:The | ＨＢｓＡｇの製造方法 |
| US4839283A (en) * | 1986-12-30 | 1989-06-13 | Zymogenetics, Inc. | Method of expressing alpha-1-antitrypsin in yeast |
| EP0300213A1 (en) * | 1987-06-22 | 1989-01-25 | Hexal-Pharma Gentechnik GmbH & Co. KG | Hepatitis a viral peptide particle immunogens |
| CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
| AU644619B2 (en) | 1989-12-21 | 1993-12-16 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Modification of plant metabolism |
| FI103206B (fi) * | 1990-01-29 | 1999-05-14 | Novartis Ag | Uusi ilmentämisjärjestelmä sieniä varten |
| US6194140B1 (en) | 1990-04-04 | 2001-02-27 | Chiron Corporation | HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility |
| EP0785273A1 (en) | 1990-11-26 | 1997-07-23 | Genetics Institute, Inc. | Paired basic amino acid converting enzyme and DNA sequence encoding it |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| DE69433160T2 (de) | 1993-05-12 | 2004-07-08 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Konserviertes Motiv der Hepatitis C Virus E2/NS1 Region |
| US5629167A (en) | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
| JPH08173170A (ja) * | 1994-05-25 | 1996-07-09 | Kirin Brewery Co Ltd | キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現 |
| US5728676A (en) * | 1994-09-08 | 1998-03-17 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
| US6329141B1 (en) | 1995-12-22 | 2001-12-11 | Dsm N.V. | Methods for transforming Phaffia strains, transformed Phaffia strains so obtained and recombinant DNA in said methods |
| EP1900818A3 (en) | 1997-11-06 | 2008-06-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neisserial antigens |
| WO1999036544A2 (en) | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
| US6087128A (en) * | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
| GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
| EP2261347A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| CA2372235A1 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Rino Rappuoli | Conserved neisserial antigens |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| EP1226253A2 (en) | 1999-10-29 | 2002-07-31 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigenic peptides |
| US6709863B2 (en) | 1999-12-08 | 2004-03-23 | Iowa State University Research Foundation | Nucleic acid molecules encoding multiple start codons and histidine tags |
| CA2871789C (en) | 2000-01-17 | 2017-04-04 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Outer membrane vesicle (omv) vaccine comprising n. meningitidis serogroup b outer membrane proteins |
| ATE439372T1 (de) | 2000-10-27 | 2009-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Nukleinsäuren und proteine von gruppen a und b- streptokokken |
| CA2474172C (en) | 2001-01-25 | 2012-07-10 | Evolva Ltd. | A library of a collection of cells |
| US8008459B2 (en) | 2001-01-25 | 2011-08-30 | Evolva Sa | Concatemers of differentially expressed multiple genes |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| EP2168596B1 (en) | 2001-12-12 | 2012-05-23 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Immunisation against chlamydia trachomatis |
| WO2003099854A2 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
| WO2004046177A2 (en) | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Chiron Srl | Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| HRP20120315T1 (hr) | 2003-11-21 | 2012-05-31 | Nps Pharmaceuticals | Proizvodnja peptida 2 nalik glukagonu i analoga |
| DE10356218A1 (de) * | 2003-12-03 | 2005-06-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Pyruvatkinasen aus Pilzen |
| AU2005319099B2 (en) | 2004-02-02 | 2010-09-16 | Ambrx, Inc. | Modified human growth hormone |
| CN103755800B (zh) | 2004-02-02 | 2016-02-24 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素多肽与其用途 |
| CN102532321B (zh) | 2004-06-18 | 2018-10-12 | Ambrx公司 | 新颖抗原结合多肽和其用途 |
| US7638299B2 (en) | 2004-07-21 | 2009-12-29 | Ambrx, Inc. | Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids |
| NZ555425A (en) | 2004-12-22 | 2010-04-30 | Ambrx Inc | Compositions of aminoacyl-tRNA synthetase and uses thereof |
| US7385028B2 (en) | 2004-12-22 | 2008-06-10 | Ambrx, Inc | Derivatization of non-natural amino acids and polypeptides |
| BRPI0610297A2 (pt) | 2005-04-18 | 2010-06-08 | Novartis Vaccines & Diagnostic | expressão de antìgeno de superfìcie de vìrus da hepatite b para a preparação de vacina |
| CA2618878C (en) | 2005-08-18 | 2016-06-28 | Ambrx, Inc. | Compositions of trna and uses thereof |
| EP2308504A3 (en) | 2005-09-01 | 2011-11-30 | Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH | Multiple vaccines including serogroup C meningococcus |
| EP1951890A4 (en) | 2005-11-16 | 2009-06-24 | Ambrx Inc | PROCESSES AND COMPOSITIONS WITH NON-NATURAL AMINO ACIDS |
| KR101423898B1 (ko) | 2005-12-14 | 2014-07-28 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비-천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도 |
| ATE522541T1 (de) | 2006-06-09 | 2011-09-15 | Novartis Ag | Bakterielle adhäsine konformere |
| ES2457527T3 (es) | 2006-09-08 | 2014-04-28 | Ambrx, Inc. | ARNt Supresor hibrido en células de vertebrados |
| WO2008030558A2 (en) | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Ambrx, Inc. | Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses |
| KR101476472B1 (ko) | 2007-03-30 | 2015-01-05 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도 |
| WO2008139591A1 (ja) * | 2007-05-11 | 2008-11-20 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 組換えアプロチニンの生産方法 |
| ES2632504T3 (es) | 2007-11-20 | 2017-09-13 | Ambrx, Inc. | Polipéptidos de insulina modificados y sus usos |
| NZ602170A (en) | 2008-02-08 | 2014-03-28 | Ambrx Inc | Modified leptin polypeptides and their uses |
| MX2011000859A (es) | 2008-07-23 | 2011-02-24 | Ambrx Inc | Polipeptidos g-csf bovinos modificados y sus usos. |
| NO2337846T3 (da) | 2008-09-26 | 2018-06-16 | ||
| PL2342223T3 (pl) | 2008-09-26 | 2017-09-29 | Ambrx, Inc. | Zmodyfikowane polipeptydy zwierzęcej erytropoetyny i ich zastosowania |
| NZ600361A (en) | 2009-12-21 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses |
| EP2516455A4 (en) | 2009-12-21 | 2013-05-22 | Ambrx Inc | MODIFIED SWINE SOMATOTROPIN POLYPEPTIDES AND THEIR USES |
| WO2011146833A1 (en) | 2010-05-20 | 2011-11-24 | Evolva Inc. | Method of producing isoprenoid compounds in yeast |
| SMT201900495T1 (it) | 2010-08-17 | 2019-11-13 | Ambrx Inc | Polipeptidi di relaxina modificati e loro usi |
| US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
| TWI480288B (zh) | 2010-09-23 | 2015-04-11 | Lilly Co Eli | 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 |
| BR112017008157A2 (pt) | 2014-10-24 | 2017-12-19 | Bristol Myers Squibb Co | polipeptídeos de fgf-21 modificados e usos dos mesmos |
| US10266578B2 (en) | 2017-02-08 | 2019-04-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
| GR76274B (da) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| DE3381090D1 (de) * | 1982-05-19 | 1990-02-15 | Gist Brocades Nv | Klonierungssystem fuer kluyveromyce spezies. |
| AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
| JPH0716432B2 (ja) * | 1982-10-20 | 1995-03-01 | サントリー株式会社 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
-
1983
- 1983-10-25 CA CA000439701A patent/CA1341302C/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-10-25 CA CA000524802A patent/CA1341116C/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-12-15 DK DK198305777A patent/DK173604B1/da not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-01-06 SG SG1996009565A patent/SG48422A1/en unknown
- 1984-01-06 AT AT89106868T patent/ATE93894T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-01-06 AT AT84300091T patent/ATE55151T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-01-06 DE DE8484300091T patent/DE3482844D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-06 DE DE89106868T patent/DE3486206T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-06 DE DE3486431T patent/DE3486431T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-06 EP EP84300091A patent/EP0120551B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-06 EP EP91114001A patent/EP0460716B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-01-06 AT AT91114001T patent/ATE138975T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-01-06 EP EP96200286A patent/EP0732403A1/en not_active Withdrawn
- 1984-01-06 EP EP89106868A patent/EP0329203B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-02-16 JP JP59026172A patent/JPS59210888A/ja active Granted
-
1992
- 1992-06-17 JP JP4200091A patent/JPH0724594B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0515431B2 (da) | 1993-03-01 |
| EP0120551B1 (en) | 1990-08-01 |
| DE3486431T2 (de) | 1996-10-10 |
| EP0120551A2 (en) | 1984-10-03 |
| DE3482844D1 (de) | 1990-09-06 |
| DE3486431D1 (de) | 1996-07-11 |
| JPH0724594B2 (ja) | 1995-03-22 |
| EP0329203B1 (en) | 1993-09-01 |
| EP0460716A1 (en) | 1991-12-11 |
| ATE138975T1 (de) | 1996-06-15 |
| DE3486206T2 (de) | 1994-02-03 |
| DK577783D0 (da) | 1983-12-15 |
| EP0460716B1 (en) | 1996-06-05 |
| DE3486431T3 (de) | 2000-05-04 |
| EP0329203A1 (en) | 1989-08-23 |
| EP0732403A1 (en) | 1996-09-18 |
| CA1341116C (en) | 2000-10-17 |
| SG48422A1 (en) | 1998-04-17 |
| JPH05268984A (ja) | 1993-10-19 |
| EP0120551A3 (en) | 1986-05-14 |
| ATE55151T1 (de) | 1990-08-15 |
| ATE93894T1 (de) | 1993-09-15 |
| DK577783A (da) | 1984-08-23 |
| CA1341302C (en) | 2001-10-09 |
| JPS59210888A (ja) | 1984-11-29 |
| DE3486206D1 (de) | 1993-10-07 |
| EP0460716B2 (en) | 1999-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0460716B1 (en) | Yeast expression systems with vectors having GAPDH promoters, and synthesis of HBsAg | |
| USRE37767E1 (en) | Highly stable recombinant yeasts for the production of recombinant proteins | |
| EP0292609B1 (en) | Process and signal sequence for the extracellular production of proteinaceous material | |
| CA1205026A (en) | Expression of polypeptides in yeast | |
| US5116750A (en) | Selectable fusion protein having aminoglycoside phosphotransferase activity | |
| Hadfield et al. | G418-resistance as a dominant marker and reporter for gene expression in Saccharomyces cerevisiae | |
| EP0123544A2 (en) | Process for expressing heterologous protein in yeast, expression vehicles and yeast organisms therefor | |
| JPS6371185A (ja) | ヒト・インターロイキン−１αの合成遺伝子 | |
| US4935350A (en) | Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability | |
| EP0329684A1 (en) | Composite yeast vectors | |
| US5627046A (en) | Yeast promoter and its use | |
| JPH1014587A (ja) | 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 | |
| JPH06506602A (ja) | 酵母プロモーター及びその利用 | |
| US5068185A (en) | Trains of yeast for the expression of heterologous genes | |
| Nazos et al. | Identification of livG, a membrane-associated component of the branched-chain amino acid transport in Escherichia coli | |
| Xia et al. | A copy‐number mutant of plasmid pSC101 | |
| IE922007A1 (en) | Cloning and/or expression vectors, preparation and use | |
| US6008051A (en) | Recombinant vector and process for cell flotation | |
| DK173763B1 (da) | Vektor for udtrykkelse i gær med en PyK promotor og en fremgangsmåde til syntese af hepatitis B virus overfladeantigen ved hjælp af en sådan vektor | |
| EP0173668A1 (en) | Recombinant saccharomyces | |
| EP0180958B1 (en) | Recombinant plasmid and microbial strain transformed by said plasmid | |
| EP0188555A4 (en) | YEAST CLONING VEHICLE. | |
| JPH0832241B2 (ja) | 新規遺伝子、ベクター、それを用いた形質転換体、及びその利用 | |
| JPH062063B2 (ja) | 新規ｄｎａおよびその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |