DK175152B1

DK175152B1 - IgM-antistof eller et fragment deraf, fremgangsmåde til prognose eller diagnose af AIDS og diagnosesæt dertil

Info

Publication number: DK175152B1
Application number: DK198905894A
Authority: DK
Inventors: Toby C Rodman
Original assignee: Inst Human Genetics Biochem; Toby C Rodman
Priority date: 1988-03-25
Filing date: 1989-11-23
Publication date: 2004-06-21
Also published as: JPH03500964A; JP2853877B2; CA1340982C; ATE147410T1; DK589489D0; DK589489A; US5872012A; EP0386166A1; EP0386166A4; EP0386166B1; WO1989009286A1; DE68927635T2; DE68927635D1

Description

i DK 175152 B1

Introduktion.

Den foreliggende opfindelse angår et igM-antistof eller et fragment deraf, en fremgangsmåde til prognose eller diagnose af AIDS og et diagnosesæt dertil. Især angår opfin- * 5 delsen protaminreaktive serum-IgM-antistoffer, som kan erkende en sekvens omfattende 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester, og som udviser lav bindingsaffinitet til antigen. Dette antistofundersæt af protaminreaktive serum-IgM-antistoffer med lav affinitet 10 kan afprøves for diagnose eller diagnose af AIDS. Opfindelsen angår også diagnosesæt til påvisning og/eller måling af de protaminreaktive serum-IgM-antistoffer med lav affinitet.

2. Opfindelsens baggrund 2.1. Protaminer.

15 Protaminer er små, yderst basiske nucleoproteiner, som er associeret med DNA, og som ikke forekommer i andre celler end spermatider og spermatozoer. Disse proteiner syntetiseres de novo og inkorporeres i kernerne i spermatogene celler under spermiogenesis, hvor de erstatter histoner 20 og er bundet til den spermatozoiske DNA, en fremadskriden, som finder sted i immunologisk sekvestrede hulrum i sædkanalerne i testis efter puberteten {N.B. Gilula et al., 1976, Dev. Biol. 50:142).

Protamin 1 (oprindeligt benævnt pi5) er et humant 25 protamin, som forekommer i 4 varianter. Det er blevet identificeret og karakteriseret ved hjælp af et monoclonalt antistof (benævnt HPmAb, beskrevet nedenfor) (T.C. Rodman et al., 1983, Gamete Res. 8:129-147).

Humant protamin 2 har længe været erkendt og vides 3 0 at forekomme som to varianter (A.H. Kolk and T. Samuel, 1975, Biochem. Biphys. Acta 393:307-319) . senere betegnet som protamin 2a og 2b (D.J. McKay et. al, 1986, Eur. J. Biochem. 156:5-8) .

Polyvalente kaninantisera, som er specifikke for de 35 to protaminer i musespermachromatin, er blevet isoleret og anvendt til karakterisering af protaminerne med hensyn til 2 DK 175152 B1 fordeling og DNA-associering og til erkendelse af immunoke-misk krydsreaktivitet mellem pattedyrprotaminer (T.C. Rodman et al., 1984, Exp. Cell Res. 150:269-281).

Polyclonale kaninantisera imod humane protaminer er 5 blevet anvendt ved immunohistokemiske studier af overgangen histon til protamin under spermiogenesis (Ch. Roux et al., 1988, J. Reprod. Fert. 82:35-42). Påvisningstrinene i immuno-afprøvningerne ved dette studium er blevet gennemført ved anvendelse af antistoffer imod kanin-IgG.

10 Monoclonale museantistoffer mod humane protaminer af

IgGl- og IgG2b-isotyperne er blevet isoleret og delvist karakteriseret (L.H. Stanker et al., 1987, Hybridoma 6(3) : -2 93-303) . Ingen af de beskrevne antistoffer har reageret med polyarginin.

15 Autoantistoffer imod spermatozoiske antigener er blevet påvist i vasectomiserede hanner ved Western blotting-metoder, som afprøver for antistoffer, som er reaktive med spermatozoiske antigener adskilt ved SDS-polycarylamid-gel-elektrophorese eller ved agglutineringsprøver (J. Hald et 20 al., 1987, J. Reprod. Immunol. 12:15-26). Da protaminer er for basiske til at vandre i SDS-polyacrylamid-geler og har immunoreaktive steder, som der ikke er adgang til, med mindre chromatinet er afkondenseret (T.C. Rodman et al., 1970, J.

Cell. Biol. .80:605-620), har de rapporterede afprøvninger 25 ikke påvist anti-protaminantistoffer.

2.2. Naturlige antistoffer.

Det naturlige antistofrepertoire er et segment af immunsystemet, som kun forstås i ringe udstrækning, som tidligt er blevet postuleret at tilvejebringe det første 30 forsvar imod specifikke inficerende stoffer (J. G. Michael, 1969, Curr. Top. Microbiol. Immunol. £8:43-62), og som i den senere tid har været genstand for forøget interesse og gisninger om en mulig rolle ved kontrollen med autoimmunitet (I. Cohen et al. 1986, Immunol. Today 2=363-364) eller andre 35 faser af immuno regulering (G. Dighiero et al., 1985, J.Immunol. 134:765). Naturlige antistoffer er hyppigt blevet beteg 3 DK 175152 B1 net som dem med lavere affinitet end deres frembragte modstykker (se f.eks. E.D. Day et al., 1986, J. Neuroimmunol.

13. = 143-158, S. Hoch et al., 1986, J. Immunol. 136:892-897, M.M. Tongio et al., 1985, Tissue Antigens 26:27-285).

5 2.3. Erhvervet immunomangelsyndrom.

Erhvervet immmunomangelsyndrom (AIDS) er en sygdom, som er karakteriseret ved en svær immunmangel, som primært er forårsaget af en nedsat cellemedieret immunreaktion (M. Gottlieb et al., 1981, N. Engl. J. Med. 305:1425, J. Masur 10 et al., 1981, N. Engl. J. Med. 305:1431). Immunomangeltilstanden er karakteriseret ved en nedgang i TH-lymphocyter (T-hjælper), at det normale celleforhold CD4 (T4)+:CD8(T8)+ er vendt om, lymphopenia, en forøget hyppighed af lejlighedsvise infektioner (f.eks. Pneumocystis carinii pneumoni) og/eller 15 ondartede tilstande (f.eks. lymphoma eller Kaposi's sarcoma). Syndromet er sædvanligvis dødeligt.

Årsagen til AIDS er et retrovirus, nu betegnet det humane immunomangelvirus (HIV) (også isoleret som LAV/ARV/-HTLV III), som inficerer Tjj-lymphocyter (R.C. Gallo et al., 20 1984, Science 224:500. F. Barre-Sinoussi et al., 1983, Sci ence 220:868, P.M. Feorino et al., 1984, Science 225:69. J.

A. Levy et al., 1984, Science 225:840).CD4-T-celleoverflademolekylet er blevet identificeret som en receptor for viruset, og virusets efterfølgende cytolytiske aktivitet udtømrer 25 denne cellepopulation (D. Klatzman et al., 1985, Nature 312:-767, A.G. Dalgleish et al., 1984, Nature 312:763, J.S. McDou-gal et al., 1986, Science 231:382, P.J. Maddon et al., 1986,

Cell 47:333).

En patient er diagnosticeret med AIDS, når han eller 30 hun (1) har positiv prøve for tilstedeværelsen af HIV og frembyder en eller flere af de specifikke indikatorsygdomme (neoplasmer, lejlighedsvise infektioner), eller når (2), i fraværelse af laboratoriebevis for HIV-infektion, alle andre årsager til immunomangel er udelukket, og en af indikatorsyg-35 dommene er tilstede sammen med en lav (under 400/mm3) CD4+-T-lymphocyttælling. AIDS-relateret kompleks (ARC) refererer 4 DK 175152 B1 til de patienter, som har positiv prøve for HIV, og som udviser vedvarende, generaliseret lymphadenopati, langvarig feber, vægttab, vedvarende diarre eller ekstrem udmattethed, men som endnu ikke har udviklet en af de indikatorsygdomme, 5 som er forbundet med fuldt udviklet AIDS.

En række studier har fastslået, at en signifikant risikofaktor for AIDS er receptivt analt samkvem (se f.eks.

J.J. Goedert et al., 1984, Lancet ii:711-716, W.W. Darrow et al., 1987, Am. J. Pub. Health 77:479-483, L. A. Kingsley 10 et al., 1987, Lancet ii.-345-348). Den forøgede risiko tilskrives almindeligvis en effektiv overføring af virus ad denne vej . En vis opmærksomhed er imidlertid blevet viet den mulige medvirken af sædbestanddele ved de patologiske konsekvenser af HIV-infektion (G.M. Mavligit et al., 1984, 15 J. Am. Med. Assoc. 251:237-241. A. Ranki et al., 1985, Cancer Res. .45. :4616S-18S, K.V. Ratman et al., 1986, Aust. N.Z.J.

Med. 15:757-760) . Relevant hertil kan en nylig rapport være, om at den gennemsnitlige latensperiode af HIV-inficerede blødere er væsentlig længere end perioden for andre HIV-20 inficerede gupper (H. Ekert, 1987, Nature 329:494) .

Adams et al. (1988, Clin. Immunol. Immmunopathol. 45:442-449) har rapporteret, at der er signifikant forekomst af antistoffer mod sperma- og sædplasmakomponenter i sera fra ARC- og AIDS-patienter. Der er blevet afprøvet for anti-25 stoffer ved hæmagglutinering, for antistoffer mod sædplasma og ved indirekte immunofluorescens på fikseret human sperma.

Ingen af de anvendte afprøvningsmetoder har kunnet påvise protaminreaktive antistoffer, da protaminer er kemeproteiner og således ikke ville være tilgængelige i sædplasma for 30 antistofbinding og hæmagglutinering og da for protamin immu-noreaktive steder ikke er tilgængelige for antistofbinding ved immunofluorescensafprøvninger, med mindre spermachroma-tinet først afkondenseres (T.C. Rodman et al., 1970, J.

Cell. Biol. 80:605-620, T.C. Rodman et al., 1984, Exp. Cell.

35 Res. 150:269-281) .

5 DK 175152 B1 3. Resumé af opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse angår et humant eller naturligt IgM-antistof eller et fragment deraf omfattende Fv-regionen, som er ejendommeligt ved, at det binder til et 5 humant protamin.

Opfindelsen angår også et humant eller naturligt IgM-antistof eller et fragment deraf som defineret i krav 2-4 .

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til prog-10 nose eller diagnose af AIDS hos et individ som defineret i krav 15.

Opfindelsen angår endvidere et diagnosesæt som defineret i krav 24-26 og 30-32.

Opfindelsen angår endelig også et antistof af IgM-15 isotypen som defineret i krav 34 og 35.

3.1. Definitioner.

Som her anvendt vil følgende forkortelser have de angivne betydninger: AIDS = erhvervet immunomangelsyndrom.

20 ARC = AIDS-relateret'kompleks.

BSA = okseserumalbumin.

ELISA = enzymbundet immunosorbentafprøvning.

Fv = den variable region eller antigenkombinerende sted i et antistofmolekyle. Dette kan være 25 et vilkårligt fragment, som indeholder idio- typen af molekylet, herunder, men ikke begrænset til f.eks. Fab, F{ab')2 °9 Fab'.

HIV = hummant immunomange1virus.

HPmAb = monoclonalt antistof til humane spermaprota- 30 miner.

mAb = monoclonalt antistof.

PI = renset humant protamin 1.

P2 = renset humant protamin 2.

PAGE = polyacrylamid-gelelektrophorese 35 PBS = phosphatpufret saltopløsning.

4. Beskrivelse af tegningen.

6 DK 175152 B1

Figur 1. Proportionalitet af protaminreaktivt IgM til totalt IgM i humane sera. En værdi (x) for totalt IgM for hvert enkelt serum er blevet afledt som en procentdel af et referenceserum (se afsnit 6.1.1), og en værdi (y) for 5 protaminreaktivt IgM er blevet afledt som en procentdel af samme referenceserum. De afbildede værdier er x/y for hvert enkelt serum.

Figur 2. (A) Fraktioner af humane spermaproteiner (striberne 1-5) SDS-PAGE; (striberne 6-8) eddikesyre-urin-10 stof-PAGE. (Stribe 1) molekylvægtmarkeringer: 14,4, 20, 30, 43, 67, 94 X 103 dalton; (stribe 2) haleproteiner; (stribe 3) i "TritonA X-100" opløselige proteiner af hovedmembraner; (stribe 4) 8%'s GuCl-eluat af "BioRexA-70"-chromatogram af kerneproteiner; (stribe 5) 16%'s eluat; (stribe 6) 23%'s 15 eluat (PI); (stribe 7) 25%'s eluat (PI og phosphoryleret P2) ,· (stribe 8) 27%'s eluat (P2) . (B) ELISA-værdier for HPmAb-reaktivitet med hver enkelt spermafraktion. (Striber 2-5) ........; (stribe 6) —. —. —. —.; (stribe 7)-; (stribe 8) --------. HPmAb er kun reaktivt med tre protamin- 20 fraktioner (striberne 6, 7 og 8).

Figur 3. Reaktivitet af HpmAb med (A) polyarginin og (B) polylysin ved stigende antigenkoncentrationer. 2μg/ml polyarginin —. —. —. —.; 5, 10 eller 20 μ9/π\1 polyarginin ........; 2, 5, 10 eller 20 Mg/ml polylysin -. Hver 25 afbildet værdi repræsenterer gennemsnittet af fire afprøvninger, gennemført som dobbeltforsøg.

Figur 4. Reaktivitet af HPmAb med (A) PI ved 2 Mg/ml —. —. —. —. ; 5 μg/ml ........; 10 eller 20 μg/ml polylysin -; ((B) P2 ved 2 μg/τnl —. —. —.—. ; 5 μ9/τη1 ........; 30 10μg/ml eller 20 μg/ml -------. Hver afbildet værdi repræsen terer gennemsnittet af 5 afprøvninger, hver især gennemført i dobbeltforsøg. Med molere ækvivalenter (ækvivalentvægte) af PI og P2 er reaktiviteten af HPmAb større med og mættet ved lavere antigenkoncentrationer af PI.

35 Figur 5. Reaktivitet af humant serum IgM med (A) , PI, (B) P2 , (C) polyarginin ved 2 μg/ml —. —. —. —.; 5 7 DK 175152 B1 μ9/ιη1 ........; 10 μg/ml -; 20 μg/ml--------af hver enkelt antigen. Venstre kolonne er serum fra et barn (alder 6 måneder), midterste kolonne fra voksen mand og højre kolonne fra voksen kvinde.

5 Figur 6. Konkurrence af HPmAb med human serum-IgM- reaktivitet imod (A) PI og (B) P2. Standard-ELISA-protokollen (se afsnit 6.1.1) gennemføres med følgende modifikation: Før tilsætningen af humant serum til de antigenbundne huller placeres 50 μΐ HPmAb ved fortyndingen 1:1.000-; 1:- 10 10.000 ........, intet HPmAb-------- i hvert enkelt hul i en time, hvorefter det vaskes ud og efterfølges af humant serum i de angivne fortyndinger. Reaktivitet påvises ved anvendelse af peroxidasekonjugeret anti-human IgM. (A) HPmAb ved fortyndingen 1:1.000 blokerer ca. 45% af serumreaktivi -15 teten med PI ved fortyndinger af serum på 1:100 og 1:500.

(B) HPmAb ved fortyndingen 1:1.000 blokerer ca. 25% af serumreaktiviteten med P2, når serumet er fortyndet 1:100, og ca. 45% af reaktiviteten, når serumet er fortyndet 1:500.

Figur 7. Reaktivitet af humant serum-IgM med 20 PI-; P2--------; og spermahovedmembranproteiner.......

efter absorption af serum på protaminer i pulje. (A) Ikke-absorberet serum; (B) serum absorberet på 100 μg protaminer; (C) serum absorberet på 200 μg protaminer.

Figur 8. Reaktivitet af humant serum-IgM med PI 25 —. —. —. —. , P2-, renset kalvethymushistoner (herunder ækvimolære vægte af Hl, H2a, H2b, H3 og H4)....... efter absorption på histoner. (A) ikke-absorberet serum, (B) absorberet på 200 μg histoner, (C) absorberet på 500 μg histoner.

Figur 9. Reaktivitet af humant serum-IgM med 30 PI-, P2 --------, polyarginin ........, polylysin —. —.—-. —. . (A) Ikke-absorberet serum; (B) serum absor beret på 200 μg polylysin; (C) serum absorberet på 200 μg polyarginin.

Figur 10A. Der er vist resultaterne af en ELISA (O.T.

35 490 nm) i serum (T.C. Rodman et al., 1986, J. Immunol. Meth.

94:105-111, F.H. Pruslin et al., 1986, J. Immunol Meth.

8 DK 175152 B1 94.:99-103) fra hver af 3 normale (ingen kliniske fund, HIV-negative) voksne individer til påvisning af antistoffer, som er reaktive med følgende stigende koncentrationer af protamin-2 (P2) : 2 ^g/ml........ 5 μg/ml -- -- -- 10 5 /zg/ml —. —. —. —20 Mg/ml -, 50 /xg/ml --------.

Den skarpe stigning i kurven mellem serumfortyndinger 1:100 og 1:500 med de højere antigenkoncentrationer antyder, at der er to underpopulationer af protaminreaktive IgM-anti-stoffer i disse sera.

10 Figur 10B. Summariske kuver for afprøvningen af IgM

fra 20 normale sera fra voksne gennemført med P2 som antigen ved følgende koncentrationer 2 μg/ml........ 5 μg/ml -- -- -- 10 μg/ml ——. —. —20 μg/ml -, hvilket viser, at kurvens stigning ved høje antigenkoncentrationer, 15 som antyder en sekundær underpopulation af protaminreaktive IgM-antistoffer, er en dominerende egenskab i sera fra normale voksne.

Figur 10C. Reaktivitet af de samme sera som i figur 10A med et syntetisk decapeptid (DP), som omfatter det defi-20 nerede antigeniske sted i protamin, ved samme koncentrationer som i figur 10A.

P2b* GQSHYRRRHCSRRRLHRIHRRQHRSC RRRKRRSCRHRRRHRRGCRTRKRTCR R H

25 DP CRRRKRRSCR* D.J. McKay et al., 198S, Eur. J. Biochem. 156:5-8.

Som for P2 (figur 10A) viser kurverne for de højere koncentrationer af DP en stigning mellem serumfortyndinger 1:100 og 1:500, hvilket antyder, at den sekundære population af 30 protaminreaktive IgM-antistof fer, som afsløres ved høje antigenkoncentrationer, ikke er en population med en antigenerkendelsesspecificitet, som er forskellig fra specificiteten af den primære population, men er en population med lavere bindingsaffinitet.

35 Figur 10D. IgM-reaktivitet af de samme sera som i figur 10A og 10C med de samme koncentrationer af P2b som i 9 DK 175152 B1 figur 10A, idet fortyndingsmidlet imidlertid har været 0,3 M NaCl (i modsætning til alle andre afprøvninger, hvor serumfortyndingsmidlet, PBS, har været 0,15 M NaCl) . Ved forhøjet NaCl-molaritet er den skarpe stigning i kurverne for høje 5 antigenkoncentrationer, som er vist i figur 10A, ophævet, hvilket antyder, at fasen med antigen-antistof-binding på grund af ionisk vekselvirkning er blevet inhiberet. Ionisk vekselvirkning ser således ud til at være en hovedbestanddel af bindingen af undersættet af protaminreaktive IgM-antistof-10 fer med lav affinitet, og derfor er reaktiviteten af denne population fortrinsvis blevet undertrykt.

Figur 11A. Reaktivitet af IgM-antistoffer i serum fra hver af 3 patienter med AIDS med P2 i stigende koncentrationer (som beskrevet for figur 10A) . Selvom den totale 15 raktivitet for to af disse sera vedbliver med at stige med voksende antigenkoncentration, antyder kurvernes form, at stigningen stammer fra en antistofpopulation, som er unimodal med hensyn til affinitet snarere end fra overlejring af en sekundær underpopulation af protaminreaktive IgM-antistoffer 20 som i figur 10A, B, C.

Figur 11B. Summariske kurver for afprøvninger af 15 sera fra AIDS-patienter for reaktivitet med P2 (som beskrevet ovenfor for figur 10B), som verificerer, at fraværelsen af den sekundære underpopulation af protaminreaktive IgM-anti-25 stoffer med lav affinitet er typisk for sera fra AIDS-patienter.

Figur 12. Fordeling af titere af undersæt af protaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet, i forhold til totalt, protaminreaktivt IgM, i sera fra normale.personer, 30 personer med AIDS og personer med risiko for AIDS, beregnet som 120 - i2, en værdi, som opnås ved afprøvning af hvert enkelt serum for IgM-reaktivitet med P2 ved 2 Mg/ml og 20 μg/ml og beregning af titeren som beskrevet nedenfor i afsnit 7.2. For gruppe' D er de dokumenterede tidsintervaller fra 35 blodprøveudtagning til den anden diagnose, oppe fra og ned, 32, 24, 44, 64, 48, 60, 55, 29, 32 og 24 måneder. Tidsinter- 10 DK 175152 B1 vallerne genspejler tidspunktet for den sidste kliniske undersøgelse af personerne og er således en angivelse af den minimale latensperiode. Alle sera er blevet afprøvet for tilstedeværelse af HIV-antistoffer ved Western pletdan-5 nelse ved anvendelse af nitrocelluloseoverføringer af elek-tropherogrammer af HIV-proteiner: P18, P24, P31, GP41, P51, P55, P65, GP110/120, GP160 (Epitope, Inc. Beaverton, OR).

Serum betegnes som positivt, når to eller flere bånd er farvet, og negativt, når ingen bånd er farvet.

10 Figur 13. Reaktivitet af IgM i serum fra hver af 3 børn (28 dage, 12 dage, 5 måneder gamle, ingen kliniske fund) med (A) P2 og (B) DP ved stigende koncentrationer (som beskrevet for figur 1A og 1C). Ligheden i kuverne for P2 og DP bekræfter identiteten af det antigeniske sted.

15 Kurvernes former antyder, at serum-IgM-antistoffer fra børn, som er reaktive med dette sted, er homogene eller unimodale med hensyn til affinitet.

5. Detaljeret beskrivelse af opfindelsen.

5.1. Protaminreaktive IgM-antistoffer.

20 Som detaljeret omtalt i nedenstående afsnit 6 er det blevet fastslået, at sera fra alle klinisk normale mennesker, som er over 12 dage gamle, indeholder IgM-antistof fer, som er reaktive med protaminer, og at disse antistoffer er et definitivt sæt af det cirkulerende IgM med en høj grad af 25 specificitet, og det antigeniske sted, med hvilket disse antistoffer er reaktive, er blevet afgrænset.

Som nedenfor beskrevet kan de protaminreaktive IgM-antistoffer ifølge opfindelsen påvises i signifikant titer i praktisk taget alle sera fra normale voksne mænd og kvinder 30 og for normale børn (7 dage til 2 år) . Fælles træk mellem de protaminreaktive IgM-antistof fer i sera fra børn og voksne er blevet fastslået ved påvisning af lighed i antigenerkendelse og reaktionsligevægte. De protaminreaktive IgM-antistof-fer, som findes i sera fra børn, kan ikke tilskrives immuno-35 genisk stimulering ved hjælp af protamin, da protaminer synthetiseres de novo i testis efter puberteten og heller 11 DK 175152 B1 ikke er inkorporeret i andre cellekerner end dem fra den spermiogeniske række. Heller ikke kan de protaminreaktive IgM-antistoffer i sera fra nyfødte tilskrives oprindelse hos moderen, da IgM ikke krydser placenta. Der er derfor 5 sund basis for at drage den slutning, at humane sera indeholder et undersæt af "naturlige" antistoffer, som er reaktive med, men ikke frembragt af protaminer.

Protaminer sekvestreres fra immunsystemet under deres syntese og cellulære inkorporering (M. Dym og D.W. Fawcett, 10 1970 Bio. Reprod. 3.:308-326), 0g det er nu ,vist, at protami ner er ikke-immunoundertrykkende, dvs. de inhiberer ikke T-cellemitogenesis in vitro, således som andre fra sperma stammende proteiner gør (T.C. Rodman et al., 1985, Science 228:1211-1215). Derfor kan sera fra mænd efter puberteten 15 og kvinder med seksuel erfaring indeholde nogle protaminreaktive antistoffer, som kan tilskrives immunogenisk frembringelse af protaminer. Derfor postuleres det, at de protaminreaktive IgM-antistoffer i humant sera fra voksne omfatter to undersæt, som har forskellig oprindelse: (1) naturlige anti-20 stoffer og (2) frembragte antistoffer.

Det princip, som er karakteristisk for det antigeniske sted, som erkendes af de protaminreaktive serum-IgM-antistof -fer er en klynge af arginylrester med et tilsyneladende minimumskrav på 4 arginylrester, herunder en triplet, i et 2 5 stykke på 6 aminosyrerester, og bindingsreaktionen er ikke afhængig af ladningstiltrækning. Som vist ved en række immu-noabsorptionsmetoder (se afsnit 6 nedenfor) er de protaminreaktive serum-IgM-antistoffer et særskilt sæt med en høj grad af specificitet.

30 Antistofmolekylerne ifølge opfindelsen er protaminre aktive IgM-antistoffer, herunder fragmenter deraf, som indeholder den idiotypiske region i antistofmolekyleme, og disse omfatter de fragmenter, som omfatter Fv-regionen, f.eks.

Fab-, F(ab')2~ og Fab'-fragmenter. Antistoffragmenter, som 35 indeholder idiotypen i molekylet har kunnet skabes ved kendt teknik. Sådanne fragmenter omfatter, men er ikke begrænset 12 DK 175152 B1 til, f.eks. det F(ab1)2~fragment, som kan fremstilles ved pepsindigerering af antistofmolekylet, de Fab'-fragmenter, som kan frembringes ved reduktion af disulfidbroerne i F (ab') 2-fragmentet, og de Fab-fragmenter, som kan frembringes 5 ved behandling af antistofmolekylet med papain og et reduktionsmiddel .

5.2. Anvendelse ved prognostisk og diagnostisk forudsigelse af latens fra HIV-infektion til manifestation af AIDS.

10 Som detaljeret beskrevet i afsnit 7 nedenfor tilveje bringer målingen af serum-anti-protamin-IgM-antistoffer en pålidelig prognostisk indikator for latensperioden mellem HIV-infektion og tidspunktet, hvor manifestationer af AIDS sætter ind. Tilstedeværelsen eller fraværelsen i serum af 15 et undersæt af de protaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet i følge opfindelsen angiver et HIV-inficeret individs evne til at modstå den patogeniske fremadskriden til AIDS. Den karakteristiske egenskab ved det undersæt af anti-protamin-Igm-antistoffer, hvis fraværelse fra serum 20 korrelerer med en relativt kort periode af HIV-latens, er den lave bindingsaffinitet til protamin i forhold til andre IgM-antiprotaminantistoffer, som er til stede i sera fra voksne. Disse anti-protamin-IgM-antistoffer med lav affinitet er reaktive med en epitop, som er karakteriseret ved en 25 arginylklynge, især 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester. Sådanne anti-protamin-anti-stoffer med lav affinitet kan være naturlige antistoffer.

Undersættet af serumprotaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet kan afprøves til prognose af AIDS. Sådanne 30 antistoffer kan påvises i sera fra normale personer, og Hiv-inficerede individer, som derefter udviser en signifikant latensperiode, men mangler eller er nedsat i sera fra individer, som er diagnosticeret med AIDS, og sera fra HIV-infice-rede individer, som, selvom de er symptomfrie på prøveudtag-35 ningstidspunktet, skrider frem til AIDS i løbet af et relativt kort tidsrum. Man kan derfor stole på en kvantitativ 13 DK 175152 B1 bestemmelse af fraværelsen eller manglen på sådanne antistoffer i HIV-seropositive individer, som en angivelse af en relativt nært forestående indtræden af AIDS.

Den kvantitative bestemmelse og/eller påvisning af 5 anti-protamin-serum-IgM med lav affinitet kan også anvendes til overvågning af effektiviteten af terapeutiske behandlinger, som en hjælp ved udvælgelse af passende personer til kliniske afprøvninger og til tilvejebringelse af en yderligere modalitet til diagnose af AIDS eller ARC. Man forestiller 10 sig også, at påvisningen og/eller målingen af disse anti-protamin-antistoffer kan anvendes på tilsvarende måde ved prognosen og diagnosen af andre immunabnormaliteter.

De forskellige afprøvninger og metoder til påvisning og kvantitativ bestemmelse, som kan anvendes, er beskrevet 15 i det følgende.

5.3. Afprøvninger af serumprotamin-reaktive IoM-anti-stoffer.

Ved en speciel udførelsesform for opfindelsen, ved hvilken afprøvningen sker til prognose og diagnose af AIDS, 20 kan tilstedeværelsen af et undersæt at protaminreaktive IgM-serumantistoffer med lav affinitet afprøves ved en vilkårlig af de nedenfor beskrevne metoder. Som et eksempel kan en underpopulation af anti-protamin-IgM-antistoffer med lav affinitet identificeres, ved at et fastlagt volumen af anti-25 stofblandingen (f.eks. serum) får lov til at reagere med stigende mængder antigen. Efterhånden som koncentrationen af antigen vokser, mættes antistoffer med høj affinitet, og antistoffer med lavere affinitet vil reagere med antigen.

Ved en foretrukket udførelsesform kan der anvendes ELISA, 30 som er beskrevet i nedenstående afsnit 5.3.3 og 7.

5.3.1. Afprøvningssvstemer.

Ethvert afprøvningssystem, som er kendt i teknikken, kan anvendes til kvantitativ bestemmelse og/eller påvisning af anti-protamin-IgM-antistofferne (eller antigenbindingsre-35 gionen deri) ifølge opfindelsen. Sådanne afprøvninger omfatter, men er ikke begrænset til f.eks. immunoafprøvninger, 14 DK 175152 B1 herunder konkurrerende og ikke-konkurrerende afprøvningssystemer: radioimmunoafprøvninger, ELISA (enzymbundet immuno-sorbentafprøvning), "sandwich"-immunoafprøvninger, precipi-tinreaktioner, geldiffusionpreceptinreaktioner, immunodiffu-5 sionsafprøvninger, agglutineringsafprøvninger, komplement-fikserings-afprøvninger, immunoradiometriske afprøvninger, fluorescensimmunoafprøvninger, protein A-immunoafprøvninger og immunoelektrophoreseafprøvninger, for blot at nævne nogle få.

10 5.3.2. Antigener.

De antigener, som kan anvendes ved afprøvningssystemer til kvantificering af protaminreaktive IgM-antistoffer, omfatter ethvert antigen, som omfatter en arginylklynge, især en sekvens omfattende 4 arginylrester, herunder en triplet, 15 i et stykke på 6 aminosyrerester, eller en epitop, som er immunologisk krydsreaktiv med ovennævnte. Ved en udførelses-form er en sådan epitop med arginylklynge en epitop med en lineær sekvens. Ved en anden udførelsesform kan epitopen være afhængig af formen, idet den er et resultat af en kon-20 figuration, som frembringer en antigenisk determinant omfattende 4 arginylrester, herunder en tripletklynge. Ved en specifik udførelsesform kan et peptid omfattende 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester anvendes som antigenet.

25 Derfor omfatter peptider, som kan anvendes som anti gen, uden at være begrænset dertil, dem, som omfatter følgende sekvenser:

R R R R R R X R R R R X

30 RRRRRXeller omvendt R R R R X R " R R R X R R " " R R R R X X " " R R R X R X " "

35 R R R X X R

X R R R X R " " 15 DK 175152 B1 hvor R betyder arginin, og X betyder en vilkårlig anden aminosyre. Andre antigener, som kan anvendes, omfatter, men er ikke begrænset til, dem, som er angivet i nedenstående tabel VII (se afsnit 6.2.5), nemlig de proteiner, som in-5 deholder en sekvens på 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester. Desuden kan et vilkårligt protamin anvendes som antigenet, f.eks. humant protamin 1 (PI) og humant protamin 2 (P2). Protaminerne er mest til fredsstillende som antigener, når deres ekstraktions- og 10 rensningsproces omfatter et trin til blokering af cysteinyl-resterne imod dannelse af di sulfidtværbindinger. Denne blokering kan gennemføres ved en vilkårlig af de kendte metoder, f.eks. aminoethylering, s-methylering og iodacetylering. Desuden kan protaminerne anvendes som antigener ved frem-15 gangsmåden ifølge opfindelsen, selvom de ikke er blevet behandlet til inhibering af di sulfidtværbinding mellem cyste-inylrester.

Andre antigener, som kan anvendes ved immunoafprøvnin-gerne ifølge opfindelsen, kan identificeres ved hjælp af 2 0 deres evne til at blive bundet af det monoclonale anti -protamin- antistof-HpmAb (ATCC accessions nr. HB 9668), som erkender en epitop, som svarer til eller er identisk med den i de protaminreaktive IgM-antistoffer ifølge opfindelsen.

5.3.3. Afprøvninqsmetode til forudsigelse af HIV-25 latensperioden.

Den her beskrevne afprøvnings- og beregningsmetode tilvejebringer en modalitet til forudsigelse af den sandsynlige HIV-latensperiode, før AIDS sætter ind, for et inficeret individ. En sådan information kan være værdifuld ved 30 lægens behandling af individuelle patienter, ved projekteringen af det offentlige behov for faciliteter til lægebehandling og ved udvælgelsen af hensigtsmæssige personer til afprøvning af foreslåede terapeutiske midler. Den tilvejebringer ligeledes yderligere kriterier til AIDS-diagnose.

35 Den her beskrevne afprøvning og metode er kun et eksempel på udledningen af et kvantitativt indeks til anvend- 16 DK 175152 B1 else ved AIDS-prognose, og andre sådanne eksempler, og modifikationer af den her beskrevne metode er ligeledes forudset og falder inden for opfindelsens rammer.

En enzymbundet immunosorbentafprøvning (ELISA), som 5 kan påvise protaminreaktive serum-IgM-antistoffer med lav affinitetsbinding, kan gennemføres. ELISA gennemføres som beskrevet i sektion 7 nedenfor (se også beskrivelsen af figur 10A, afsnit 4 ovenfor) med stigende koncentrationer af antigen (f.eks. protamin 2) ved 2, 5, 10, 20 og 50 μg/ml.

10 Kort fortalt består forsøgsmetoden af følgende trin: (i) Antigenovertrækning.

Prøvehuller på en mikrotiterplade overtrækkes med antigen (50 μΐ foretrækkes) ved tilsætning af antigenopløsning til hullerne efterfulgt af en 4 timers inkubering. Med 15 protamin 2 som antigen er de fortrinsvis anvendte antigenkoncentrationer 2 μg/ml og 20 μg/ml.

(ii) Blokering.

Antigenopløsning vaskes ud med puffer, og alle hullerne fyldes til randen med blokeringsopløsning til overtrækning 20 af regioner, som ikke er overtrukket med antigen, hvorved ikke-specifik binding til huloverfladen inhiberes i de efterfølgende trin.

(iii) Binding af serumantistoffer.

Blokeringsopløsning vaskes ud, og fortyndet serum 25 (50 μΐ fortrækkes) sættes til hvert enkelt hul. Hver prøve serum afprøves tredobbelt ved hver af de to fortyndinger.

Det har vist sig, at serumfortyndinger 1:100 og 1:500 er egnede, når protamin 2 anvendes som antigen, og at de, for de fleste humane sera, har serumbaggrundsværdier, som er 30 lave nok til, at der kan foretages gyldige fortolkninger af forsøgsresultaterne. Med forskellige peptider, som bærer det antigeniske sted, har andre par af serumfortyndinger, som varierer fra ufortyndet serum til en fortynding på 1: -1000, imidlertid vist sig anvendelige.

35 (iv) Påvisning af bundne IgM-antistoffer.

Efter tre timers forløb udvaskes serumfortyndingerne, 17 DK 175152 B1 og 50 μΐ peroxidasemærket, andet antistof (anti-humant IgM) sættes til hvert enkelt hul. Efter 1,5 timers forløb vaskes det andet antistof ud, og 50 μΐ peroxidasesubstrat tilsættes.

Efter 30 minutters forløb sættes der 50 μΐ 2,5 N svovlsyre 5 til hvert enkelt hul for at standse indvirkningen af enzym (peroxidase) på substrat, hvorved frembringelsen af chroma-tisk produkt standses.

(v) Måling.

Pladen anbringes i en automatisk pladeaflæser, som 10 bevæger pladen til centrering af hvert enkelt hul over en stråle af filtreret lys, således at den optiske tæthed (OT) af det indfaldende lys (f.eks. 4 90 nm) aflæses for hvert enkelt hul og noteres.

(vi) Beregning.

15 Derefter afbildes den optiske tæthed ved 490 nm (O.D.^gg) (y-akse) imod den reciprokke serumfortynding (x-akse) (se f. eks. figur 10 og 11 nedenfor). En stigning i hældning for reaktivitetskurven ved høj antigenkoncentration (se figur 10A) angiver tilstedeværelsen af et sekundært 20 undersæt af protaminreaktive IgM-antistoffer (lav affinitet) .

Denne stigning ses ikke ved afprøvninger af sera fra patienter, som er diagnosticeret med AIDS (se figur 11A). Derfor kan den iagttagne fraværelse af stigningen i hældningen på reaktivitetskurven ved høj antigenkoncentration, som er 25 repræsentativ for et undersæt af anti-protamin-IgM-antistof-fer med lav affinitet, tilvejebringe en yderligere modalitet til diagnose af AIDS eller ARC.

Et beregningssystem kan konstrueres til kvantificering af dette undersæt af protaminraktive IgM-antistoffer med 30 lav affinitet, dvs. til fastsættelse af den forholdsmæssige titer af det sekundære undersæt af protaminreaktive IgM-antistoffer, repræsenteret ved stigningen i hældning af reaktivitetskurven med høj antigenkoncentration, som følger: 2^g/ml og 20 /xg/ml udvælges empirisk som egnede forsøgsanti-35 genkoncentrationer. Stigningen af kurven mellem to punkter på x-aksen, serumfortyndingerne 1:100 (xl) og 1:500 (x2) , 18 DK 175152 B1 kan udtrykkes som forskellen mellem O.T.-værdierne på y-aksen for disse to punkter. Forøgelsen i stigning fra kurven for 2 antigen (protamin) til stigningen for kurven for 20 μg er (O.T.xl - O.T.x2) ved 20 Mg/ml antigen - (O.T.xl - O.T.x2) 5 ved 2 Mg/ml antigen og kan noteres som i 20 - i 2.

Derefter beregnes værdier for i 20 - i 2. En værdi på "15" kan betragtes som værende den nedre grænse for det "normale" interval (se afsnit 7.2 nedenfor). En værdi i det normale interval for et HIV-serapositivt serum forudsiger 10 en latensperiode på mindst 2 år, før AIDS manifesterer sig, og sandsynligvis længere, medens en lav (£ 20- 1 2) -værdi forudsiger, at fremadskriden til sygdommen er nært forestående .

Man må lægge mærke til, at det, når metoden er blevet 15 anvendt på andre peptider, som bærer det designerede, anti-geniske sted (se afsnit 5.3.2.), har vist sig, at man, resultater, selvom optimale resultater altid opnås, når forholdet mellem de to koncentrationer af antigenet er 1:10, også kan opnå gode resultater med andre koncentrationspar ved anven-20 delse af de forskellige alternative peptider, som bærer det designerede antigeniske sted.

Man må også lægge mærke til, at forskellige legemsvæsker fra en patient kan anvendes som afprøvningprøve, f.eks. serum eller plasma, idet serum foretrækkes til anvendelsen.

25 5.4. Terapi.

De protaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet ifølge opfindelsen har potentiel anvendelse ved terapi af AIDS og andre immun-abnormaliteter. Det er forudset, at anti-protamin-antistofferne med lav affinitet kan have en 30 rolle ved beskyttelse af et HIV-inficeret individ imod udbrud af AIDS. Antistofferne kan have lignende beskyttelsesvirkninger i individer, som er angrebet af, eller som er foruddispo-nerede for, andre tilstande med immunabnormalitet. Det er således forudset, at antistofferne ifølge opfindelsen kan 35 give kortvarig beskyttelse hos en vært ved passiv immunote-rapi, dvs. ved indgivelsen af således i forvejen dannet 19 DK 175152 B1 anti-protamin-IgM med lav affinitet. Humant immunoglobulin vil være foretrukket til en sådan anvendelse, fordi et heterologt immunoglobulin vil fremkalde en immunreaktion mod dets fremmede, immunogeniske komponenter. Undersættet af 5 protaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet ifølge opfindelsen vil kunne isoleres fra humane sera i pulje i tilstrækkelige mængder til anvendelse ved passiv inmmoterapi til forsinkelse af fremadskriden til AIDS i HIV-positive individer.

10 En molekylær clon med relation til de protaminreaktive antistoffer med lav affinitet ifølge opfindelsen kan fremstilles ved kendt teknik. Rekombinant-DNA-metodologi (se f.eks. T. Maniatis, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New 15 York) kan anvendes til konstruktion af nucleinsyresekvenser, som koder et monoclonalt antistofmolekyle eller en antigenbindende region deri, med egenskaber mage til dem hos de protaminreaktive antistoffer med lav affinitet.

Et monoclonalt museantistofmolekyle kan også være 20 værdifuldt til anvendelse ved passiv immunoterapi ved konstruktion af molekyler af såkaldt kimærisk antistof. Der kan fremstilles molekyler af kimærisk antistof indeholdende et museantigenbindende domæne med human-konstante regioner (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851; 25 Takeda et al., 1985, Nature 314:452).

Antistoffer kan renses ved kendt teknik f.eks. imrnuno-absorption eller immunoaffinitetschromatografi, chromatogra-fiske metoder, såsom HPLC (væskechromatografi med høj ydeevne) , eller en kombination deraf.

30 5.5. Diagnosesæt.

Opfindelsen angår også diagnosesæt til gennemførelse af de ovenfor beskrevne metoder. Ved en udførelsesform omfatter diagnosesættet (a) et peptid eller protein omfattende en sekvens på 4 arginylrester, herunder en triplet, i et 35 stykke på 6 aminosyrerester (en "arginylklynge") og (b) et konjugat af en specifik bindingspartner for IgM-antistoffer 20 DK 175152 B1 og en markering, som kan frembringe et påviseligt signal. I andre udførelsesformer kan diagnosesættet omfatte (a) et peptid eller protein omfattende en formafhængig epitop, hvilken epitop omfatter 4 arginylrester, herunder en triplet-5 klynge, og (b) et konjugat som ovenfor. Ved endnu en udførelsesform kan sættet omfatte (a) et peptid eller protein, som er karakteriseret ved evnen til at blive bundet af HPmAb, og (b) et konjugat som ovenfor. Reagenserne kan også omfatte hjælpestoffer, såsom puffermidler og proteinstabilseringsmid-10 ler, f.eks. polysaccharider. Diagnosesættet kan endvidere, hvor dette er nødvendigt, omfatte andre komponenter af det signalfrembringende system, herunder f.eks. midler til nedsættelse af baggrundsinterferens, kontrolreagenser og et apparat til genenmførelse af et forsøg.

15 I en anden udførelsesform omfatter diagnosesættet et konjugat af et antistof, som er reaktivt med et peptid eller protein omfattende en sekvens på 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester, og en markering, som kan frembringe et påviseligt signal. I andre udfø-20 relsesformer kan der anvendes et konjugat af en markering og et antistof, som er reaktivt med et peptid eller protein omfattende en formafhængig arginylklyngeepitop eller et peptid eller protein karakteriseret ved erkendelse af HPmAb. Hjælpestoffer som nævnt ovenfor kan også være til stede.

25 I en foretrukket udførelsesform anvendes der et ELISA- sæt omfattende en sekvens på 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester immobiliseret på et fast bærestof og et konjugat af en specifik bindingspartner for IgM-antistoffer og en markering, som kan frembringe 30 et påviseligt signal, og som er et enzym, såsom peberrod-peroxidase.

6. Eksempel: Protaminreaktive, naturlige IgM-antistof-fer i humane sera.

I de detaljerede eksempler er der beskrevet identifi-35 kationen af et sæt af naturlige IgM-antistof fer i humant serum, som er reaktive med protaminer, en klasse af basiske 21 DK 175152 B1 nucleoproteiner med lav molekylvægt, som syntetiseres de novo i testis efter puberteten, og som er særegne for sperma.

Disse antistoffer er blevet påvist ved ELISA i signifikant titer i alle 100 sera fra normale voksne mænd og kvinder og 5 i 26 ud af 28 sera fra normale børn med alder på fra 7 dage til 2 år. Fælles træk mellem de protaminreaktive IgM-anti-stoffer i sera fra børn og voksne er blevet fastslået ved påvisning af lighed i antigenerkendelse og reaktionskinetik. Derfor er protaminernés rolle som enten i immunogenisk stimu-10 lans eller antigenisk mål i dette sæt af naturlige antistoffer ikke sandsynlig.

Det antigeniske sted, som erkendes af de protaminreaktive serum-IgM-antistoffer, er blevet karakteriseret ved sammenligning med mønstret for antigenerkendelse af et mono-15 clonalt antistof mod humane spermaprotaminer (HPmAb). Ved anvendelsen af syntetiske peptider, som simulerer aminosyre-sekvenserne i forskellige segmenter af humant protamin 2 og af polyarginin, polylysin og histoner, som forsøgsantigener, ser det princip, som er karakteristisk for det antigeniske 20 sted, som erkendes af både HPmAb og serum-IgM-antistofferne, ud til at være arginylrester i klynge med et tilsyneladende minimumkrav på 4 arginylrester, herunder en triplet, i et stykke på 6 aminosyrerester, og for begge har det vist sig, at reaktionen ikke er afhængig af ladningstiltrækning. En 25 række immunoabsorptionsmetoder har antydet, at de protaminreaktive serum-IgM-antistoffer er et særskilt sæt med en høj grad af specificitet.

En undersøgelse af proteindatabaser har afsløret, at den formodentlige minimumepitop er til stede i 4 eller 5 30 humane, autogene proteiner, alle dele af immunsystemet, og i en række virusproteiner (tabel VII) .

6.1. Materialer og metoder.

6.1.1. Enzvmbundet immunosorbentafprøvning for serumantistoffer .

35 Den enzymbundne immunosorbentafprøvningsmetode (ELISA), ved hvilken data i nedenstående tabel I er blevet 22 DK 175152 B1 indsamlet, og som er blevet anvendt gennem hele dette studium, er tidligere beskrevet {F.H. Pruslin et al., 1986, J. Immunol. Methods 9±:99; T.C. Rodman et al., 1986, J. Immunol. Methods 94.: 105. Kort fortalt anbringes 50 μΐ antigen (speci-5 ficeret koncentration) i hvert enkelt hul på en fladbundet mikrotiterplade med 96 huller, tildækkes og holdes ved stuetemperatur i 4 timer. Hullerne vaskes 20 gange med 0,01%'s "TweenA-20” i phosphatpufret saltopløsning (PBS), fyldes derefter til randen med 5%'s okseserumalbumin (BSA) i PBS 10 tildækkes og holdes ved 5°C natten over. Pladerne bringes op på stuetemperatur og vaskes 20 gange, og 20 μΐ serum eller monoclonalt antistof (mAb) (fortyndet med 1% BSA) sættes til hvert enkelt hul. Efter to timer ved stuetemperatur vaskes hullerne 20 gange, og 50 μΐ peroxidasekonjugeret, 15 andet antistof [gede-F(ab1)2-anti-humant IgM, μ-kæde-speci-fikt, eller gede-F(ab1)2-anti-muse-IgA-, -IgG og -IgM] tilsættes. Pladerne tildækkes, holdes ved stuetemperatur i 1,5 timer og vaskes 20 gange. 50 μΐ substrat (orthophenyldi-amin) sættes til hvert enkelt hul, og efter 30 minutters 20 forløb standses reaktionen ved tilsætning af 50 μΐ Η2504 (2,5 N). Den optiske tæthed af den farvede opløsning i hvert enkelt hul aflæses ved 490 nm i en automatiseret pladeaflæser. Denne protokol er udviklet til maksimering af følsomhed og til minimering af tvetydighed stammende fra serumbag-25 grunds- og plade-til-pladeforskelle i bindingseffektivitet (T.C. Rodman et al., 1986, J. Immunol. Methods 94:105).

6.1.2. Antigener.

Renset protamin 1 (PI) og protamin 2 (P2) fremstilles som beskrevet (T.C. Rodman et al., 1982, J. Cell. Sci. 53.:-30 227) med modifikationer. Kort fortalt isoleres spermatozoer fra ejaculater i pulje og sonikeres til adskillelse af hoveder fra haler. Hovederne opsamles og adskilles ved behandling med "TritonA X-100" i en membranproteinf rakt ion og en DNA-nucleoproteinfraktion. Sidstnævnte opløseliggøres i 4 M 3 5 guanidiniumchlorid (GuCl) , 1% 2-mercaptoethanol, og behandles med ethylenimin til aminoethylering af cysteinylresterne i 23 DK 175152 B1 protaminerne, hvorved dannelse af disulfidbindinger forhindres, og dialyseres derefter imod 50 mM HCl og chromato-graferes på en "BioRexA 70"-kolonne med trinvis eluering med stigende koncentrationer af GuCl. Ring PI viser sig i 5 23%'s eluatet, rent P2 (a og b) viser sig i 27%'s eluat, medens en række phosphorylerede varianter af P2 sammen med en del af PI viser sig i en mellemliggende pulje (25%'s eluat). PI og P2 (23 og 27%'s eluaterne) dialyseres hver især natten over imod 50 mM HCl efterfulgt af en 2-3 timers 10 dialyse imod PBS, pH 7,2, og koncentrationen af hver enkelt måles ved en farvestofbindende afprøvning (M.M. Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248). De syntetiske peptider er blevet fremstillet ved metoden ifølge Merrifield (M.R. Merri-field 1963, J. Am. Chem. Soc. .85:2149) og renset ved HPLC 15 (væskechromatografi med høj ydeevne) med omvendt fase.

Polyarginin (molekylvægt 10.000-20.000 dalton) er fremskaffet fra Chemical Dynamics Corp. (Plainfield, NJ) , og polylysin (molekylvægt 15.000-30.000 dalton) er fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

20 6.1.3. Monoclonale antistoffer.

mAb mod humane spermaprotaminer (HPmAb) fås ved itnmun-icering af en BALB/c-mus med kerneproteinfraktionen fra humant sperma og fusion af miltcellerne med et ikke-udskil-lende musemyeloma. Ved præparering for det her beskrevne 2 5 studium er hybridomakulturen blevet genclonet ved begrænsning af fortyndingen til sikring af monoclonalitet. HPmAb isoleres fra ascitesfluidum ved ammoniumsulfatudfældning og renses ved dialyse imod PBS forfulgt af DEAE-kolonnechromatografi (diethylaminoethyl, ionbytning).

30 mAb imod kyllingemyosin, anvendt som kontrol, frem stilles ligeledes ud fra ascitesfluidum.

6.1.4. Humane sera.

De normale, humane sera er enten afgivet af laborato-riepersonel eller opnået som kliniske prøver, som kun er 35 identificeret med hensyn til fødselsdato, køn og "ingen fund".

24 DK 175152 B1 6.1.5. Immunoabsorpt ioner.

For hver enkelt af immunoabsorptionsmetoderne er den vægt af absorberende protein, som er angivet i beskrivelsen af tegningen (afsnit 4 ovenfor), blevet koblet til 0,5 g 5 cyanogenbromidaktiveret "Sepharose^4B" (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) i en 0,7 x 10 cm kolonne. 40-50 μΐ serum fortyndet 1:50 med 1%'s BSA/natriumboratpuffer, pH

7,5, lægges i lag på kolonnen, som derefter blandes ved at vendes rundt natten over ved 4°C. Det absorberede serum 10 tømmes ud af kolonnen og afprøves ved ELISA ved de noterede fortyndinger for reaktivitet med de designerede antigener.

6.1.6. Homologieftersøgnina.

En eftersøgning efter proteiner, som bærer et segment på 6 rester betegnet som et segment med et minimum på 4 15 arginylrester, herunder en klynge på 3, er blevet gennemført af Protein Identification Source hos National Biomedial Research Foundation og suppleret med egne undersøgelser af den øjeblikkelige litteratur.

6.2. Resultater.

20 6.2.1. Protaminreaktive antistoffer forekommer i humane sera.

Data i tabel I viser, at protaminreaktive antistoffer er til stede i alle sera fra en gruppe af normale individer i alderen 0-60 år.

25 25 DK 175152 B1

Tabel I

Forekomst af humane serumantistoffer, som er reaktive med humane spermaprotaminer.*

5 Alder Antal afprøvet IgM IgG

0 (navlestrengsblod) 1 01 1 dag 2 02 2 dage 2 02 10 4 dage 3 03 5 dage 2 02 7 dage 3 2 3 10 dage 3 23 12-28 dage 11 11 11 15 1-12 måneder 9 99 1-2 år 4 4 4 voksen mand 41 41 41 voksen kvinde 59 59 59 * Alle sera er blevet afprøvet ved fortyndinger 1:100, 1:500, 20 1:1.000 med humane protaminer i pulje som antigen. Alle sera, som er betegnet som positive, udviser reaktivitet ved fortyndingen 1:500. Titere og IgM- og IgG-reaktivitet med protaminer er blevet beregnet i forhold til reaktiviteten af et referenceserum (F.H.Pruslin et al., 1986, J. Immunol.

25 Methods 94.-.99; T.C. Rodman et al., 1986, J. Immunol. Methods 94.:105) . Negative IgM-vaerdier er under 1% af referenceserum, positive IgM-værdier for sera fra børn varierer fra 15% (7 dages nyfødt) til 65% af referenceserum, IgG-værdier er 40-90% af referenceserum. For sera fra voksne er intervallet 30 for IgM-reaktivitet med protamin 54-180% af referenceserum, og for IgG-reaktiviteten er det 50-200%. De totale IgG- og IgM-titere for alle sera falder inden for det normale område for de respektive aldersgrupper (C. de Preval, 1982, Immunology, J.F. Bach og R.S. Schwartz, udg., John Wiley & Sons, 35 New York, side 230).

26 DK 175152 B1

Som det er vist i tabel I er protaminreaktive IgG-antistoffer til stede i alle sera, og IgM-antistoffer er til stede i sera fra de individer, hvis immunsystemer er modnet tilstrækkeligt til frembringelse af en signifikanat 5 titer af IgM (C. de Preval, 1982, Immunology, J.F. Bach og R.S. Schwartz, udg., John Wiley & Sons, New York, side 230).

En proportionalitet for det totale IgM repræsenteret ved det protaminreaktive IgM er blevet beregnet for hvert enkelt serum for en gruppe fra hver enkelt individkategori (figur 10 1). Beregningen definerer titeren af protaminreaktivt anti stof sammenlignet med titeren af totalt IgM indenfor en tilsvarende afprøvningsprotokol. De værdier, som er afledt for denne proportionalitet, dvs. forholdet mellem protaminreaktivt IgM og totalt IgM, falder for alle befolkningsunder-15 grupper inden for et relativt snævert interval (figur 1) , hvilket antyder, at de protaminreaktive antistoffer repræsenterer en specifik komponent i normalt, humant serum.

6.2.2. Idenfikation af humane spermaprotaminer.

Kerneproteinerne i human sperma omfatter to protami-20 ner, betenget PI og P2. Bestemmelse af aminosyresekvenserne har vist, at P2 eksisterer som to varianter, P2a og P2b, som kun afviger ved, at P2a har tre yderligere rester ved sin NH2~ende (Tabel IIA) (D.J. McKay et al., 1986, Eur. J. Biochem. 156:5: H. Ammer et al., 1986, Biol. Chem. Hoppe-25 Sevier 367:515).

27 DK 175152 B1

1¾ K K

u w oi

L> Di OS

OS U Di S co w < oi oi oi oi u os Ni co oi oi oi H Oi Oi σ oi Ni u u oi CO CO Di

Oi Oi Oi

Oi X u oi σ co

Di Pi Di

X

Di Oi K

oi

Oi X o oi

CO H Oi CO Di U

α x

Oi Di Oi Oi U E-I

H Oi σ s s x co oi o! ci

Di J Η H Of Oi Ni

NS U H

0 Oi Di <U oi Oi Oi X Di H 4-1

Pi OS OS G V-l Di Ni Η

Oi H Oi CD <1) >< Pi J E co x oi oi

Oi Oi Ni σ G

N CO Oi ® (!) H Bi U

U U Di U >

01 U Oi W Ji oi oi O

Oi O Η I 0) t-ι CO X Di Λ co X U Di

CD H D< Pi Cti CN

CO 0) Di Di CO Cft

CG Oi Oi U

0) -H CO Oi u

> E >H X O H

ϋ 10 O Qi W Q) d)4-> Di Oi Oi Tt — co O co >h OS ή in in h cd t-i Oioioi 4J n n m

Μ Q Di x Oi a III

> ro O 4J 0) IO U) CN

CD E U CO Oi 4J Cd CO o

O t-l (0 CO CO

σωοοίχ ω4->4-) 0)^ΛΛΧΐ

HQ 4-) t-l t-l ϋ ¢) n CM N

EcopiOK t-iOO 0) Ό ft ft ft < o *4—1 I ·Η ·Η — '—·

J) N X to 4-4 4-) 4J

MG ' cd cd h oo m

M m Di E-I O - «! Λ 4-) Q

E H oi w C O) Tf Tt T) H 3 < o! ϋ ft ft Οι >-Οι·Η·Η·Η

CD X CO 4J 4J 4J

Q Π5 -Q Q. Οι α f0 1-1 CN (N · at at at h < ft ft ft cq aoiDi in o in

M H

28 DK 175152 B1

Det er fornyligt blevet påvist, at PI og P2a,b kan fås, i renset form og i højt udbytte, separat ud fra en gruppe af phosphorylerede varianter af P2 (F.H. Pruslin et al., 1987, Gamete Res. 1,8.:179). Disse fremstillinger af PI 5 og P2 foretrækkes til anvendelse som antigen ved fastfaseaf-prøvning, da de hver især er et lille molekyle med høj positiv ladning, hvilket begunstiger lineær orientering på polystyrenoverfladen, og der er ringe mulighed for intramolekylær tværbinding, da cysteinylresterne aminoethyleres ved frem-10 stillingsprocessen (se afsnit 6.1.2), således at dannelsen af disulfidbindinger blokeres.

6.2.3. Specificitet af monoclonalt anti-protamin-antistof for protaminer: Definition af epitooen.

Der er blevet fremstillet et mAb (HPmAb) ved anvend-15 else af nucleoproteinfraktionen fra humant sperma som det immunogen, som er reaktivt med PI og P2 og de phospho ry lerede varianter af P2 og ikke med nogen anden komponent i humant sperma (figur 2). Gentagne afprøvninger, ved anvendelse af forskellige portioner af renset PI og P2, har bekræftet, at 20 HPmAb, selvom reaktiviteten med hver enkelt er af samme størrelsesorden, udviser større reaktivitet med PI, når det afprøves imod molære ækvivalenter af PI og P2. Inspektion af den primære struktur af disse molekyler (Tabel IIA) afslører, at der ikke er udstrakt aminosyresekvenshomologi mellem 2 5 de to, positionshomologi for fire rester inden for et stykke på seks rester udvises kun i tre segmenter: aminosyrerne 7-12 i PI med 20-25 i P2b, 29-34 i PI med 34-39 i P2b og 45-50 i PI med 49-54 P2b. For hver enkelt, PI og P2b, udgør argininrester imidlertid 48% af aminosyresammensætningen, 30 og i hver af dem er et antal af arginylresterne i klynger. Selvom en større del af arginylresterne i P2 er grupperet i klynger på 2 eller flere rester, har PI en enkelt klynge med 6 arginylrester. Analyse af aminosyresekvenseme antyder, at erkendelse af protaminerne af HPmAb kunne være afhængig 35 af arginintætheden. Derfor er HPmAb blevet afprøvet imod tre syntetiske decapeptider (tabel IIB), som repræsenterer 29 DK 175152 B1 segmenter af"P2 udvalgt for forskellig tæthed af arginin og for variation i andre aminosyrer, og imod polyarginin, som repræsenterer maksimal arginintæthed.

Resultaterne er vist i tabel III.

5 Tabel III

Reaktivitet (OT49Q) af monoclonalt antiprotaminantistof med syntetiske peptider (tabel II) og polyarginin

Forsøg * Antigen Anti-prota- 10 mine-mAb Myosin^ Ikke-immuniseret (HPmAb), -mAb, museserum, 1:1.000 1:1.000 1:1000 fortynding fortynding fortynding 15 A Peptid 1 (50) 0,06 0,06

Peptid 1 (10) 0,00 0,01

Peptid 2 (50) 0,33 0,05

Peptid 2 (10) 0,27 0,01 N" 20 Peptid 3 (50) 0,25 0,05 < 0,04

Peptid 3 (10) 0,11 0,01

Polyarginin (20) 0,82 0,08 j

Polyarginin (10) 0,80 0,08 25 B Peptid 1 (50) 0,06 0,04

Peptid 2 (50) 0,32 0,03

Peptid 3 (50) 0,05 0,04 * Del A: Peptider ubehandlet. HPmAb er reaktivt med pep-30 tiderne 2 og 3 (ubehandlet) og med poyarginin.

Del B: Peptider aminoethyleret til blokering af dannelse af disulfidblandinger mellem cysteinylrester. Aminoethylering af peptider resulterer i eliminering af reaktivitet af HPmAb med peptid 3 og ingen ændring i reaktivitet for peptid 1 og 35 2. Kontrol-mAb- (anti-myosin-) og ikke -immuniseret rrtuseserum er ikke reaktive med peptiderne eller med polyarginin.

Den høje reaktivitet af HPmAb med polyarginin (tabel IIIA) understøtter den formodning, at erkendelsen er afhængig 30 DK 175152 B1 af arginylrester i klynger, og antyder, at andre aminosyrer ikke er essentielle for erkendelse af epitopen. Peptid 1 udviser ingen reaktivitet med HPmAb, hvilket antyder, at en klynge på 2 arginylrester er utilstrækkelig til erkendelse, 5 medens den beskedne, men virkelige reaktivitet af peptid 2 antyder, at en tæthed på 4 arginylrester, herunder en klynge på 3, i et stykke på 6 rester erkendes (tabel IIIA) . Den tilsyneladende uoverensstemmelse, som udvises af reaktiviteten af peptid 3 (tabel IIIA), hvor de 4 arginylrester 10 er enkeltvise, løses let. Når de syntetiske peptider anvendes som syntetiseret, dvs. ikke behandlet til blokering af cyste-in-cysteintværbindingen, udviser peptid 3 reaktivitet med HPmAb. Når de 3 peptider imidlertid behandles, såsom ved fremstillingen af protaminerne (se afsnit 6.1.2) til bloke-15 ring af dannelsen af disulfidbindinger mellem cysteinyl-resterne, elimineres reaktiviteten af peptid 3 med HPmAb (tabel HIB) . Denne iagttagelse fortolkes som antydende, at de to cysteinylrester i peptid 3 er tværbundet i den ubehandlede tilstand, hvilket resulterer i en form, i hvilken de 4 20 enkelte arginylrester bringes i sammenstilling, således at disse rester er i hensigtsmæssig nærhed eller hensigtsmæssigt orienteret, således at antistoferkendelse finder sted. Med cysteinylresterne blokeret frembringes denne form ikke, og peptid 3 er ikke reaktivt med HPmAb (tabel HIB) . I samklang 25 med denne iagttagelse ændres reaktiviteten af peptid 2, som formodentlig er afhængig af en tæthed på 4 arginylrester, herunder en triplet, og fraværelsen af reaktivitet i peptid 1 ikke ved behandlingen til blokering af cystein-cystein-tværbinding (tabel IIIB).

30 Det specifikke krav fra HPmAb om en epitop, som omfat ter en arginintriplet, er blevet yderligere dokumenteret, når HPmAb ingen reaktivitet udviser imod det mere dominerende sæt af basiske kerneproteiner, histonerne, og især imod det argininrige histon H3, hvori der er 2 arginindubletter, 35 resterne 52, 53 og 128, 129, men ingen arginintriplet (R.J. DeLange et al., 1972, Pore. Natl. Acad. Sci. USA 6.9:882) .

31 DK 175152 B1

Den mulighed, at erkendelsen af HPmAb af en klynge på 3 eller flere arginylrester kun eller hovedsagelig skyldes en koncentreret, høj positiv ladning, er blevet sonderet yderligere ved sammenligning af reaktiviteten af HPmAb med 5 polyarginin, som repræsenterer den maksimale positive nettoladning samt den maksimale arginintæthed, og med polylysin, som repræsenterer en næsten lige så høj positiv nettoladning (figur 3) . Afprøvningsdata i figur 3 antyder, at specificiteten af HPmAb ikke er en erkendelse af en epitop med høj 10 positiv ladning, men har relation til særegne egenskaber, som er iboende i en klynge af arginylrester.

Sammenligning af reaktivitetskurverne (figur 3 og 4) antyder større lighed i bindingskinetikken af HPmAb med PI og polyarginin end med PI og P2. For både PI og polyarginin 15 ser HPmAb ud til at være mættet ved lav antigenkoncentration.

For polyarginin kan denne mættethed postuleres at skyldes en højere gentagelsesorden i epitopen, men i både PI og P2 forekommer den formentlig minimale epitop på 6 aminosyrer (H.M. Geysen et al., 1987, Science 235:1184. i dette tilfælde 20 på 6 aminosyrer med 4 arginylrester, herunder en klynge på 3, 2 gange. Den større reaktivitet af HPmAb med PI (figur 4) kan derfor skyldes klyngen på 6 arginylrester, en arginintæthed, som ikke er til stede i P2 (tabel IIA).

Et resumé af ovenstående data fører til den formod-25 ning, at HPmAb reagerer med arginylrester i klynge, med aktivitetstyrken relateret til arginintætheden, med et minimumkrav på 4 i en epitop på 6 rester med 3 af arginylresterne i række eller tæt sammen til tilvejebringelse af en specifik konfiguration eller klynge på 3 arginylrester.

30 6.2.4. Protaminreaktive ΙαΜ-antistoffer til stede i normalt humant serum.

Egenskaberne af de protaminreaktive IgM-antistoffer i humant serum (tabel I) er blevet undersøgt ved sammenligning med de egenskaber, som er fastlagt for HPmAb, og ved 35 bestemmelse af, om reaktiviteten beror på et specifikt undersæt af humane IgM-antistoffer.

32 DK 175152 B1

De relative reaktiviteter af en repræsentativ gruppe af humane sera (voksen mand, voksen kvinde og barn) med PI og P2 og polyarginin er blevet afprøvet (figur 5). Til trods for de forventede forskelle i absolut titer antyder ligheden 5 mellem disse sera i rangorden for aktvitet med de 3 antigener ved hældningerne i kurverne for serumfortynding imod reaktivitet og i reaktionen på voksende antigenkoncentration, at serumaktiviteten er den hos et særskilt sæt IgM-antistoffer, som er til stede i alle normale sera. Data i figur 5 bekræf-10 ter også, at det protaminreaktive IgM-antistof sæt i sera fra børn har samme egenskaber som i sera fra voksne.

Overensstemmelse mellem immunoerkendelsesegenskabeme hos humane IgM-antistoffer og hos HPmAb er blevet påvist ved konkurrence-ELISA (figur 6). Inhiberingen ved hjælp af 15 HPmAb af serumantistof reakt iviteten med både PI og P2 er proportional med koncentrationen af HPmAb. Nærved 50% inhi-bering af serumreaktiviteten med PI opnås ved en HPmAb-for-tynding på 1:1000. I samklang med den iagttagelse, at HPmAb udviser større reaktivitet med PI end med P2 (figur 2B og 2 0 4) , angiver data i figur 6 også, at HPmAb udviser større konkurrence med PI-reaktiviteten af serumantistofferne end med P2-reaktiviteten.

Sikkerhed for, at blokeringen af serum-IgM-reaktivite-ten med PI og P2 skyldes en specifik epitoperkendelse af 25 HPmAb, er tilvejebragt ved parallelle afprøvninger gennemført med et muse-mAb til kyllingemyosin og med normalt (ikke-immuniseret) museserum, idet ingen af dem udviser nogen inhi-bering af IgM-reaktiviteten af humant serum med PI og P2.

Den omvendte konkurrenceafprøvning, dvs. blokering 30 af HPmAb med humant serum, viser også, at den af HPmAb erkendte epitop udviser homologi med den, som erkendes af de humane protaminreaktive IgM-antistoffer (tabel IV).

33 DK 175152 B1

Tabel IV

Konkurrence af humane sera (voksen mand, voksen kvinde, barn) med reaktivitet af HPmAb imod (A) PI (10 Mg/ml) og (B) P2 (10 //g (ml)* 5 ____________ HPmAb HPmAb

Serum (1:1.000 fortynding) (1:10.000 fortynding)

Forsøg (1:100 fortynding)_OT .% nedgang OT % nedgang 10 A 0 0,79 -- 0,74

Voksen mand 0,71 10 0,65 12

Voksen kvinde 0,70 12 0,65 12 15 Barn 0,68 14 0,63 15 B 0 0,64 -- 0,57

Voksen mand 0,61 -- 0,53

Voksen kvinde 0,62 -- 0,51 20 Barn 0,58 10 0,51 11 * ELISA-protokollen er blevet modificeret ved indsættelse af et enkelt trin: før tilsætning af HPmAb sættes 50 μΐ humant serum til hvert enkelt hul, og efter 1 time (ved stuetemperatur) fjernes serum, og hullerne vaskes. Reakti-25 viteten påvises ved binding til peroxidasekonjugeret anti-muse-IgA, IgG og IgM.

OT: optisk tæthed.

Selvom den maksimale inhibering af humant serum, som 30 er blevet afsløret ved den fastfaseblokeringsafprøvning, som er anvendt ved dette studium, kun er ca. 15% (tabel IV) , har et repræsentativt serum fra hver enkelt af de humane befolkningsklasser, voksen mand, voksen kvinde og barn, haft tilsvarende blokeringsaktivitet. Denne iagttagelse er 35 i overensstemmelse med, at sera fra voksne og børn udviser tilsvarende skelnen og aktivitet med de syntetiske peptider, som er anvendt til definition af epitopen af HPmAb (sammenlign tabel III og V).

34 DK 175152 B1

Tabel V

Reaktivitet 0T^9Q) af humane sera-IoM med syntetiske peptider fra tabel II): (A) Peptider ubehandlet (B) peptider aminoe-thvleret * 5 Serum

Forsøg Peptid Voksen mand Voksen kvinde Barn 1:100 1:500 1:100 1:500 1:100 1:500 A Peptid 1 0,12 0,09 0,02 0 0,07 0,02 10 Peptid 2 0,72 0,24 0,70 0,29 0,63 0,19

Peptid 3 0,82 0,24 0,47 0,18 0,56 0,20

B Peptid 1 0,06 0,02 ND ND ND ND

Peptid 2 0,78 0,24 ND ND ND ND

15 Peptid 3 0,05 0,01 ND ND ND ND

* Serumfortyndinger er vist over hver enkelt kolonne. IgM-antistoffer fra humant serum er ikke signifikant reaktive med peptid 1 ubehandlet eller behandlet, er reaktive med 20 peptid 2, både ubehandlet og behandlet, og er reaktive med peptid 3 ubehandlet, men ikke, når peptidet behandles til forhindring af cystein-cystein-tværbinding (se tabel III) .

ND: ikke bestemt.

25 Data i tabel V, som viser, at reaktiviteten af serum antistofferne med de syntetiske peptider er parallel med reaktiviteten af HpmAb, tilvejebringer også yderligere støtte for den betragtning, at epitoperne for de to kategorier af antistoffer er ens. IgM-antistofferne i alle tre sera erken-30 der, ligesom HPmAb gør (tabel III), peptid 2 i enten ethyle-ret eller ikke-ethyleret tilstand (cystein-cystein-tværbinding blokeret eller ublokeret), erkender ikke peptid 1 i nogen af tilstandene og erkender peptid 3, når det er ikke-ethyleret, men ikke, når det er ethyleret (tabel V).

35 Til sikring af, at serumaktiviteten med protaminer kan tilskrives et afgrænset sæt af IgM-antistoffer, er der blevet gennemført en række affinitetsabsorptionsprocesser.

Først er det blevet påvist, at disse antistoffer skelner 35 DK 175152 B1 mellem en fraktion af protaminer i pulje og en fraktion af spermamembranproteiner, der som tidligere vist (T.C. Rodman et al., 1985, Science 228:1211) omfatter otte eller ni proteiner, som er reaktive med naturligt forekommende antistoffer 5 i humant serum. Efter absorption på en affinitetskolonnne, hvortil der bindes stigende mængder af protaminer i pulje, nedsættes serumreaktiviteten med protaminer progressivt til 0, medens der kun iagttages en mindre nedsættelse af serumaktiviteten med spermamembranproteinfraktionen (figur 7).

10 Som ved analysen af epitopen for HPmAb er den mulighed blevet taget i betragtning, at reaktiviteten af serum-antistofferne primært er en ladningsafhængig reaktion. Ligeledes er der, da autoantistoffer til histoner er blevet identificeret i både normale og pathologiske, humane sera (Y. Shoenfeld 15 et al., 1987, Arthritis Rheum. 30:169), blevet foretaget en vurdering af evnen hos IgM-antistoffer fra humant serum til at skelne mellem protaminer og histoner. Som bekræftelse på den høje følsomhed af den ved dette studium anvendte ELISA -metode (F.H. Pruslin et al., 1986, J. Immunol. Methods 94:99; 20 T.C. Rodman et al., 1986, J. Immunol. Methods £4:105) er der i forsøgsserum blevet påvist en høj titer af IgM-antistof fer, som er reaktive med rensede kalvethymushistoner (figur 8A) . Efter absorption af en portion serum på en hi-stonbundet affinitetskolonne er denne reaktivitet imidlertid 25 elimineret, medens reaktiviteten af det histonabsorberede serum imod protaminer er praktisk taget uændret (fig. 8, B og C) .

Yderligere sikkerhed for, at protaminreaktiviteten af et undersæt af IgM-antistoffer i humant serum ikke stammer 30 fra ladningstiltrækning, er opnået ved hjælp af data i figur 9. Afprøvet med polylysin binder IgM-antistoffer i humant serum ikke til dette antigen. Når dette serum absorberes på en polylysinbundet affinitetskolonne, fjernes imidlertid reaktiviteten med polylysin, medens reaktiviteten med prota-35 miner og med polyarginin bibeholdes (figur 9B) . Når dette serum omvendt absorberes på polyarginin, bibeholdes reaktivi- 36 DK 175152 B1 teten med polylysin, medens reaktiviteten med protamin 1, protamin 2 og polyarginin fjernes (figur 9C).

6.2.5. Antigeniske steder erkendt af HPmAb og immu-noalobulinantistoffer fra humant serum svarer til hinanden 5 OQ er måske identiske.

Tabel VI er en summarisk sammenligning af reaktiviteten af HPmAb, et muse-anti-protamin-IgG udskilt af et hybri-doma og med rimeligt sikker monoclonalitet (se afsnit 6.1.3) og reaktiviteten af et specifikt undersæt af IgM-antistoffer 10 i humane sera.

Tabel VI

Resumé af overensstemmelse af antigenerkendelse af HPmAb og protaminreaktive serum-IgM-antistoffer.

15 _ ELISA Protamin-

Totalt reaktivt

Antigen HPmAb serum- serum-IgM

-IgM

2 0 _ PI ++ + P2 + ++

Polyarginin + + ++

Polylysin - + --* 25 Peptid 1 - ·

Peptid 1, ethyleret

Peptid 2 + +

Peptid 2, ethyleret + +

Peptid 3 + + 30 Peptid 3, ethyleret

Kalvethymushistoner i pulje - + -- **

Histoner H3 + *** 35 Spermamembranproteiner - + --**** * Serum absorberet på polylysin, polylysinreaktive antistoffer fjernet, protaminreaktive antistoffer bibeholdt.

** Serum absorberet på kalvethymushistoner, histonreaktive antistoffer fjernet, protaminreaktive antistoffer bibeholdt.

37 DK 175152 B1 *** Som for **.

**** serum absorberet på protaminer i pulje, protaminreaktive antistoffer fjernet, spermamembranproteinreaktive antistoffer bibeholdt.

5

Sammenligningen (tabel VI) angiver, at epitoperne for de to antistofsæt udviser en høj grad af homologi. Den principielle forskel, som er påvist af forsøgsprotokollerne ved dette studium, er en tilsyneladende rangorden for reakti-10 vitet med de tre antigener, humant spermaprotamin 1, humant spermaprotamin 2 og polyarginin (sammenlign figur 3 og 4 med figur 5). En mulig forklaring på denne forskel kan være, at de forskellige undersæt af protaminreaktive, humane IgM-antistoffer, dvs. dem med forskellige bindingsaffiniteter, 15 har moderat forskellige præferencer for arrangementet af arginylrester inden i epitopen eller for faktorer uden for epitopen, som har indflydelse på bindingsmønstrene (H.M. Geysen et al., 1987, Science 235:1184; T. Dryberg og M.B.

A. Oldstone, 1986, J. Exp. Med. 164:1344) . Det er imidlertid 2 0 indlysende, at den dominerende og fælles egenskab hos den epitop, som erkendes af både HPmAb og serum-IgM-antistoffer, er arginylrester i klynge.

Da de protaminreaktive IgM-antistoffer er til stede i sera fra børn, som ikke har været udsat for sperma eller 2 5 protaminer, er den mulighed blevet overvejet, at andre proteiner, som er autogene for mennesker med segmenthomologe til denne formodede epitop, kunne være beslægtede enten med hensyn til oprindelse (immunogenisk stimulering) eller til rolle (antigenisk erkendelse) med dette sæt af naturlige 30 IgM-antistoffer. En eftersøgning er blevet foretaget i prote-insekvensdatabaser for segmenter på 6 aminosyrer med 4 arginylrester, herunder en klynge på 3. Resulaterne er vist i tabel VII.

38 DK 175152 B1

Tabel VII

Andre proteiner end protaminer og spermaspecifikke histoner med et segment på 6 aminosyrer omfattende 4 arginylrester, hvoraf 3 er anbragt i en klynge.

5 _____

Protein Rester

Humant Komplement C3-forstadium 668-673 10 Komplement C4A 1.426-1.431 T celleoverfladeglyco- protein CD8-forstadium 208-213 T celleoverfladeglyco- protein CD4-forstadium 422-427 15 Udledt forstadium af i-kæde i histo compatibi-litetsantigen

Bacterier 20 Escherichia coli Replikationsiniteringsprotein 57-62 65-70

Transposase 139-144 nus-B-protein 3-8 25 30 S ribosomalprotein 2-7

Alanyl-tRNA-synthetase 430-435

Diaminopimelatdecarboxy-lase 403-408 DNA-dirigeret RNA-polyme- 30 rase 197-202 1.368-1.373

Serratia marcescens Anthranilatsynthetase (komponent II) 157-163

Vira 35 Herpes simplex Kinasebeslægtet, omdan- (type 1) nende protein 141-146

Herpes simplex (type 2) Glycoprotein D 364-369

Papillomavirus 40 (type 6b) Sandsynligt L2-protein 4-9

Papillomavirus (type II) Sandsynligt L2-protein 3-8 438-443

Papillomavirus 45 (type 33) Sandsynligt L2-protein 450-455

Sandsynligt E6-protein 140-145

Papillomavirus (type 8) Sandsynligt L2-protein 318-323 327-332 50 Hepatitis B-virus Kerneantigen 150-155 (undertype AYW og 155-160 6 undertyper) 164-169 171-176 39 DK 175152 B1

Epstein-Barr-virus Hypotetisk BHLF 1- 157-162 (stamme B95-8) -protein 282-287 407-412 532-537 5 2.085-2.090

Hypotetisk BORF 1- -protein 9-14

Sandsynligt glycoprotein 528-533 837-842 10 Hypotetisk BSLF 1- -protein 859-864

Hypotetisk BLLF 2- -protein 53-58

Hypotetisk BERF 3- 15 -protein 90-95 362-367

Hypotetisk BRLF 1- - protein 86-91

Adenovirus 2 Mindre kerneprotein 315-320 20 331-336

Sandsynligt tidligt E4-34K--protein 265-270

Sandsynligt tidligt E4-13K -protein 70-75 25 Sandsynligt tidligt E1B-21K- -protein 157-162

Sent Ll-52K-protein 53-58

Tidligt E2A-DNA-bindings-protein 46-51 30 Hovedkerneproteinforstadium 100-105 152-157

Terminalt protein 349-354 366-371

Adenovirus 5 Sandsynligt tidligt E1B-21K- 35 -protein 157-162

Sent Ll-52K-protein 54-59

Tidligt E2A-DNA-bindings-protein 46-51

Adenovirus 7 Terminalt protein 338-343 40 355-360

Rhinovirus 2 Genompolyprotein 1.396-1.401

Gul febervirus Genompolyprotein 1.720-1.707 (stamme 17D)

Sindbisvirus (to Strukturelt polyprotein 22-27 45 (stammer) Ikke-strukturelt polyprotein 1.886-1.891 T-celleleukæmivirus env-polyprotein 305-310 (HTLV II) HIV (HTLV III) Trans-aktiverende trans- 50 kriptionelt reguleringsprotein: version 1 61-66 version 2 39-44 40 DK 175152 B1

Sekvensen, 6 aminosyrer med 4 arginylrester, herunder en klynge på 3, er blevet identificeret i alle de protaminer fra hvirveldyr og ikke-hvirveldyr eller spermaspecifikke histoner, som er blevet sekventeret, i nogle få bakterierpro-5 teiner, hovedsageligt fra Escherichia coli, og i en række virusproteiner (tabel VII) . De eneste humane, autogene proteiner, som udviser denne sekvens, bortset fra protaminer, er 2 komplementforstadier, 2 T-celleglycoproteiner og 1 (udledt) variant af i-kæden i histokompatibilitetsantigener af klasse 10 II (tabel VII).

6.3. Diskussion.

Der er blevet påvist et sæt af naturlige IgM-antistof-fer i sera fra normale mænd og kvinder af alle aldersgrupper, hvilke antistoffer er reaktive med humane protaminer, de 15 grundlæggende kerneprotaminer i sperma, og det minimale antigeniske sted med 6 rester er blevet identificeret som et med 4 arginylrester, herunder en klynge på 3. Da disse antistoffer er til stede i sera fra børn, som ikke har været udsat for protaminer, argumenteres der imod immunogenisk 20 stimulering af protaminer som oprindelsen til disse antistoffer. Inden for sammenhængen af fornyligt erkendte, immunologiske mekanismer kan oprindelsen til disse antistoffer derfor tilskrives andre autogene molekyler med en sekvens, som er homolog med protaminets antigeniske sted, eller idio-25 toper på andre immunoglobuliner, som bærer billedet af det antigeniske protaminsted.

Muligheden for, at disse antistoffer er frembragt af et vilkårligt af de segmenter af humane proteiner, som er angivet i tabel VII, er interessant, da det antages, at de 30 alle er involveret i immunoregulatoriske mekanismer, og at de alle kan være til stede i immunsystemet hos nyfødte. Da på den anden side den neonatale mave-tarm-kanal er befolket med E. coli, må den mulighed, at E. coli-proteiner (tabel VII) tilvejebringer den indledende stimulans for frembringel-35 sen af de protaminreaktive antistoffer, også tages i betragtning. Den hypotese er blevet fremsat, at naturlige antistof- 41 DK 175152 B1 fer kan stamme fra stimulering ved hjælp af tarmkanalens flora (S.V. Boyden, 1966, Adv. Immunol. 5:1).

Det er også muligt, at virusproteiner kan være det antigeniske mål for disse antistoffer. Den hypotese er blevet 5 fremsat, at en rolle for naturlige antistoffer kan være et forsvar imod potentielle, inficerende stoffer (J.G. Michael et al., 1962, J. Exp. Med. 115:131).

Disse studier har tilvejebragt en afgrænsning af det antigeniske sted, hvormed et sæt af naturlige IgM-antistoffer 10 i humane sera er reaktivt.

7. Eksempel: Protaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet til stede i humane sera har relation til laten-sen af det humane immunomanaelvirus.

I beskrivelsens detaljerede eksempler er der beskrevet 15 anti-protamin-IgM-antistoffer med lav affinitetsbinding, i humane sera, hvis tilstedeværelse i sera har relation til latensperioden mellem infektion med humant immunomangelvirus (HIV) og udbrud af AIDS.

Latensperioden mellem infektion med HIV og den klini-20 ske manifestation af AIDS er yderst variabel, og den maksimale periode er endnu ikke blevet fastslået, lige som det er muligt, at nogle HIV-inficerede individer aldrig udvikler sygdommen. Der er her beskrevet identifikationen og en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af en faktor, som ser 25 ud til at angive evnen hos et HIV-inficeret individ til at modstå den patogene fremadskriden til AIDS. Denne faktor kan påvises i sera fra normale individer, og HIV-inficerede individer, som senere udviser en signifikant latensperiode, men den er fraværende eller mangelfuld i sera fra individer, 30 som er diagnosticeret med AIDS, og sera fra HIV-inficerede individer, som, skønt de er symptomfrie på blodprøveudtagningstidspunktet, skrider frem til AIDS i løbet af et relativt kort tidsrum. Denne faktor er et undersæt af en population af IgM-antistoffer, som er reaktive med et specifikt 35 antigenisk sted, som er karakteristisk for spermaprotaminer.

Det kritiske undersæt af protaminreaktive IgM-antistoffer 42 DK 175152 B1 ser ud til at være naturlige antistoffer. Den her beskrevne afprøvningsmetode tilvejebringer en modalitet til forudsigelse af den sandsynlige latensperiode for et HIV-inficeret individ.

5 7.1. Tilstedeværelsen i normale sera og fraværelsen i sera fra ÅIDS-patienter af orotaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet.

Det har vist sig, at der, når normale sera fra voksne afprøves ved ELISA med stigende koncentrationer af protami-10 ner, fremkommer en skarp stigning i hældningen for kurven over aktiviteten (optisk tæthed, O.T.) imod serumfortynding ved de højere antigenkoncentrationer (figur 10A). Summariske kurver (figur 10B) for en tilsvarende afprøvning af 20 tilfældigt udvalgte, normale sera fra voksne har verificeret, 15 at stigningen i hældning ikke er noget unormalt for et eller nogle få sera, men er en gennemgående egenskab hos normale sera fra voksne, hvilket antyder, at der, udover hovedantistof sættet, er et påviseligt sekundært undersæt af protamin-reaktive IgM-antistoffer. Den mulighed, at det sekundære 20 undersæt er et, som erkender en forskellig epitop på protam-inmolekylet, eller er et med samme erkendelsesspecificitet som hovedsættet, men som udviser forskellige bindingsaffiniteter, er blevet afprøvet. Sammenlignelige afprøvninger (figur 10C) med samme sera som dem, som er afprøvet imod 25 protamin ved som antigen at anvende et syntetisk decapeptid (DP) , som omfatter en kopi af det antigeniske sted, som erkendes af de serumprotaminreaktive IgM-antistoffer (se afsnit 6 ovenfor), har antydet, at stigningen i hældning for aktivitetskurven for disse sera med høj antigenkoncent-30 ration ikke har kunnet tilskrives et undersæt med forskellig erkendelsesspecificitet, men har kunnet fortolkes som afslørende et undersæt, som er reaktivt med samme antigeniske sted, men med en påviselig lavere affinitet.

Når en gruppe på 15 sera fra patienter diagnosticeret 35 med AIDS på samme måde er blevet afprøvet imod stigende koncentrationer af protamin, er stigningen i hældningen af 43 DK 175152 B1 reaktivitetskurven ved høj antigenkoncentration, fortolket som et tegn på et andet undersæt af protaminreaktive IgM-antistoffer, ikke blevet iagttaget ved nogen afprøvninger (figur 11), selv ikke ved afprøvninger af de sera (figur 5 11A) , som har en høj total titer af protaminreaktive IgM- antistoffer.

1.2. En kvantifikation af anti-protamin-antistoffer til forudsigelse af HIV-latens.

Da tilstedeværelsen i normale sera og fraværelsen i 10 AIDS-sera af en specifik faktor har antydet muligheden for en sygdomsrelateret mangel, er der blevet udviklet et beregningssystem til kvantifikation af denne faktor, dvs. til bedømmelse af den forholdsvise titer af det sekundære undersæt af protaminreaktive IgM-antistoffer repræsenteret ved 15 stigningen i hældning af reaktivitetskurven med høj antigenkoncentration. Ved undersøgelse af kurvesættene (figur 10A, B) er 2 Mg/ml og 20 ^g/ml blevet empirisk udvalgt som egnede forsøgsantigenkoncentrationer. Stigningen af kurven mellem to punkter på X-aksen, serumfortyndingerne 1:100 (xl) og 2 0 1:500 (x2) , kan udtrykkes som forskellen mellem O.T.-værdi erne på Y-aksen for disse to punkter. Forøgelsen i stigning fra kurven over 2 μg protamin til kurven over 20 μg er (O.T.xl-O.T.x2) ved 20 μg/ml protamin - (O.T.xl-O.T.x2) ved 2 μg/ml protamin og kan angives som i 20 - i 2.

25 Værdier for i 20 - i 2 er blevet beregnet for sera fra en gruppe voksne mænd og kvinder fra den almindelige befolkning (HIV-negative ved Western plet), en gruppe af patienter diagnosticeret som havende AIDS og en gruppe med risiko for AIDS (seropositive, homoseksuelle mænd) og diagno-30 sticeret som symptomfrie eller med mild immunomangel (lav T4-tælling eller lavt mitotisk stimuleringsindeks eller begge dele, men intet andet unormalt) på det tidspunkt, hvor blodprøven udtages. For nogle af sidstnævnte har en klinisk opfølgningsbedømmelse været til rådighed som anført.

35 Resultaterne er vist i figur 12.

Ved undersøgelse af figur 12A er en værdi på 15 blevet 44 DK 175152 B1 betragtet som den nedre grænse for det "normale" område.

På denne basis er procentdelen for hver enkelt gruppe af sera inden for normalområdet blevet bestemt (tabel VIII).

5 Tabel VIII

Protentdel af sera i det normale område for antiprotamin-IgM-niveauer for hver patientgruppe % i 10 Gruppe Totalt normalt område A normale 57 95 B AIDS 31 6 C symptomfrie --> AIDS 14 0 15 D symptomfrie --> symptomfrie 10 90 E symptomfrie --> ukendt skæbne 10 50

De data, som er vist i figur 12, antyder, at en i 20 20 - i 2-værdi i normalområdet i et HIV-positivt serum forudsi ger en latensperiode på mindst 2 år før en manifestation af AIDS, sandsynligvis længere, medens en lav i 20 -i 2-værdi forudsiger, at fremadskriden til sygdommen er nært forestående.

25 Den omstændighed, at værdierne for grupperne A og D

og værdierne for grupperne B og C udgør to adskilte fordelinger, medens værdierne for gruppe E omfatter begge fordelinger (figur 12) , antyder, at sættet af intervaller mellem HIV-seropositivitet og AIDS-manifestation for hver enkelt af 30 grupperne C og D er karakteristisk og relevant.

7.3. Bekræftelse af eksistensen af et undersæt af protaminreaktive antistoffer med lav affinitet.

Undersættet af protaminreaktive IgM-antistoffer repræsenteret ved i 20 - i 2 er blevet skelnet som værende med 35 "lav affinitet". Antistofaf f initet er et udtryk for den styrke, med hvilken antistoffet binder til et antigen, som det erkender. Denne binding er afhængig af den sammensatte virkning af de intermolekulære kræfter, f.eks. hydrogenbin- 45 DK 175152 B1 ding, hydrophobicitet, ionisk vekselvirkning (F. Karysh, 1962, Adv. Immunol. 2:1-40). Et mål for bindingsstyrken kan fås for bindingen af homogent antistof til en hapten eller en enkelt antigenisk determinant og, ved anvendelse af masse-5 virkningsloven, udtrykkes som affinitetkonstanten. Affinitetskonstanten har derfor direkte relation til modstandsevnen mod dissociation af antistof/antigen-komplekset.

Da det er kendt, at en række antistoffer med forskellige affiniteter fremkommer som reaktion på en enkelt immuno-10 logisk påvirkning (T.P. Werblin et al.,1972, Immunochem. 9:987-1011), har megen opmærksomhed været viet og mange metoder udviklet til bestemmelse af de separate, "tilsyneladende" affinitetskonstanter for en population af antistoffer, som er reaktive med samme antigeniske determinant {J. Steens-15 gaard et al., 1980, Mol. Immunol. 17:689-698; A.M. Lew, 1984, Immunol. Meth. 72:171-176; E. Sciutto et al., 1987,

Mol. Immunol. 24.:577-585). Selvom disse metoder og deres anvendelser er blevet modsagt og forsvaret, er et værdifuldt empirisk princip'dukket op: I et antistof, som er heterogent 20 for affinitet, vil antistofferne med høj affinitet binde til antigen og modstå dissociation fra antigen med større held end antistoffer med lav affinitet. Derfor kan antistof-understofpopulationer med forskellige affiniteter for samme antigen identificeres, ved at et fastlagt volumen af anti-25 stofblandingen (f.eks. serum) tillades at reagere med voksende mængde antigen. Efterhånden som koncentrationen af antigen vokser, mættes antistoffer med høj affinitet, og antistoffer med lavere affinitet vil reagere med antigen. Bevismateriale fra forsøg har også vist, at sådanne antistofserier hyppigt 30 har unimodale eller bimodale affinitetsfordelinger, med en eller to hovedunderpopulationer (A. Gandolfi et al., 1981, Theor. Biol. 92:57-84). I overensstemmelse med dette princip kan det undersæt af antistoffer, som er repræsenteret ved i 20 - £ 2, dvs. det, som påvises ved høj antigenkoncentration, 35 betragtes som repræsenterende en population med lavere affinitet end hovedpopulationen, som påvises ved lavere anti- 46 DK 175152 B1 genkoncentrationer.

Bekræftende beviser for den formodning, at i 20 -i 2-værdien repræsenterer et undersæt med lavere affinitet end hovedpopulationen i protaminreaktive IgM-antistoffer, 5 er opnået, ved at bindingsreaktionen er gennemført ved forhøjet NaCl-molaritet, hvilket eliminerer fasen med antistof-binding på grund af ionisk vekselvirkning. Fortyndingsmidlet for det afprøvede serum justeres fra 0,15 M NaCl til 0,3 M NaCl. Reaktivitetskurverne for de afprøvninger, som er gen-10 nemført i dette medium (figur 10D), viser, at forøgelsen i kurvens stigning ved høje antigenkoncentrationer (figur 10A, 10B) er elimineret, og at i 20 - i 2-værdierne er bemærkelsesværdigt formindskede. Eliminering af fasen med antistofbinding på grund af ionisk vekselvirkning, som antages 15 at være en bindingskomponent med lav energi (F. Karysh, 1962, Adv. Immunol. 2:1-40) ser ud til at resultere i en fortrinsvis eliminering af bindingen af undersættet af antistoffer med lav affinitet (figur 10A, 10D).

7.4. Sera fra børn indeholder en population af prota-2 0 minreaktive IgM-antistof fer. som er homogen i bindinasaf f ini- tet.

Som beskrevet ovenfor i afsnit 6 indeholder sera fra klinisk normale børn protaminreaktive IgM-antistoffer med samme antigenerkendelsesspecificitet som dem i sera fra 25 voksne. Når sera fra børn er blevet afprøvet med stigende koncentrationer af P2 (figur 13A) og DP (figur 13B) angiver det faktum, at kurverne er parallelle, at de protaminreaktive IgM-antistoffer i sera fra børn, til forskel fra normale sera fra voksne, er en homogen (eller unimodal) population 30 med hensyn til bindingsaffinitet.

7.5. Naturligt forekommende anti-protamin-antistoffer.

De protaminreaktive IgM-antistoffer, som findes i sera fra børn, kan ikke tilskrives immunogenisk stimulering ved hjælp af protamin, da protaminer synthetiseres de novo 35 i testis efter puberteten og heller ikke er inkorporeret i andre cellekerner end dem fra den spermiogeniske række.

47 DK 175152 B1

Heller ikke kan de protaminreaktive IgM-antistoffer i sera fra 12 dage gamle eller ældre (se afsnit 6 ovenfor) nyfødte tilskrives oprindelse hos moderen, da IgM ikke krydser placenta. Det identificerede, antigeniske sted for de protamin-5 reaktive antistoffer har en meget begrænset forekomst i andre humane, endogene proteiner end protaminer (se afsnit 6.2.5 ovenfor) . Det er derfor rimeligt at slutte, at de protaminreaktive IgM-antistoffer fra sera fra børn er naturlige antistoffer, og ved ekstrapolering at et af de to under-10 sæt af de protaminreaktive IgM-antistof fer fra sera fra voksne består af naturlige antistoffer.

Protaminer sekvestreres fra immunsystemet under deres syntese og cellulære inkorporering (M. Dym og D.W. Fawcett, 1970 Bio. Reprod. 3:308-326), og det er nu vist, at protami-15 ner er ikke-immunoundertrykkende, dvs. de inhiberer ikke T-cellemitogenesis in vitro, således som andre fra sperma stammende proteiner gør (T.C. Rodman et al., 1985, Science 228:1211-1215. Derfor kan sera fra mænd efter puberteten og kvinder med seksuel erfaring indeholde nogle protaminreak-20 tive antistoffer, som kan tilskrives immunogenisk frembringelse af protaminer. Derfor postuleres det, at de protaminreaktive IgM-antistoffer i humant sera fra voksne omfatter to undersæt, som har forskellig oprindelse: (1) naturlige antistoffer, (2) frembragte antistoffer.

25 Ovenstående diskussion og forsøgsresultater viser, at de protaminreaktive antistoffer i sera fra børn er naturlige antistoffer, og antyder, at de naturlige, protaminreaktive antistoffer i sera fra børn svarer til undersættet af protaminreaktive IgM-antistoffer med lav affinitet i sera 30 fra voksne.

Det foreslås, at manglen på et (potentielt naturligt) undersæt af protaminreaktive antistoffer med lav affinitet i HIV-positive sera (figur 11, 12) kan have relation til den patogenetiske fremadskriden til AIDS, enten som et indeks 35 eller som en bidragende faktor.

Den her beskrevne afprøvnings- og beregningsmetode 48 DK 175152 B1 tilvejebringer en modalitet til forudsigelse af den sandsynlige latensperiode, før AIDS sætter ind, for et HIV-infice-ret individ. En sådan information kan være værdifuld ved lægens behandling af individuelle patienter, ved projekterin-5 gen af det offentlige behov for faciliteter til lægebehandling og ved udvælgelsen af hensigtsmæssige personer til afprøvning af forelsåede terapeutiske midler.

8. Deponering af hvbridoma.

Hybridomacellelinie HPmAb, som producerer det mono-10 clonale anti-protamin-antistof HPmAb er blevet deponeret hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, den 23. marts 1988 og er blevet tildelt accessions nr. HB 9668.

Den foreliggende opfindelse skal ikke være begrænset i omfang af den deponerede cellelinie, da den deponerede 15 udførelsesform er tilsigtet som en enkelt illustration af et aspekt ved opfindelsen, og alle cellelinier, som er funktionelt ækvivalente, falder inden for opfindelsens rammer. Faktisk vil forskellige modifikationer af opfindelsen ud over dem, som er vist og beskrevet i nærværende beskrivelse, 20 være indlysende for fagfolk på området ud fra ovenstående beskrivelse og de ledsagende tegninger. Sådanne modifikationer skal forstås som faldende inden for rammerne af de tilhørende patentkrav.

Claims

49 DK 175152 B1

1. Humant eller naturligt IgM-antistof eller et fragment deraf omfattende Fv-regionen, kendetegnet ved, at det binder til et humant protamin.

2. Humant eller naturligt IgM-antistof eller et frag ment deraf omfattende Fv-regionen, kendetegnet ved, at det binder til et peptid eller protein omfattende 4 arginylrester, herunder en triplet, i en sekvens på 6 aminosyrerester.

3. Humant eller naturligt IgM-antistof eller et frag ment deraf omfattende Fv-regionen, kendetegnet ved, at det binder til et peptid eller protein omfattende en formafhængig epitop, som omfatter 4 arginylrester, herunder en tripletklynge.

4. Humant eller naturligt IgM-antistof eller et frag ment deraf omfattende Fv-regionen, kendetegnet ved, at det binder til en epitop, som er karakteriseret ved evnen til at blive bundet af et monoclonalt antistof HPmAb "som produceret af det hybridoma, som har ATCC accessionsnum- 20 mer HB 9668.

5. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det binder protaminet med lav affinitet i forhold til bindingsaffiniteter, som udvises af en hovedpart af protaminspecifikke IgM-antistoffer, som er til stede i sera 25 fra et sundt, voksent menneske.

6. Antistof ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det binder peptidet eller proteinet med lav affinitet i forhold til bindingsaffiniteter, som udvises af en hovedpart af protaminspecifikke IgM-antistoffer, som er til 30 stede i sera fra et sundt, voksent menneske.

7. Antistof ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det binder peptidet eller proteinet med lav affinitet i forhold til bindingsaffiniteter, som udvises af en hovedpart af protaminspecifikke IgM-antistoffer, som er 35 til stede i sera fra et sundt, voksent menneske.

8. Antistof ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, kende 50 DK 175152 B1 tegnet ved, at det er polyclonalt.

9. Antistof ifølge krav 5, 6 eller 7, kende tegnet ved, at det er polyclonalt.

10. Fragment af antistoffet ifølge krav 1, 2, 3 eller 5 4, kendetegnet ved, at det omfatter Fv-regionen.

11. Antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at protaminet er et humant protamin.

12. Antistof ifølge krav 11, kendetegnet ved, at protaminet er humant protamin 1 eller humant protamin 10 2.

13. Fremgangsmåde til prognose eller diagnose af AIDS hos et individ, kendetegnet ved, at man påviser eller måler protaminspecifikke IgM-antistoffer med lav affinitetsbinding, som er til stede i en legemsvæske 15 fra individet, hvor den lave affinitetsbinding udvises i forhold til bindingsaffiniteter af en hovedpart af protamin-specifikke IgM-antistoffer, som er til stede i legemsvæsken fra individet eller i legemsvæsken fra et sundt, voksent menneske, og hvori fraværelsen eller nedsatte niveauer af 20 antistofferne med lav affinitetsbinding i forhold til niveauerne i legemsvæsken fra et sundt, voksent menneske angiver tilstedeværelse eller indtræden af AIDS hos individet i løbet af ca. 2 år.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendete g- 25 net ved, at antistofferne med lav affinitetsbinding påvises eller måles ved en fremgangsmåde, som omfatter et første trin, hvor legemsvæsken bringes i kontakt med et peptid eller protein omfattende 4 arginylrester, herunder en triplet, i en sekvens på 6 aminosyrerester, således at der dannes et 30 immunospecifikt kompleks mellem antistoffer med lav affinitetsbinding og peptidet eller proteinet.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at antistofferne med lav affinitetsbinding påvises eller måles ved en fremgangsmåde, som omfatter, at le- 35 gemsvæsken bringes i kontakt med et peptid eller protein omfattende en formafhængig epitop, som omfatter 4 arginyl- 51 DK 175152 B1 rester, herunder en tripletklynge, således at der dannes et immunospecifikt kompleks mellem antistoffer med lav affinitetsbinding og peptidet eller proteinet.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendete g-5 net ved, at antistofferne med lav affinitetsbinding påvises eller måles ved en fremgangsmåde, som omfatter et første trin, hvor legemsvæsken bringes i kontakt med en epitop, som er karakteriseret ved evnen til at blive bundet af et monoclonalt antistof HPmAb som produceret af hybridomaet 10 med ATCC accessionsnummer HB 9668.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 13, 14, 15 eller 16, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter, at de protaminspecifikke IgM-antistoffer bringes i kontakt med en mærket bindingspartner for de protaminspecifikke IgM- 15 antistoffer, således at der sker immunospecifik binding af de protaminspecifikke IgM-antistoffer til bindingspartneren, og at den immunospecifikke binding til bindingspartneren påvises eller måles ved påvisning eller måling af mærkningen.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 14, 15 eller 16, k e n- 20 detegnet ved, at peptidet eller proteinet er immobi- liseret.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter, at de protaminspeci-fikke IgM-antistoffer bringes i kontakt med en mærket bin- 25 dingspartner for de protaminspecifikke IgM-antistoffer, således at der sker immunospecifik binding af de protaminspe-cifikke IgM-antistoffer til bindingspartneren, og at den immunospecifikke binding til bindingspartneren påvises eller måles ved påvisning eller måling af den immobiliserede mærk- 30 ning.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 14, 15 eller 16, kendetegnet ved, at antistofferne med lav affinitetsbinding påvises eller måles ved en fremgangsmåde, som yderligere omfatter et andet trin, hvor legemsvæsken bringes i kontakt 35 med peptidet eller proteinet, således at der dannes et immu-nospecifikt kompleks mellem de protaminspecifikke antistoffer 52 DK 175152 B1 og peptidet eller proteinet, og hvor peptidet eller proteinet forligger i en forhøjet koncentration i forhold til første trin, og således at der dannes en mængde immunospecifikke komplekser mellem antistofferne med lav affinitetsbinding 5 og peptidet eller proteinet, som er forøget i forhold til mængden i første trin.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at antistofferne med lav affinitetsbinding påvises eller måles ved en fremgangsmåde, som yderligere omfatter 10 et andet trin, hvor legemsvæsken bringes i kontakt med peptidet eller proteinet, således at der dannes et immunospeci-fikt kompleks mellem de protaminspecifikke antistoffer og peptidet eller proteinet, og hvor peptidet eller proteinet foreligger i en forhøjet koncentration i forhold til første 15 trin, og således at der dannes en mængde immunospecifikke komplekser mellem antistofferne med lav affinitetsbinding og peptidet eller proteinet, som er forøget i forhold til mængden i første trin.

22. Diagnosesæt, kendetegnet ved, at det 20 i én eller flere beholdere omfatter (a) et peptid eller protein omfattende en sekvens på 4 arginylrester, herunder en triplet, i en sekvens på 6 aminosyrerester og (b) et konjugat af en specifik bindingspartner for 25 IgM-antistoffer og en mærkning, som kan frembringe et påviseligt signal.

23. Diagnosesæt, kendetegnet ved, at det i én eller flere beholdere omfatter (a) et peptid eller protein omfattende en sekvens på 30. arginylrester, herunder en triplet, og (b) et konjugat af en specifik bindingspartner for IgM-antistoffer og en mærkning, som kan frembringe et påviseligt signal.

24. Diagnosesæt, kendetegnet ved, at det 35 i én eller flere beholdere omfatter (a) et peptid eller protein karakteriseret ved evnen 53 DK 175152 B1 til at blive bundet af et monoclonalt antistof HPmAb som produceret af hybridomaet med ATCC accessionsnummer HB 9668 og (b) et konjugat af en specifik bindingspartner for et 5 IgM-antistof og en mærkning, som kan frembringe et påviseligt signal.

25. Diagnosesæt ifølge krav 22, 23 eller 24, kendetegnet ved, at proteinet er et protamin.

26. Diagnosesæt ifølge krav 22, 23 eller 24, k e n-10 detegnet ved, at peptidet eller proteinet er immobi- liseret.

27. Diagnosesæt ifølge krav 26, kendetegnet ved, at den specifikke bindingspartner er et anti-IgM-antistof, og at mærkningen er et enzym.

28. Diagnosesæt, kendetegnet ved, at det i én eller flere beholdere omfatter et konjugat af (a) et antistof, som er specifikt for et peptid eller protein omfattende 4 arginylrester, herunder en triplet, i en sekvens på 6 aminosyrerester, og (b) en mærkning, som kan frembringe 20 et påviseligt signal.

29. Diagnosesæt, kendetegnet ved, at det i én eller flere beholdere omfatter et konjugat af (a) et antistof, som er specifikt for et peptid eller protein omfattende en formafhængig epitop, som omfatter 4 arginylrester, 25 herunder en tripletklynge, og (b) en mærkning, som kan frembringe et påviseligt signal.

30. Diagnosesæt, kendetegnet ved, at det i én eller flere beholdere omfatter et konjugat af (a) et antistof, som er specifikt for et peptid eller protein karak- 30 teriseret ved evnen til at blive bundet af et monoclonalt antistof HPmAb som produceret af hydridomaet med ATCC accessionsnummer HB 9668 og (b) en mærkning, som kan frembringe et påviseligt signal.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendete g-35 net ved, at den yderligere omfatter, at de protaminspe- cifikke IgM-antistoffer med lav affinitetsbinding bringes i 54 DK 175152 B1 kontakt med en mærket bindingspartner for de protaminspe-cifikke IgM-antistoffer med lav affinitetsbinding, således at der sker immunospecifik binding af de protaminspecifikke IgM-antistoffer med lav affinitetsbinding til bindingspart-5 neren, og at den immunospecif ikke binding til bindingspartneren påvises eller måles ved påvisning eller måling af mærkningen.

32. Antistof af IgM-isotypen, kendetegnet ved, at det konkurrerende inhiberer den immunospecifikke 10 binding til en epitop af monoclonalt antistof HPmAb som produceret af hybridomaet med ATCC accessionsnummer HB 9668.

33. Antistof af IgM-isotypen, kendetegnet ved, at det er konkurrerende inhiberet i sin immunospecifikke binding til en epitop af monoclonalt antistof HPmAb som 15 produceret af hybridomaet med ATCC accessionsnummer HB 9668.