DK174977B1

DK174977B1 - Humane t-PA-proteiner, deres fremstilling, DNA, hybridvektor og transformeret eukaryot værtscelle indeholdende en DNA-sekvens, som koder for de humane t-PA-proteiner, og farmaceutisk præparat indeholdende et sådant t-PA-protein

Info

Publication number: DK174977B1
Application number: DK198605491A
Authority: DK
Inventors: Jutta Heim; Bernd Meyhack; Bhabatosh Chaudhuri; Jan Van Oostrum
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1985-11-18
Filing date: 1986-11-17
Publication date: 2004-04-05
Also published as: GB8528321D0; FI91160C; DK549186D0; NO175266C; NO864569D0; ZA868689B; IE57866B1; PT83752A; JPS62272976A; EP0225286B1; PT83752B; KR920007666B1; FI864654L; ATE78514T1; KR870005094A; IL80659A0; NZ218305A; IL80659A; AU598490B2; NO175266B

Description

i DK 174977 B1

Den foreliggende opfindelse angår humane t-PA-proteiner (vævplasminogenaktivator-proteiner), en fremgangsmåde til deres fremstilling, et DNA, en hybridvektor og en transformeret eukaryot værtscelle indeholdende en DNA-sekvens, 5 som koder for et sådant humant t-PA-protein, samt et far-y maceutisk præparat indeholdende et sådant humant t-PA-pro tein.

Blodpropper er hovedårsagen til sygdom og død hos menne-10 sker i de udviklede lande. Blodpropper er sammensat af fibrin, som er dannet ud fra dets opløselige precursor-fibrinogen ved indvirkning af enzymet thrombin. En række enzymer og andre stoffer sikrer, at blodpropper normalt kun dannes, når og hvor de er nødvendige for at forhindre 15 blodtab.

Pattedyrplasma indeholder et enzymsystem, som er i stand til at opløse fibrinet i blodpropper. Én bestanddel af det fibrinolytiske system er en gruppe enzymer, som kaldes 20 plasminogenaktivatorer, der omdanner plasminogen, som er en inaktiv proenzymform af plasmin, til det proteolytiske enzymplasmin. Plasmin nedbryder derpå fibrinnetværket i blodpropperne til dannelse af opløselige produkter. Når legemets thrombolytiske potentiel er utilstrækkeligt til 25 at fjerne intravaskulære blodpropper, f.eks. hos patienter, som lider af thromboembolismer eller post-kirurgiske komplikationer, kan det være bydende nødvendigt at anvende exogent administrerede thrombolytiske midler. 1 35

To typer plasminogenaktivatorer kan isoleres fra humane legemsvæsker eller celler, nemlig urokinase, som er en serinprotease, der eksempelvis forekommer i human urin og nyreceller, og vævplasminogenaktivator, der i det følgende 2 DK 174977 B1

betegnes "t-PA", som tindes i endothelialcellerne og i en række endocrine væv. Vævpiasminogenaktivator afviger fra urokinase med hensyn til dets kemiske og immunologiske 5 egenskaber, med hensyn til dets langt større fibrinoly-tiske virkning i nærværelse af fibrin samt med hensyn til dets høje affinitet til fibrin. t-PA forekommer i to mole- V

kylformer: den aktive tokædeform og en énkædet precursor-form, som ofte betegnes "pro t-PA". énkædeformen kan 10 omdannes til tokædeformen ved inkubering med katalytiske mængder plasmin, fortrinsvis i nærværelse af fibrin.

Nucleotidsekvensen for cDNA, der koder for human t-PA, er blevet bestemt og aminosyresekvensen fastlagt derudfra, jævnfør D. Pennica et al., Nature 301, 214 (1983). Fire 15 potentielle N-glycosyleringssteder er blevet identificeret, hvoraf det ene øjensynligt ikke anvendes til carbonhydratbinding, jævnfør G. Pohl et al., Biochemistry 23, 3701 (1984).

Kilder for human t-PA omfatter f.eks. ekstrakter af humane 20 væv, som ikke er tilgængelige for kommerciel udnyttelse, og forskellige humane tumorceller, som har vist sig at frigøre t-PA i forskellig grad. I beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 41.766 beskrives således en t-PA, som er isoleret fra en dyrket human melanomacelle-25 linie. Human t-PA er også blevet fremstillet under anvendelse af rekombinant DNA-teknologi. Dobbelstrenget t-PA cDNA afledt af humane tumorceller er blevet klonet og udtrykt i kinesiske hamsterovarieceller (CHO-celler) og i E. coli-celler (beskrivelsen til europæisk patentansøgning 30 nr. 93.619) eller gærceller (S. cerevisiae, beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 123.544 og nr. 143.081). t-PA opnået fra dyrkede humane melanomaceller eller fra transformerede CHO-celler svarer sandsynligvis til det autentiske t-PA glycoprotein. t-PA isoleret fra transfor-35 merede gærceller indeholder formentlig carbonhydratkæder, 3 DK 174977 B1 som er specifikke for gær. Forskelle i strukturen af carbonhydratkæderne hos gær og høj ere eucaryoter er veldokumenterede og vedrører den ydre kædeaddition af 5 mannoserester og modifikationen af kæmecarbonhydraterne, jævnfør R. og S. Kornfeld, Ann.Rev.Biochem. 54, 631 (1985), J.C. Byrd et al., J. Biol. Chem. 257, 14657 (1982) , R.B. Trimble et al., J. Biol. Chem. 258, 2562 (1983) . t-PA'en udtrykt i E. coli er ikke glycosyleret men 10 er fibrinolytisk virksom, skønt den har en temmelig lav specifik virkning. Størsteparten af proteinerne akkumulerer i cytoplasmaet i en inaktiv form, sandsynligvis på grund af ukorrekt foldning af molekylet. Den korrekte foldning afhænger af dannelsen af et antal specifikke 15 disulf idbroer i t-PA molekylet, som er afgørende for enzymaktivitet.

Det er påvist, at carbonhydratresteme i t-PA kan nedbrydes kemisk med oxidationsmidler, såsom natriumper-iodat, jævnfør beskrivelsen til PCT-ansøgning nr. 84/1786 20 og nr. 84/1960. Det dannede t-PA-derivat anføres at have en fysiologisk clearance rate, som er lavere end raten for ubehandlet t-PA. Der anføres intet vedrørende omfanget af kemisk nedbrydning af carbonhydratgrupperne, den specifikke aktivitet for den modificerede t-PA og den sand-25 synligvis skadelige kemiske virkning af oxidationsmidlet på følsomme aminosyregrupper i t-PA kæden [ det antages ' eksempelvis, at tryptophanrester angribes af periodat, jævnfør A.S. Inglis et al., FEBS Lett. 104, 115 (1979)].

Virkningen af glycosyleringsinhibitoren tunicamycin på 30 t-PA-producerende melanomaceller er beskrevet af S.p. Little et al., Biochemistry 23, 6191 (1984). Det er påvist, at glycosylering inhiberes ved 90%. Samtidig inhiberes også proteinsyntesen med 30%, hvilket indicerer,, at tunicamycin interfererer direkte eller indirekte med 35 vitale processer i cellen. Det dannede t-PA-protein 4 DK 174977 B1 bevarer den fibrinolytiske virkning. Den potentielle tilstedeværelse af spor af den skadelige glycosylerings-og proteinbiosynteseinhibitor tunicamycin må nødvendigvis 5 begrænse anvendelsen af denne t-PA som terapeutisk middel.

1 samme litteratursted er den enzymatiske deglycosylering af t-PA ved hjælp af endo-Ø-N-acetylglucosaminidase H (Endo H) beskrevet. Behandling med Endo H fører til en blanding af t-PA-arter, hvor carbonhydratresteme er 10 fjernet for op til 85-90%'s vedkommende. Imidlertid er ca.

50% af t-PA fuldstændigt modstandsdygtigt mod behandling med Endo H. Det anføres, at produktet bevarer autentisk t-PA's fibrinrettede egenskaber.

I betragtning af de formentlig fordelagtige egenskaber ved 15 t-PA-molekyler, som mangler en del af eller alle carbon-hydratresterne, er der et behov for sådanne forbindelser samt fremgangsmåder, som muliggør hensigtsmæssig fremstilling af disse proteiner. Bortset fra produktet isoleret fra transformerede E. coli celler, som imidlertid ikke 20 synes at have stor værdi til terapeutiske formål, jævnfør ovenfor, er de deglycosylerede t-PA-arter beskrevet i litteraturen kemisk udefinerede molekyler, som ydermere forekommer i komplekse blandinger, der indeholder et ubestemt antal enkelte arter. t-PA-arter, hvori én eller 25 alle de N-bundne carbonhydratkæder er fuldstændigt fjernet, er ikke beskrevet.

Da alle eukaryoter har de fælles mekanismer for ekspressionen af genetisk information, kan ekspressionen af eukaryotiske gener forløbe med større effektivitet i en 30 eukaryotisk vært end i E. coli. Blandt de eukaryotiske organismer, som er egnede til udnyttelse, er gær lettest at håndtere. Da gær er en mikroorganisme, er det let at dyrke gærceller. Den cellemasse, som kan opnås pr. rumfang dyrkningsvæske, er betydeligt større for gær end for E.

35 coli, og den er fri for endotoksiner. Almindeligvis er 5 DK 174977 B1 gærs fermenteringsforløb grundigt beskrevet, og betingelser for fermentering i stor målestok er allerede fastlagt. Sekretionsvejen for gær ligner sekretionsvejen 5 for højere celler, herunder humane celler. Det er kendt, at gærceller kan danne deres egne proteiner samt fremmed-proteiner ved spaltning af de tilsvarende signalsekvenser. Endvidere ser det ud til, at proteiner, som indgår i og gennemgår sekretionsvejen hos en eukaryotisk vært, 10 sandsynligvis danner en høj grad af tertiær struktur sammenlignet med proteiner dannet i cytoplasmaet. Det skal bemærkes, at prokaryoter, såsom E. coli, ikke synes at have store proteiner med højere ordens strukturer. Glycosyleringssystemet er forbundet med sekretionsvejen i 15 højere organismer. Det antages, at forskellene i glycosy-lering kan påvirke sorteringen af proteinerne. Således overføres gærcarboxypeptidase Y, som er simpelt keme-glycosyleret med 13 mannoserester, til vacuolen, hvorimod gærinvertase med ydre carbonhydratkæder bestående af ca.

20 100-150 mannoserester passerer gennem de sekretoriske vesikler og går ud i periplasmatiske rum, jævnfør L. Lehle et al., J. Biol. Chem. 254, 12209 (1979), og C. Hashimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2244 (1981). Der er således ingen tvivl om, at ændring af carbonhydratkæderne 25 kan have indvirkning på den sekretoriske opførsel af t-PA.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte humane t-PA-proteiner, som mangler en eller flere af de N-bundne carbonhydratkæder, men som bibeholder værdifulde biologiske egenskaber, såsom fibrinolytisk 30 virkning, en mindre fysiologisk clearance rate og længere in vivo stabilitet end naturligt t-PA. Det er endvidere formålet med opfindelsen at tilvejebringe hybridvektorer indeholdende DNA sekvenser, som koder for sådanne t-PA'er, og et stærkt promotorsystem, der effektivt kontrollerer 35 ekspressionen af DNA sekvenserne.

6 DK 174977 B1

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer hidtil ukendte humane mutant t-PA-proteiner, hvori et eller flere af de naturligt forekommende N-glycosyleringssteder er ændret på 5 en sådan måde, at der ikke kan foregå glycosylering på disse steder. Dette opnås ved at tilvejebringe DNA sekvenser, som koder for sådanne t-PA-proteiner, hybridvektorer indeholdende sådanne DNA sekvenser og værtsceller, som er transformeret med sådanne hybridvektorer, og som udtrykker 10 sådanne t-PA-proteiner.

1. Fremstilling af moden t-PA, som mangler en eller flere af carbonhydratkæderne.

Det er velkendt, at en nødvendig forudsætning for N-bundet glycosylering i pattedyrceller er forekomsten af 15 tripeptidsekvensen-Asn-L-Ser(eller Thr)-, hvor Asn er acceptoren, og L kan være en vilkårlig af de 20 genetisk indkodede aminosyrer bortset fra prolin eller asparagin-syre, som forhindrer glycosylering, jævnfør D.K. Struck og W.J. Lennarz, The Biochemistry of Glycoproteins and 20 Proteoglycans, udg. W.J. Lennarz, Plenum Press 1980, side 35, og R.D. Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40, 17 (1974).

Der findes fire potentielle steder for N-glycosidisk binding i t-PA molekylet (numrene refererer til stillingen af Asn i aminosyresekvensen for t-PA, jævnfør fig. 1 på 25 tegningen ): -Asn^-^-Ser-Ser-, Asn^^-Gly-Ser-,

Asn218_pro_ser Qg Asn448_Arg-Thr-. som følge af forekomsten af Pro i sekvensen Asn^lS-Pro-Ser udnyttes Asn^ie ikke til fæstnelse af carbonhydrater i pattedyrceller, jævnfør G. Pohl et al., i det ovenfor anførte litteratur-30 sted.

For at undgå individuel glycosylering (et eller flere af N-glycosyleringsstederne) er det nødvendigt at ændre tripeptidsekvenserne, som er signaler for N-glycosylering. Ombytning af Asn- og/eller Ser- (eller Thr-)resterne i de 7 DK 174977 B1 ovenfor omtalte tripeptidsekvenser med en vilkårlig anden aminosyre ville umuliggøre dannelse af glycosidbindinger ved disse steder. For nemheds skyld foretages modificering 5 af t-PA molekylet, dvs. ændring af N-glycosylerings-stederne, ikke på proteinniveauet. Det er i stedet for fordelagtigt at modificere genet, som koder for t-PA, på en sådan måde, at ved ekspression af det modificerede gen ved hjælp af en vært dannes en mutant t-PA, hvori et eller 10 flere af de naturligt forekommende N-glycosyleringssteder er ændret på en sådan måde, at der ikke kan forekomme glycosylering på disse steder.

Opfindelsen angår således humane mutant t-PA proteiner som er ejendommelige ved, at de har aminosyresekvensen 15

Al-ll6~Asn~Ser“Yl"A120-183“Asn“G1Y“Y2~A187-217~Asn-Pro"Y3” A221-447”Asn"Ar9“Y4_A451-527 (*') hvori Ai_h5 betyder den N-terminale aminosyresekvens 20 bestående af aminosyrer 1 til 116 i moden t-PA, Ai20-1'83 betyder aminosyresekvensen bestående af aminosyrer 120 til 183 i moden t-PA, Ai87-217 betyder aminosyresekvensen bestående af aminosyrer 187 til 217 i moden t-PA, A221-447 betyder aminosyresekvensen bestående af aminosyrer 221 til 25 447 i moden TPA, A45l-527 betyder den C-terminale aminosyresekvens bestående af aminosyrer 451 til 527 i moden t-PA, og a) Yi og Y3 er Ser, Y2 er en genetisk indkodet aminosyre forskellig fra Ser og Thr, og Y4 er Thr, eller 30 b) Y]_, Y2 og Y3 hver især er Ser, og Y4 er en genetisk indkodet aminosyre forskellig fra Ser og Thr, eller c) Y]_, Y2 og Y4 hver især uafhængigt er en genetisk indkodet aminosyre forskellig fra Ser og Thr, og Y3 er Ser, i den énkædede eller den tokædede form.

35 8 DK 174977 B1

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af et humant t-PA-protein ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man under passende næringsbetingelser dyrker transformerede eukaryote værtsceller 5 indeholdende en DNA-sekvens, som koder for det nævnte humane t-PA-protein, og isolerer det humane t-PA-protein og, om ønsket, adskiller en blanding af énkædeformen og tokædeformen af det dannede t-PA-protein i de enkelte komponenter og til fremstilling af tokædeformen uden indhold af énkædeformen 10 omdanner énkædeformen af det dannede t-PA-protein til tokædeformen .

Opfindelsen angår endvidere:

15 - DNA, som er ejendommeligt ved, at det indeholder en DNA

sekvens, der koder for et humant t-PA-protein ifølge opfindelsen, en hybridvektor, som er ejendommelig ved, at den in-20 deholder en promotor og en DNA sekvens, som koder for et humant t-PA-protein ifølge opfindelsen, og en transformeret eukaryot værtscelle, som er ejendommelig ved, at den indeholder en DNA sekvens, som koder 25 for et humant t-PA-protein ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår endelig også et farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt ved, at det indeholder et humant t-PA-protein ifølge opfindelsen og et farmaceutisk acceptabelt 30 bærestof.

Udtrykket "moden t-PA” refererer til en t-PA, som ikke indeholder nogen præ- eller pro-sekvenser, som starter med Ser i stilling 1. Der henvises i denne forbindelse til 3$ fig. 1 på tegningen, som viser aminosyresekvensen for moden t-PA.

9 DK 174977 B1

Genetisk indkodede aminosyrer er følgende L - aminosyrer:

Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys,

Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp og Pro og endvidere aminosyren Gly.

5

Til ombytning foretrækkes de aminosyrer, som har en lignende størrelse og polaritet som de aminosyrer, som skal udskiftes. Antallet af mulige substitutter for Asn-,

Thr- og/eller Ser-resterne er begrænset af den givne 10 nucleotidsekvens og de mulige codoner, jævnfør afsnit 2.

Til ombytning af Asn i stilling X]_, X2, X3 og/eller X4 foretrækkes således aminosyrerne Thr og Ser. Til ombytning af Ser Y^, Y2 og/eller Y3 og til ombytning af Thr Y4 foretrækkes aminosyrerne Ala og Asn.

15

Opfindelsen angår især t-PA-proteiner valgt blandt [Ala186]-t-PA [Ala450]-t-PA, [Asn119, Ala186, Asn450]-t-PA og [Asn119, Ala186, Ala450]-t-PA.

20 Forbindelser med formlen I, hvori mindst ét af de oprindelige t-PA N-glycosyleringssteder er bevaret, er N-glycosylerede. Forbindelser med formlen I, hvori intet af de oprindelige t-PA glycosyleringssteder er bevaret, indeholder ingen N-bundet glycosylering.

25 énkædeformen af t-PA mutanterne ifølge opfindelsen svarer til den ovenfor anførte formel I. Tokædeformen dannes ved spaltning af Arg275jie276peptidbindingen, jævnfør fig. 1.

De to kæder holdes sammen ved hjælp af en disulfidbro.

30 Overalt i forbindelse med den foreliggende opfindelse og medmindre andet udtrykkeligt er anført, refererer udtrykket "t-PA" til énkædeformen, som er den foretrukne form for t-PA'erne ifølge opfindelsen.

35 Forbindelserne med formlen I fremstilles fortrinsvis ved hjælp af bioteknologi.

10 DK 174977 B1

Fremgangsmåden til fremstilling af mutant t-PA proteiner ifølge opfindelsen omfatter dyrkning af en transformeret eukaryotisk værtsorganisme, som indeholder en DNA sekvens, der koder for ethvert af de nævnte mutant t-PA proteiner, 5 under passende næringsbetingelser, isolering af mutant t-PA proteinet og, om ønsket, adskillelse af en blanding af én-kædeformen og tokædeformen af det dannede mutant t-PA i de enkelte komponenter, og omdannelse af énkædeformen af den dannede t-PA mutant til tokædeformen til dannelse af tokæde-10 formen, som ikke indeholder énkædeformen.

Det primære produkt ved t-PA genekspression ifølge opfindelsen er énkædeførmen af t-PA. Hvis der imidlertid findes proteaser enten i værtscellen eller i kulturvæsken, kan 15 den primært udtrykte énkædede t-PA være i det mindste delvis omdannet til tokædet t-PA. Det faktisk Isolerede produkt kan derfor bestå af mutant énkædet t-PA, mutant tokædet t-PA eller blandinger deraf.

20 Egnede eukaryotiske værtsorganismer er celler af højere organismer, især pattedyr, specielt etablerede humane eller animalske cellelinier, såsom den humane Bowes cellelinie eller HeLa celler, eller den kinesiske hamster ovariecellelinie (CHO-cellelinie), og gær, såsom 25 Saccharomyces cerevisiae. Den foretrukne værtsorganisme ifølge opfindelsen er Saccharomyces cerevisiae.

Den eukaryotiske værtsorganisme, især gær, som indeholder den ovenfor omtalte DNA sekvens, dyrkes under anvendelse 30 af i og for sig kendte fremgangsmåder.

Transformerede gærstammer ifølge opfindelsen dyrkes således i et flydende medium, som indeholder assimilerbare kilder for kulstof, nitrogen og uorganiske salte.

35 11 DK 174977 B1

Der kan anvendes forskellige kulstofkilder. Som eksempler på foretrukne kulstofkilder kan nævnes assimilerbare carbonhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, såsom natriumacetat, som kan 5 anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitro genkilder omfatter f.eks. aminosyrer, såsom casamino-syrer, peptider og proteiner og deres nedbrydningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakter, endvidere gærekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevand samt ammonium-10 salte, såsom ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat, som kan anvendes enten alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salte, som kan anvendes, omfatter f.eks. sulfater, chlorider, phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium.

15 Næringsmediet kan tillige også indeholde vækstfremmende stoffer. Stoffer, som fremmer vasksten, indbefatter f.eks. sporelementer, såsom jern, zink, mangan og lignende, eller individuelle aminosyrer.

20 Gærceller transformeret med autonomt kopierende plasmider, f.eks. plasmider indeholdende gær 2μ plasmid DNA (infra), har i varierende grad tendens til at miste det indførte hybridplasmid. Af denne grund må sådanne gærceller dyrkes under selektive betingelser, dvs. betingelser, som kræver 25 ekspression af et plasmidindkodet gen for vækst. De mest selektive markører, som for tiden anvendes, og som forekommer i hybridvektorerne ifølge opfindelsen (infra), er gener, som koder for enzymer for aminosyre- eller purin-biosyntese. Dette gør det nødvendigt at anvende synte-30 tiske minimalmedier, som mangler den pågældende aminosyre eller purinbase. Visse gener, der bibringer resistens mod et passende biocid, kan imidlertid lige så godt anvendes, f.eks. gener, der tilvejebringer resistens mod cyclo-heximid, mod aminoglycosidet G 418, mod et tungmetal eller 35 lignende. Gærceller transformeret med vektorer indeholdende gener med antibiotisk resistens dyrkes i komplekse 12 DK 174977 B1 medier, der Indeholder det tilsvarende antibiotikum, hvorved der opnås større vækstrater og højere celletæt-heder.

5 Gærceller transformeret med DNA integreret i kromosomerne kræver ikke selektive vækstbetingelser. Disse transformerede celler er tilstrækkeligt stabile til at tillade vækst uden selektionstryk. Af den ovenfor omtalte årsag dyrkes disse celler fordelagtigt i komplekse medier.

10 Gærceller, som indeholder hybridplasmider med en konsti-tutiv promotor, f.eks. ADHI, GAPDH, udtrykker t-PA genet fæstnet til promotoren uden induktion. Hvis t-PA genet imidlertid er under kontrol af en reguleret promotor, 15 f.eks. PGK eller PH05, skal vækstmediets sammensætning tilpasses til opnåelse af maksimale koncentrationer af mRNA transskripter, dvs. når PH05 promotoren anvendes, skal vækstmediet indeholde en lav koncentration af uorganisk phosphat for tilkobling (derepression) af denne 2 0 promotor.

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af konventionelle teknikker. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, mediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges på en sådan 25 måde, at der opnås maksimale koncentrationer af t-PA. En valgt gærstamme dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser i submers kultur med rystning eller omrøring ved en temperatur på fra ca. 25 til ca. 35eC, fortrinsvis ved ca.

30eC, ved en pH-værdi på 4-8, f.eks. ved en pH-værdi på 30 ca. 7, og i fra ca. 4 til ca. 20 timer, fortrinsvis indtil der er opnået maksimale proteinudbytter.

Det dannede t-PA protein kan akkumulere i gærcellerne eller kan udskilles til det periplasmiske rum eller til 35 dyrkningsmediet. Når t-PA proteinet er akkumuleret i cellerne, består det første trin i udvindingen af t-PA

13 DK 174977 B1 proteinet af frigørelse af proteinet fra cellens indre.

Ved de fleste metoder fjernes cellevæggen først ved enzymatisk nedbrydning med glucosidaser (jævnfør afsnit 4). Derefter behandles de dannede sfæroplastere med 5 detergenter, såsom "Triton x-100"®. Der kan eventuelt anvendes mekaniske kræfter, såsom forskydningskræfter, f.eks. X-presse, fransk presse, eller rystning med glasperler til oplukning af cellerne. Den dannede blanding opkoncentreres med hensyn til mutant t-PA på konventionel 10 måde, f.eks. ved fjernelse af størsteparten af det ikke-proteinholdige materiale ved behandling med polyethylen-imin, fældning af proteinerne med ammoniumsulfat eller •trichloreddikesyre, gelelektroforese, dialyse, kromato grafi, f.eks. ionbytterkromatografi, størrelsesudeluk-15 kelseskromatografi, HPLC eller HPLC med omvendt fase, såkaldt "molekylær sizing" på en egnet "Sephadex"®-søjle eller lignende. Den endelige rensning af det forrensede produkt opnås eksempelvis ved affinitetskromatografi, f.eks. ved hjælp af antistofaffinitetskromatografi, især 20 monoklonal antistofaffinitetskromatografi under anvendelse af monoklonale anti-t-PA antistoffer fæstnet på en uopløselig matrix på i og for sig kendt måde, og lignende.

Andre foretrukne fremgangsmåder til isolering af mutant 25 t-PA fra dyrkningsvæskeme består i selektiv adsorbtion på et bæremateriale med specifik affinitet for opløselige fibrinfragmenter, som er covalent bundet til en uopløselig matrix, f.eks. dextran eller, især, til DE-3 "Sepharose"®.

DE-3 er en trypsininhibitor, som findes i frøene fra 30 bælgplanten Erythrina latissima, jævnfør beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 112.122. Det har vist sig, at DE-3 også er i stand til at inhibere t-PA aktivitet.

Den rensede DE-3 inhibitor kan således kobles til en uopløselig matrix, f.eks. BrCN aktiveret "Sepharose"®, 35 under anvendelse af standardmetoder. t-PA proteiner adsorberes på inhibitormatrixen og kan elueres med en puffer, som indeholder et chaotropt middel.

14 DK 174977 B1

Ved en foretrukken udførelsesfonn for fremgangsmåden ledes dyrkningsmediet, eventuelt efter gennemførelse af et eller flere af de ovenfor nævnte rensningstrin, ved stuetemperatur gennem en søjle eller behandles ved en batch proces 5 med BrCN aktiveret "Sepharose"®, hvortil DE-3 inhibitoren er koblet. Efter vaskning af "Sepharose"® bærematerialet elueres den adsorberede vævplasminogenaktivator ved behandling med en pufferopløsning, f.eks. phosphatpufret natriumchloridopløsning, med en pH-værdi på ca. 5,5-6,0 og 10 indeholdende et chaotropt middel, såsom NH4SCN, i en mola-ritet på fra ca. 1,0 til ca. 2,0, fortrinsvis 1,2. Eventuelt kan benzamidin eller arginin vælges som frigørelsesmidler. Med fordel sættes en detergent, især en ikke-ionisk detergent, såsom "Triton X-100"® eller "Tween 80"® 15 til alle pufferopløsningerne, som anvendes i rensningstrinnene, for at forhindre adsorptionen af vævplasminogenaktivator til beholderoverfladerne og for at forbedre stabiliteten. Detergentet kan tilsættes til en slutkon-centration på 0,01-0,1%.

20 Når vævplasminogenaktivatoren udskilles af gærcellerne i det periplasmiske rum, kan der anvendes en simplificeret fremgangsmåde: Proteinet udvindes uden lysering af cellerne ved enzymatisk fjernelse af cellevæggen eller ved 25 behandling med kemiske midler, f.eks. thiolreagenser eller EDTA, som giver anledning til beskadigelse af cellevæggene, der tillader frigørelse af det dannede mutant t-PA.

Når mutant t-PA udskilles i dyrkningsvæsken, kan den udvindes direkte fra denne.

30

Dyrkning af gærceller, som indeholder et kromosomalt integreret t-PA gen, og isolering og rensning af det udtrykte t-PA gennemføres på samme måde som beskrevet ovenfor.

35 15 DK 174977 B1 Når der anvendes de foretrukne gærstammer ifølge opfindelsen, nemlig proteasedeficiente gærstammer, foreligger den isolerede mutant t-PA for det meste på énkædeformen.

Når der anvendes gærceller, som udviser proteolytisk 5 virkning, opnås en produktblanding bestående af énkæde-formen og tokædeformen af mutant t-PA i varierende forhold.

Til fremstillingen af tokædeformen af mutant t-PA, som er 10 praktisk taget fri for énkædeformen, omdannes énkædeformen enzymatisk til tokædeformen ved spaltning af Arg275ne276_ peptidbindingen, f.eks. ved indvirkning af plasmin eller * et enzym med en ækvivalent virkning på énkædeformen af t-PA.

15

Til hensigtsmæssig fremstilling af énkædeformen af mutant t-PA, som er praktisk taget fri for tokædeformen, anvendes hensigtsmæssigt en proteaseinhibitor, såsom aprotinin ("Trasylol"®) eller basisk pancreatisk trypsininhibitor, 20 under rensningen for at inhibere spor af proteaser, som kan forekomme, og som kan bevirke (partiel) omdannelse af énkædeformen til tokædeformen. Den endelige rensning opnås derpå ved kromatografi på en søjle, som indeholder et selektivt affinitetsreagens, såsom DE-3.

25

De transformerede værtsorganismer ifølge opfindelsen kan fremstilles ved rekombinant DNA teknik omfattende følgende trin: fremstilling af et strukturgen, som koder for mutant t-PA 30 proteinet ifølge opfindelsen, inkorporering af det dannede strukturgen i en passende vektor, transformering af en egnet værtorganisme med den dannede hybridvektor og 35 selektering af transformerede værter fra ikke-transfor-merede værter.

16 DK 174977 B1 2. DNA sekvenser, som koder for mutant t-PA proteiner.

Opfindelsen angår som nævnt også en DNA, som indeholder en sekvens, der koder for et humant mutant t-PA protein ifølge 5 opfindelsen.

Opfindelsen angår især en DNA, som har en sekvens med formlen n1-348-aac-agc_w1“n348-549_aat“ggg“w2“n559-651_aac“ccc-w3“ 10 N661-1341-AAC"AGA’W4“N1351-1581 i11') hvori Ni_348 betyder en deoxyribonucleotidsekvens bestående af deoxyribonucleotider 1-348 i genet for moden t-PA, n358-549 betyder en deoxyribonucleotidsekvens bestående af 15 deoxyribonucleotider 358 til 549 i genet for moden t-PA, N559-651 betyder en deoxyribonucleotidsekvens bestående af deoxyribonucleotider 559 til 651 i genet for moden t-PA, n661-1341 betyder en deoxyribonucleotidsekvens bestående af deoxyribonucleotider 661 til 1341 i genet for moden 20 t-PA, og Ni35i_i58i betyder en deoxyribonucleotidsekvens bestående af deoxyribonucleotider 1351-1581 i genet for moden t-PA, og W1( W2, W3 og W4 hver for sig betyder codoner, som koder for aminosyrerne Y^ Y2, Y3 hhv. Y4 som defineret ovenfor.

25

Genet, som koder for human moden t-PA, er kendt og kan afledes fra en hvilken som helst human celle, som er i stand til at producere t-PA. Sådanne celler er af canceragtig eller ikke-canceragtig oprindelse og er 30 fortrinsvis afledt af en etableret cellelinie. Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen er genet for t-PA afledt af HeLa celler. Der henvises til fig. 1 på tegningen, som viser DNA sekvensen for moden t-PA forekommende i HeLa celler startende med TCT kodende for Ser 35 som den første aminosyre og nummerering af deoxyribo-nucleotiderne.

17 DK 174977 B1 I vildtype moden t-PA er AGC, W2 TCA, W3 AGT, og W4 ACA.

I forbindelserne med formlen II' er mindst én af disse originale codoner ændret på en sådan måde, at den dannede codon indkoder en aminosyre Yl7 Y2, Y3 eller Y4 som ovenfor defi-5 neret. Codonerne Wlf W2, W3 og/eller W4 kan ombyttes med et vilkårligt andet codon, som er forskelligt fra et nonsens-codon under hensyntagen til det ovenfor anførte forbehold.

. Der foretrækkes sådanne ændrede codoner, som koder for de foretrukne aminosyrer anført ovenfor, og som er forskellige 10 fra de oprindelige codoner med hensyn til ét eller højst to deoxyribonucleotider.

I forbindelserne med formlen II' er codonerne W1# W2, W3 og/eller W4 fortrinsvis modificeret på følgende måde: 15 AGC (W-p koder for Ser) er ændret til ATC (Ile) eller AAC (Asn), TCA (W2, koder for Ser) er ændret til GCA (Ala) eller TTA (Leu), AGT (W3, koder for Ser) er ændret til AAT (Asn) eller ATT (Ile), og ACA (W4, koder for Thr) er ændret til ATA (Ile) , GCA (Ala), AAC eller AAT (begge Asn) .

20 DNA sekvenserne med formlen II er fortrinsvis sådanne, som koder for de mutant t-PA proteiner, som er omtalt ovenfor som særligt foretrukne.

25 DNA'erne med sekvenserne med formlen II kan fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. Fremgangsmåderne til fremstilling af disse DNA*er indbefatter kemisk syntetisering af DNA'et, udskæring af en del af DNA'et indeholdende codonet for den uønskede amino-30 syrerest fra det oprindelige modne t-PA gen, og ombytning deraf med et DNA segment, hvori codonet er blevet erstattet med en deoxyribonucleotidtriplet, som koder for den ønskede aminosyrerest, eller gennemførelse af deoxyribo-nucleotidombytningen ved hjælp af steddirigeret (site-directed) mutagenese.

18 DK 174977 B1

Den kemiske syntese af DNA er velkendt og kan gennemføres under anvendelse af konventionelle teknikker. Egnede teknikker er beskrevet af S.A. Narang i Tetrahedron 39, 3 (1983). Specielt kan anvendes de fremgangsmåder, som er 5 beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 146.785.

Udskæring af en del af det modne t-PA DNA kan gennemføres under anvendelse af restriktionsenzymer. En forudsætning 10 for denne fremgangsmåde er tilgængeligheden af passende restriktionssteder i omegnen af det codon, som skal ændres. Et lille restriktionsfragment, som indeholder codonen for en uønsket aminosyre, fjernes ved endonucle-asespaltning. En tilsvarende dobbeltstrenget DNA sekvens 15 fremstilles f.eks. ved hjælp af kemisk syntese, hvori tripletterne, som koder for den ønskede aminosyre, er anvendt. DNA fragmentet ligeres i den rigtige orientering i det tilbageblevne store fragment til dannelse af en dobbeltstrenget DNA sekvens, som koder for en mutant t-PA.

20 For nemheds skyld og for at lette håndteringen af t-PA genet, er sidstnævnte fordelagtigt indeholdt i et større DNA segment forsynet med passende linkere, som tillader indsætning og kloning af segmentet i en kloningsvektor.

25 Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen gennemføres fremstillingen af DNA’er med DNA sekvenserne med formlen II ved steddirigeret mutagenese. Denne fremgangsmåde er en in vitro mutagenesefremgangsmåde, ved hvilken et fastlagt sted i et område af klonet DNA kan ændres, 30 jævnfør oversigtsartiklerne af M.J. Zoller og M. Smith, Methods Enzymol. 100, 468 (1983), D. Botstein og D. Shortle, Science 229, 1193 (1985).

35 19 DK 174977 B1

Fremgangsmåden til mutering af vildtype t-PA genet er karakteriseret ved, at det enkeltstrengede vildtype t-PA gen eller et enkeltstrenget DNA indeholdende vildtype t-PA genet hybridiseres til en oligodeoxyribonucleotidprimer, 5 som er komplementær til området af t-PA genet, som skal muteres, bortset fra mismatch eller mismatcher, som dirigerer mutationen, det hybridiserede oligodeoxyribo-nucleotid anvendes som en primer til initiering af syntesen af den komplementære DNA streng, det dannede 10 (delvis) dobbeltstrengede DNA transformeres til en recipient mikroorganismestamme, mikroorganismestammen dyrkes, og transformanter indeholdende DNA med det modificerede t-PA gen selekteres.

15 Vildtype t-PA genet er fortrinsvis indeholdt i et plasmid, f.eks. et plasmid beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081. Til mutagenese isoleres t-PA genet fordelagtigt fra plasmidet, f.eks. ved restriktions-endonucleasespaltning under dannelse af et dobbeltstren-20 get DNA indeholdende t-PA genet og eventuelt andre funktioner bundet dertil, f.eks. promotor, signalpeptid DNA osv., og som har klæbrige ender, hvorpå det ligateres til et egnet restriktionsfragment af den replikative form (RF) af en enkeltstrenget DNA phag, såsom et derivat af phag 25 M13, f.eks. M13mp8 eller M13mp9. Kompetente mikroorga nismer, f.eks. Ca-behandlede celler af en E. coli stamme, transficeres med hybridphagvektoren, og enkeltstrenget phag DNA indeholdende det indsatte t-PA gen isoleres fra supernatanten fra de dyrkede celler. Til denne skabelon 30 hybrideres mismatch (mutagent) oligodeoxyribonucleotid-primeren.

35 20 DK 174977 B1

Nogle af fremgangsmåderne beskrevet i litteraturen beror på den enzymatiske forlængelse af den mutagene primer langs den cirkulære skabelon efterfulgt af ligatering til 5 dannelse af et covalent lukket dobbeltstrenget cirkulært molekyle med mutationen eller mutationerne i den ny-syntetiserede streng. Som følge af den sædvanligvis lave effektivitet ved denne fremgangsmåde er der udviklet en modificeret fremgangsmåde, jævnfør K. Norris et al., Nucl.

10 Acids Res. 11, 5103 (1983), ved hvilken der anvendes en anden primer. I tilfælde af en M13 phagvektor anvendes fortrinsvis en universel M13 sekvenseringsprimer.

I overensstemmelse hermed annelleres den phosphorylerede mutagene primer og M13 sekvenseringsprimeren samtidig til 15 den cirkulære enkeltstrengede t-PA skabelon DNA. Annelle-ring forekommer hurtigt ved 55eC i 5 minutter og derefter ved stuetemperatur i 5 minutter. Molforholdet mellem primer og skabelon er fordelagtigt 20:1. Forlængelse af begge primere gennemføres ved hjælp af E. coli DNA 20 polymerase (Klenow fragment). Den nysyntetiserede DNA streng fra sekvenseringsprimeren ligateres til den 5’-phosphorylerede ende af den mutagene primer ved hjælp af T4 DNA ligase. På denne måde dannes delvis dobbeltstrengede molekyler bærende den eller de ønskede mismatch(er).

25 Den mutagene primer og M13 sekvenseringsprimeren kan syntetiseres kemisk, jævnfør ovenfor. For at opnå tilstrækkelig priming af DNA syntese ved stuetemperatur og derover foretrækkes det at anvende oligodeoxyribo-nucleotider med en længde i området fra ca. 14 til 22 30 nucleotider. Desuden er der større sandsynlighed for, at sådanne oligodeoxyribonucleotider genkender de entydige målsteder. Især har et mutagent oligodeoxyribonucleotid med én mismatch en længde fra 14 til 18 nucleotider, medens mutagene oligodeoxynucleotider med to mismatcher 35 har en længde fra ca. 17 til 30 nucleotider. De mutagene 21 DK 174977 B1 primere er udformet på en sådan måde, at mismatchen eller mismatcherne er anbragt nær midten af molekylet. Dette giver det største bindingsdifferentiel mellem en perfekt 5 matchet duplex og en mismatchet duplex (se nedenfor).

Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen indeholder de mutagene oligodeoxyribonucleotider tripletter med én eller to mismatcher, som koder for aminosyrerester, der forhindrer glycosylering og er beskrevet i det 10 foregående som særligt foretrukne.

Det delvis dobbeltstrengede DNA bærende den eller de ønskede mismatcher kan anvendes direkte til transfektion af en recipient mikroorganisme, især en stamme af E. coli. Transfektion med DNA'et fører til en blanding af phager, 15 som indeholder henholdsvis vildtype t-PA genet og det muterede t-PA gen. De dannede plak screenes for phag DNA indeholdende de muterede t-PA gen.

En foretrukken fremgangsmåde til selektering af phag DNA indeholdende det muterede t-PA gen fra den dannede blan-20 ding af phager med inkorporeret vildtype eller muteret t-PA er den såkaldte "dot blot" hybridisering, jævnfør det ovenfor anførte litteratursted af M.J. Zoller og M. Smith. Metoden er baseret på forskellen i temperaturstabilitet hos en perfekt matchet DNA duplex og en DNA duplex med en 25 eller flere mismatcher. Det enkeltstrengede phag DNA immobiliseres på et fast bæremateriale, såsom filtrerpapir eller nitrocelluloseark ved opvarmning til højere temperatur, f.eks. 80°C, og hybridisering til den 3^>_mærke(je mutagene oligodeoxyribonucleotidprimer (se ovenfor). Ved 30 lav temperatur reagerer både mutant og vildtype t-PA DNA ved dannelse af duplexer. Efterfølgende vaskninger gennemføres ved højere og højere temperaturer, f.eks. med intervaller på 10eC, hvorved primeren selektivt dissocieres fra vildtype t-PA DNA'et, indtil kun perfekt matchede 22 DK 174977 B1 mutantmolekyler forbliver hybridiserede. Mutantmolekylerne identificeres ved autoradiografi. Den nødvendige sluttem-peratur kan beregnes teoretisk. Fortrinsvis vælges en temperatur, som ligger 4-8eC over smeltetemperaturen T 0 5 (punkt med 50% dissociation af primåren). T0-temperaturen beregnes ved en forhøjelse på 2° for hvert AT basepar og en forhøjelse på 4· for hvert GC basepar i den perfekt baseparrede primermuterede t-PA gen duplex mellem oligo-deoxyribonucleotidprimeren og det muterede t-PA gen.

10

Rene mutant phager opnås ved retransfektion af en recipient mikroorganismestamme, såsom en E. coli stamme, med de identificerede primære mutant phager, hvorpå der atter foretages screening af plak for phag DNA indeholdende det 15 muterede t-PA gen ved hjælp af "dot blot" hybridisering under anvendelse af den ovenfor omtalte mutagene oligodeoxyribonucleotidprimer (32P-mærket).

Det muterede t-PA gen udskæres fra den replikative form af 20 phagen ved hjælp af egnede restriktionsendonucleaser og anvendes til kloning i en hybridvektor.

3. Hybridvektorer indeholdende DNA sekvenser, som koder 25 for mutant t-PA proteiner.

Opfindelsen angår som nævnt også hybridvektorer, som indeholder en promotor og en DNA sekvens ifølge opfindelsen, hvilken DNA sekvens er under transskriptionel kontrol af 30 promotoren.

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen er valgt blandt gruppen bestående af et hybridpiasmid og en lineær DNA vektor og er endvidere udvalgt afhængigt af den værtsorganisme, 35 som er udset til tranformering.

Promotorer fra pattedyrceller er eksempelvis virus promotorer, såsom HTLV, SV40, vaccinia promotor og lignende.

23 DK 174977 B1 5 Promotorer for gær, som er de mest foretrukne værtsorganismer ifølge den foreliggende opfindelse, er afledt af det genome DNA fra gær, især fra Saccharomyces cerevisiae. Fortrinsvis anvendes promotoren fra et kraftigt udtrykt gærgen til ekspressionen af t-PA mutanter. Der kan således 10 anvendes promotoren for TRP1 genet, ADHI eller ADHII genet, sur phosphatase (PH05) genet, isocytochrom c genet eller en promotor for generne, som koder for glycolytiske enzymer, såsom promotoren for enolasegenet, glyceraldehyd- 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)-genet, 3-phosphoglycerat-15 kinase (PGK)-genet, hexokinasegenet, pyruvatdecarboxylasegenet, phosphofructokinasegenet, glucose-6-phosphat-isomerasegenet, 3-phosphoglyceratmutasegenet, pyruvat- kinasegenet, triosephosphatisomerasegenet, phosphoglucose-isomerasegenet, invertasegenet og glucokinasegenet, eller 20 en promotor for de gærparrende pheromongener, som koder for a- eller α-faktoren. Foretrukne vektorer ifølge opfindelsen indeholder promotorer med transskriptionel kontrol. Promotorer af denne type, f.eks. promotoren for PH05 genet, kan tilkobles eller frakobles ved at variere 25 vækstbetingelserne. Eksempelvis kan PH05 promotoren frakobles eller tilkobles efter ønske, alene ved at forøge eller formindske koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet. Promotoren kan således frakobles under den eksponentielle vækstfase hos gæren og kan være tilkoblet 30 (derepressed) kun under den tidlige stationære fase ved maksimal celletæthed, hvilket tillader ekspression af genet kontrolleret af PH05 promotoren. Denne egenskab kombineret med et højt transskriptionsniveau gør PH05 promotoren til den foretrukne promotor ved den forelig-35 gende opfindelse.

I hybridvektorerne ifølge opfindelsen er promotoren opera- 24 DK 174977 B1 belt bundet til mutant t-PA kodningsområdet for at sikre effektiv ekspression af mutant t-PA’en. Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen er promotoren bundet direk-5 te til kodningsområdet for den modne t-PA mutant med et translationsstartsignal (ATG) indsat ved samlingsstedet.

Ved en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen, især når der anvendes gær som værtsorganisme, indgår en signalsekvens i konstruktionen. Egnede signalsekvenser er 10 sådanne, som er naturligt bundet til den anvendte promotor, især PH05- eller invertasesignalsekvensen, eller t-PA signalsekvensen. Andre signalsekvenser, såsom signalsekvenserne for gærinvertase- eller α-faktorgenerne, kan også anvendes. Eventuelt kan fusionerede signalsekvenser 15 dannes ved ligering af en del af signalsekvensen for genet, som er naturligt bundet til den anvendte promotor med en del af t-PA signalsekvensen. Der foretrækkes sådanne kombinationer, som tillader en præcis spaltning mellem signalsekvensen og den modne t-PA aminosyresekvens.

20 Der kan også anvendes yderligere sekvenser, såsom pro-eller spacer-sekvenser, der eventuelt kan bære specifikke processing signaler, i konstruktionerne for at lette nøjagtig processing af precursormolekyler. Eventuelt kan der dannes fusionerede proteiner indeholdende indre 25 processing signaler, som tillader korrekt modning in vivo eller in vitro. Fortrinsvis indeholder processing signalerne en Lys-Arg-rest, som genkendes af en gærendopepti-dase anbragt i Golgimembranerne. Efter ekspression af mutant t-PA genet træder genproduktet ind i sekretions-30 vejen og transporteres til det periplasmiske rum. Hvis der kan ske yderligere udskillelse gennem cellevæggen til dyrkningsmediet, er det muligt at opnå en betydelig udbytteforøgelse. Endvidere kan udvindingsprocessen simplificeres, når cellerne ikke skal sprænges.

35 Fortrinsvis indeholder hybridvektorerne ifølge opfindelsen 3'-flankeringssekvensen for et gen, som indeholder de 25 DK 174977 B1 rigtige signaler for transskriptionsterminering og poly-adenylering. Egnede 3'-flankeringssekvenser er f.eks. sådanne for genet, som naturligt er bundet til den anvend-5 te promotor, i tilfælde af gær især flankeringssekvenser for PH05 genet.

Opfindelsen angår især en lineær DNA vektor bestående af en DNA sekvens ifølge opfindelsen, eventuelt indeholdende en 10 signalsekvens, flankeret af sekvenser, som forekommer naturligt i et kromosomalt gen, såsom promotorområdet for et værtskromosomalt gen ved 5'-enden og (del af) 3'-flankeringsområdet for genet ved 3'-enden. Opfindelsen angår især et lineært DNA indeholdende gær PH05 promotoren, mutant t-PA 15 kodningsområdet og PH05 3'-f1ankeringsområdet.

Som følge af de homologe 3'- og 5’-flankeringssekvenser integreres hele den lineære DNA vektor inklusive mutant t-PA genet stabilt i det pågældende værtskromosom, dvs. i 20 tilfælde af gær PH05 promotoren og 3'-flankeringssekvenserne for gær PH05 genet ved PH05 stedet i gærkromosom IX.

*

Opfindelsen angår også især cirkulære hybridpiasmider, som bortset fra promotoren, en DNA sekvens, som koder for et 25 humant mutant t-PA protein ifølge opfindelsen, eventuelt indeholdende en signalsekvens, og 31-flankeringssekvenser indeholder en eller flere DNA sekvenser, som er inessentielle eller mindre vigtige for promotorens funktion, dvs. for ekspressionen af det modificerede t-PA kodningsområde, men 30 som udfører vigtige funktioner, f.eks. ved propageringen af cellerne transformeret med hybridpiasmiderne. Den eller de yderligere DNA sekvenser kan være afledt af prokaryotiske og/eller eukaryotiske celler og kan indeholde kromosomale og/eller ekstrakromosomale DNA sekvenser. De yderligere DNA 35 26 DK 174977 B1 sekvenser kan eksempelvis stamme fra (eller bestå af) plasmid DNA, såsom bakterielt eller eukaryotisk plasmid DNA, virus DNA og/eller kromosomalt DNA, såsom bakterielt DNA, gær DNA eller højere eukaryotisk kromosomalt DNA.

5 Foretrukne hybridplasmider indeholder yderligere DNA

sekvenser afledt af bakteriepiasmider, især Escherichia coli plasmid pBR322 eller beslægtede plasmider, bakterio-phag X, gær 2μ plasmid, og/eller gær kromosomalt DNA.

10 i de foretrukne hybridplasmider ifølge opfindelsen bærer de yderligere DNA sekvenser et gærreplikationsorigin og en selektiv genetisk markør for gær. Hybridplasmider indeholdende et gærreplikationsorigin, f.eks. et autonomt replicerende segment (ars), opretholdes ekstrakromosomalt i 15 gærcellen efter transformation og repliceres autonomt efter mitose. Hybridplasmider indeholdende sekvenser, som er homologe til gær 2μ plasmid DNA, kan også anvendes. Disse hybridplasmider vil blive integreret ved rekombination i 2μ plasmider, som allerede findes i cellen, eller 20 vil replicere autonomt. 2μ sekvenser er især egnede til højfrekvens transformationsplasmider og giver anledning til høje kopital.

Endvidere kan de foretrukne hybridplasmider ifølge opfin-2 5 delsen indeholde en DNA sekvens som en del af et gen, der foreligger i værtsgærkromosomet, f.eks. PH05 genet eller dets promotor bundet til mutant t-PA kodningsområdet. Som følge af den homologe sekvens, som bør udgøre et stræk på ca. 20 til 100 deoxynucleotider, kan hele plasmidet eller 30 lineære fragmenter deraf inkorporeres stabilt i værts kromosomet ved rekombination. Under propageringen vil afkomstcellerne således bevare det indførte genetiske materiale selv uden selektionstryk.

35 27 DK 174977 B1

Hvad angår den selektive genmarkør for gær, kan der anvendes et hvilken som helst markørgen, som leder selektionen for transformanter som følge af den pheno-5 typiske ekspression af markøren. Egnede markører for gær er især sådanne, som udtrykker antibiotisk resistens eller, i tilfælde af auxotrofe gærmutanter, gener, som komplementerer værtslæsioner. Tilsvarende gener bibringer f.eks. resistens mod antibiotiket cycloheximid eller 10 tilvejebringer prototrofi i en auxotrof gærmutant, f.eks. URA3, LEU2, HIS3 eller TRP1 genet. Det er også muligt som markører at anvende strukturgener, som er forbundet med et * autonomt replicerende segment, forudsat at værten, som skal transformeres, er auxotrof for produktet udtrykt ved 15 hjælp af markøren.

Fordelagtigt indeholder de yderligere DNA sekvenser, som findes i hybridpiasmideme ifølge opfindelsen, også et replikationsorigin og en selektiv genetisk markør for en 20 bakterievært, især Escherichia coli. Der er fordele forbundet med forekomsten af et E. coli replikationsorigin og en E. coli markør i et gærhybridplasmid. For det første kan der opnås store mængder hybridplasmid DNA ved vækst og forstærkning i E. coli, og for det andet gennemføres kon-25 struktionen af hybridpiasmider hensigtsmæssigt i E. coli under anvendelse af alle aspekter af kloningsteknologi baseret på E. coli. E. coli plasmider, såsom pBR322 og lignende, indeholder både E. coli replikationsorigin og E. coli genetiske markører, som bibringer resistens over-30 for antibiotika, f.eks. tetracyclin og ampicillin, og de anvendes fordelagtigt som en del af gærhybridvektorerne.

De yderligere DNA sekvenser, som eksempelvis indeholder replikationsorigin og genetiske markører for gær og en 35 28 DK 174977 B1 bakterievært (se ovenfor), betegnes i det følgende som "vektor DNA", som sammen med gærpromotoren og mutant t-PA kodningsområdet danner et hybridplasmid ifølge opfindelsen.

5

En foretrukken udførelsesform for opfindelsen angår hybridplasmider, som kan replicere autonomt i en gærværts-stamme, og som har selektable markører, og lineære DNA'er, som integrerer i værtskromosomet indeholdende en 10 gærpromotor og en DNA sekvens, der koder for et humant mutant t-PA protein ifølge opfindelsen, hvilken DNA sekvens er anbragt sammen med transskriptionsstart- og -terminerings-signaler samt indkodet translationsstart- og -stopsignaler i hybridvektoren under kontrol af promotoren, således at den 15 i en transformeret gærstamme udtrykkes til dannelse af mutant vævpiasminogenaktivatoren.

De foretrukne hybridvektorer ifølge opfindelsen fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte fremgangs-20 måder, f.eks. ved at sammenkæde en gærpromotor, et mutant t-PA kodningsområde, 3'-flankeringssekvensen for et gærgen og eventuelt vektor DNA.

Til fremstillingen af hybridplasmider kan der anvendes 25 hensigtsmæssigt kortlagt cirkulært vektor DNA, f.eks. bakterielt plasmid DNA eller lignende (se ovenfor), som har mindst ét restriktionssted, fortrinsvis to eller flere restriktionssteder. Det er fordelagtigt, at vektor DNA'et allerede indeholder replikationsoriginer og genmarkører 30 for gær og/eller en bakterievært. Vektor DNA'et spaltes ved anvendelse af en passende restriktionsendonuclease.

Det spaltede DNA ligeres til DNA fragmentet, som indeholder gærpromotoren og DNA segmentet, som koder for mutant 35 29 DK 174977 B1 t-PA'en. Inden eller efter bindingen af promotoren og mutant t-PA kodningsområdet (eller samtidig dermed) er det også muligt at indføre replikationsoriginer og/eller 5 markører for gær eller en bakterievært. I alle tilfælde skal restriktions- og ligeringsbetingelserne vælges således, at der ikke sker nogen påvirkning af de væsentlige funktioner for vektor DNA'et og promotoren. Hybridvektoren kan være opbygget af sekvenser eller ved lige-10 ring af to DNA segmenter, som indeholder alle de pågældende sekvenser.

Der kan anvendes forskellige teknikker til sammenføjning af DNA segmenter in vitro. Korte ender (helt baseparrede DNA duplexer) dannet véd anvendelse af visse restrik-15 tionsendonucleaser kan ligeres direkte med T4 DNA ligase.

Det er mere almindeligt, at DNA segmenter sammenbindes gennem deres enkeltstrengede klæbrige ender og lukkes covalent ved anvendelse af en DNA ligase, f.eks. T4 DNA ligase. Sådanne enkeltstrengede såkaldte "klæbrige ender" 20 kan dannes ved at spalte DNA med en anden type endo-nucleaser, som danner forskudte ender (de to strenge i DNA dobbeltstrengen spaltes forskellige steder med en afstand på nogle få nucleotider). Enkeltstrengede ender kan også dannes ved addition af nucleotider til korte ender eller 25 forskudte ender under anvendelse af terminal transferase ("homopolymer tailing") eller ved simpelthen at fraspalte den ene streng af et DNA segment med kort kæde med en egnet exonuclease, f.eks. X exonuclease. En anden fremgangsmåde til fremstilling af forskudte ender består i at 30 ligere et kemisk fremstillet linker DNA, som indeholder et genkendelsessted for en endonuclease, der danner forskudte ender, til et DNA segment med korte ender, hvorpå det dannede DNA spaltes med den pågældende endonuclease.

Komponenterne i hybridvektoren ifølge opfindelsen, såsom 30 DK 174977 B1 gærpromotoren, strukturgenet for mutant t-PA'en eventuelt Indeholdende en signalsekvens, transskriptionsterminator, replikationssysternet osv., bindes sammen i en forudbestemt 5 rækkefølge for at sikre korrekt funktion. Komponenterne sammenbindes gennem fælles restriktionssteder eller ved hjælp af syntetiske bindermolekyler for at sikre korrekt orientering og rækkefølge af komponenterne.

En lineær DNA vektor fremstilles under anvendelse af 10 kendte fremgangsmåder, f.eks. ved at binde den ovenfor omtalte gærpromotor til mutant t-PA kodningsområdet på en sådan måde, at mutant t-PA kodningsområdet kontrolleres af promotoren, og at forsyne det dannede DNA med et DNA segment, som indeholder transskriptionsstopsignaler 15 afledt af et gærgen.

Sammenføjningen af DNA segmenterne kan gennemføres som beskrevet i detaljer ovenfor, nemlig ved kortendeligering, gennem klæbrige ender eller gennem kemisk fremstillede binder DNA'er. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

For at blive udtrykt effektivt skal især mutant t-PA genet 2 være korrekt anbragt med hensyn til sekvenser, som inde 3 holder transskriptionens (gærpromotor) funktioner og 4 translationelle funktioner (ribosombindingssteder). For 5 det første skal ligeringen af DNA segmentet, som indehol- 6 der promotoren, med mutant t-PA kodningsområdet gennem 7 føres i den korrekte orientering. Hvis der er mulighed for 8 to orienteringer, bestemmes den korrekte orientering ved 9 konventionel restriktionsanalyse. Hybridvektorer, som 10 indeholder et indsat mutant t-PA gen med forkert oriente- 11 ring, omorienteres ved fraspaltning af det indsatte gen med en egnet restriktionsendonuclease og genligeres med hybridvektorfragmentet. I alle tilfælde undgås forkert orientering ved ligering af to DNA segmenter, som begge har forskellige restriktionssteder ved enderne. Endvidere 31 DK 174977 B1 bør dannelsen af hybridvektoren gennemføres på en sådan måde, at den tillader korrekt transskriptionsstart og transskriptionsstop. Hvad angår transskriptionsstop bør 5 transskriptet fortrinsvis ende i en DNA sekvens afledt af kromosomal gær DNA eller gær 2μ plasmid. For det andet skal der dannes en korrekt aflæsningsstruktur. Almindeligvis kendes nucleotidsekvensen for promotorområdet og mutant t-PA kodningsområdet inden ligeringen, eller den 10 kan let bestemmes, således at der ikke er problemer med at fastlægge den korrekte aflæsningsstruktur.

Når der ønskes ekspression af det modne mutant t-PA til akkumulering i cytoplasmaet, skal signalsekvenser eller dele deraf, som eventuelt følger efter promotorområdet 15 og/eller eventuelt ligger forud for kodningsområdet for modent mutant t-PA, elimineres, f.eks. ved spaltning med en exonuclease, f.eks. med Bal31. Et foretrukket område til direkte binding af en gærpromotor til mutant t-PA kodningssekvensen er mellem hoved mRNA starten og ATG*en 20 for genet, som er naturligt bundet til gærpromotoren. Til binding i dette område bør mutant t-PA kodningssekvensen indeholde sin egen ATG til translationsstart, da den ellers skal forsynes med et yderligere syntetisk oligo-nucleotid. Gærpromotoren kan også bindes til mutant t-PA 25 kodningssekvensen ved hjælp af et syntetisk oligodeoxy-ribonucleotid som forbindelsesmolekyle. Promotorregionen kan således eventuelt spaltes nær 3'-enden, således at den mangler et forudbestemt antal basepar. På tilsvarende måde kan mutant t-PA kodningssekvensen spaltes nær sin 5' -30 ende. Der kan derpå dannes et syntetisk oligodeoxy-nucleotid på en sådan måde, at når gærpromotoren og mutant t-PA kodningssekvensen sammenbindes over forbin-delsesoligodeoxynucleotidet, gendannes de manglende basepar, herunder et ATG translationsstartsignal, og mutant 35 t-PA kodningssekvensen har den korrekte aflæsningsstruktur i forhold til ATG startcodonet.

32 DK 174977 B1 4. Transformation af værtsorganismer med hybridvektorer, som indeholder en mutant t-PA kodningssekvens.

5 Et andet aspekt af opfindelsen omfatter transformerede eukaryote værtsorganismer, som indeholder en DNA sekvens, der koder for et mutant t-PA protein ifølge opfindelsen.

Egnede eukaryote værtsorganismer er især de ovenfor 10 anførte, specielt gær omfattende arter af slægterne Kluyveromyces, Candida, Rhodotorula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis og beslægtede slægter, jævnfør J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam 1971, især stammer af Saccharomyces cerevisiae.

15

De transformerede eukaryote værtsorganismer er udvalgt fra en værtsorganisme transformeret med et hybridplasmid, som indeholder en promotor og en DNA sekvens, der koder for et humant mutant t-PA protein ifølge opfindelsen, hvilken DNA 20 sekvens er under transskriptionel kontrol af promotoren, og en værtsorganisme, hvori DNA sekvensen er stabilt integreret i et værtskromosom og under transskriptionel kontrol af en kromosomal værtspromotor. 1 2 3 4 5 6 35

Fremgangsmåden til fremstillingen af de transformerede 2 eukaryote værtsceller omfatter transformering af eukaryote 3 værtsceller med en hybridvektor indeholdende en promotor 4

og en DNA sekvens, som koder for et humant mutant t-PA

5 protein ifølge opfindelsen, hvilken DNA sekvens er under 6 transskriptionel kontrol af promotoren.

33 DK 174977 B1

Transformationen af de eukaryote værtsceller gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Transformeringen af gæren med hybridvektorerne kan eksempelvis 5 gennemføres under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al.# Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978). Denne fremgangsmåde kan opdeles i tre trin: (1) Fjernelse af gærcellevæggen eller dele deraf.

(2) Behandling af de "nøgne" gærceller (sfæroplastere) med 10 det transformerende DNA i nærværelse af polyethylenglycol (PEG) og Ca2+-ioner.

(3) Regenerering af cellevæggen og selektion af de transformerede celler i et fast agarlag.

15 Foretrukne fremgangsmåder: ad (1): Gærcellevæggen fjernes enzymatisk under anvendelse af forskellige glucosidasepræparater, såsom snegletarm-saft, f.eks. "Glusulase"® eller "Helicase"®, eller enzymblandinger udvundet fra mikroorganismer, f.eks.

20 "Zymolyase”®, i osmotisk stabile opløsninger, f.eks. 1 M sorbitol.

ad (2): Gærsfæroplasterne sammenklumper i nærværelse af PEG, og der induceres lokale sammensmeltninger af cyto-25 plasmamembranerne. Tilvejebringelsen af "fusionsagtige" tilstande er afgørende, og mange transformerede gærceller bliver diploide eller endog triploide under transformeringsprocessen. Metoder, som tillader selektion af sammensmeltede sfæroplastere kan anvendes til opkoncen-30 trering af transformanter, dvs. transformerede celler, som der let kan screenes for blandt forudvalgte fusionsprodukter.

ad (3): Da gærceller uden cellevæg ikke deler sig, skal 35 34 DK 174977 B1 cellevæggen regenereres. Denne regenerering gennemføres hensigtsmæssigt ved at indlejre sfæroplasterne i agar. Eksempelvis kan smeltet agar (ca. 50°C) blandes med 5 sfæroplasterne. Efter afkøling af opløsningen til væksttemperaturer for gær (ca. 30eC), dannes et fast lag. Dette agarlag skal forhindre hurtig diffusion og tab af vigtige makromolekyler fra sfæroplasterne og derved lette regenereringen af cellevæggen. Regenerering af cellevæggen 10 kan imidlertid også opnås (dog med lavere effektivitet) ved udspredning af sfæroplasterne på overfladen af præformede agarlag.

Fortrinsvis fremstilles regenereringsagaren på en sådan måde, at der på samme tid opnås regenerering og selektion 15 af transformerede celler. Da gærgener, som koder for enzymer, der indgår i aminosyrebiosyntesen, sædvanligvis anvendes som selektive markører (se ovenfor), gennemføres regenereringen fortrinsvis i minimalt gæragarmedium. Hvis der kræves meget høj regenereringseffektivitet, er følgen-20 de to-trins metode fordelagtig: (1) regenerering af cellevæggen i et rigt komplekst medium, og (2) selektion af de transformerede celler ved kopieringsudpladning af cellelaget på selektive agarplader.

Hvis hybridvektoren ikke indeholder noget markørgen, kan 25 de transformerede celler også identificeres ved hjælp af andre metoder. Sådanne metoder indbefatter f.eks. in situ hybridisering med et mærket DNA fragment, som homologt til sekvenserne i hybridvektoren, f.eks. i overensstemmelse med Hinnen et al., se ovenfor, in situ immunoanalyser 30 forudsat at et antistof for produktet dannet af det indførte gen er tilgængeligt, eller andre screeningsmetoder, som måler genprodukter, som er indkodet ved hjælp af det eller de transformerende plasmider.

Eventuelt kan gæren cotransformeres med en hybridvektor 35 DK 174977 B1 ifølge opfindelsen og en anden vektor indeholdende en genmarkør for gær. Hvis de to forskellige vektorer har fælles DNA sekvenser (disse kan være bakterielle sekvenser 5 på vektorerne), foregår der rekombination, som fører til et fusioneret selekterbart hybridmolekyle.

Gæren kan også cotransformeres med en lineær DNA vektor bestående af gærpromotoren, mutant t-PA kodningsområdet eventuelt indeholdende en signalsekvens kontrolleret af 10 promotoren og transskriptionsstopsignaler for et gærgen, og en vektor indeholdende en selektiv markør for gær. Co-transformering muliggør opkoncentrering af de gærceller, som har optaget DNA, som der ikke kan selekteres direkte for. Da kompetente celler optager alle typer DNA, vil en 15 stor procentdel af celler transformeret med en selektiv vektor også indeholde eventuelt yderligere DNA, såsom den ovenfor omtalte lineære DNA vektor. Som følge af tilstrækkeligt lange homologe sekvenser, f.eks. deoxynucleotider med en længde på ca. 20-100, vil polypeptidgenet være 20 stabilt integreret i værtskromosomet.

De transformerede eukaryote værtsorganismer, især de transformerede gærstammer, som indeholder hybridpiasmiderne ifølge opfindelsen, eller som har den lineære DNA vektor indeholdende mutant t-PA genet integreret stabilt i 25 en værtskromosom, kan forbedres med hensyn til fremstilling af mutant t-PA ved mutation og selektion under anvendelse af kendte metoder. Mutationen kan eksempelvis opnås ved hjælp af bestråling med ultraviolet lys eller ved behandling med egnede kemiske midler. Det foretrækkes 30 især at fremstille mutanter, som mangler protease, især gærmutanter, for at undgå proteolytisk nedbrydning af det dannede mutant t-PA i cellerne.

5. Farmaceutiske præparater.

De omhandlede, hidtil ukendte mutant t-PA proteiner, som 36 DK 174977 B1 fortrinsvis foreligger på énkædeformen, har værdifulde farmakologiske egenskaber. De kan anvendes på samme måde som kendte plasminogenaktivatorer i mennesker til fore-5 byggelse eller behandling af thrombose eller andre tilstande, hvor der ønskes frembragt lokal fibrinolytisk eller proteolytisk virkning ved hjælp af plasminogen-aktivering, såsom arteriosclerose, myocardial og cerebral infarkt, thrombose i vener, thromboembolisme, postkirur-10 gisk thrombose, thrombophlebitis og diabetiske karsygdomme.

Det har overraskende vist sig, at de omhandlede, hidtil ukendte mutant t-PA proteiner har biologiske virkninger, som er sammenlignelige med eller bedre end virkningerne af 15 helt glycosyleret naturligt t-PA. De hidtil ukendte t-PA mutanter har således fribrinolytisk virkning. De entydige fibrin-rettede egenskaber, dvs. evnen til at aktivere plasminogen udelukkende i nærværelse af fibrin, er fuldstændigt bevaret. Endvidere har de hidtil ukendte protei-20 ner en længere in vivo stabilitet sammenlignet med autentisk t-PA. Tilsyneladende er de hidtil ukendte proteiner, som delvis eller fuldstændigt mangler N-bundne carbon-hydratkæder, mindre følsomme for proteolytisk spaltning end det helt glycosylerede produkt.

25 Bevarelsen af biologisk virkning i glycoproteiner, som mangler carbonhydratrester, kan ikke forudsiges og varie rer. I nogle tilfælde medfører deglycosylering eller endog partiel deglycosylering svækkelse eller mangel på biologisk virkning, jævnfør D.R. Karp et al., J. Biol.

30 Chem. 257, 7330 (1982), H.T. Kentmans et al., Biochemistry 22, 3067 (1983), H.R. Gradnick et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 80, 2771 (1983). De overraskende egenskaber ved mutant t-PA'erne ifølge opfindelsen kan ikke forventes på baggrund af de tidligere opnåede resultater med kemisk 35 eller enzymatisk deglycosyleret t-PA, jævnfør S.P. Little et al., supra og PCT 84/1960, supra, da kemisk eller enzy- 37 DK 174977 B1 matisk behandling af t-PA tydeligvis ikke sikrer et produkt, hvori de N-bundne carbonhydratkæder mangler fuldstændigt, eller hvor i det mindste de N-bundne carbonhydratkæder mangler.

5

Opfindelsen angår således som nævnt også farmaceutiske præparater, som indeholder en terapeutisk virksom mængde af den aktive bestanddel (énkædet eller tokædet mutant t-PA eller blandinger deraf, fortrinsvis den énkædede form) sammen 10 med organiske eller uorganiske, faste eller flydende, farmaceutisk acceptable bærestoffer, som er egnede til parenteral indgift, dvs. intramuskulær, subkutan eller intraperitoneal indgift, og som ikke har skadelig virkning på de aktive bestanddele.

15

Præparaterne kan foreligge i form af egnede infusionsopløsninger, fortrinsvis vandige opløsninger eller suspensioner, som kan fremstilles inden brugen, f.eks. ud fra lyofiliserede præparater, som indeholder den aktive 20 bestanddel alene eller sammen med et bærestof, såsom mannitol, lactose, glucose, albumin og lignende. De farmaceutiske præparater er steriliserede eller kan om ønsket være blandet med hjælpestoffer, f.eks. konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, 25 opløseliggørende stoffer, puffere og/eller salte til regulering af det osmotiske tryk. Sterilisering kan gennemføres ved sterilfiltrering gennem filtre med lille porestørrelse (0,45 μία i diameter eller mindre), hvorefter præparatet om ønsket kan lyofiliseres. Der kan også til-30 sættes antibiotika for at bevare steriliteten.

De farmaceutiske præparater dispenseres på dosisenhedsform, f.eks. ampuller, som indeholder 1-2000 mg farmaceutisk acceptabelt bærestof pr. dosisenhed og ca. 1-100 mg, 35 fortrinsvis 3-25 mg, af den aktive bestanddel (énkædet eller tokædet mutant t-PA eller blandinger deraf, fortrinsvis på énkædeformen), pr. dosisenhed.

38 DK 174977 B1

Afhængigt af sygdommens type og patientens alder og tilstand ligger den daglige dosis til behandling af en patient med en legemsvægt på ca. 70 kg i området fra 3 til 100 mg, fortrinsvis fra 5 til 50 mg, i døgnet. I tilfælde 5 af myocardial infarkt indgives fortrinsvis en dosis på ca. 30-80 mg i løbet af 60 til 120 minutter, fortrinsvis i tre lige store dele og i løbet af ca. 90 minutter.

Opfindelsen angår især de i de efterfølgende eksempler 10 beskrevne DNA sekvenser, hybridvektorer, transformerede værtsstammer, mutant t-PA proteiner og fremgangsmåderne til deres fremstilling.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under hen-15 visning til tegningen, på hvilken fig. 1 viser DNA sekvensen og tilsvarende aminosyre- sekvenser for t-PA DNA fra HeLa celler. Glycosy-leringsstederne er understreget. Pilene angiver det forventede spaltningssted mellem Arg og Ile, 20 som danner tokædeformen af t-PA ud fra énkæde- formen, fig. 2 viser DNA sekvenserne for de muterede t-PA gener og de tilsvarende aminosyresekvenser for mutant t-PA proteinerne ifølge opfindelsen.

25 fig. 3 viser coagellyseringsvirkningen af mutant t-PA'er nemlig [ Asn11^ ]-t-PA (ret linie 3), [Asn11^,

Aia186 j_t-PA (ret linie 4) og [Asn*^, Ala^·®^,

Asn^SO ]-t-PA (ret linie 5) sammenlignet med autentisk human melanoma t-PA (ret linie 1) og 30 gær vildtype t-PA (ret linie 2), og fig. 4 viser skematisk immunopåvisningen af mutant t-PA'er ved hjælp af såkaldte "Western blots".

35 39 DK 174977 B1

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

5 I eksemplerne anvendes følgende forkortelser: BSA: okseserumalbumin DTT: 1,4-dithiothreitol (l,4-dimercapto-2,3-butandiol) EDTA: ethylendiamintetraeddikesyre 10 PEG: polyethylenglycol 6000 SDS: natriumdodecylsulfat

SSC: opløsning indeholdende 150 mM NaCl, 15 mM

natriumcitrat, 0,5 mM EDTA, indstillet til pH

7,2 med HC1 15 TBE: opløsning indeholdende 90 mM Tris, 90 mM borsyre, 2,5 mM "Titriplex"® TE: opløsning indeholdende 10 mM Tris.HCl (pH 8,0) og 0,1 mM EDTA (pH 8,0)

TNE: opløsning indeholdende 100 mM NaCl, 10 mM

20 Tris.HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA

Tris.HCl:tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, pH indstillet med HCl 25

Eksempel 1

Kloning af et p31/PH05-TPA18 BamHI-Hindlll fragment inde-30 holdende vævplasminogenaktivatorgenet i M13mp8.

a) Plasmidet p31/PH05-TPA18 (beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) har PH05 promotoren 35 40 DK 174977 B1 og PH05 signalsekvensen fusioneret i struktur til t-PA strukturgenet (jævnfør fig. 1). Plasmidet ledes gennem DH-l (F®, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdRl7 (rj|, m$),

5 supE44, X®), en dam® stamme af E. coli. To amp1* kolonier isoleres og dyrkes i 100 ml LB medium indeholdende 100 jig/ml ampicillin. Plasmid DNA isoleres fra cellerne. Restriktionsenzymspaltninger med BamHI og HindiII

(Boehringer) viser den korrekte størrelse af t-PA gen 10 indsætningsdelen, som bekræftes ved hjælp af restriktionsmønsteret fra spaltningen med PstI (Boehringer).

b) Tre μς p31/PH05-TPA18 fra E. coli stamme DH-l inkuberes ved 37eC i 60 minutter med 20 E Hindlll (Boehringer, 20 E/μΙ) i 50 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 15 50 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol. En alikvot kontrolleres på en 1%'s agarosegel i TBE puffer til bekræftelse af fuldstændig nedbrydning. Nedbrydningsblandingen inkuberes ved 65eC i 10 minutter. Derpå tilsættes 0,5 μΐ 5 M NaCl efterfulgt af 18 E BamHI (Boehringer, 18 E/μΙ). Denne 20 blanding inkuberes ved 37eC i 60 minutter. En analyse af en alikvot på en 1%'s agarosegel i TBE puffer viser 2,3 Kb indsætningsdelen foruden 3,6 Kb vektorfragmentet. Indsætningsdelen isoleres på en 0,8%'s præparativ agarosegel. Gelskiven overføres til et "Micro-Colloidon"© rør 25 (Sartorius GmbH), dækkes med 100 μΐ TE og elektroelueres (elektroforese ved 90 mA i 50 minutter). TE-opløsningen samles i et siliconebehandlet rør. DNA*et fældes med 2,5 rumfang absolut ethanol efter tilsætning af 0,1 rumfang lOxTNE. DNA-kuglen vaskes med koldt 80%'s ethanol og 30 tørres i vakuum. DNA'et opslæmmes i 20 μΐ TE (13 fmol/μΐ).

c) Tre μg M13mp8 (RF-form) spaltes med Hindlll og BamHI, og 7,3 Kb fragmentet isoleres på en 0,8%'s præparativ agarosegel, elektroelueres og fældes som beskrevet ovenfor. DNA'et opslæmmes i 20 μΐ TE (30,8 fmol/jil).

41 DK 174977 B1 d) 92 fmol M13mp8 BamHI-Hindlll skåret vektor og 130 fmol BamHI-Hindlll t-PA indsætningsdel ligeres i 20 μ1 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 1 μς 5 Gelatin (Sigma) med 400 E T4 DNA ligase (New England Bio Labs, 400 E/μΙ) i 18 timer ved 15eC. Efter inkubering ved 65°C i 10 minutter fortyndes en alikvot på 1 μΐ af ligeringsblandingen (1:10 med TE). 2 μΐ og 8 μΐ af denne fortyndede ligeringsblanding anvendes til transformation 10 af E. coli JM101 Ca^+ celler i overensstemmelse med håndbogen "M13 Cloning and sequencing handbook" udgivet af Amersham. Fra de 200 farveløse plak (8 μΐ, 1:10 fortyndet ligeringsblanding), udtages 25, og der fremstilles énkeltstrenget DNA og DNA på replikativ form (RF), jævnfør 15 J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 21-78 (1983). Ved analyse af RF-DNA viser to kloner den korrekte størrelse af den indsatte del (2,3 Kb BamHI-Hindlll t-PA genfragment). Disse to kloner indeholdende t-PA genet med PH05 promotoren og terminatoren analyseres yderligere. Spalt-20 ningerne med PstI, Hindlll-EcoRI, BamHI-EcoRI bekræfter tilstedeværelsen af 2,3 Kb fragmentet, én af klonerne anvendes til yderligere konstruktioner og betegnes p8A-7.

«Γ

Eksempel 2

Mutation af det første glycosYleringssted ved Asn 117 25 under anvendelse af enkeltstrenget p8A-7.

117 119

Asn -SerI SerI

kodende streng 5» 3* for t-PA .7.TGO AAC AGC AGC GCG TTG GCC ...

mutagen primer X C TTG TCG TTG CGC AAC c muteret kodende streng · · · TGG AAC AGC AAC GCG TTG GCC ...

Asn Ser [Asn| I

42 DK 174977 B1

Alle mutagenprimere og sekvenseringsprimere syntetiseres under anvendelse af phosphorami ditmetoden, jævnfør M.H. Caruthers, Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene 5 Fragments (H.G. Gassen og A. Lang, udg.) Verlag Chemie, Weinheim, Vesttyskland, på et synteseapparat fra Applied Biosystems (Model 380B).

Der fremstilles følgende sekvenseringsprimere:

Sekvenseringsprimer I dGCCCAGCCTGATGGCGT

Sekvenseringsprimer II dCCACGGGAGGCAGGAGG

Sekvenseringsprimer III dCAGCACGTGGCACCAGG

Sekvenseringsprimer IV dTGGCAGGCGTCGTGCAA

Universal Ml3 sekvenseringsprimer dGTAAAACGACGGCCAGT 1 2 3 4 5 6 a) Phophorylering af mutagenprimer: 2 200 pmol af mutagenprimeren I phosphoryleres i 20 /ti 3

50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM

4 spermidin, 0,1 mM EDTA indeholdende 1 /il 10 mM ATP under 5 anvendelse af 8 E T4 polynucleotidkinase (Boehringer, 6 8 E/μΙ). Efter inkubering ved 37#C i 45 minutter afbrydes reaktionen ved opvarmning til 65eC i 10 minutter.

43 DK 174977 B1 b) Annellering af mutagenprimer I og universel sekvenseringsprimer til enkeltstrenget skabelon eller templat p8A-7: 5 0,88 pg (123 fmol) enkeltstrenget templat p8A-7 inkuberes med 20 pmol phosphoryleret mutagent oligodeoxyribo-nucleotid I (10 pmol/μΐ) og 10 pmol universal M13 sekvenseringsprimer i 10 μΐ 20 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT ved 55°C i 5 minutter, hvorpå der 10 afkøles til stuetemperatur i 5 minutter.

c) Forlængelsesligeringsreaktion:

Til den ovenfor beskrevne annellerede blanding sættes 10 μΐ enzym-dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) opløsning indeholdende 1 μΐ puffer (0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M 15 MgCl2, 0,1 M DTT), 4 μΐ 2,5 mM dNTP blanding, 1 μ 10 BH γ-ΑΤΡ, 1,4 μΐ T4DNA ligase (Amersham, 2,5 Ε/μ1), 0,6 μΐ

Klenow DNA polymerase (BRL, 2,99 E/μΙ). Blandingen inkuberes ved 15°C i 8 timer. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter.

20 d) Transformering af ligeringsblanding:

Ligeringsblandingen fortyndes med TE i forholdet 1:20 og 1:200. 1 fil og 5 μΐ af hver. af disse fortyndede opløsninger anvendes til transformering af 0,2 ml E. coli JM101 kompetente celler [J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 25 21-78 (1983)]. 36 plak udtages, phagerne isoleres ved PEG-fældning og genopløses i 50 μΐ TE (0,1-0,16 μg/μl).

e) Screening af phager: 2 μΐ phag DNA afsættes som pletter på tørt nitrocellulosepapir (Millipore S.A., katalog nr. HAWP090, porestørrelse 30 0,45 μΐη). Efter tørring i luften opvarmes filteret ved 80eC i 2 timer i vakuum.

Filteret præhybridiseres med 5 ml 6xSSC, lOxDenhardt (0,2% BSA, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll), 0,2% SDS ved 67*C i 1 time i en varmeforseglelig pose.

44 DK 174977 B1

Filteret udtages og skylles med 50 ml 6xSSC ved stuetemperatur i 1 minut. Filteret anbringes i en forseglelig pose. 3 ml 6xSSC, lOxDenhardt og 100 μΐ 1 2 3 4 5 6 7 8P-mærket 5 mutagenprimer I (5xl03 cpm) tilsættes.

Fosen opbevares ved stuetemperatur i 1 time. Filteret udtages og vaskes med 6xSSC (50 ml x 3) i i alt 10 minutter ved stuetemperatur. Filteret autoradiograferes i 1 time ved -70°C med forstærkerskærm. Filteret vaskes ved 10 50eC med 6xSSC (50 ml) og autoradiograferes ved -70eC i 1 time med forstærkerskærm.

Filteret vaskes ved 60eC med 6xSSC (50 ml) og autoradiograferes ved -70°C i 2 timer med forstærkerskærme. På det 60°C vaskede filter findes 5 kloner med mutationer efter 15 begyndelsesscreening.

f) Sekvensering:

Mutering af AGC kodonet (Serll9) til AAC kodonet (Asnll9) bekræftes for én positiv klon ved DNA sekvensbestemmelse med sekvenseringsprimer I under anvendelse af kædeter-20 minatormetoden, jævnfør F. Sanger, S. Nickler og A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977). Muteringen af DNA'et resulterer i en Ser->Asn ændring i aminosyreposition 119 i moden t-PA ([Asn^-^]-t-PA).

g) Plakrensning: 2

Den positive klon med betegnelsen p8A-7-M01 plakrenses.

3

Phagstammematerialet fortyndes (1:10*7, 103, 10^), anbrin 4 ges på YT plader og inkuberes natten over ved 37eC. Der 5 efter udtages plak, phager isoleres, hvorpå der screenes 6 med 8P-mærket mutagenprimer I. DNA fra 7 ud af de 7 10 phager har den ønskede mutation, jævnfør fig. 2. Fra en af disse, p8A-7-M01 fremstilles RF-DNA, som anvendes til 8 kloning i pJDB207.

Eksempel 3 45 DK 174977 B1

Mutering af det andet glycosyleringssted ved Asn 184 under anvendelse af enkeltstrenget p8A-7.

184 186

Aan GlyI Seri kodende streng .?.ggg AAT GGG TCA GCC TAC CGT3!..

5 mutagen primer II 3 CC TTA CCC CGT CGG ATG5 muteret kodende streng .3.GGG AAT GGG GCA GCC TAC CGT3 ...

Asn Gly1Alal

Der foretages phosphorylering af primer II, annellering, forlængelsesligering og transformation på nøjagtig samme måde som beskrevet i eksempel 2. Der udtages 36 plak, og phager screenes med mutagenprimer II. Vaske- 10 temperaturerne for filteret er som følger: stuetempe ratur, 50eC og 60eC. Vaskningen ved 60eC viser, at der findes fire mutagene kloner. DNA'et fra én klon sekvenseres med sekvenseringsprimer II, hvilket bekræfter mute- * ringen ved det andet glycosyleringssted, jævnfør fig. 2.

15 Phag fra denne klon plakrenses og screenes for positive mutationer, én af de positive kloner betegnes p8A-7-M02. Muteringen omdanner kodonet TCA (Serl86) til GCA (Alal86), hvilket bevirker en Ser-»Ala ændring i stilling 186 i moden t-PA ([ Ala186 ]-t-PA).

20 Eksempel 4

Mutering af det andet glycosyleringssted ved Asn 184 under anvendelse af enkeltstrenget muteret p8A-7-M01.

Der gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 2 under anvendelse af enkeltstrenget p8A-7-M01 og mutagen-25 primer II. Efter plakrensning og screening betegnes én af 46 DK 174977 B1 de positive kloner p8A-7-M021. DNA'et fra denne klon sekvenseres med sekvenseringsprimere I og II. Mutering ved glycosyleringssteder 117 og 184 bekræftes, jævnfør fig. 2.

5 Kombinationen af to mutationer i DNA'et fører til et mutant t-PA molekyle med to aminosyreændringer ved stillingerne 119 og 186 ([Asn11^, Ala1®® ]-t-PA).

Eksempel 5

Mutering af det fjerde glycosyleringssted ved Asn 448 10 under anvendelse af enkeltstrenget muteret p8A-7-M021 (første konstruktion) 448 450

Asn Arg IThr|Val Thr c« Ol kodende streng .T.ctx AAC aga ACA gtc ACC GAC a. ..

3* 5'

mutagen primer IV GAA TTG TCT TTG CAG TGG CTG T

Cl 3· muteret kodende streng .. .CTT AAC AGA AAC GTC ACC GAC A...

Asn Arg[Asn]Val Thr

Der gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 2 under anvendelse af enkeltstrengede p8A-7-M021 og mutagen-15 primer IV. Vasketemperaturerne for filtrene er som følger: stuetemperatur, 50*C, 60°C og 68eC. 68eC vasken identificerer de positive kloner. Efter plakrensning betegnes én positiv klon p8A-7-M0421. DNA'et fra denne klon underkastes sekvensanalyse med sekvenseringsprimere 20 I, II og IV, som bekræfter mutationer ved glycosylerings-stederne 117, 184 og 448, jævnfør fig. 2. Med tre mutationer på DNA'et har det dannede mutant t-PA molekyle tre aminosyreudskiftninger i stillingerne 119, 186 og 450 ([Asn11^, Ala1®®, Asn^SO ]-t-PA). I denne mutant er der 25 dannet et nyt glycosyleringssted ved det fjerde sted ved at ombytte Thr^SO me(j Asn.

Eksempel 6 47 DK 174977 B1

Mutation af det fjerde glycosyleringssted ved Asn 448 under anvendelse af enkeltstrenget muteret p8A-7-M021 5 (anden konstruktion).

448 450 5' Leu Leu Asn Arg|ThrIVal Thr 3' kodende Streng ·· *TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTC ACC GAC...

mutagen primer 3' 5' primer iv-l 5, aa ttg tct cgt cag tgg 3, muteret kodende .. .TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA GCA GTC ACC GAC...

streng Aen Arg|Ala|Val Thr

Der gås frem på samme måde som beskrevet ovenfor i eksempel 2, idet der anvendes enkeltstrenget p8A-7-M021 og mutagenprimer IV-I. Temperaturerne for filtervaskningeme 10 er som følger: stuetemperatur, 50eC og 60®C i 6xSSC. Efter plakrensning isoleres en af de positive kloner, som betegnes p8A-7-M0421(1). DNA'et fra denne klon sekvenseres under anvendelse af sekvenseringsprimere I, II og IV, hvilket bekræfter mutationerne ved glycosyleringssteder 15 117, 184 og 448, jævnfør fig. 2. Med tre mutationer på DNA’et har det dannede mutant t-PA molekyle tre aminosyre-ombytninger i stillingerne 119, 186 og 450 ([Asn**8,

Ala186, Aia450]-t-PA).

Eksempel 7 48 DK 174977 B1

Mutering af det tredje glycosyleringssted ved Asn 218 under anvendelse af enkeltstrenget muteret p8A-7-M0421(1).

218 220 Asn Pro I Seri kodende streng .?.G AAC CCC AGT GCC CAG G.?.

it et

5 mutagen primer III C TT G GGG TTA CGG GTC C

muteret kodende streng .V.G AAC CCC AAT GCC CAG G.?!

Asn Pro lAsnj I

Oer gås frem på samme måde som beskrevet i eksempel 2, idet man anvender enkeltstrenget p8A-7-M0421(1) og mutagenprimer III. Temperaturerne ved filtervaskningerne er som følger: stuetemperatur, 50eC og 60eC. Vaskningen 10 ved 60°C identificerer de positive kloner. Efter plakrensning isoleres en af de positive kloner, og den betegnes p8A-7-M04321{ 1). DNA'et fra denne klon sekvenseres under anvendelse af sekvenseringsprimere I til IV.

Mutation ved glycosyleringssteder 117, 184, 218 og 448 15 bekræftes, jævnfør fig. 2. De fire mutationer på DNA'et fører til et mutant t-PA molekyle med fire aminosyre-ændringer i stillingerne 119, 186, 220 og 450 ([Asn^^9/

Ala186, Asn220, Ala450 ]-t-PA).

Eksempel 8 20 Kloning af de muterede t-PA genindsætningsdele i pJDB207.

a) Fremstilling af RF-DNA: RF-DNA fremstilles til p8A-7-M01, p8A-7-M02, p8A-7-M021, p8A-7-M0421, p8A-7-M0421(1) og p8A-7-M04321(1) ved anvendelse af den hurtige DNA isoleringsmetode, jævnfør 25 D.S. Holmes og M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981).

49 DK 174977 B1 b) Isolering af indsætningsdele:

De seks RF-DNA * er (0,5 pg) spaltes med 16 E BamHI og 20 E HindiII i 50 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM 5 NaCl, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter tilsætning af 2 μΐ RNase (Serva, 1 mg/ml) og inkubering i

5 minutter ved 37°C isoleres 2,3 Kb indsætningsdelene på en 0,8%'s præparativ agarosegel. DNA’et ekstraheres ved elektroeluering, og efter fældning opløses det i 5 |il TE

10 (46,8 fmol/μΐ).

c) Tre μg pJDB207 spaltes med BamHI og Hindlll, og 6,6 Kb vektoren isoleres. Efter elektroeluering og fældning gen-opløses DNA'et i 20 μΐ TE (35 fmol/μΐ).

d) 140 fmol pJDB207 BamHI-Hindlll spaltet vektor, 234 fmol 15 BamHI-Hindlll muteret t-PA indsætningsdele ligeres i 20 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 1 μg gelatine med 400 E T4 DNA ligase i 16 timer ved 15®C. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65QC i 10 minutter. 2 μΐ og 5 μΐ af disse ligeringsblandinger anven-20 des til transformation af E. coli HB101 calcium^* celler, jævnfør M. Dagert og S.D. Ehrlich, Gene 6, 23-28 (1979).

6 ampR-kolonier udtages fra hver af de seks ligeringer.

DNA fremstilles ved hurtig-isoleringsmetoden. Ved analyse med DNA med BamHI-Hindlll og PstI iagttages bånd med den 25 korrekte størrelse, έη klon fra hver af de fem ligeringer dyrkes i 100 ml LB medium indeholdende 100 /tg/ml ampicillin. Plasmid DNA'er afledt af p8A-7-M01, p8A-7-M02, p8A-7-M021, p8A-7-M0421, p8A-7-M0421(1) og p8A-7- M04321(l) isoleres og betegnes 30 pJDB207/PH05-TPA18-M01, pJDB207/PH05-TPA18-M02, pJDB207/ PH05-TPA18-M021, pJDB207/PHO5-TPA18-MO421, pJDB207/PH05- TPA18-M0421(1) og pJDB207/PH05-TPA18-M04321(1).

Eksempel 9 50 DK 174977 B1

Konstruktion af gærekspressionsvektor indeholdende PH05 promotoren, invertasesignalsekvensen og tPA kodnings-5 området♦ A) Fremstilling af oligodeoxyribonucleotider til invertasesignalsekvens:

Fire oligodeoxyribonucleotider, 1-1, 1-2, 1-3 og 1-4, fremstilles ved hjælp af et DNA syntetiseringsapparat 10 (model 380B fra Applied Biosystems). Efter deblokering renses de syntetiske fragmenter på en 12%'s polyacryl-amidgel indeholdende 8 M urinstof. Der opnås saltfri rene oligodeoxyribonucleotider ved anvendelse af Sep. Pak (Waters Associates). Disse fragmenter udgør en duplex, som 15 koder for invertasesignalsekvensen med de ofte anvendte gærkodoner.

EcoRI Hindlll _MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu I—1 5'AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3’ 1-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

AlaGlyPheAlaAlaLyelleSerAla 1-35'GGCTGGTTTXGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGIC 3' 1-4 3’CAAAACGTCCGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hgal_

Xhol B) Underkloning af invertasesignalsekvensen i plasmid p31 a) Fremstilling af vektor; 20 1,5 /tg p31R/SS-TPAA2, jævnfør beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081, spaltes med 10 E EcoRI (Boehringer) i 50 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter tilsætning af 1 /ti 2,5 M NaCl tilsættes 10 E Xhol 51 DK 174977 B1 (Boehringer), og blandingen inkuberes ved 37°C i 1 time.

4,2 kb vektoren isoleres på en 0,8%'s præparativ agarose-gel. Gelskiven overføres til et "Micro Colloidon"® rør 5 (Sartorius GmbH), dækkes med 200 μΐ TE og elektroelueres (underkastes elektroforese ved 90 mA i 50 minutter). TE-opløsningen isoleres, og der fældes i 2,5 rumfang absolut ethanol efter tilsætning af 0,1 rumfang 10 x TNE. DNA-kuglen vaskes med koldt 80%’s ethanol og tørres i vakuum.

10 DNA'et opslæmmes i 6 μΐ TE (40 pmol/μΐ).

b) Annellering af oligodeoxyribonucleotider (1-1, 1-2, 1-3 og 1-4), kinaserinq og liqering af vektor

En opløsning indeholdende 10 pmol af hvert af de fire deoxyribonucleotider i 10 /il 0,5 M Tris.HCl pH 8 inkuberes 15 ved 95eC i 5 minutter på et vandbad. Vandbadet afkøles langsomt til 30eC i løbet af 5 timer. Til denne annelle-rede blanding sættes 2 μΐ af henholdsvis 0,1 M MgCl2, 0,1 M NaCl, 30 mnM DTT, 4 mM ATP og 8 E (1 μΐ) poly-nucleotidkinase (Boehringer). Kinaseringen gennemføres ved 20 37°C i 1 time. De annellerede, kinaserede oligodeoxyribo nucleotider og 60 pmol p31R/SS-TPAA2 EcoRI-Xhol spaltet vektor (1,5 μΐ) ligeres med 400 E (1 μΐ) T4 DNA ligase (Biolabs) ved 14eC i 17 timer. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65*C i 10 minutter. 10 μΐ af denne lige-25 ringsblanding anvendes til transformering af E. coli HB101 Ca2+ celler, jævnfør M. Dagert og S.D. Ehrlich, Gene 56, 23-28 (1979). 20 amp^ kolonier udtages. DNA fremstilles ved hurtig-isoleringsmetoden, jævnfør D.S. Holmes og

M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981). DNA

30 spaltes med EcoRI og Xhol, mærkes radioaktivt ved EcoRI enden og analyseres på en 6%'s polyacrylamidgel indeholdende 8 M urinstof under anvendelse af radioaktivt mærket pBR322 Haelll spaltet DNA som markør. Der konstateres korrekte båndstørrelser for DNA opnået fra alle 20 kloner.

35 én klon dyrkes i 100 ml LB medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Plasmid DNA isoleres og betegnes p31RIT-12.

52 DK 174977 B1 C) Konstruktion af pJDB207/PHQ5-I-TPA a) Fremstilling af vektor

Tre μg pJDB207/PH05-TPAl8, jævnfør beskrivelsen til 5 europæisk patentansøgning nr. 143.081, inkuberes ved 37eC i 1 time med 10 E BamHI i 50 μ1 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol. En alikvot analyseres på en 1%'s agarosegel i TBE puffer til konstatering af fuldstændig spaltning. Spaltningsblandingen 10 inkuberes ved 65eC i 10 minutter. Derpå tilsættes 0,5 μΐ 5 M NaCl efterfulgt af 15 E Xhol (Boehringer). Blandingen inkuberes ved 37*C i 1 time. 6,8 kb vektoren isoleres på en 0,8%'s præparativ agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering, og efter fældning opløses det i TE.

15 b) Xhol spaltning af p31/PH05-TPA18:

Tredive Mg p31/PH05-TPA18, jævnfør beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081, inkuberes ved 37eC i 1 time med 60 E Xhol (15 E/μΙ) i 200 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol, 20 blandingen ekstraheres med et tilsvarende rumfang phenol-chloroform, og der fældes i ethanol.

c) Partiel PstI spaltning af Xhol spaltet p31/PH05-TPA18

Det fældede Xhol spaltede p31/PH05-TPA18 DNA resuspenderes i 250 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 25 6. mM mercaptoethanol, 2,5 mg ethidiumbromid, blandingen inkuberes ved 37*C i 35 minutter med 22,5 E PstI, og der ekstraheres med et tilsvarende rumfang phenol og derpå med et tilsvarende rumfang chloroform-isoamylalkohol (50:1).

1,6 kb fragmentet isoleres på en 1%'s præparativ agarose-30 gel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering og fældes [ indsætningsdel 1 ].

53 DK 174977 B1 d) Sall-Xhol spaltning af p31RIT-12:

Tredive μg p3lRIT-l2 inkuberes ved 37°C i 1 time med 60 E Sall (Boehringer 12 E/μΙ) og 60 E Xhol (15 E/μΙ) i 200 μΐ 5 10 mM Tris.HCl pH 8, 6 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol, blandingen ekstraheres med et tilsvarende rumfang phenol-chloroform, og der fældes i ethanol.

869 bp fragmentet isoleres på en 1,2%'s præparativ agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering, afsal-10 tes over DE-52, og fældes i ethanol.

e) Hgal spaltning af Sall-Xhol spaltet p31RIT-12

Sall-Xhol spaltet p31RIT-12 opslæmmes i 100 /ti 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM dithio-threitol, 10 mg okseserumalbumin, og blandingen inkuberes 15 ved 37eC i 1 time med 6 E Hgal (Biolabs, 0,5 Ε/μ1). 600 bp fragmentet isoleres på en 1,2%'s agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering og fældes i ethanol.

f) Annellering af binder oligonucleotider 90 pmol af to oligodeoxyribonuciecotider med sekvenserne

PstI

20 5’ CTGCATCTTACCAAGTGATCTGCA 3' 3' AGAATGGTTCACTAG 5' opslæmmes i 10 μΐ 0,5 mM Tris.HCl pH 8 i et silicone-behandlet Eppendorf-rør. Opløsningen inkuberes ved 95®C i 5 minutter, hvorpå den langsomt afkøles til stuetemperatur natten over.

25 g) Kinaserinq af binder

Til den ovenfor fremstillede opløsning sættes 2 μΐ 0,1 M

KC1, 2 μλ 0,1 M MgCl2, 3 /ti 30 mM DTT, 1 μΐ 200 mM ATP, 8 E polynucleotidkinase (8 E/μΙ). Blandingen inkuberes ved 37°C i 1 time.

54 DK 174977 B1 5 h) Ligering af Hgal fragmentet fra p31RIT-12 med den kinaserede binder

Den kinaserede binderopløsning overføres til et rør indeholdende det tørre Hgal fragment, hvorpå der tilsættes 400 E T4 DNA ligase. Opløsningen inkuberes ved stuetem-10 peratur (21-22eC) i 90 minutter, fortyndes til 100 μΐ med TE og ekstraheres med et tilsvarende rumfang phenol-chloroform. Fragmentet fældes ved tilsætning af 0,6 rumfang isopropanol og 0,1 rumfang 3 M natriumacetat ved stuetemperatur til den vandige opløsning.

15 i) BamHI-PstI spaltning af det ovenfor fremstillede DNA

Det ovenfor fremstillede tørre DNA spaltes med 10 E BamHI og 10 E PstI i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter fortynding til 100 μΐ ekstraheres opløsningen med et tilsvarende 20 rumfang phenol-chloroform, og det vandige lag fældes i isopropanol [ indsætningsdel 2].

j) Ligering af de tre fragmenter 100 pmol pJDB207/PH05-TPA18 BamHI-Xhol spaltet vektorfragment, 200 pmol af hvert af de andre to indsætnings-25 fragmenter [1 og 2] ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 E T4 DNA ligase i 16 timer ved 15°C. Reaktionen afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter. 5 μΐ af denne ligeringsblanding anvendes til transformering af 30 E. coli HB101 Ca2+ celler. 10 ampR kolonier udtages, og der fremstilles DNA ved anvendelse af hurtig-isolerings- 55 DK 174977 B1 metoden. Ved analyse med EcoRI, Pst I og BamHI-Hindlll konstateres fragmenter med den korrekte størrelse. Én klon dyrkes 1 100 ml LB medium indeholdende 100 pg/ml 5 ampicillin. Plasmid DNA isoleres og betegnes pJDB207/PH05- I-TPA.

Eksempel 10

Konstruktion af en gærekspressionsvektor indeholdende PH05 promotoren. PH05 signalsekvensen eller invertasesignal-10 sekvensen og tPA kodningsområdet, hvor kun det fjerde glycosyleringssted er fjernet.

BamHI-Hindlll vektorfragmentet af plasmid pJDB207 ligeres med et BamHl-Scal fragment opnået fra pJDB207/PH05-I-TPA eller pJDB207/PH05-TPA18 og et Scal-Hindlll fragment 15 opnået fra pJDB207/PH05-TPA18-M0421(1).

a) Fremstilling af vektor:

Tre μg pJDB207 spaltes med BamHI og Hindlll, og 6,6 Kb vektoren isoleres. Efter elektroeluering fældes DNA'et i ethanol.

20 b) Scal-Hindlll spaltning af pJDB207/PH05-TPA18-M0421(l): 1.5 μ$ af plasmid DNA'et spaltes med 7 E Seal (Boehringer) og 6 E Hindlll i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2/ 50 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter behandling med phenol og fældning i ethanol isoleres 25 987 bp fragmentet på en 1,2%'s præparativ agarosegel (indsætningsdel 1).

c) BamHI-Scal spaltning af pJDB207/PH05-TPA18 og pJDB207/ PH05-I-TPA: 1.5 μg af de to plasmid DNA'er spaltes med 7 E BamHI og 56 DK 174977 B1 7 E Seal i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter phenolisering og fældning i ethanol isoleres 1300 bp fragmenterne på en 5 1,2%'s præparativ agarosegel (indsætningsdel 2).

d) Ligering af de tre fragmenter: 100 pmol pJDB207/PH05-TPA18 BamHI-Hindlll spaltet vektor-fragment, 200 pmol af hvert af de andre to indsætningsfragmenter [1 og 2] ligeres i 10 /ti 50 mM Tris.HCl 10 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 μg gelatine med 400 E T4 DNA ligase i 16 timer ved 15eC. Reaktionerne afbrydes ved inkubering ved 65#C i 10 minutter.

5 μΐ af denne ligeringsblanding anvendes til transformationen af E. coli HB101 Ca2+ celler. 10 ampR kolonier 15 udtages, og der fremstilles DNA ved hurtig-isolerings-metoden. Ved en analyse med EcoRl, PstI og BamHI-Hindlll opnås fragmenter med den korrekte størrelse, én klon fra hver af de to konstruktioner dyrkes i 100 ml LB medium indeholdende 100 /tg/ml ampicillin. Plasmid DNA'er isoleres 20 og betegnes pJDB207/PH05-TPA18-M04 og pJDB207/PH05-I-TPA-M04.

Eksempel 11

Kloning af de muterede t-PA genindsætningsdele i en gærekspressionsvektor indeholdende PH05 promotoren og inver-25 tasesignalsekvensen.

BamHI-Hindlll vektorfragmentet af plasmid pJDB207 ligeres med et BamHI-Narl fragment opnået fra pJDB207/PH05-I-TPA og et Narl-Hindlll fragment opnået fra de muterede t-PA gener.

DK 174977 B1 P“ ·Ί o / a) Fremstilling af RF-dna.

RF-DNA fremstilles for p8A-7-M01, p8A-7-M02, p8A-7-M021, p8A-7-M0421, p8A-7-M0421(1) og p8A-7-M04321(1).

5 b) Isolering af Narl-Hindlll indsætningsdelene fra muterede t-PA gener.

De seks RF-DNA’er (1 μg) spaltes hver for sig med 6 E Narl (Biolabs) i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, .6 mM MgCl2r 6 mM mercaptoethanol ved 37°C i 1 time. Spaltningsblandingen 10 inkuberes ved 65°C i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 1 /ti 1 M NaCl efterfulgt af 6 E Hindlll. Efter inkubering ved 37*C i 1 time tilsættes RNase (2 μΐ, 0,5 μg/μl). Efter 15 minutter ved 37eC og behandling med phenol fældes DNA'erne i ethanol. 1450 bp DNA fragmenterne isoleres på 15 en 1,2%'s præparativ agarosegel. DNA'erne ekstraheres ved elektroeluering og fældes i ethanol (indsætningsdel 1).

c) Isolering af BamHI-Narl indsætningsdelen.

Tre μg pJDB207/PH05-I-TPA spaltes med 6 E Narl i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, 6 mM mercaptoethanol 20 ved 37®C i 1 time. Derpå tilsættes 2 /il 1 M NaCl og derefter 6 E BamHI. Efter inkubering ved 37eC i 1 time foretages behandling med phenol, og DNA fældes i ethanol.

930 bp DNA fragmentet isoleres på en 1,2%'s præparativ agarosegel. DNA'et ekstraheres ved elektroeluering og 25 fældes i ethanol (indsætningsdel 2).

d) Fremstilling af vektor.

58 DK 174977 B1 e) Ligering af de tre fragmenter.

100 pmol pJDB207/PH05-TPA18 BamHI-Hindlll spaltet vektorfragment, 200 pmol af hvert af de andre to indsætnings-5 fragmenter [1 og 2] ligeres i 10 μΐ 50 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 /tg gelatine med 400 E T4 DNA ligase i 16 timer ved 15°C. Reaktionerne afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter. 5 pi af denne ligeringsblanding anvendes til transformationen af 10 E. coli HB101 Ca2+ celler. 10 ampR kolonier udtages, og DNA fremstilles ved hurtig-isoleringsmetoden. Ved analyse med EcoRI, PstI og BamHI-Hindlll konstateres fragmenter med den korrekte størrelse. Én klon fra hver af de seks konstruktioner dyrkes i 100 ml LB medium indeholdende 15 100 Mg/mi ampicillin. Plasmid DNA'er isoleres og betegnes pJDB207/PH05-I-TPA-M01, pJDB207/PH05-I-TPA-M02, pJDB207/ PH05-I-TPA-M021, pJDB207/PH05-I-TPA-M0421, pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1) og pJDB207/PH05-I-TPA-M04321(1) .

Eksempel 12 20 Transformation af Saccharomyces cerevisiae GRF18

Plasmiderne pJDB207/PH05-TPA18-M01, pJDB207/PH05-TPA18- M02, pJDB207/PH05-TPA18-M04, pJDB207/PH05-TPA18-M021, pJDB207/PH05-TPA18-M0421, pJDB207/PH05-TPA18-421(1), pJDB207/PH05-TPA18-M04321(1), pJDB207/PH05-I-TPA-M01, 25 pJDB207/PH05-I-TPA-M02, pJDB207/PH05-I-TPA-M04, pJDB207/ PH05-1-TPA-M021, pJDB207/PH05-I-TPA-MO421, pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1) og pJDB207/PH05-I-TPA-M04321(1) indføres hver for sig i Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR) under anvendelse 30 af transformationsmetoden beskrevet af Hinnen et al [Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978) ]. Fem /tg af hvert enkelt plasmid DNA sættes til 100 μΐ af en sfæroplast suspension, og blandingen behandles med polyethylenglycol.

59 DK 174977 B1

Sfæroplasterne blandes med 10 ml regenereringsagar og anbringes på minimal-gærmediumplader uden leucin. Efter inkubering i 3 dage ved 30°C opnås 200 transformerede 5 celler, in koloni fra hver af gærtransformationerne udtages. De forskellige kolonier betegnes som følger:

Saccharomyces cerevlsae GRF18/pJDB207/PH05-TPAl8-MOl Saccharomyces cerevlsae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA18-M02 Saccharomyces cerevlsae GRP18/pJDB207/PH05-TPA18-M04 Saccharomyces cerevlsae GRF18/pJDB207/PH05-TPAl8-M021 Saccharomyces cerevlsae GRP18/pJDB207/PH05-TPA18-M0421 . Saccharomyces cerevlsae GRFl8/pJDB207/PH05-TPA18-M0421(l)

Saccharomyces cerevlsae GKF18/pJDB207/PH05-TPA18-M04321(l)

Saccharomyces cerevlsae GRF 18/pJDB207/PH05-I-TPA-M01 Saccharomyces cerevlsae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-MO2 Saccharomyces cerevlsae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M04 Saccharomyces cerevlsae CRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M021 Saccharomyces cerevlsae GRFl8/pJDB207/PH05-I-TPA-M0421 Saccharomyces cerevlsae GRF18/pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1)

Saccharomyces cerevlsae GRP18/pJDB2Q7/PH05-I-TPA-MO4321(1)

Eksempel 13 10 Transformation af Saccharomyces cerevisiae stamme HT246 S. cerevisiae stamme HT246 opnås ved gentagen tilbagekrydsning af mutanten S. cerevisiae stamme HT 232, som mangler protease B aktivitet, jævnfør D.H. Wolf et al., i G.N. Cohen og H. Holzer (redaktører), Limited Proteolysis 15 in Microorganisms, conference report, Bethesda 1978, side 61, og S. cerevisiae H423, jævnfør beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081.

S. cerevisiae HT246 transformeres med plasmiderne pJDB207/ PH05-TPA18-M01, pJDB207/PH05-TPAl8-M02, pJDB207/PH05- 60 DK 174977 B1 TPA18-M04, pJDB207/PH05-TPA18-M021, pJDB207/PH05-TPA18- M0421, pJDB/PH05-TPA18-421(1), pJDB207/PH05-TPA18- M04321(1), pJDB207/PH05-I-TPA-M01, pJDB207/PHO5-I-TPA- 5 M02, pJDB207/PH05-I-TPA-M04, pJDB207/PH05-I-TPA-M02l, pJDB207/PH05-I-TPA-M0421, pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1) og pJDB207/PH05-I-TPA-M04321(1) under anvendelse af trans-formationsmetoden ifølge Hinnen et al. (se ovenfor) under selektering for leucinprototrofi (jævnfør eksempel 12).

10 Der udtages én klon fra hver, som gives følgende betegnelser:

SaccharomyceB cerevisae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-MQl Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PHO5-TPA18-H02 Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-MQ4 Saccharonyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M021 Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-TPAl8-M0421 Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M0421(l)

Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M04321(l)

Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-MQl Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-H02 Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PHQ5-I-TPA-MO4 Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-H021 Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-M0421 Saccharomyces cerevisae Hl246/pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1)

Saccharomyces cerevisae HT246/pJDB207/PH05-I-TPA-M04321(I)

Eksempel 14

Fremstilling af gærcelleekstrakter og bestemmelse af t-PA 15 aktivitet Gærceller dyrkes ved 30#C i 20 ml HE-17 medium (8,4 g gærnitrogenbase (Difco), 10 g L-asparagin, Sigma, 1 g L-histidin (Sigma), 40 ml 50% glucose pr. 1 opløsning) i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe med omrystning i 24 timer, indtil 20 der nås en celletæthed på 8-10xl07 celler/ml. Cellerne centrifugeres og opslæmmes i 10 ml 0,9%'s NaCl-opløsning.

61 DK 174977 B1

To ml af celleopslæmningen anvendes til at inokulere 50 ml lav-P-L minimalmedium (som beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081), hvortil der er sat 5 10 g/1 L-asparagin, Sigma, og 10 g/1 L-histidin, Sigma, i 250 ml Erlenmeyer-kolber. Inkuberingen foretages ved 30eC og 250 omdrejninger pr. minut.

Celler fra 10 ml lav-P^ minimalmedium samles efter 24 og 48 timer ved centrifugering ved 3000 omdrejninger pr.

10 minut i 10 minutter i "Falcon" 2070 rør. Cellerne vaskes én gang med 10 ml lav-P^ medium og centrifugeres. Cellekuglen suspenderes i lyseringspuffer (65 mM kalium-phosphat pH 7,4, 4 mM "Zwittergent" (Calbiochem.). Til cellesuspensionen sættes 8 g glasperler (0,5-0,75 mm i 15 diameter), og en lille glasstav, og suspensionen rystes på en hvirvelblander (Scientific Instruments Inc., USA) ved største hastighed i 4x2 minutter med intervaller på 2 minutter på is. Mere end 90% af cellerne oplukkes på denne måde. Cellerester og glasperler sedimenteres ved centri-20 fugering i 5 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut ved 4°C. Supernatanten overføres til Eppendorf-rør.

t-PA aktiviteten bestemmes under anvendelse af den kolori-metriske analyse ifølge J.H. Verheijen et al., Thromb.

. Haemost. 48, 226 (1982).

25 De opnåede resultater er anført i nedenstående tabel 1: 62 DK 174977 B1

Tabel 1

Saccharcmyces cerevisiae stamme I.E./l/OD$oo μg/l/OD6oo GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-MOl 250 9 GRF18/pJDB207/PH05-TPA18-M021 950 34 GRF18/pJDB20 7/PH05-TPA18-M0421 650 23 HT246/pJDB20 7/PH05-TPA18-MOl 1112 40 HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M021 5330 190 HT246/pJDB207/PH05-TPA18-M0421 2240 80 HT246/pJDB207/PH05-TPAl8 (control) 1112 40

Eksempel 15

Fermentering af transformerede gærstammer 131 målestok 5 Alle transformanter holdes på flydende nitrogens temperatur (dampfase) i et medium med følgende sammensætning: natriumglutamat 50 g/1 saccharose 50 g/1 dextran 50 g/1 10 Til en fermentering 13 1 målestok af hver enkelt af de transformerede S. cerevisiae stammer fremstilles to forkulturer:

Med en podenål udtages celler fra en frisk dyrket kultur på agarskrårør, og de inokuleres i 50 ml forkulturmedium 15 med følgende sammensætning: gærnitrogenbase (Difco 0919-15) 8,4 g/1 L-asparagin 10 g/1 L-histidin 1 g/1 glucose 20 g/1 20 og der inkuberes ved 30°C og 180 omdrejninger pr. minut i 63 DK 174977 B1 48 timer. 10% af den første forkultur inokuleres til den anden forkultur, og der inkuberes i yderligere 24 timer.

Den anden forkultur centrifugeres, cellerne opslæmmes i 5 0,9%'s NaCl-opløsning og inokuleres til et 3 1 fermente ringsmedium med følgende sammensætning: glucose 20 g/1 bactopepton 15 g/1 ammoniumsulfat 3 g/1 10 gærekstrakt, oxoid 1 g/1 L-histidin 0,1 g/1

MgS04.7H20 1 g/1 til en optisk tæthed (ODøqq) på 0,2.

Fermenteringerne gennemføres i en 3 1 MBR bioreaktor (MBR

15 Bio Reactor AG, Wetzikon, Schweiz) ved 30°C, en omrøringshastighed på 500 omdrejninger pr. minut og en beluftnings-hastighed på 150 1 pr. time. Efter 48 timer nås en optisk tæthed på ca. 12. Dyrkningsvæsken afkøles til 4eC, centrifugeres, og cellekuglen opslæmmes i 150 ml nedbrydnings-20 puffer bestående af 4 mM "Zwittergent" 9-14 (Calbiochem) i 50 mM phosphatpuffer pH 7,4.

Der tilsættes 150 g glasperler (diameter 0,5 mm), og cellerne nedbrydes i 30 minutter, indstilling 5 på en flerrørs hvirvelblander (Scientific Manufacturing 25 Industries, USA).

Eksempel 16

Rensning af det dannede mutant t-PA

Suspensionen af de nedbrudte celler (se eksempel 14) centrifugeres, og til supernatanten sættes fast ammonium- 64 DK 174977 B1 sulfat, indtil der opnås 35%'s mætning med hensyn til ammoniumsulfat. Suspensionen centrifugeres, og kuglen opløseliggøres i 0,2 M ammoniumacetat indeholdende 0,1% 5 "Synperonic"® PE-F 68. 5 g (vådvægt) DE-3 inhibitor koblet til "Sepharose"®-4B perler tilsættes, og suspensionen omrøres forsigtigt ved 4eC natten over. Perlerne isoleres fra opløsningen, vaskes to gange med 0,2 M natriumchlorid-opløsning indeholdende 0,1% "Synperonic"®, fyldes på en 10 søjle med en diameter på 10 mm og vaskes med 10 ml 0,2 M natriumchloridopløsning Indeholdende 0,1% "Synperonic"® efterfulgt af 10 ml 0,2 M NH4SCN i 0,2 M ammoniumacetat indeholdende 0,1% "Synperonic"®. Derefter elueres t-PA med 1,2 M NH4SCN i 0,2 M ammoniumacetat indeholdende 0,1% 15 "Synperonic"® ved en strømningshastighed på 30 ml/time.

Fraktioner med den største fibrinolytiske virkning hældes sammen. Blandingen indeholdende mutant t-PA*et med en renhed på ca. 90% eller derover anvendes til karakteriseringsundersøgelser og biologiske analyser.

20 Eksempel 17

Aktivitet af mutant t-PA'eme i biologiske analyser

Ekspressionen af plasmiderne pJDB207/PH05-TPA18-M01, PJDB207/PH05-TPA18-M02, pJDB207/PH05-TPAl8-M04, pJDB207/ PHO 5-TPA18-M021, pJDB207/PH05-TPA18-M0421, pJDB207/PH05- 25 TPA18-M0421(1) , pJDB207/PH05-I-TPA-M01, pJDB207/PH05-I- TPA-M02, pJDB207/PHO5-I-TPA-MO4, pJDB207/PH05-I-TPA-M021, PJDB207/PH05-I-TPA-M0421 og pJDB207/PH05-I-TPA-M0421(1) i S. cerevisiae stammen HT 246 resulterer i biologisk aktive mutant t-PA'er, nemlig [Asn119 ]-t-PA, [ Ala188 ]-t-PA, 30 [ Ala450 ]-t-PA, [Asn119, Ala186 ]-t-PA, [Asn119, Ala186,

Asn48® ]-t-PA og [Asn119, Ala188, Ala48® ]-t-PA, hvis aktivitet er lig med eller større end aktiviteten af vildtypegær t-PA. Alle mutante t-PA’er viser aktivitet på 65 DK 174977 B1 caseinplader og fibrinplader, jævnfør J. Jespersen et al., Haemostasis 18, 301 (1983), ved den kolorimetriske analyse beskrevet af J.H. Verheijen et al., Thromb. Haemost. 48, 5 266 (1982), og ved en fluorometrisk analyse under anven delse af Cbz-Gly-Gly-Arg-AMS som substrat, jævnfør M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978).

Ved den fluorometriske analyse fortyndes alle t-PA opløsningerne til nøjagtig 20 FE/ml (0,28 μg/ml) i en 60 mM 10 phosphatpuffer pH 7,4 indeholdende 0,01% "Tween"® 80 og 0,05% HSA. Det konstateres, at ca. 90% af alle t-PA'er foreligger i énkædeformen, og ca. 10% foreligger i tokæde-formen.

Der foretages forsøg til bestemmelse af coagellyserings-15 aktiviteten af de forskellige mutant t-PA'er, i hovedsagen i overensstemmelse med R.D. Philo og P.J. Gaffney, Thromb. Haemost. 45, 107-109 (1981).

Ved afbildning af logaritmen til lyseringstiden mod logaritmen til t-PA koncentrationen fås en ret linie, hvis 20 hældning er et udtryk for den tilsatte plasminogenakti-vators fibrinspecificitet. Ved sammenligning med et standardpræparat kan coagellyserings I.E./ml bestemmes. Resultaterne opnået med de forskellige mutant t-PA'er er vist i fig. 3.

25 Det fremgår af figuren, at [Asn11^ ]-t-PA (ret linie 3) og [AsnH9, Alal8€> ]-t-PA (ret linie 4) lyserer in vitro coagel med omtrentlig samme hældning som reference-melanoma t-PA (mt-PA, ret linie 1). Konklusionen er, at alle de målte t-PA'er har en lignende fibrinaktivitet.

30 Imidlertid lyserer [Asn^^ Ala·1-^, Asn^SO ]_-fc-pA (ret linie 5) coageler ca. dobbelt så hurtigt som melanoma t-PA'en, vildtypegær t-PA'en (ret linie 2, jævnfør beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081), [ Asn*19 ]-t-PA og [Asn^^, Ala^®^ ]-t-PA.

66 DK 174977 B1

Forholdet mellem de opnåede virkninger (i I.E./ml) opnået ved de ovenfor beskrevne analyser er anført i tabel 2.

Tabel 2

VIE/FE CIE/EE CIE/VIE

at-PA 4.1 3.3 1.2 vildtype t-PA 2.5 4.7 1.9 (Aen1** J-t-PA 3.2 5.1 1.6 (Åen11’, Al·1·* J-t-PA 3.8 5.4 1.4 [Aen11* , Ala1 ·*, Aen*50 ]-t-PA 5.4 12.1 2.2 5 VIE = I.E. ifølge Verheijen et al. (se ovenfor) FE = fluorometriske enheder ifølge Zimmermann et al.

(se ovenfor) CIE = internationale enheder for coagellysering ifølge 10 Philo et al. (se ovenfor)

Eksempel 18

Immunpåvisning

Identiteten af coagellyseringsaktiviteten renset fra rå gærekstrakter med t-PA påvises ved anvendelse af Western 15 blots, hvor der anvendes polyklonale antistoffer fra kanin rettet mod melanoma t-PA.

Ca. 12 FE af de forskellige t-PA molekyler adskilles ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese under anvendelse af 12,5%'s geler under reducerende betingelser.

20 Derpå overføres protein til en nitrocellulosemembran, i alt væsentligt i overensstemmelse med producentens instruktion (Schleicher & Schuell, Feldbach, Schweiz). Overførselen gennemføres i en overførselspuffer (glycin 14,4 g/l, tris 3 g/1, methanol 20%) i 2,5 timer ved .

67 DK 174977 B1 40 V/cm. Efter blokering i 3% BSA i 1 time inkuberes nitrocellulosen natten over med antistoffet (kaninserum, 100 μΐ til 40 ml BSA-puffer).

5 Antistof-t-PA-komplekser besættes derpå med *25j-protein A (4 jiCi til 40 ml BSA-puffer) i 2 timer.

Efter udstrakt vaskning eksponeres en røntgenfilm med nitrocellulosemembranen. Resultatet er vist i fig. 4. Alle mutant t-PA'er påvises ved hjælp af det polyklonale 10 antistof og viser en reduktion i størrelse svarende til manglende glycolytiske sidekæder. Hver mutation bevirker et tab på ca. 1 kD i molekylvægt.

Eksempel 19

Glycosyleringstilstand i mutant t-PA’er 15 Glycosylering bestemmes med 125j-concanavalin A overlejringsanalyse efter gelelektroforese. Concanavalin A er en plantelectin, som specifikt genkender mannoserester. Igen sættes 12 FE af hver mutant til 12,5% PAGE. Derefter fik-seres de ti proteiner i 30 minutter i 7%’s eddikesyre.

20 Gelen vaskes derpå i lectinpuffer med følgende sammensætning : 0,15 M NaCl 50,0 mM Tris pH 7,4 0,5 mM CaCl2 25 0,5 mM MnCl2

Vaskningen fortsættes, indtil pH-værdien når ca. 7,3.

Derpå overlejres gelen forsigtigt med 2 ml lectinpuffer indeholdende 3 mg hæmoglobin, 100 μg concanavalin A og 2 jiCi 125j_COncanavalin A.

68 DK 174977 B1

Efter inkubering natten over i et fugtigt kammer vaskes gelen kraftigt i lectinpuffer, tørres og udsættes for en røntgenfilm. Alle mutant t-PA'er er farvet med 125J-5 concanavalin A. Da selv [Asn119, Ala18**, Asn^20^ Ala488 ]-t-PA reagerer svagt roed lectin, konkluderes det, at denne mutant indeholder resterende O-bundne sukkerdele.

Eksempel 20

Farmaceutiske præparater til parenteral indgift 10 En opløsning indeholdende [Asn119, Ala188, Ala480 ]-t-PA på énkædeformen, på tokædeformen eller som blandinger deraf opnået som beskrevet ovenfor dialyseres mod 0,3 molær natriumchlorid indeholdende 0,01% "Tween"® 80 og opbevares ved -80eC. Inden indgivelsen indstilles koncentra-15 tionen til 75 Mg/ml af total t-PA (dvs. énkæde plus tokæde t-PA) og 0,3 M NaCl. Opløsningen steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 Mm membranfilter.

I stedet for det ovenfor omtalte t-PA er det også muligt at anvende den samme mængde af et andet t-PA beskrevet i 20 de foregående eksempler, som f.eks. [Asn119 ]-t-PA, [ Ala186 ]-t-PA, [ Ala450 ]-t-PA, [Asn119, Ala186 ]-t-PA eller [Asn119, Ala186, Asn450 ]-t-PA.

Denne metode er velegnet til fremstilling af opløsninger af mutant t-PA'er på énkædeformen eller tokædeformen eller 25 i form af blandinger deraf til parenteral administration, f.eks. intravenøs administration.

Claims

69 DK 174977 B1
1. Humane t-PA-proteiner, kendetegnet ved, at de har aminosyresekvensen Al-116_Asn"Ser-Yl"A120-183“Asn“G1Y-Y2"A187-217'Asn-Pro“Y3"
5 A221-447"Asn~Ar9~Y4”A451-527 (1 *) hvori Ai_h6 betyder den N-terminale aminosyresekvens bestående af aminosyrer 1 til 116 i moden t-PA, A^20-183 betyder aminosyresekvensen bestående af aminosyrer 120 til 183 i moden t-PA, A187-217 betyder aminosyresekvensen 10 bestående af aminosyrer 187 til 217 i moden t-PA, A221-447 betyder aminosyresekvensen bestående af aminosyrer 221 til 447 i moden TPA, A45i_527 betyder den C-terminale aminosyresekvens bestående af aminosyrer 451 til 527 i moden t-PA, og 15 a) Yi og Y3 er Ser, Y2 er en genetisk indkodet aminosyre forskellig fra Ser og Thr, og Y4 er Thr, eller b) Y]_, Y2 og Y3 hver især er Ser, og Y4 er en genetisk indkodet aminosyre forskellig fra Ser og Thr, eller c) Y]_, Y2 og Y4 hver især uafhængigt er en genetisk 20 indkodet aminosyre forskellig fra Ser og Thr, og Y3 er i Ser, i den énkædede eller den tokædede form. 2. t-PA-Protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er valgt blandt [ Ala188 ]-t-PA, [ Ala48G ]-t-PA, [Asn^9( Ala188, Asn^50 Dg [Asn119, Ala188,
25 Ala450 ]-t-PA. 3. [ Ala188j-t-ρΑ ifølge krav 1. 4. [ Ala488 ]-t-PA ifølge krav 1. 5. [Asn119, Ala188, Ala450 ]-t-PA ifølge krav 1. 6. [Asn119, Ala186, Asn450 ]-t-PA ifølge krav 1. 70 DK 174977 B1
7. Humane t-PA-proteiner i den étkædede form ifølge ethvert af kravene 1-6.
8. Fremgangsmåde til fremstilling af et humant 5 t-PA-protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man under passende næringsbetingelser dyrker transformerede eukaryote værtsceller indeholdende en DNA-sekvens, som koder for det nævnte humane t-PA-protein, og isolerer det humane t-PA-protein og, om ønsket, adskiller en blanding 10 af énkædeformen og tokædeformen af det dannede t-PA-protein i de enkelte komponenter og til fremstilling af tokædeformen uden indhold af énkædeformen omdanner énkædeformen af det dannede t-PA-protein til tokædeformen.
9. DNA, kendetegnet ved, at det indeholder en DNA 15 sekvens, der koder for et humant t-PA-protein ifølge krav 1.
10. Hybridvektor, kendetegnet ved, at den indeholder en promotor og en DNA sekvens, som koder for et humant t-PA-protein ifølge krav 1.
11. Transformeret eukaryot værtscelle, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA sekvens, som koder for et humant t-PA-protein ifølge krav 1.
12. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder et humant t-PA-protein ifølge krav 1 og et 25 farmaceutisk acceptabelt bærestof.