JPH03500964A - プロタミン反応性ＩｇＭ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロタミン反応性ＩｇＭ抗体 １、序 本発明は、プロタミン反応性のＩｇＭ抗体、及び、予知、診断ならびに治療にお けるその使用に関する。特に、本発明は、６個のアミノ酸残基片肉で、トリプレ ットを含む４個のアルギニル残基を含む配列を認識することができ、抗原に対し て低い結合親和性を示す、プロタミン反応性の血清ＩｇＭ抗体に関する。プロタ ミン反応性の血清１ｇＭ抗体のこの低親和性抗体のサブセットは、エイズ（Ａ　 ｌ　１．ｓ）の予知又は診断のためにアッセイすることができる。低親和性のプ ロタミン反応性血清Ｉｇ？ｌ抗体の検出及び／又は測定のための方法及び診断キ ットが提供される。

２、血里勿宜且 ２．１．ブ旦叉ｌｌ プロタミンは、精子細胞及び複数の精子以外の細胞には生じないＤＮＡに結合す る（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　１ｙｉｔｈ）、極めて塩基性の小さな核蛋白質であ る。精子完成、即ち、思春期後の精巣の輸精管の免疫学的に隔離された内腔にお いて生ずる工程であって、ここでは上記蛋白はヒストンを置換し、そして、精子 のＤＮＡに結合されるのであるが、この精子完成の間に、この蛋白は、新たに合 成され、そして、精子を形成する細胞の核にとりこまれる（Ｇｉｌｕｌａ、　Ｎ 、Ｂ、　＋ら、　１９７６、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、５０　：１４２）。

プロタミン１　（もともとはｐ１５と命名）は、４つの変異体の中に生ずるヒト のプロタミンである。それは、り同定され、特性化された（Ｒｏｄｍａｎ＋Ｔ、 Ｃ，、ら、　１９８３゜ＧａｍｅｔｅＲｅｓ、　８　：１２９−１４７）。

ヒトプロタミン２は長いこと認識され、そして、２個の変異体として生ずること が知られており　（Ｋｏｌｋ。

Ａ、Ｈ，及びＳａｍｕｅｌ、Ｔ、＋１９７５．Ｂｉｏｃｈｉｏ＋、Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、Ａｃｔａ　３９３：３０７−３１９）、後にプロタミン２ａ及び２ｂと命名 された（Ｍｃｋａｙ＋Ｄ、Ｊ−＋ら、　１９８６．　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　１５６：５−８）。

マウス精子クロマチンの２個のプロタミンに特異的な多価ウサギ抗血清が分離さ れており、これは分布及びＤＮＡ会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）についてプロ タミンを特性化し、かつ、哺乳類プロタミンの間の免疫化学的な交差反応性を認 識するために使用されてきた（Ｒｏｄｍａｎ。

Ｔ、Ｃ，ら、　１９８４．Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１５０：２６９−２８１ ）。

ヒトプロタミンに対するポリクローナルウサギ抗血清が、精子完成の間のプロタ ミン転移に対するヒストンの免疫組織化学的研究において使用されてきた（１’ １ｏｕｘ。

ｃｈ、　、ら、１９８８．Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、８２：３５−４２）　 、この研究におけるイムノアッセイの検出工程は、ウサギＩｇＧに対する抗体の 使用により実施された。

ＩｇＧ　１及びＩｇＧ２のアイソタイプのヒトプロタミンに対するマウスのモノ クローナル抗体が分離され、そして部分的に特性化された（Ｓｔａｎｋｅｒ、　 Ｌ、）１．　＋ら、　１９８７゜）！ｙｂｒｉｄｏｍａ　６　（３）　：　２９ ３−３０３）。記載された抗体はいずれもポリアルギニンとは反応しなかった。

５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は凝集反応試験により分離された 精子抗原と反応性の抗体をアッセイするウェスタンプロット法により、精子抗原 に対する自己抗体が精管切除された雄において検出された　（Ｈａｌｄ、Ｊ−＋ ら、　１９８７．Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、１０：１５−２６） 。

プロタミンは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて移動するには余りに塩基 性が強く、クロマチンが非凝縮（ｄｅｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）されなければアクセ スできない免疫反応箇所を有するので、この報告されたアッセイは抗プロタミン 抗体を検出しなかった（Ｒｏｄ＋＋＋ａｎ、　Ｔ、Ｃ，、ら、　１９７０゜Ｊ、 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、８０：６０５−６２０）。

２．２．且然坑生 まだ、はとんど理解されていない免疫系の一部分である自然抗体のレパートリ− は、初期には、特異的な感染物質に対する第１次防御を提供すると考えられたが （Ｍｉｃｈａｅｌ　＋　Ｊ、　Ｇ　、　＋　１９６９＋　Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

４８：４３−６２）　、最近では、自己免疫のコントロールにおける可能な役割 （Ｃｏｈｅｎ　、　Ｉ　、　＋ら、１９８６．Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．Ｔｏｄａｙ　 ７：３６３−３６４）、又は、免疫調節の他の相（Ｄｉｇｈｉｅｒｏ＋Ｇ、、ら 。

１９８５、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４ニア６５）に関して、ますます興味のあ る推測の主題となっている。自然抗体は、しばしば、誘引された対応物よりも、 より低い親和性を有する対応物として指名されている（例えば、Ｄａｙ、Ｅ、Ｄ 、ら、１９８６、　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、　１３：１４３−１５８　 ；　Ｈｏｃｈ、Ｓ、、ら、１９８６．Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：８９２−８９７；　Ｔｏｎｇｉｏ、Ｍ、Ｍ、、ら＋　 １９８５＋　ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｆｇｅｎｓ　２６：２７−２８５）。

２．３．２ 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は減少した細胞媒介性免疫反応により第一義 的に起こされた重い免疫不全により特徴づけられる病気である（Ｇｏｔｔｌｉｅ ｂ、Ｍ、、ら、１９８１゜Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０５：１４２５；　Ｍ ａｓｕｒ、Ｊ、、ら、　１９８１．Ｎ、Ｅｎｇｌ。

Ｊ　、　Ｍｅｄ　、　３０５　：１４３１）免疫不全の状態は、減少したＴ、（ Ｔ−ヘルパー）リンパ球、通常のＣＤ　４　（Ｔ４）　”　？　ＣＤ　８　（Ｔ ８）　”の細胞比の逆転、リンパ球減少症、日和見感染の増大した発病率（例え ば、ニューモシスチスカリニフェーモニア（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒ ｉｎｉｉ　ｐｎｅｕｏ＋ｏｎｉａ）、及び／又は悪性性（例えば、リンパ腫又は カボジ肉腫）により特徴づけられる。症状は、一般に致命的である。

ＡＩＤＳを引き起こすものは、７１９７７球に感染する、今日、ヒト免疫不全ウ ィルス（ＨＩＶ）とよばれるレトロされる）（Ｇａ１１ｏ、Ｒ，Ｃ，、ら＋１９ ８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５００；Ｂａｒｒｅ−５ｉｎｏｕｓｓｉ、Ｆ、 、ら、　１９８３，５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８；　Ｆｅｏｒｉｎｏ、Ｐ。

Ｈｌら、　１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：６９；　Ｌｅｖｙ＋Ｊ−Ａ、＋ 　ら、　１９８４゜５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：８４０）、　ＣＤ４　Ｔ細胞表面 分子はこのウィルスの受容体として同定され、そして、このウィルスのその後の 細胞溶解活性はこの細胞集団を消耗させる（ＫＩａｔｚａ＋ａｎ、Ｄ、、ら＋　 １９８５．Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア６７；　Ｄａｌｇｌｅｔｓｈ。

Ａ、Ｇ、、ら、１９８４＋Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア６３；　ＭｃＤｏｕｇａｌ 、Ｊ、Ｓ、、ら。

１９８６、５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：３８２；　Ｍａｄｄｏｎ、Ｐ、Ｊ、＋ら、 　１９８６．　Ｃｅｌ　１４７：３３３）。

患者は、（１））ＩＩＶの存在試験が陽性で、特別の指示的な疾病（新生物、日 和見感染）の１又はそれ以上が存在する時、又は（２）　ＨＩＶ感染に対する実 験室的証拠がない場合、他のすべての免疫不全の原因が除外され、そして、低Ｃ Ｄ４’　Ｔリンパ球数（４００／ａ＋ｍ″以下）であるとともに指示的な疾病の １つが存在するとき、この患者はエイズ（ＡＩＤＳ）と診断される。エイズ関連 複合体（ＡＲＣ）は、ＨＩＶ試験が陽性であり、永続的な一般的なリンパ節障害 、長期持続性の発熱、体重減少、永続的な下痢、又は極端な疲労を有するが、成 熟したエイズに関連する指示的疾病の１つを未だ示していない患者に関する。

多くの研究は、エイズの危険のある有意の因子は、受容的な肛門性交であること を示している（例えば、Ｇｏｅｄｅｒｔ、Ｊ、Ｊ、、ら＋１９８４．Ｌａｎｃｅ ｔ　ｉｉニア１１−７１６；　ＤａｒｒｏｗＷ、Ｗ、、ら、１９８７．Ａｍ、Ｊ 、Ｐｕｂ、Ｈｅａｌｔｈ　７７：４７９−４８３；　Ｋｉｎｇｓｌｅｙ。

Ｌ、Ａ、、ら、１９８７．Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：３４５−３４８）。増大する危 険は、一般には、かかるルートによるウィルスの伝播の効率性に帰因する。しか しながら、ある考察は、旧Ｖ感染の病理学的な結果において、精子成分のありう る密接な関係についてなされている（Ｍａｖｌｉｇｉｔ、Ｇ、Ｍ、、ら、１９８ ．ｉ。

Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃｉ、２５１：２３７−２４１；　Ｒａｎｋｉ　Ａ −＋ら、　１９８５゜Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４５：４６１６Ｓ−１８Ｓ；　Ｉ ’ｉａｔｍａｎ、に、Ｖ、、ら、１９８６．Ａｕ５ｔ。

Ｎ、Ｚｊ、Ｍｅｄ、１５ニア５７−７６０）。ＨＩＶニ感染された血友病の潜伏 期間は、他の旧νが感染したグループの潜伏期間よりも長いという最近の報告が あることも意味があるかもしれない（Ｅｋｅｒｔ、ｌ’１．．１９８７．Ｎａｔ ｕｒｅ　３２９：４９４）。

アダムら（１９８８，Ｃ１ｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｏｕｎｕｎｏｐａｔｈ ｏｌ、　４５：４４２−４４９）は、ＡＲＣ又はエイズ患者の血清中の精子及び 精子のプラズマ成分に対する抗体の有意の影響が存在することを報告した。抗体 は、抗体の精子プラズマに対する凝集反応により、及び固定されたヒト精子上の 間接的な免疫蛍光法により、アッセイされた。プロタミンは核蛋白であり、それ ゆえ抗体結合及び凝集反応のための精子プラズマにおいてはアクセスできなし） であろうこと、及び、プロタミンの免疫反応箇所は、精子クロマチンが最初に非 凝縮されていなければ、免疫蛍光アッセイにおける抗体結合に対してはアクセス しえないので、使用されたアッセイ法のいずれもプロタミン−反応性の抗体を検 出することはできなかった（Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ、Ｃ，ら、１９７０．Ｊ、Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、８０：６０５−６２０；Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ、Ｃ，、ら、１９８４ ．Ｅｘｐ、Ｃｅ１１．Ｒｅｓ、１５０：２６９−２８１）。

３、会所Ω景要 本発明は、プロタミン反応性ＩｇＭ抗体、及び、予知、診断ならびに治療におけ るその使用に関する。特別の態様において、本発明は低親和性の結合を存するプ ロタミン反応性血清Ｉｇ）Ｉ抗体に関する。特に、かかる抗体は６アミノ酸残基 配列内で、トリブレットを含む、４個のアルギニル（ａｒｇｉｎｙり残基を存す る配列を認識することができる。かかる抗体の自然抗体（非誘引のもの）であろ う。

血清のプロタミン反応性のＩｇＭ抗体の低親和性サブセットは、エイズの予知又 は診断のためにアッセイできる。かかる抗体は正常の被検者及び旧Ｖに感染され た有意の潜伏期間を示す者の血清において検出可能であるが、しかし、エイズと 診断されたもの、及び、サンプリング時には無症候と考えられたが、比較的に短 時間内にエイズに移行するものの血清には存在しないか、不十分である。本発明 はエイズ及び他の免疫異常の予知及び診断のためのプロタミン反応性の血清Ｉｇ Ｍ抗体の低親和性サブセットの検出及び／又はその定量測定のための方法、及び 、診断用キットを提供する。

特別の態様において、かかる診断用キットは、（ａ）６個のアミノ酸残基の配列 内にトリプレットを含む４個のアルギニル残基をもつ配列から成るペプチド；及 び［有］）ＩｇＭ抗体のための特別の結合パートナ−と検出可能なシグナルを発 生することができるラベルの接合体（ｃｏｎ−ｊｕｇａｔｅ）　とから成る。

３．１．冗−一二設 ここで使用されるとき、次の略号は、以下に示す意味をもつであろう。

エイズ（ＡＩＤＳ）＝後天性免疫不全症候群ＡＲＣ＝エイズ関連複合体 （ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｘ）ＢＳＡ　＝牛血清アルブミン ＥＬＩＳＡ　＝酵素結合イムノソルベントアッセイＦｖ　＝抗体分子の可変領域 又は抗原結合箇所。

これはＦａｂ、　Ｆ（ａｂ’）ｚ、　Ｆａｂ’等を含む分子（これに限定されな い）のイディオ タイプを含有するいかなる断片でもよ い。

ＨＩＶ　＝ヒト免疫不全ウィルス ＨＰｍＡｂ　＝ヒト精子プロタミンに対するモノクローナル抗体 ｍＡｂ　＝モノクローナル抗体 ＰＩ　＝精製ヒトプロタミンＩ Ｐ２　＝精製ヒトプロタミン２ ＰＡＧＥ　−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法ＰＢＳ　＝燐酸緩衝食塩水 ４、凹皿Ω脱肌 第１図。ヒト血清中の全ＴｇＭに対するプロタミン反応性のＩｇＭの割合。各々 の血清に対する全１ｇＭに関する値（Ｘ）は参照血清（第６．１．１項参照）の パーセントとして導かれており、プロタミン反応性１ｇＭに対する値（Ｙ）は同 じ参照血清のパーセントとして導かれている。プロットされた値は各血清に対す るＸ／Ｙである。

第２図。Ａ：ヒト精子蛋白の分画（レーン１〜５）ＳＯＳ　ＰＡＧＥ　、レーン （６〜８）酢酸−尿素ＰＡＧＥ、（レーン１）分子量マーカー：　１４．４．２ ０．３０．４３．６７、９４ｘ１０３ダルトン；（レーン２）テイル（尾部）蛋 白；（レーン３）頭部膜のトライトンＸ−１００可溶性蛋白；（レーン４）核蛋 白のＢｉｏＲｅｘ−７０クロマトダラムの８％ＧｕＣ１溶出液；（レーン５）１ ６％溶出液；（レーン６）２３％溶出液（ＰＩ）：（レーン７）２５％溶出液（ Ｐｉ及び燐酸化されたＰ２）；　（レーン８）２７％溶出液（Ｐ２）。Ｂ：各精 子の蛋白分画とのＨＰ＋＋＋Ａｂ反応性のＥＬＩＳＡ値。（レーン２〜５）・・ ・・・・・・・；　（レーン６）−・−・−；　（レーン７）−；　（レーン８ ）　−−−−−−−−ＨＰｍＡｂは３つのプロタミン分画とのみ反応性である（ レーン６゜７、及び８）。

第３図。上昇する濃度におけるＨＰ＋ｎＡｂのポリアルギニン囚及びポリリジン ■との反応性。２μｇ／ｄポリアルギニンー・−・−；５，１０．又は２０μｇ ／ｄのポリアルギニン・・・・・・・・：　２．　５．１０．又は２０　ｔｔ　 ｇ／ｄのポリリジン□。各プロットされた値は、重複して行われた、４つのアッ セイの平均を表わしている。

第４図。ＨＰｍＡｂの■２μｇ／−でのＰｌ−・−・−；５μｇ／ｍｌでのＰｌ ・・・・・・・・；１０又は２０μｇ／戚のＰｉ　−□；■２ｕｇ／ｌｄｌのＰ ２−・−・−；　５　ｐｇ／ｍｌ＝・・；１０μｇ／ｒｎｌ　；２０μｇ／ｍ− −−−−−−−との反応性。各プロットされた値は重複して行われた５個のアッ セイの平均を表わす。ＰｌとＰ２の等モル（等しい重量）に関し、ＩＩＰｍＡｂ の反応性はＰｌの低抗原濃度でより大きく、そして、飽和している。

第５図。ヒト血清ＩｇＭの■Ｐ１．■Ｐ２．（Ｇｌポリアルギニンとの各抗原の ２μｇ／ｒｔｄｌ−・−・−；５μｇ／ｒｎｌ・・・・−−−・；　１０ｕｇ／ ｍｆｌ　−；　２０ｕｇＩｙ＆−−−−−−における反応性。（左欄）小児（６ 月）の血清；　（中欄）成人男；　（右＠）成人量。

第６図。■Ｐ１及び■Ｐ２に対するＨＰｍＡｂのヒト血清１ｇＭ反応性との競合 。標準ＥＬＩＳＡプロトコール（第６、１．１項参照）は、次のように修正して 実施された。

抗原が結合したくぼみ（ｗｅｌｌｓ）にヒト血清を加える前に、希釈度を１　： 　１０００−　；　１　：　１０．０００・・・・・・・・；非存在−−−−− −−−で５０μｌのＨＰ＋ｎＡｂを各くぼみに１時間置き、次に洗い出し、そし て記載した希釈度のヒト血清を加えた；反応性はペルオキシダーゼ共役の抗ヒト ＩｇＭを使用して検出された。■１　：　１０００の希釈度のＨＰｎ＋Ａｂは、 Ｐｌに関し、１　：　１００及び１　：　５００希釈の血清において〜４５％の 血清の反応性を阻止した。■１：　１ｏｏｏ希釈のＨＰｍＡｂは、Ｐ２に関し、 血清が１　：　１００に希釈された時は、〜２５％の血清の反応性を、血清がｉ 　：　ｓｏｏに希釈された時は、〜４５％の反応性を阻止した。

第７図。プールされたプロタミンに血清を吸着させた後の、ヒト血清ｘｇ？Ｉの ＰＩ　−；　Ｐ２−−−−−−−−及び精子頭部膜蛋白・・・・・・・・との反 応性。■非吸着血清；■１００μｇのプロタミンに吸着された血清；（０２００ μｇのプロタミンに吸着された血清。

第８図、ヒストンに吸着された後の、ヒト血清１ｇＭのＰｌ−・−・−、Ｐ２− 、精製した牛胸腺ヒストン（等モル量のＨｌ、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３及びＨ４を 含む）・・・・・・・・との反応性。囚非吸着血清、０２００８ｇヒストン上に 吸着、（０５００μｇのヒストン上の吸着。

第９図、ヒト血清■ｇＭのＰＩ−、Ｐ２−−−−−一。

ポリアルギニン・−・−・・・・・−一−−−−及びポリリジン−０−０−との 反応性。■非吸着血清：■２００μｇのポリリジンに吸着された血清；　（０２ ００μｇのポリアルギニンに吸着された血清。

第１０Ａ図。次のように上昇する濃度のプロタミン−２（Ｐ２）：　２　ｐｇ／ ｌｎ１．−−−・−・−、５ｐｇ／ｍｌ　−−−＋、　１０μｇ／ｍｅ−・−・ −１２０μｇ／ｄ　−、５０μｇ／ｄ−−−−−−と反応する抗体を検出するた め、３人の正常な（臨床所見なし、旧Ｖ陰性）大人の被検者のそれぞれから得た 血清（Ｒｏｄｍａｎ＋Ｔ、Ｃ，、ら、　１９８６．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、 　Ｍｅｔｈ、　９４　：１０５−１１１；　Ｐｒｕｓ１ｉｎ＋Ｆ、Ｈ，＋ら、１ ９８６＋Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ＋９４：９９−１０３）中におけるＥＬ ＩＳＡ（０，Ｄ、４９０ｎｍ）が示されている。高い抗原濃度について１　：　 １００の希釈血清と１　：　５００のものの間の曲線の急激な上昇は、これらの 血清には、プロタミン反応性１ｇＭ抗体の２つのサブポピユレーションが存在す ることを示唆している。

第１０Ｂ図。次の濃度：２μｇ／ｉ・・・・・・・・、５μｇ／ｄ−−−−、１ ０μｇ／ｄ−・−・−９２０μｇｏｄ−において、抗原としてのＰ２とともに実 施された、２０人の正常な大人の血清のＩｇＭアッセイのサマリー曲線は、高い 抗原濃度においてカーブの増大を示しており、これはプロタミン反応性のＩｇＭ 抗体の第２のサブポピユレーションを示唆するものであるが、これは、正常の大 人の血清の圧倒的な特色である。

第１０Ｃ図。第１０Ａ図と同一の濃度における、プロタミンの一定の抗原箇所を 含む合成デカペプチド（ＤＰ）との第１０Ａ図と同一の血清の反応性。

」又じ　ｆ’；ＱＳ）ＩＹＲＲＲＨＣ５ＲＲＲＬＨＲＩＨＲＲＱＨＲＳＣＲＲＲ ＫＲＲＳＣＲＨＲＲ）ＩＨＲＲＧＣＲＴＲＫＲＴＣＲＲＨ ＤＰ　ＣＲＲＲＫ　ＲＲＳ　ＣＲ ″’　ＭｃＫａｙ、ＤＪ、、ら、１９８６．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、１ ５６：　５−８　Ｐ２（第１０Ａ図）について、ＤＰのより高濃度に対するカー ブは、１　：　１００と１　：　５００の希釈の血清の間で増大を示しており、 これは、高い抗原濃度で表われるプロタミン反応性のＩｇＭ抗体の第二次ポピユ レーションは、第一次ポピユレーションの抗原認識特異性とは異なり、一層低い 結合親和性を有する抗原認識特異性をもつものであることを示している。

第１０Ｄ図。第１０Ａ及びＩＯＣ図と同じ血清のＩｇＭの第１０Ａ図と同一の濃 度のＰ２ｂとの反応性であるが、希釈液は０．３　Ｍ　ＮａＣｌであった（一方 、他のすべてのアッセイでは、血清希釈液、ＰＢＳは０．１５Ｍ　ＮａＣｌであ った。）。

増加されたＮａＣ１モル濃度において、第１０Ａ図で見られた高い抗原濃度に対 するカーブの急な増大は消失し、これは、イオン性相互作用に基づく抗原−抗体 結合の相が抑制されたことを示唆している。こうして、イオン性の相互作用はプ ロタミン反応性ｉｇｈ抗体の低い親和性のサブセットの結合の主要成分であるよ うに思われ、そのポピユレーションの反応性は選択的に抑制された。

第１１Ａ図＝　（第１０Ａ図のような）上昇する濃度におけるエイズの３人の患 者のそれぞれからの血清中のｉｇＭ抗体のＰ２との反応性。これらの血清の２つ において、全反応性は上昇する抗原濃度ともに増加し続けるが、このカーブの形 は、この増大が第１ＯＡ、Ｂ、Ｃ図のようなプロタミン反応性ＩｇＭ抗体の第二 次サブポピユレーションのスーパーインポジション（ｓｕｐｅｒｉｍ−ｐｏｓｉ ｔｉｏｎ　（重ねあわせ））の増大というよりは、むしろ、親和性に関して単峰 形の（ｕｎｉｍｏｄａｌ）抗体ポピユレーションの増大であることを示している 。

第１１Ｂ図、（上述の第１０Ｂ図で述べた）Ｐ２との反応性に対するエイズ患者 からの１５個の血清のアッセイに対するサマリーカーブは、プロタミン反応性Ｉ ｇＭ抗体の第二次の低親和性サブポピユレーションの欠除は、エイズ患者からの 血清の典型的なものであることを証明している。

第１２図。２μｇ／−及び２０ＭｇｉｒｄにおけるＰ２とのＩｇＭ反応性のため に各血清をアッセイして得られた値を△２０−△２として計算し、そして第７． ２項で後述するように力価を計算すると、プロタミン反応性のＩｇＭ抗体の低親 和性サブセットの力価の分布は、正常者、エイズ患者及びエイズの恐れのある被 検者からの血清における全プロタミン反応性のＩｇＭに比例する。Ｄグループに ついて、血液採取から２度目の診断までの詳細な時間間隔は、上から下に、３２ ．２４．４４．６４．４８゜６０、５５．２９．３２．２４ケ月であった。この 時間間隔は被検者の最後の臨床試験の時期を反映しており、それゆえ、最小の潜 伏期間をあられすものである。すべての血清は、旧Ｖ蛋白の電気泳動グラム（ｅ ｌｅｃｅｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）をニトロセルロースに移すことを行うウェス タンプロットにより、旧Ｖ抗体の存在が試験された：　ＰＩ３゜Ｐ２４．　Ｐ３ １．　ＧＰ４１．　Ｐ５１．　Ｐ５５．　Ｐ６５．　ＧＰＩＩＯ／１２０．　Ｇ ＰＩ６０（エピトープ、　Ｉｎｃ、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）　、血清は２以 上の帯が染色されたとき陽性とされ、帯が染色されなかったとき陰性とされた。

第１３図、　（第１Ａ図及びＩＣ図において述べたように）上昇する濃度におけ る■Ｐ２及び＠ＤＰとの、３人の小児（２８日令、１２日令、５ケ月令、臨床所 見なし）の被検者のそれぞれの血清中の、ＩｇＭの反応性、Ｐ２とＤＰに対する カーブの類似性は抗原箇所の同一性を示している。カーブの形は、右箇所と反応 性の小児血清ＩｇＭ抗体は、親和性に関して均−又は単峰性であることを示して いる。

５、発亙坐詳豊星説亙 本発明は、プロタミン反応性のＩｇＭ抗体、及び、予知、診断及び治療における その使用に向けられる。特に、この発明は、アルギニルクラスター（ｃｌｕｓｔ ｅｒ　：同種類のものの集り）により特徴づけられるエピトープを認識する、低 親和性結合を行うプロタミン反応性血清ＩＢＭ抗体に関する。ヒト血清中のその ようなプロタミン−反応性抗体の検出及び／又は測定は、旧Ｖの血清陽性とエイ ズの臨床的発現への進行の間の潜伏期間を予測するための診断アッセイに使用で きる。本発明は、又、エイズ及び他の障害の予知及び／又は診断のための低親和 性結合のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体の検出及び／又は測定のための方法及びキ ットを提供する。

５．１．プロ　ミン　・　Ｗ 本発明は、プロタミン反応性のＩｇＭ抗体に関する。

このような抗体は、アルギニルクラスター、特に、６個のアミノ酸残基片肉のト リブレットを含む、４個のアルギニル残基によって特徴づけられるプロタミンの エピトープを認識することができる。一つの態様において、このアルギニルクラ スターエピトープは線状の配列のものである。他のＨ様において、このエピトー プはコンフォメーション（立体配座）に依存することができ、トリブレットクラ スターを含む、４個のアルギニル残基から成る抗原決定基を形成する立体配置に 帰因する。特別の態様において、ＩｇＭ抗体は低親和性をもってアルギニルクラ スターエピトープに結合する。

特別の態様において、本発明は正常なヒトの血清中に存在する自然抗体（即ち、 誘引されたものでない）である、プロタミン反応性のＩｇＭ抗体に関する。

後記第６項で詳述するように、本発明者は、１２２日令上のすべての臨床的に正 常な人の血清はプロタミンと反応するＩｇＭ抗体を含んでいること、この抗体は 高いオーダーの特異性を有する、循環しているＩｇＭの決定的なセットであるこ とを確立し、これらの抗体が反応する抗原箇所を定義した。

後述するように、本発明のプロタミン反応性のＩｇＭ抗体は、正常な成人の男女 、及び、正常な小児（７日令から２年）の事実上すべての血清中で、有意の力価 をもって検出された。小児と大人の血清のプロタミン反応性ｒｇ？Ｉ抗体の間の 共通性は、抗原認識及び反応平衡の類似性を示すことによって確立された。小児 の血清中に見い出されたプロタミン反応性１ｇＭ抗体はプロタミンによる免疫的 刺激によるものではない。というのは、プロタミンは思春期後の精巣において新 たに合成されるものであり、精子完全系の細胞以外の細胞の核にはとり込まれな いからである。ＩｇＭは胎盤を横切らないので、新生児の血清中のプロタミン反 応性１ｇＭ抗体は母由来のものでもない。それゆえ、ヒト血清はプロタミンと反 応する（プロタミンにより誘導されるのではない）“自然”抗体のサブセットを 含むと推論することの正しい根拠が存在する。

プロタミンは、それが合成され、細胞内にとり込まれる間、免疫系から隔離され ており　（Ｄｙｏ＋、Ｍ、及びＦａｗｃｅｔｔ、Ｄ、Ｗ１１９７０．Ｂｉｏｌ、 Ｒｅｐｒｏｄ、　３　：３０８−３２６）　、そして、我々はプロタミンが非免 疫抑制的であること、即ち、それらは他の精子由来の蛍白がそうであるように、 インビトロでＴ細胞を阻害しないことを示した（Ｒｏｄｍａｎ。

Ｔ、Ｃ，ら、　１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１２１１−１２１５）　、 それゆえ、思春期後の男性及び性交した女性の血清は何らがのプロタミン反応性 抗体、これは、プロタミンによる免疫的誘導に帰因するものであるが、を含むこ とができる。

このようにして、本発明者は、成人のヒト血清のプロタミン−反応性ＩｇＭ抗体 は２つの起源が異なるサブセット、即ち、（１）自然抗体、及び、（２）誘導さ れた抗体、を含むと仮定する。

プロタミン反応性の血清ＩｇＭ抗体により認識される抗原箇所の主要な特性は、 ６個の残基片肉の、トリブレットを含む、４個のアルギニル残基という明白な最 小限の要件をもつクラスター化されたアルギニル残基であり、結合反応は電荷吸 引に依存しないことである。

一連の免疫吸着（ｉａｍｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）法により示されるように （後記第６項参照）、蛋白反応性の血清ＩｇＭ抗体は、高度の特異性をもつ別個 のセットである。

本発明の抗体分子は、抗体分子のイディオタイプの領域を含む、それらの断片を 含め、プロクミン反応性ＩｇＭ抗体である；これらは、これに限定されるもので はないが、Ｆａｂ、　Ｆ　（ａｂ”）ｔ、　Ｆａｂ’　断片等のような、Ｆｖ領 領域含む断片を含有する。分子のイディオタイプを含む抗体断片は、既知の方法 により生成される。例えば、限定されるものではないが、次のような断片をふく む： 抗体分子のペプシン消化により製造されるＦ　（ａｂ’　）　を断片；Ｆ（ａｂ ’）ｚ断片のジスルフィド結合を還元して生成しうるＰａｂ”断片、及び、抗体 分子をパパイン及び還元側で処理することにより製造されるＦａｂ断片。

５．２．　び鰺　におしる　：　ＨＩＶ感力か゛エイズの　での゛　の　゛１ 後記の第７項で詳述するように、血清抗プロタミンＩｇＭ抗体の測定は、旧Ｖ感 染とエイズの発病の開始との間の潜伏期間の信頼できる診断的な指示を提供する 。

本発明のプロタミン反応性１ｇＭ抗体の低親和性サブセットの血清中における存 在又は非存在は、旧Ｖに感染した個人がエイズの病理的な進行を阻止しうる能力 の指示となる。血清中における非存在が比較的短期間のＨＩＶ潜伏と相関する、 抗プロタミンＩｇＭ抗体のサブセットの特徴的な性質は、大人の血清に存在する 他のＩｇＭ抗プロタミン抗体に比較してプロタミンへの低い結合親和性である。

この低い親和性の抗プロタミン１ｇ）ｌ抗体は、アルギニルクラスターにより、 特に、６個のアミノ酸残基片肉の、トリブレットを含む、４個のアルギニル残基 により特徴づけられるエピトープと反応する。このような低親和性の抗プロタミ ン抗体は、自然抗体かもしれない。

血清のプロタミン反応性のＩＢＭ抗体の低親和性サブセットは、エイズの診断の ためにアッセイできる。かかる抗体は、正常の被検者、及び、旧Ｖ感染者であっ て、引き続き、有意の潜伏期間を示す者の血清中で検出可能であるが、エイズと 診断された者及び採血時には無症候であるが、比較的短時間内にエイズに進行す る旧Ｖ感染者の血清中には存在しないか、又は、不十分である。このように、） ＩＩＶが血清的に陽性である（ｓｅｒｏｐｏｓｉ　ｔｉｖｅ）、人における、か かる抗体の不存在又は不十分さを定量的に測定することは、エイズの比較的に切 迫した始まりの指示として、信頼しうる。

低親和性の抗プロタミン血清１ｇＭの定量的測定及び／又は検出は、また、治療 処置の効力をモニターし、臨床的試験のために相応の被検者を選択する際の助け とするために、及び、エイズ又はＡＲＣの診断の付加的なモダリティ−（Ｍｏｄ ａｌｉｔｙ）を提供するために使用することができる。また、これらの抗プロタ ミン抗体の検出及び／又は測定は、他の免疫学的な異常を予知し、診断する際に 、同様に使用しうることも想像される。

使用できる検出及び定量的な決定のための種々のアッセイ及び方法を以下に記載 する。

エイズを予知及び診断するためのアッセイの本発明の特別の態様において、プロ タミン反応性の１８Ｍ血清蛋白の低親和性サブセットの存在は、以下に記載する いかなる方法によってもアッセイすることができる。

１つの例として、抗プロタミンＩｇＭ抗体の低親和性サブポピユレーションは、 一定量の抗体混合物（例えば、血清）を増加する量の抗原と反応させることによ り同定しうる。抗原の濃度が上昇するにつれて、高い親和性を有する抗体が飽和 し、次に、低い親和性の抗体が抗原と反応するであろう。好ましい態様において 、後記第５．３．３項及び後記第７項に記載したＥＬＩＳＡが使用できる。

５．３．１．７・セイシスーム この分野で既知のアッセイシステムは、本発明の抗プロタミンＩｇＭ抗体（又は それらの抗原結合領域）の定量的測定、及び／又は検出のために使用しうる０例 えば、かかるアッセイは、これに限定されるものではないが、競合及び非競合ア ッセイシステムを含む、次のイムノアッセイであるニラジオイムノアッセイ、Ｅ ＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）、“サンドウィッチ゛′イムノ アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、 補体−結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、螢光イムノアッセイ、 プロティンＡイムノアッセイ、及びイムノエレクトロホーレシスアッセイ、等で ある。

５．３．２．扱−一一振 プロタミン反応性のＩｇＭ抗体の定量化のためのアッセイシステムにおいて使用 −うる抗原は、アルギニルクラスター、殊に、６個のアミノ酸残基片肉にトリブ レットを含む４個のアルギニル残基を含む配列を有するもの、又は、上述のもの と免疫学的に交差結合性のエピトープを含むすべての抗原である。−の態様にお いて、かかるアルギニルクラスターエピトープは線状の配列のものである。他の 態様において、エピトープはコンフォメーション的に依存し、トリブレットクラ スターを含む４個のアルギニル残基から成る抗原決定基を生成する立体配置（ｃ ｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）から生成する。

特別の態様において、６個のアミノ酸片肉においてトリブレットを含む、４個の アルギニル残基から成るペプチドを抗原として使用できる。

このため、抗原として使用しうるペプチドは、これに限定されるものではないが 、次の配列を含む。

ＲＲＲＲＲ ＲＲＲＲＸ ＲＲＲＲＲＸ又は、逆位のもの ＲＲＲＲＸＲ〃　〃 ＲＲＲＸＲＲ〃　。

ＲＲＲＲＸＸ　〃　。

ＲＲＲＸＲχ　〃　〃 ＲＲＲＸＸＲ〃　〃 ＸＲＲＲＸＲ＃　ｌ 上記において、Ｒはアルギニンであり、そして、Ｘは他のすべてのアミノ酸であ る。

使用できる他の抗原は、限定されるものではないが、後記の第■表（第６．２． ５項を参照）、即ち、６個のアミノ酸配列内に、トリブレットを含め、４個のア ルギニル残基を有する蛋白が含まれる。加えて、いかなるプロタミンも、例えば 、ヒトプロタミン１（ＰＩ）、ヒトプロタミン２（Ｐ２）が、抗原として使用で きる。抽出及び精製方法においてシスティン残基がジスルフィドの交差結合を形 成することを阻止する工程を含む場合は、プロタミンは抗原として最も満足しう るちのである。この阻止は、例えば、アミノエチル化、Ｓ−メチル化、及びヨー ドアセチル化等のいかなる既知の方法によっても実施できる。加えて、プロタミ ンは、システイニル基の間のジスルフィド交差結合を阻止するための処理がなさ れない場合でも、本発明の方法における抗原として使用できる。

本発明のイムノアッセイにおいて使用できる他の抗原は、この発明のプロタミン 反応性のＩｇＭ抗体のエピトープに類似又は同一のエピトープを認識する、抗プ ロタミンモノクローナル抗体ＨＡｍ＾ｂ（ＡＴＣＣ寄託番号、）Ｉ８９６６８） によって結合される能力により同定しうる。

５．３．３．　ＨＩＶ　”　Ｘ　Ｂ１７）　’１（７）タメノ７−＋４一方店 ここに記載するアッセイ及び計算方法は、怒染した個人のエイズの発病の前の旧 Ｖのありうる潜伏期間を予測するためのモダリティ−を提供する。かかる情報は 、個々の患者の医学的なマネージメント、医療施設に対する社会の需要の予測及 び提案された治療を試みるために適切な被検者を選択する場合に有用であろう。

これは、また、エイズの診断のための付加的な基準を提供する。

ここに記載されるアッセイ及び方法は、エイズの予知に使用するための定量的な インデックスの派生的なものの１つの実例にすぎない。これらの他の実例、及び 、ここに記載する方法の修正も想定され、それも本発明の範囲内である。

低親和性結合のプロタミン反応性の血清１ｇＭ抗体を検出できる、酵素結合イム ノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が実施される。抗原（例えば、プロタミン ２）の濃度を、２．　５．１０．２０及び５０μｇ／ｍと増加させつつ、後記の 第７項に記載されるようにしてＥＬＩＳＡが実施される（また、前述の第４項第 １０Ａ図の記載も参照されたい）、簡単にいうと、この方法は、次の工程から成 る： （ｉ）抗原コーティング； マイクロ滴定皿のアッセイくぼみに抗原溶液を加え、続いて４時間培養すること により、このくぼみは抗原（５０μ！が好ましい）でコーティングされた。抗原 としてプロタミン２を使用する場合、好ましい抗原濃度は２μｇ／Ｉｎ１及び２ ０ｕｇ／ｍ！である。

（ｉｉ）阻　止： 抗体溶液は緩衝液で洗い流され、そして、抗体によりコーティングされていない 領域をコーティングするため、すべてのくぼみには阻止溶液が一杯に詰められ、 そのことにより、以後の工程においてくぼみの表面に非特異的に結合するのを阻 止した。

（ｉｉｉ）血清抗体の結合 阻止溶液が洗い流され、そして、希釈された血清（５０μ！が好ましい）が各く ぼみに加えられる。各血清試料は、２個の希釈液のそれぞれにおいて３回試験さ れる。本発明者は、血清の１　：　１００及び１　：　５００の希釈が、プロタ ミン２を抗原として使用する際に適当であること、及び、大部分のヒト血清のた めに行われる試験結果の妥当な解釈にとって、十分な低い血清バックグラウンド 値をもつことを知った。しかしながら、抗原性箇所をもつ種々のペプチドに関し ては、非希釈の血清から１　：　１０００の希釈までの、種々の血清希釈の他の 対が有用であることを知った。

（ｉｖ）結合されたＩｇＭ抗体の検出：３時間後に、血清希釈液が洗い流され、 ５０μ！のペルオキシダーゼ−ラベルの第２の抗体（抗ヒトＩｇＭ　）が各くぼ みに加えられた。１．５時間後に、この第２の抗体が洗い流され、そして５０μ ！のペルオキシダーゼの基質が加えられた。３０分後、５０μ２の２．５規定の 硫酸が各（ぼみに加えられ、基質に対する酵素（ペルオキシダーゼ）の作用を停 止させ、こうして、染色（Ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）物質の製造を止めた。

（ｖ）測　定ニ ブレートは自動プレート読み取り機中に置かれ、ここで、濾過された光線に対し て各くぼみの中心をあわせるためプレートを移動させ、その後、各くぼみに対し て入射光（例えば４９０ｎｍ）の光学濃度（０，０，）が読みとられ、記録され た。

（ｖｉ）計　測： ４９０ｎｍにおける光学濃度（０，０，４９０）　（Ｙ軸）が、血清希釈の逆数 （Ｘ軸）に対してプロットされた（例えば、後掲第１０及び１１図を参照）。高 い抗原濃度における反応性カーブの傾斜の増大は（第１０Ａ図参照）、プロタミ ン反応性のＩｇＭ抗体の第２の（低親和性）サブセットが存在することを示して いる。この増大は、エイズと診断された患者が得た血清のアッセイにおいては、 みられない（第１１Ａ図参照）。こうして、抗プロタミンＩｇＭ抗体の低親和性 のサブセットを表わす高い抗体濃度における反応性カーブの傾斜の増大の非存在 が観察されると、エイズ又はＡＲＣであると診断するための追加的なモダリティ を提供することができる。

プロタミン反応性のｘｇｈ抗体のこの低親和性のサブセットの量を測定するため 、即ち、高い抗原濃度での反応カーブの傾斜の増大により表わされるプロタミン 反応性１ｇＭ抗体の第２のサブセットの比例する力価をアセスするために、計測 システムは次のように工夫されうる：２μｇ／ｄと２０μｇ／ｒａｆｔが経験的 に適当な試験抗原濃度として選択される。Ｘ軸の２つの点、血清希釈１　：　１ ００（ｘ　１　）と１　＝　５００（ｘ　２　）の間のカーブの増大は、これら ２つの点に対するＹ軸上の０．Ｄ、値の差異として表現できる。２μｇの抗原（ プロタミン）カーブのものから２０μｇカーブのものへの増大における増加は、 ２０　ｕ　ｇｏｄ抗原における（０．０．　ｘ　１−０．Ｄ、　ｘ　２　）マイ ナス２ｕｇ／ｄｌ抗原における（０．０．　ｘ　１−０．Ｄ、　ｘ　２　）であ り、そして、Δ２０−Δ２として記載される。

次に、△２０−Δ２の値が計測される。“１５′という値は、“正常”なものの 低い方の限界値として考えることができる（第７．２項参照）。ＨＩＶ−セロポ ジティブな血清に対する正常の範囲内の値は、エイズの発現前に少くとも２年の 、多分もっと長い潜伏期間を予測させるのに対し、低い△２０−Δ２値はこの病 気の進行が切迫していることを予測させる。

示された抗原箇所を有する他のペプチドに対しても、この方法は適用されている ので（第５．３．２項を参照）、最善の結果は２つの抗原の濃度比が常に１：１ ０のときに得られているが、示された抗原箇所をもつ他の種々のペプチドを使用 する場合には、他の濃度対のときに良好な結果が得られるこ六が見い出されてい る点に留意すべきである。

アッセイ試料として患者の種々の体液、例えば、血清、血漿等が使用でき、好ま しいのは血清であることにも留意されるべきである。

５．４．主−一里 本発明の低親和性のプロタミン反応性１ｇＭ抗体は、エイズ及び他の免疫的な異 常の治療において潜在的に使用可能である。低親和性の抗プロタミン抗体は、旧 Ｖに感染した個人をエイズの発病から保護することに、その役割を有しているも のと想定される。この抗体は、他の状態の免疫異常に悩んでいる者、又は、それ らに疾病素因をもつ者において同様な保護的効果を有しているかもしれない。こ のようにして、本発明の抗体は受動免疫治療、即ち、予め形成された低親和性の 抗プロタミンｒｇｈの投与によって、宿主に短期間の保護を与えることができる ことも考えられる。異種免疫グロブリンはその外来性の免疫性成分に対して免疫 応答を引き起こすであろうから、かかる使用目的に対してはヒト免疫グロブリン が好ましい９１つの態様において、）ＩＩＶ陽性の個人においてエイズへの進行 を引き延ばすために、本発明のプロタミン反応性のＩｇＭ抗体の低親和性サブセ ットを、プールされたヒト血清から受動免疫治療において使用するのに十分な量 で分離しうる。

本発明の低親和性でプロタミン反応性の抗体に関する分子クローンは既知の方法 で製造できる。低親和性のプロタミン反応性の抗体の性質に類似の性質をもつモ ノクローナル抗体分子、又は、これの抗原結合領域をコードする核酸配列をつく るために、組換えＤＮＡ手法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、１９８２．Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｃｏｌｄＳｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を使用しうる。

いわゆる°“キメラ抗体”分子を形成させることにより、マウスモノクローナル 抗体分子が受動免疫において有効に使用しうる。キメラな抗体分子は、マウス抗 原結合領域をヒトの定常領域に含ませて、製造しうる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１ ９８Ｌ　Ｐｒｏｃ　Ｎｏｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８１：６８５１；　Ｔａｋｅｄａら、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：　４ ５２）。

抗体は、既知の方法、例えば、イムノアブソープション、イムノアフィニティク ロマトグラフイー、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）のようなりロフ トグラフィー法、又はそれらの組みあわせにより、精製することができる。

５．５．益ｌ団トＬム１ 本発明は、また、上述の方法を実施するための診断用キットを含む。−の実施態 様において、診断用キットは、（ａ）６個のアミノ酸残基の配列内に、トリブレ ッドを含む、４個のアルギニル残基をもつ配列を有するペプチド、又は蛋白（“ アルギニルクラスター”）；と（ｂ）ＩｇＭ抗体に対する特異的な結合パートナ −と検出しうるシグナルを生成可能なラベルの接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を 含む。他の態様において、診断用キットは（ａ）コンフォメーション依存性のエ ピトープ、このエピトープはトリプレットクラスターを含む、４個のアルギニル 残基をもつエピトープであるが、これから成るペプチド又は蛋白と、（ロ）上述 の接合体より成る。さらに、他の態様において、このキットは（ａ）　ＨＰ＋ｎ Ａｂとにより結合される能力によって特徴付けられるペプチド又は蛋白、及びの ）上述の接合体を含むことができる。この反応剤は、又、緩衝剤及び例えばポリ サッカライド等の蛋白安定化剤等の補助剤を含むことができる。この診断キット は、更に、所望に応じて、バックグラウンドの干渉を減じるための剤を含むシグ ナル発生系の他の成分、コントロール反応剤、試験を実行するための装置等を含 んでもよい。

他の態様において、診断用キットは、６個のアミノ酸残基の配列内に、トリブレ ットを含む、４個のアルギニル残基をもつ配列を有するペプチド又は蛋白に反応 性の抗体と、検出しうるシグナルを発生するラベルの接合体を含む。他の態様に おいて、ラベルと、コンフォメーション依存性のアルギニルクラスターエピトー プを含むペプチド又は蛋白に反応性の抗体、又はＨＰｗＡｂによる認識によって 特徴づけられるペプチド又は蛋白に反応性の抗体との接合体を使用しうる。

好ましい態様において、ＥＬＩＳ＾キットが使用され、これは、６個のアミノ酸 残基の配列内に、トリブレットを含む、４個のアルギニル残基が配列したものが 固体担体に固定されたものと、ＩｇＭ抗体に対する特異的な結合パートナ−とセ イヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素の検出可能なシグナルを発生しうる ラベルとの接合体より成るものである。

６、裏施拠：ヒ　′　のプロ　ミン　・Ω１蔦山混血生 ここに詳述する実施例において、本発明者は、思春期後の精巣で新たに合成され 、精子に特異的である、一群の低分子量の塩基性核蛋白であるプロタミンに反応 する、ヒトの精子中の一群の自然１ｇＭ抗体の同定を記載する。これらの抗体は 、正常の成人男性及び女性の１００個の血清中のすべてにおいて、及び７日から ２才までの年齢の正常な小児の２８個の血清のうちの２６個において、ＥＬＩＳ Ａにより、有意の力価で検出された。

小児の血清と大人の血清のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体の間の共通性は、抗原の 認識及び反応動力学における類似性を示すことによって確立された。それゆえ、 免疫原生刺激又は自然抗体のそのセットの抗原ターゲットのいずれかとしてのプ ロタミンの役割は、ありそうではない。

蛋白反応性血清ＩｇＭ抗体により認識される抗原箇所は、ヒト精子プロタミンに 対するモノクローナル抗体（ＨＰｍＡｂ）による抗原認識のパターンとの比較に より特徴づけられた。テスト抗原として、ヒトプロタミン２の種々のセグメント のアミノ酸配列を模倣する合成ペプチド及びポリアルギニン、ポリリジン及びヒ ストンの使用により、ＨＰｎ＋Ａｂと血清ＩｇＭ抗体の双方により認識される抗 原箇所の主要な特性は、６個の残基片肉に、トリブレンドを含め、明らかな最小 限の必要性として４個のアルギニル残基をもつ、クラスター化されたアルギニル 残基という特性のようにみえる。一連の免疫吸着法は、プロタミン反応性の血清 １ｇＭ抗体が高い特異性をもつ別個のセットであることを示している。

蛋白のデータベースのサーチによれば、推測上の最少限のエピトープは、４〜５ 個のヒトの自己蛋白、免疫系のすべてモイアティ（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）　、及び 多くのウィルス蛋白に存在していることが示されている（第■表）。

６．１．林葺及Ｕ方法 ６．１．１．パ　−のための　ムイムノＩ土丘ｌ上ヱヱ土工 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法、これにより後記第１表の データが集められ、上記方法は本研究において使用されているが、これは記載さ れている　（Ｐｒｕｓｌｉｎ、Ｆ、Ｈｌら＋　１９８６．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、９４：９９；　Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ、Ｃ，、ら＋　１９８６＋　 Ｊ、Ｉａｏｎｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、　９４：１０５）、簡単に説明すると 、９６個のくぼみをもつ平底のマイクロ滴定プレートの各くぼみに５０μｉの抗 原（特定濃度）が置かれ、カバーがされ、そして、室温で４時間保持された。こ のくぼみはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．０１％Ｔｗｅｅｒｉ−２０で２ ０回洗われ、次に、ＰＢＳ中の５％牛血清アルブミン（ＢＳ）をふちまで一杯に つめ、カバーをして、１晩５°Ｃに置いた。このプレートは室温に戻され、２０ 回洗浄され、５０μ℃の血清又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）　（１％のＢＳ Ａで希釈）が各くぼみに加えられた。室温で２時間後、各くぼみは２０回洗われ 、そして、５０ｕｌのペルオキシダーゼが接合した第２の抗体〔ヤギＦ（ａｂ’ ）２抗ヒ目ｇＭ　ｕ鎖特異性、又はヤギＦ（ａｂ’）ｚマウスＩｇＡ、　ＩｇＧ 及びＩｇＭ：ｌが加えられた。このプレートはカバーされ、室温で１．５時間保 持され、そして、２０回洗われた。各くぼみに５０ｕｆの基質（オルトフェニレ ンジアミン）が加えられ、３０分後に、５０μ！の硫酸（２，５規定）を加えて 反応を停止させた。各くぼみの着色溶液の光学濃度が自動プレート読み取り機（ ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）において４９０ｎｍで読まれ た。感受性を最大にし、血清のバックグラウンド及びプレートとプレートの間の 結合効率から生ずるあいまいさを最小限にするために、プロトコールが展開され た。（Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ、Ｃ，ら＋　１９８６．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　９４：１０５）。

６．１．２．誼−一一皿 精製されたプロタミン１（ＰＩ）及びプロタミン２（Ｐ２）がＲｏｄｍａｎ、Ｔ 、Ｃ，らの方法（１９８２，Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、５３　：２２７）を修正し て調製された。簡単に述べると、精子が射出精液のプールから分離され、そして 、音波処理により頭部と尾部が分離された。頭部が集められ、ＴｒｉｔｏｎＸ− １００の処理により、膜蛋白の分画とＤＮＡ−核蛋白分画にわけられた。後者を ４Ｍのグアニジニウムクロリド（ＧｕＣｌ）、１％の２−メルカプトエタノール に溶解し、そして、エチレンイミンで処理してプロタミンのシステイニル残基を アミノエチル化し、そのことにより、ジスルフィド結合の形成を防止し、次に、 ５０ｍＭの塩酸に対して透析し、ＢｉｏＲｅｘ７０カラム上で、ＧｕＣｌの濃度 を増加させた段階的な溶出液でクロマトグラフを行った。純粋なＰｌは２３％の 溶出液に現われ、また、純粋なＰ２（ａとｂ）は２７％溶出液に現われ、一方、 一連のＰ２のリン酸化された変異体は一部の２１とともに中間的なブール（２５ ％溶出液）に現われた。ＰｌとＰ２　（２３及び２７％溶出液）は、それぞれ５ ０ｍＭのＨＣＩに対して１晩透析され、続いて、ｐＦ１７．２のＰＢＳに対して ２〜３時間透析され、それぞれの濃度は染料−結合アッセイにより測定された（ Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、　Ｍ、＋１９７６＋Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２：２４８）。合成ペプチドはメリーフィールドの方法で 製造された（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、１９６３．　Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｗ、Ｓａｃ、　８５：２１４９）。そしてこれは、逆相ＨＰＬＣ（高性能 液体クロマトグラフィー）により精製された。

ポリアルギニンｃｉｏ、ｏｏｏ〜２０．０００ダルトン分子量）は、ケミカルダ イナミクス社（Ｃｈｅｍｔｃａｌ　Ｄｙｎａｎ＋ｉｃｓ　Ｃａｒｐ。

Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、　ＮＪ）から入手され、ポリリジン（１５，０００〜３ ０．０００ダルトンの分子量）はシグマケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅ＋ｗｉｃ ａｌ　Ｃｏ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）から入手した。

６．１．３．モノクーロ　ル ヒト精子プロタミン（ＨＰｍＡｂ）に対するｍＡｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスとヒ ト精子の核蛋白分画で免疫し、そして、非分泌マウスミエローマで肺臓細胞を融 合させることにより得られた。ここに記載する研究のための調製において、ハイ ブリドーマカルチャーは、単クローン性を保証するため、希釈を制限しながら、 再クローンされた。ＨＰｍＡｂは硫酸アンモニウム沈澱により腹水から分離され 、ＰＢＳに対して透析され、次にＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル；イオン交 換）カラムクロマトグラフィーにより精製された。

コントロールとしての、ニワトリミオシンに対するｍＡｂは同様にして腹水から 製造された。

６．１．４．−監一土一良一滑 正常のヒト血清は、実験室の人より与えられたか、又は、生年月日、性及び“所 見なし”という点のみが確認された病院の供試物として得られた。

６．１．５．　ｉｍｍｕｎｓａｂｓｏｒ　ｔｉｏｎｓ）各免疫吸着方法に対して 、図（前記４）の説明中で述べられた量の吸着蛋白が、０．７　Ｘｌ０ＣＩＩＩ Ｏカラムにおいて、０．５ｇの臭化シアン−活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ ）に結合された。１％ＢＳＡ／ホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，５で希釈された ４０〜５０μ２の血清がカラム上に各層をなしておかれ、次に、４℃で１晩端部 をひっくり返しながら混合された。吸着された血清はカラムから排出され、記載 された濃度において、ＥＬＩＳＡにより、指定された抗原との反応性が試験され た。

６、．１．６．凹上辻り址二九 ３個のクラスターを含む最少銀４個のアルギニル残基をもつものとして指定され た６個の残基の片を生産する蛋白のサーチが、ナショナルバイオメディカルリサ ーチファウンデーションの蛋白同定源（Ｐｒｏｔｅｉｎ症生 第１表のデータは、プロタミン反応性抗体は０〜６０才の一群正常の被検者のす べての血清において存在している。

（本真以下余白） 第１表 ヒ　プロ　ミンと　・　のヒト　−の 年　齢　試験番号　１ｇＭ　ＩｇＧ Ｏ（調帯面）　１　０　１ １　日　２　０　２ １−１２月　９　９　９ １−２年　４　４　４ 大人男性　４１　４１　４１ 大人女性　５９　５９　５９ ＊　すべての血清は、抗原としてプールされたヒトプロタミンにより、１　：　 １００．１　：　５００．１　：　１．０００の希釈度でアッセイされた。陽性 と指定されたすべての血清は、１　：　５００の希釈度で反応性を示した。Ｉｇ ＭとＩｇＧのプロタミンとの反応性の力価は、対照血清の力価に関して計算され た（Ｐｒｕｓ１ｉｎ＋Ｆ、Ｉ（、ら＋１９８６．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　９４：９９：　Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ、Ｃ，ら＋　１９８６＋　Ｊ 、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　９４：１０５）　、ネガティブなＩｇＭの値は対照血清の１％ 以下であった；小児の血清に対するポジティブなＩｇＭ値は、１５％（７日新生 児）から６５％に亙っていたＳ　ＩｇＧ値は対照血清の４０〜９０％であった。

大人の血清に対しては、プロタミンとの１ｇＭ反応性の範囲は、対照血清の５４ 〜１８％であり、ＩｇＧのそれは５０〜２００％であった。すべての血清に対す るＩｇＧとＩｇＭの総計は、それぞれの年令のグループについて正常な範囲の内 であった。　（ｄｅ　Ｐｒｅｖａｌ＋Ｃ，＋１９８２＋Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 Ｂａｃｈ＋　Ｊ、Ｆ。

及びＳｃｈ＆４ａｒｔｚ、Ｒ，Ｓ、ｅｄｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

第１表に示されているように、プロタミン反応性のＴｇＡ抗体はすべての血清中 に存在し、そして、ＩｇＭ抗体は免疫系がＩｇＭの有意の力価を生産するのに十 分なだけ成熟している被検者の血清中に存在している（ｄｅＰｒｅｖａｌ、Ｃ， １９８２＋　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｔｙ、Ｂａｃｈ、Ｊ、Ｆ、及びＳｃｈｗａｒｔｙ 。

Ｒ，Ｓ、ｅｄｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ＋Ｎｅｅｉ　Ｙｏｒｋ、 ｐ、２３０）。全１ｇＭに対するプロタミン反応性１ｇ？ｌの割合が各被検者の カテゴリーごとの血清に対して計算された（第１図）。

計算は、類似のアッセイプロトコール内で、全ＩｇＭの力価に比較して、プロタ ミン反応性の抗体の力価を定めた。この割合のために導かれた値、即ち、全１ｇ Ｍに対するプロタミン反応性ＩｇＭの比は、全集団（ｐｏｐｕｌａ−ｔｉｏｎ） のサブグループに対して比較的狭い範囲内にあり（第１図）、これは、プロタミ ン反応性の抗体は正常のヒト血清の特異的な成分を表わすことを示唆している。

６．２．２．−ヒト　プロ　ミン■Ｈ定ヒト精子の核蛋白は、２個のプロタミン 、Ｐｌ及びＰ２と呼ばれるものを含む。アミノ酸配列の決定は、Ｐ２が２つの変 異体Ｐ２ａ及びＰ２ｂとして存在することを示しており、Ｐ２ａはそのアミノ末 端に３個の付加的な残基をもつ点のみで異なる（第１ＩＡ表）　（Ｍｃｋａｙ。

Ｄ、Ｊ、ら＋１９８６．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｆｏｃｈｅ＋ｏ、１５６：５；　Ａｉｍ ｅｒ＋Ｈ，ら、１９８６゜Ｂｔｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　３ ６７：５１５）（本真以下余白） 第■表 ＬＬ組法 Ａ、ヒ　プロ　ミン Ｐｉ　Ａ　ＲＹ　ＲＣＣＲＳ　Ｑ　Ｓ　ＲＳ　ＲＹ　Ｙ　ＲＱ　ＲＱ　ＲＳＲＲ ＲＲＲＲＳＣＱＴＲＲＲＡＭＲＣＣＲＰ２ａ　ＲＴ　ＨＧ　Ｑ　Ｓ　ＨＹ　ＲＲ ＲＨＣＳ　ＲＲＲＬ　［Ｉ　ＲＩＨＲＲＱＨＲＳＣＲＲＲＫＲＲＳＣＲＨＲＰ２ ｂ　Ｇ　Ｑ　Ｓ　ＨＹ　ＲＲＲＨＣＳ　ＲＲＲＬ　ＨＲＩ　ＨＲＩｎ）ＩＲ５Ｃ ＲＲＲＫＲＲ５ＣＲＩ（ＲＪ？Ｒ）ｌＰｌ、ｃｏｎｔ、　Ｐ　ＲＹ　ＲＰ　ＲＣ ＲＲＨＰ２ａ、　ｃｏｎｔ、　ＲＲＨＲＲＧ　ＣＲＴ　ＲＫ　ＲＴＲＲＨ Ｐ２ｂ、　ｃｏｎｔ、　ＲＲＧ　ＣＲＴ　ＲＫ　ＲＴ　ＣＲＲＨペプチド１　（ Ｐ２ｂ１６−２５）　ＨＲＩ）！ＲＲＱＨＲＳペプチド２　（Ｐ２ｂ２６−３５ ）　ＣＲＲＲＫＲｉ？ＳＣＲペプチド３　（Ｐ２ｂ４２−５１）　ＲＧＣＲＴＲ ＫＲＴＣ本発明者らは、最近、ＰＬ、Ｐ２ａ、Ｐ２ｂが、リン酸化されたＰ２の 変異体のグループから別々に、精製された形態で、高収率に得られることを知っ た（Ｐｒｕｓｌｉｎ。

Ｆ、）１．らｒ　１９８７＋Ｇａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、１８　：　１７９）。これ らＰｌとＰ２の製造は固相のアッセイにおいて抗原として使用するに好ましい、 というのは、それぞれがポリスチレン表面上で線状に配向するのに好適な高い陽 電荷をもつ小さな分子であり、そして、システイニル基はアミノ−エチル化され （６，１，２参照）、それゆえジスルフィド結合の生成は阻止されているので、 分子内の交差結合の可能性がほとんどないからである。

６．２．３．プロ　ミンに・　る　プロ　ミンモノクロー　ルー　の　：エビ　 −プ 皇足義 本発明者は、免疫源としてヒト精子の核蛋白分画を使用して、Ｐｌ、及びＰ２、 及びＰ２のリン酸化された（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）変異体に反応性で 、他のヒト精子成分とは反応しないｉＡｂ　（ＨＰｍＡｂ）を製造した（第２図 ）。精製されたＰｌとＰ２の異なるバッチを使用してアッセイを繰り返すと、各 々の反応性は同じオーダーの大きさであったが、等モルのＰｌとＰ２に対してア ッセイすると、ＨＰｍＡｂはＰｌにより大きな反応性を示すことが１４認された 。これらの分子の一次構造をみると、２つの間には広範囲に亙るアミノ酸配列の 相同性が存在しないことがわかる；６個の残基片肉で４つの残基における位置的 な相同性がわずかに３個の分節で示されている：　Ｐｌの７〜１２のアミノ酸と Ｐ２ｂの２０〜２５のもの、Ｐｌの２９〜３４のものとＰ２ｂの３４〜３９のも の、及びＰｌの４５〜５０のものとＰ２ｂの４９〜５４のもの。しかしながら、 ＰＩとＰ２ｂのそれぞれに対して、アルギニンはアミノ酸組成の４８％を占めて おり、そして、アルギニル残基の多くは集まっている。Ｐ２のアルギニン残基の 大部分は２以上の残基のかたまり（クラスター）として集合しているが、Ｐｌは ６個のアルギニル残基からの１個のクラスターを有する。アミノ酸配列の分析は 、ＨＰｍＡｂによるプロタミンの認識は、アルギニンの密集（ｄｅｎｓｉｔｙ） に依存しているであろうことを示唆している。それゆえ、異なるアルギニン密集 に対して、及び、各種の他のアミノ酸に対して選択されたＰ２の分節（ｓｅｇｍ ｅｎｔ）を表わす、３個の合成デカペプチド（第ＤＢ表）、及び、最大のアルギ ニン密集を表わすポリアルギニンに対して、）ｌＰｍＡｂがアッセイされた。

この結果は、第■表に示されている。

（本頁以下余白） 第■表 抗プロタミンモノクローナル抗体と合成ペプチド（第■表）及びポリアルギニン の反応性（００４９゜）Ａ　ベブｆＦ　１　（５０）　０．０６　０．０６ベブ チＦ　１　（１０）　０．００　０．０１ベブｆＦ　３　（５０）　０．２５　 ０．０５　＜０．０４Ｂ＜ブｆＦ　１　（５０）　０．０６　０．０４ベブチＦ 　２　（５０）　０．３２　０．０３＜ｉ５Ｆ　３　（５０）　０．０５　０． ０４率バートＡ　：未処理ペプチド。ｆｌＰ＋ＩＩＡｂはペプチド２゜３　（未 処理）及びポリアルギニンに対して反応性である。

パートＢ　ニジステイニル基の間でジスルフィド結合の形成を阻止するためにア ミノがエチル化されたぺブチド、ペプチドのアミノエチルはペプチド３とのＨＰ ＋ｎＡｂの反応性を消失し、ペプチド１又は２の反応性に何らの変化もない、コ ントロール（Ｄ＋ａＡｂ（抗ミオシン）及び非免疫のマウスの血清はペプチド又 はポリアルギニンと反応しない。

）ＩＰ＋＋Ａｂのポリアルギニンとの高い反応性は、認識は集合したアルギニル 残基に依存するという提案を支持し、そして、他のアミノ酸はエピトープの認識 には必須のものではないということを示唆している。ペプチド１は）ＩＰｍＡｂ とは反応性を示さず、これは、２個のアルギニル残基のクラスターは認識には不 十分であることを示唆しているのに対し、適度の、しかし現実のペプチド２の反 応性は、６個の残基からなる片肉の、３個のクラスターを含めて４個のアルギニ ル残基の密集がＤＩＭされることを示唆している　（第ｍＡ表）。４個のアルギ ニル残基が単独に存在するペプチド３の反応性の表現の不一致は容易に解決され る。合成ペプチドが合成のまま、即ち、システィン−システィンの交差結合を阻 止するための処理がされていないものとして使用される時は、ペプチド３はＨＰ ｍＡｂと反応性を示す。

しかしながら、システイニル残基の間でジスルフィド結合の生成を防止するため に、プロタミンの製造時に３個のペプチドが処理されるとく第６．１．２項参照 ）、ペプチド３０ＨＰｍＡｂとの反応性は消失する（第１［１８表）。

この観察は、未処理の状態にあっては、ペプチド３の２個のシステイニル基は交 差結合しており、これが、４個の単独のアルギニル残基を、抗体の認識を起こさ せるのに十分接近させるか、又はそのように配向することを生じさせるような並 列の状態にさせることを示しているものと、我々は解釈している。システイニル 残基が阻害されると、そのような構造は引き起こされず、そして、ペプチド３は ＨＰｍＡｂと反応しない（第■Ｂ表）。この観察に一致して、ペプチド２の反応 性は、トリブレットを含む４個のアルギニル残基の密集に依存していると推測さ れるが、及びペプチド１の反応性の非存在は、システィン−システィンの交差結 合によっては変えられない（第ｎ［８表）。

ＨＰｍＡｂがアルギニントリプレットを含むエピトープを特に必要とすることは 、ＨＰｍＡｂがより有力な塩基性アミノ酸のセットであるヒストンや、殊に、２ 個のアルギニンタブレットが５２と５３の残基ならびに１２８と１２９の残基に 存在するも、１個のアルギニントリブレッドもないようなアルギニンに冨んだヒ ストンＨ３（ＤｅＬａｎｇｅ。

Ｒ，Ｊ、ら＋１９７２＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、 　６９：８８２）に対しては反応性を示さないことにより、さらに、証拠が与え られている。

ＨＰｍＡｂによる３個以上のアルギニル残基のクラスターの認識は、専ら、又は 、主に、濃縮された高いポジティブな電荷に基づくという可能性は、最大の真の ポジティブな電荷及び最大のアルギニン密集を表わすポリアルギニンに対するＨ ＰｍＡｂの反応性を、高い真のポジティブ電荷をもつものとして非常に近いポリ リジンのそれとを比較することにより、証明された（第３図）。

第３図のアッセイのデータは、［ＩＰ＋ｎＡｂの特異性は高ポジティブな電荷を もつエピトープの認識ではなく、アルギニル残基のクラスターに固有な特別の性 質に関連することを示している。

反応カーブの比較（第３及び４図）は、ＢＰ＋ｏＡｂがＰｌとポリアルギニンと の結合動力学において、Ｐｌ及びＰ２とのそれよりもずっと類似していることを 示している。ＰＩとポリアルギニンの両方に対して、ＨＰｍＡｂは低い抗原濃度 で飽和しているようにみえる。ポリアルギニンに対しては、この飽和はエピトー プの繰り返しの高いオーダーによるものと仮定されるが、ＰｌとＰ２の双方にお いては、６個のアミノ酸の推測の最小のエピトープは、この例では３個のクラス ターを１つ含む４個のアルギニル残基をもつ６個のアミノ酸片であるが、２であ るように思われる。それゆえ、ＨＰｍＡｂのＰｌとのより大きい反応性は（第４ 図）Ｐ２には存在しないアルギニンの密集である（第１ＩＡ表）、６個のアルギ ニル残基のクラスターによるものかもしれない。

上述のデータを概観すると、ＨＰｍＡｂは、アルギニンの密集と相関する活性の 強度をもって、集合したアルギニル残基と反応し、その最小の要件は３個のアル ギニル残基が連続したものを含め、６個の残基のエピトープ内に４個以上存在す るか、特別の配置又は３個のアルギニル残基のクラスターを与える近接した並べ 方、父応にｎ叫り生 ヒトの血清プロタミン反応性のｒｇｈ抗体（第１表）の特性は、ＨＰｍＡｂに対 して確立された特性と比較することにより、そして、その反応性がヒトＩｇＭ抗 体の特別のサブセットの中にあるかを決定することにより、検討された。

典形的なヒト血清のグループ（大人男性、大人女性、小児）のＰｌ及びＰ２及び ポリアルギニンとの相対的な反応性がアッセイされた（第５図）。絶対的な力価 において差異が予想されたにもかかわらず、３つの抗原の活性の順位、血清希釈 対反応カーブの傾斜及び上昇する抗原濃度に対する反応性における血清の間の類 似性は、血清の反応性はすべての正常の血清中に存在するＩｇ？！抗体の別個の セットの反応性であることを示している。第５図のデータは、又、小児のプロタ ミン反応性ＩｇＭ抗体のセットは、大人の血清のものと同一の特性を有すること を確立した。

ヒ）　ＩｇＭ抗体の免疫認識特性とＨＰｍＡｂのそれが一致することは競合ＥＬ ＩＳＡにより示された（第６図）。血清抗体のＰｌ及びＰ２の双方との反応性の ＨＰｍＡｂによる抑制は、ＨＰｍＡｂの濃度に比例している。Ｐｌとの血清の反 応性のほぼ５０％抑制は、肝ｍＡｂの１　：　１．、ＯＯＯの希釈により達成さ れた。ｔｌＰＩＡｂはＰ２とよりも、Ｐｌとより大きい反応性を示すという観察 と一致して（第２図及び４図）、第６図のデータは、又、ＨＰｍＡｂは血清抗体 の２２反応性よりは、血清抗体の２１反応性に関して、より大きな競合を示すこ とを示している。

血清ＩｇＭがＰｌ及びＰ２と反応するのを阻害するのは、ＨＰｍＡｂによる特異 的なエピトープの認識によるものであるということの保証は、ニワトリミオシン に対するマウスπＡｂ　、及び、正常な（非免疫化の）マウス血清によりなされ たバレラルアッセイ、このいずれも、ヒト血清Ｉｇ？ＩのＰＩ及びＰ２との反応 性を阻害しないが、このアッセイにより提供された。

逆競合（ｃｏｎｖｅｒｓｅ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）アッセイ翫即ち翫ヒト血 清によるＨＰｍＡｂの阻害は、又、［ＩＰｍＡｂにより認識されるエピトープは ヒトのプロタミン反応性ＩｇＭＪ元体により認識されるエピトープと相同性を示 す（第■表）。

第■表 （Ａ）　Ｐ　Ｌ　（１０ｕ　ｇ／ｄ）及び（Ｂ）Ｐ２（１０ｕｇ／ｄ）”に対す るＨＰｍＡｂの反応性に関するヒト血清（成人男性、成人型Ａ　ＯＯ，７９−０ ，７４−− 成人男性　０．７１　１０　０．６５　１２成人女性　０．７０　１２　０．６ ５　１２小　児　０．６８　１４　０．６３　１５８　０　０．６４−０．５７ 　−− 成人男性　０．６１−０．５３　− 成人女性　０．６２−０．５１　１１ 小　児　０．５８　１０　０．５１　１１事ＥＬＩＳＡプロトコールは、単一の 工程を挿入することにより修飾された：　ＨＰｍＡｂの添加の前に、５０ｕｌの ヒト血清が各くぼみに加えられ、そして、１時間後に、（室温で）血清が除去さ れ、そして、くぼみが洗われた。反応性はペルオキシダーゼ接合の抗マウスＩｇ Ａ。

ＩｇＧ、　ＩｇＭへの結合により検出された。

゛ＯＤ＝光学濃度 本研究において使用された固相遮断アッセイにおいて示されたヒト血清による最 大の抑制はわずか１５％までであったが（第■表）、同様な遮断活性は、ヒトの 各集団のクラス、即ち、大人男性、大人女性及び小児のそれぞれから得られた典 型的な血清により達成された。この観察は、ＨＰｍＡｂに対するエピトープを定 義するために使用された合成ペプチドに関する大人及び小児の血清の類似の区別 及び活性の表示に一致する。

（第■表及び第７表の比較） 第７表 （第ｎ表の）合成ペプチドとのヒト血清ＩｇＭの反応性（００４９゜）（Ａ）未 処理のペプチド（Ｂ）アミノエチル化さＡペプチド１　０．１２　０，０９　０ ．０２　０　０．０７　０．０２〃２　０．７２　０．２４　０．７０　０．２ ９　０．６３　０．１９〃３　０．８２　０．２４　０．４７　０．１８　０． ５６　０．２０Ｂペプチド１　０．０６　０．０２　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ〃 ２　０．７８　０．２４　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　ＮＤＩ３　０．０５　０．０１　 ＮＤ　ＮＤ　ＮＤ　Ｎ０本血清の希釈液は、各欄の上に示されている。ヒト血清 １ｇｌ’ｌ抗体は未処理又は処理のペプチド１と有意に反応性ではなく、未処理 又は処理の双方においてペプチド２と反応性であり、そして、未処理のペプチド ３と反応性であるが、システィン−システィン交差結合を防止するため処理され たペプチドでは反応性でない（第ｎ表参照）。ＮＤ：未決定。

血清抗体と合成ペプチドの反応性がＨＰｍＡｂの反応性と平行していることを示 している第７表は、又、２つのカテゴリーの抗体に対するエピトープが類似のも のであると考えるための証拠を与える。エチル化された、又は、非エチル化され た状態（システィン−システィン交差結合が阻止されたもの、又は、非阻止のも の）のいずれでも、ＨＰｍＡｂと同様に（第■表）、３種の血清のすべてのＩｇ Ｍ抗体はペプチド２を認識し、どちらの状態においてもペプチド１を認識せず、 そして、非エチル化の場合においてペプチド３を認識し、エチル化された時は認 識しなかった（第７表）。

血清のプロタミンとの反応性は、ＩｇＭ抗体の制限されたセットに帰するという ことを保証するために、一連のアフィニティ吸着法が実施された。最初に、これ らの抗体はプールされたプロタミンの分画と、既に示したように、自然に生ずる ヒト血清抗体に反応性の８又は９個の蛋白を含む精子膜蛋白（Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ 、Ｃ，ら、　１９８５゜５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１２１１）とを区別すること が示された。上昇する量のプールされたプロタミンが結合しているアフィニティ カラムに吸着された後は、血清のプロタミンとの反応性は段々と０に近づいたの に対して、血清の精子膜蛋白分画との反応性はわずかな減少が観察されただけで あった（第７図）。

１１Ｐ＋＋＋Ａｂに対するエピトープの分析におけるように、血清抗体の反応性 は主に電荷依存性の反応の反応性であるという可能性が考えられた。又、正常の 、及び、病気を有するヒトの血清の双方においてヒストンに対する自己抗体が同 定されたので（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ、　Ｙら、１９８７゜Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　 ＲＩ＋ｅｕｍ＋　３０：１６９）、ヒト血清１ｇ？抗体のプロタミンとヒストン を区別する能力についてアセスメントがなされた。この方法で使用されたＥＬＩ ＳＡ法の高度の感度を肯定して（Ｐｒｕｓｌｉｎ＋Ｆ、Ｈ，ら、　１９８６．Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　９４二９９；　Ｒｏｄｍａｎ、　Ｔ、Ｃ，ら、　１９８６．　 Ｊ、ＩｍｍｕｎｏＬＭｅｔｈｏｄｓ　９４：１０５）　、精製された子牛胸腺と 反応性の高力価のＩｇＭ抗体が試験血清中に検出された（第８Ａ図）。

ヒストンが吸着されたアフィニティカラム上に一定量の血清が吸着された後は、 精製された子牛胸腺との反応性は消失したのに対し、ヒストン吸着血清のプロタ ミンに対する反応性は実質的に変わらなかった（第８Ｂ図及び第８Ｃ図）。

ヒト血清中のＩｇＭ抗体のサブセットのプロタミン反応性は電荷誘引の反応性で はないという他の証拠が、第９図のデータにより得られた。ポリリジンとともに 試験されたとき、ヒト血清の１．Ｍ抗体はその抗原に結合した。しかしながら、 血清がポリリジン結合アフィニティカラム上に吸着されたとき、ポリリジンとの 反応性はなくなったが、一方、プロタミンとの反応性及びポリアルギニンとの反 応性は保持されていた（第９Ｂ図）。逆に血清がポリアルギニンに吸着された時 は、プロタミン１、プロタミン２及びポリアルギニンとの反応性は消去されたが 、ポリリジンとの反応性は維持された（第９Ｃ図）。

６．２．５．　ＨＰｍＡｂ　びヒト　パ　グロブｒン　によ切　れる　」ｖｉ国 装似山１ｊゼルー孟丘ん皿二工五盈− 第■表は、合理的に保証されたモノクローン性（６゜１．３を参照）をもつハイ ブリドーマにより分泌されるマウス抗−ブロタミンＩｇＧの）ｌＰｍＡｂの反応 性と、ヒト血清中のＩｇ？！抗体の特異的サブセットの反応性の総括的な比較で ある。

（来貢以下余白） 第■表 ＨＰｍＡｂ及びプロタミン反応性血清ＩｇＭ抗体によるポリアルギニン　＋＋＋ ＋ エチル化ペプチド１ ペプチド２　÷　÷ エチル化ペプチド２　＋　＋ ペプチド３　＋　＋ エチル化ペプチド３ プールさｈた子牛胸腺ヒストシ　十　−一十ヒストンＨ３十−〇 精子膜蛋白　＋　−１ ＊ポリリジンに吸着された血清、ポリリジン反応性抗体は消去し、プロタミン反 応性抗体が保持されている。

十子牛胸腺ヒストンに吸着された血清、ヒストン反応性抗体は消去し、プロタミ ン反応性抗体は保持されている。

Ｑ十から断定することによる。

１プールされたプロタミンに吸着された血清、プロタミン反応性は消去し、精子 膜蛋白反応性抗体は保持されている。

比較（第■表）は、２つの抗体のセットに対するエピトープは高度に相同性を示 していることを明らかにしている。この研究の実験のプロトコルにより検出され る主要な差異は、３つの抗原、ヒト精子プロタミン１、ヒト精子プロクミン２及 びポリアルギニンとの反応性の明白なランクオーダー（ｒａｎｋ　ｏｒｄｅｒ） の差異である（第３図、及び第４図を第５図と比較。）この差異の１つの可能な 説明は、プロタミン反応性ヒトＩｇＭ抗体の数個のサブセット、即ち、異なった 結合アフィニティのサブセットは、アルギニル残基のイントラ（ｉｎｔｒａ）エ ピトープの配列に対する、又は、結合パターンに影響を与えるエクストラ　（ｅ ｘｔｒａ）エピトープ因子に対する適度に異なった選択性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃ ｅ）をもつがもしれないということである　（Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｈ，Ｍ、ら、　 １９８７゜５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：１１８４；　Ｄｒｙｂｅｒｇ＋７．＋及び ０１ｄｓｔｏｎｅ、　Ｍ、Ｂ、Ａ、＋１９８６、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６４： １３４４）。しかしながら、ＨＰｍＡｂと血清ＩｇＭ抗体の双方により認識され るエピトープの主要で、共通な特質は、集まったアルギニル残基の特質であるこ とは明らかである。

プロタミン反応性のＩｇＭ抗体が、精子又はプロタミンにさらされたことのない 小児の各自の血清中に存在しているので、この推測上のエピトープに相同の分節 をもつヒトに１原的な他の蛋白が起源（免疫原性の刺激）、又は、自然のＩｇＭ 抗体のそのセットの役割（抗原的認識）のいずれかに関連するという可能性も考 えられる。３個のクラスターを含む４個のアルギニル残基をもつ６アミノ酸の分 節のために、蛋白配列データベースについてサーチがなされた。その結果は、第 １表に示されている。

（来貢以下余白） 第１表（１） ６＠のアミノ酸をもち、そのうち４＠がアルギニル基であり、これらの３個はク ラスターにて配列している分節をもつ、プロタミン及び絹子特ヒト　補体ω前駆 体　６６８−６７３ 補体Ｃ４Ａ　１．４２６−１．−４３１丁細胞表面グリコ蛋白ＣＤ８前駆体　２ ０８−２１３丁細胞表面クリコ蛋白ＣＤ４前駆体　４２２−４２７組織適合抗原 のＴ鎖の 推論された前駆体 トランスボザーゼ　１３９−１４４ ヌスＢ蛋白　３−８ ３Ｏ８ＩＪｌシーマール蛋白２−７ アラニルーｔＲＮ＾　ンンセターｆ　４３０−４３５ジアミノピメトト　デカル 材シラーｆ　４０３−４０８ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄＲＮＡ＃リメラーゼ１９ ７−２０２１３６８−１，３７３ 単純ヘルペス（タイプ１）　キｔ−七関連トランスフォーミング蛋白　１４１− １４６単純〜４ベス（タイプ２）　グリコブＩティンＤ　３６４−３６９乳頭腫 ウィルス（タイプ６ｂ）　プロバブル　Ｌ２　プロティン　４−９乳頭腫つ侶ス （タイプ■）　プロバブル　Ｌ２　プロティン　３−８乳頭腫ウィルス（タイプ ３３）　ブＤ！τカＬＬ２　プロティン　４５０−４５５プロバブ３Ｅ６　プロ ティン　１４０−１．４５乳江ｎ腫つ侶ス（タイプ８）　プロバブル　Ｌ２　プ ロティン　３１８−３２３Ｂ型肝炎ウィルス　コアー抗原　１．５０−１５５サ ブタイ７’ＡＹＷ及ヒ１５５−１６０６サブタイプ　１６４−１６９ 第■表（２） シ吃−５３７ ２，０８５−２，０９０ 仮定のＢＯＲＦ　１蛋白　９−１４ ブ■ルプ龜グリコブＤテイン５２８−５３３仮定のＢＳＬＦ１ブ訂ティン　８５ ９−８６４仮定のＢＬＬＦ２ブ■ティン５３−５８仮定のＢＥＲＦ３プロツイン 　９０−９５仮定のＢｌ？ＬＦ　１ブ■テイン　８６−９１アデノウイルス２　 マイｔ−ニア７九テイン　３１５−３２０プロバブル７−リーＥ４３４にブＤテ ィン２６５−２７０プロルブルアーリーＥ４１３に九ティン７０−７５ブ■バブ 霧アーリーＥＩＢ２１にプロツイン１５７−１６２シートＬ１５２にプロティン ５３−５８７−’ｊ−ε２＾　ＤＮＡ結合　プロティン　４６−５１メジヤ一ゴ アープロテイン０駆体１００−１０５ターミナルブ訂ツイン３４９−３５４ アデノウィルス５　プロバブルアーリーＥＩＢ　２１Ｋ　プロティン　１５７− １６２トドＬ１５２にブ■ティン５４−５９ アーリー　ε２＾　ＤＮＡ結合　プロティン　４６−５１アデノウイルス７　タ ーミナｓカテイン　３３８−３４３よ石−彊力 ライノウィルス２　デノ五〇カッイン　１．３９６−１，４０１黄熱病ウイルス （１７ＤＩり　ゲノムａ九ディン　１，７乾−１，７０７シンＦビスクイ蕗スＣ ２つの株）構造ｆリブｎティン２２−２７メ１挙１ｆｆｉｆリブロツイン１，８ ８６−１．８９１Ｔｌｌ胞白１ｆｌＬｔｉウイ藤ス（ＢＴＬＶＩＩ）ｅｎｖｔＪ ブＤツイン３０５−３１０１’ｌＴＶ　ＣＩＩＴＬＶ　Ｉｌ［）　）ランス活性 化転写調節ブ叶インパージｉン　１　６１−６６ ３個のクラスターを含む４個のアルギニル残基を有する６個のアミノ酸の配列が 、整理されたすべてのを椎動物と非を椎動物のプロタミン又は精子特異的ヒスト ン中に、主に大腸菌であるが幾つかのバクテリア蛋白中に、そして、多くのウィ ルス蛋白の中で確認された（第１表）。プロタミン以外の、その配列を示す唯一 のヒトの自速性の蛋白は、２つの補体前駆体である、２個のＴ細胞グリコ蛋白と １個の（推論された）、クラス■組織適合抗原のＴ鎖の変異体である（第１表） 。

６．３．抜−一一玉 本発明者は、すべての年令の正常な男性及び女性の血清中に、精子の塩基性核蛋 白であるヒトプロタミンと反応性のＩｇＭ自然抗体のセットを見い出し、そして 、最小の抗原箇所が３個のクラスターを含む４個のアルギニル残基を有する６個 の残基のものであることを同定した。これらの抗体は、プロタミンにさらされた ことのない小児の血清中にも存在するので、かかる抗体の起源をプロタミンによ る免疫刺激とするこ′とには反論がある。最近になってわかった免疫メカニズム の脈絡の中において、これらの抗体の起源はプロタミンの抗原箇所に相同の配列 をもつ他の１原的な分子によるか、又は、プロティンの抗原箇所のイメージを生 む他の免疫グロブリンのイディオタイプによるものであるかもしれない。

これらの抗体が第■表中のヒトの蛋白のいずれかの分節により誘因されるという 可能性は、興味をそそるものである、なぜならば、すべてのものが免疫調節メカ ニズム中に含まれており、すべてのものが発生期の免疫系中に存在するかもしれ ないと信じられるからである。一方、新生児の胃腸管には、Ｅ、ｃｏｌｉが存在 しているので、Ｅ、ｃｏｌｉ蛋白（第１表）がプロタミン反応性の抗体の誘因に とって最初の刺激を提供するという可能性も考えうる。自然抗体は胃腸管の細菌 叢による刺激から生ずるものとも考えられる（Ｂｏｙｄｅｎ、Ｓ、Ｖ、、１９６ ６゜Ａｄｖ、　ｌｍｌｌ１ｕｎｏｌ、５：１）。

ウィルス蛋白がこれらの抗体の抗原性ターゲットであるかもしれないという可能 性もある。自然抗体の１つの役割は、感染する恐れのあるものに対して、防御す ることであるという仮説もある　（Ｍｔｃｈａｅｌ、　Ｊ、Ｇ、、ら。

１９６２、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１１５：１３１）。

これらの研究は、ヒト血清のＩｇ？Ｉ自然抗体のセットがそれにより反応性とな る、抗原箇所の定義を提供した。

７、皇施拠：ヒ　′　に　る　のプ ロ　ミン　、・　ＩＭ　は　ヒトの ウィルスの゛　と　、　る ここに詳述する実例において、本発明者は、ヒト血清中の低親和性の結合力をも つ、抗プロタミンＩｇＭ抗体、その血清中における存在はヒト免疫不全ウィルス （旧■）感染とエイズの発病の間の潜伏期間に関係するが、その抗体を記載する 。

ＨＩＶによる感染とエイズの臨床的な発現の間の潜伏期間は大いに変動しうるも のであるが、この最大の期間は未だ決定されておらず、ＨＩＶに感染した者が病 気を進行させないとうことも可能である。本発明者はＨＩＶに感染した個人のエ イズへの病理的な進行に抵抗する能力の指標であると思われる因子の同定、及び 定量的決定のための方法を、ここで報告する。この因子は正常の被検者及びＨＩ Ｖに感染した者であって、引き続き、有意の潜伏期間を示している者の血清中で は検出しうるが、エイズと診断されたものの血清中、及び、旧νに感染した者で あって、血液採取の時点では無症候性であるが、比較的短期間にエイズへ進行す る者の血清中には存在しないか、不十分である。この因子は、精子プロタミンに 特徴的な特異的な抗原箇所に反応するＩｇＭ抗体のポピユレーションのサブセッ トである。

プロタミン反応性のＩｇ？Ｉ抗体の決定的なサブセットは自然抗体であるように 思われる。ここに記載するアッセイ方法は、ＨＩＶに感染した者における可能な 潜伏期間の予測のためのモダリティ−を与える。

７．１．　プロ　ミン　、・　■門　のな　の　′　にお番る　゛エイズ■ ヱぶり１ｒ在 本発明者は、正常な大人の血清が上昇する濃度のプロタミンとともにＥＬＩＳＡ にてアッセイされると、抗原の高い濃度では、活性（光学濃度、０．０．）対血 清希釈カーブの傾きにおいて急な増加が生ずることを知った（第１０Ａ図）。２ ０人のランダムに選ばれた正常な大人の血清を同様にアッセイした時の略式のカ ーブ（第１０Ｂ図）は、傾斜の増大は１又は少数の血清という例外ではなくて、 正常な大人の血清の一致した特性であることを証明しており、主要な抗体セット に加えて、プロタミン反応性１ｇＭ抗体の検出しうる第２のサブセットが存在す ることを示唆している。我々は、第二のサブセットがプロタミン分子上の異なっ たエピトープを認識するものであるか、又は、主要なセットと同一の認識特異性 をもつが、異なった結合親和性をもつだけのものであるのかの可能性について試 験した。血清中のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体（上述の第６項参照）により認識 される抗原箇所の１つのコピーを有する合成デカペプチド（ＤＰ）を抗原として 使用して、プロタミンに対して試験されたのと同一の血清についての比較アッセ イ　（第１０Ｃ図）は、高抗原濃度の血清に対する活性カーブの傾斜の増大は、 異なった認識特異性をもつサブセットに起因するものではなく、同じ抗原箇所と 反応するが、明らかに低親和性であるサブセットを示しているものと解釈できた 。

同様に、エイズと診断された患者の１５の血清から成るグループがプロタミンの 上昇する濃度に対して試験されたとき、高抗原濃度での反応カーブの傾斜の増大 、これはプロタミン反応性ＩｇＭ抗体の第二のサブセットの指標として解釈され るものであるが、これはいかなるアッセイにおいてもみられなかったしく第１１ 図）、高い合計力価のプロタミン反応性１ｇＭ抗体による血清のアッセイ　（第 １１Ａ図）においてさえもみられなかった。

７．２．ＨＩｖ′　の　゛のための　−プロ　ミン生少定量 特別の因子の正常な血清中における存在とエイズにおける非存在は、病気に関連 する不全の可能性を示唆しているので、この因子を定量化するために、即ち、抗 原の高濃度による反応カーブの傾斜の増大により表わされるプロタミン反応性１ ｇｌ’ｌ抗体の第二のサブセットの比例した力価をアセスするために、計算シス テムが工夫された。１対のカーブの検分により　（第１ＯＡ及び１０８図）、適 切な試験抗原濃度として、経験的に２μｇ／ｒｒｄｌと２０μｇ／ｒｔｒｌが選 択された。Ｘ軸上の２点、即ち血清希釈１　：　１００（χ１）と１　：　５０ ０（ｘ　２）の間のカーブの増大は、これら２点に対するＹ軸上のｏ、ｐＪ！の 間の差として表わされうる。２μｇのプロタミンカーブから２０μｇのカーブへ の増大の増加は、２０ｕｇ／ｄブロタミンニおける（０．０．　ｘ　１−０．０ ．　ｘ　２）　−２ｕ　ｇ／ｄプロタミンにおける（０．０．　Ｘ　１−０．０ ．　Ｘ　２）であり、これは△２ｏ−△２として記載される。

一般の集団（ウェスタンプロットにおいてＨＩＶ陰性）の成人男性及び成人女性 から成るグルー・ブ、及び、エイズと診断された患者のグループ、及び、エイズ の恐れのあるもの（血清陽性でホモセフシュアルの者）、及び、血液試料を採取 した時点で無症候性又は軽い免疫不全（低いＴ４カウント又は低い分裂刺激イン デックス又はその双方であって、他に異常のないもの）として診断されたグルー プに対して、Δ２０−△２の値が計算された。後者の幾つかのものにとり、追試 の臨床的なアセスメントが利用できた。結果は第１２図に示されている。

第１２Ａ図を点検すると、１５という値が゛正常な”範囲の下限であると考えら れた。これに基づき、正常な範囲内の血清の各グループのパーセントが決定され た（第４表）。

（来貢以下余白） 第４表 各患者グループに対する抗プロタミンＩｇＭレベルが正な−に　る　゛のパーセ ン グループ　肚　上皇鉦皿夏Ｘ Ａ正常　５７９５ Ｂエイズ　３１６ Ｃ無症候性−→エイズ　１４０ Ｄ無症候性−→無症候性　１０　９０ Ｅ無症候性−→結末わからす　１０　５０第１２図に示されたデータは、ＨＩＶ 陽性血清中の正常範囲内の△２０−△２の値はエイズが発症する迄に少くとも２ 年の、恐らくは、それより長い潜伏期間を予想させるのに対し、低いΔ２０−Δ ２値はこの病気への進行が差し迫っていることを予想させることを示している。

グループＡとＤに対する値とグループＢとＣに対する値が２つの明らかな分布か ら成っているのに、グループＥに対する値は双方の分布を含んでいるという事実 （第１２図）は、グループＣとＤの各々に対するＨＩＶ血清陽性とエイズの発病 の間の間隔の設定が特徴的であり、適切であることを示唆している。

７．３．プロ　ミン　・　の　のサブセーム上ａ白旧ｌ臣 △２０−△２で表わされるプロタミン反応性のＩｇＭ抗体のサブセットは、°“ 低親和性”として区別されている。抗体の親和性は、抗体が認識する抗原に対す る抗体の結合する力の表われである。この結合は、分子内の力、例えば、水素結 合、疎水性、イオン性相互作用、の混合した効果である（Ｋａｒｕｓｈ、　Ｆ、 　＋　１９６２．　Ａｄｖ、　ＩＩｌｍｕｎｏｌ、。

２：１−４０）。結合力の測定は、均一な抗体のハブテン又は単独の抗原決定基 への結合に対してなされ、そして、質量作用の法則（Ｌａｅｖ　ｏｆ　Ｍａｓｓ 　Ａｃｔｉｏｎ）の適用により親和性定数（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｏｎ５ｔａｎ ｔ）として表わすことができる。それゆえ、親和性定数は、抗体／抗原複合体の 解離に対する抵抗性に直接関連する。

異なった親和性の一連の抗体が、単一の免疫的誘因に応答して生ずることが知ら れているので（Ｗｅｒｂｌｉｎ。

Ｔ、Ｐ、、ら、　１９７２．　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、　９：９８７−１０１１ ）、同一の抗原決定基と反応する抗体の集団の別個の“みかけの（ａｐｐａｒｅ ｎ　ｔ）親和性定数を決定するのに関心が向けられ、多くの方法が工夫された（ Ｓｔｅｅｎｓｇａａｒｄ、Ｊ、ら、１９８０゜Ｍｏ１．Ｉｓｍｕｎｏｌ、１７： ６８９−６９８ＨＬｅ＋ｎ、＾、Ｍ、＋１９８４＋Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｂ、７２：１７１−１７６；５ｃｉｕｔｔｏ、Ｅ、、ら＋１９８’ＬＭｏ １．Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２４：５７７−５８５）。これらの方法及びその通用が論駁され、また、防御さ れた間に、有用な経験的法則が現われた：親和性が雑多な抗体系においては、高 い親和性をもつ抗体が抗原に結合し、低親和性の抗体よりも、より強く抗原との 解離に抵抗する。それゆえ、同一の抗原に対して異なった親和性をもつ抗体のサ ブポピユレーションは、一定量の抗体混合物（例えば、血清）を上昇する量の抗 原と反応させることにより同定されうる。

抗原の濃度が増大するにつれて、高い親和性をもつ抗体は飽和し、そして低い親 和性をもつ抗体が抗原と反応するようになろう。実験的証拠は、かかる抗体系は しばしば、１又は２つの主要なサブポピユレーションをもつ、単峰性（ｕｎｉｍ ｏｄａｌ）又はパイモデル（ｂｉｍｏｄａｌ）親和性分布をもつことを示してい る（Ｇａｎｄｏｌｆｉ、Ａ、ら。

１９８Ｉ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、９２：５７−８４）　、この原則に従って、 Δ２０−Δ２により表わされる抗体のサブセット、即ち、抗原の高い濃度で検出 されるものは、抗原の低い濃度において検出される主要ポピユレーションより低 い親和性をもつポピユレーションを表わすと考えられる。

Δ２０−△２の値がプロタミン反応性のＩｇＭ抗体の主要ポピユレーションより も低い親和性をもつサブセットを表わすとの推論を肯定する証拠は、イオン性相 互作用に基づく抗体結合相を消失させる、高められたＮａＣ１モル濃度において 結合反応を実施することにより得られた。アッセイの血清希釈は０．１５Ｍ　Ｎ ａＣ１から０．訪ＮａＣ１に調節された。この媒質で実施されたアッセイのため の反応カーブは（第１０Ｄ図）、高い抗原濃度でのカーブの立ち上がりの増加が （第１０Ａ、１０８図）消失し、△２０−△２値は驚く程減少したことを示して いる。

低エネルギーの結合成分であると考えられる（Ｋａｒｕｓｈ。

Ｆ、　、　１９６２．Ａｄｖ、１ｍｍｕｎｏ１．２：１−４０）イオン性相互作 用による抗体結合相の消失は、抗体の低親和性サブセットの結合の選択的消失を 生ずるようにみられた（第１ＯＡ。

１０Ｄ図）。

７．４．　人　において　で　るプロ　ミン１　Ｉｈ−のポピユレーション　４ ゛ 土見且盪 上述の第６項で述べたように、臨床的に正常な小児の被検者の血清は、大人の血 清と同一の抗原認識特異性をもつプロタミン反応性１ｇＭ抗体を含む。小児の血 清を上昇する濃度のＰ２　（第１３Ａ図）及びＤＰ（第１３Ｂ図）とともにアッ セイするとき、そのカーブが平行であることは、正常な成人の血清とは異なり、 小児血清のプロタミン反応性１ｇＭ抗体は結合親和性に関して均一（又は単峰性 （ｕｎｉｍｏｄａｌ）であることを示している。

７．５．　炊に　る　プロ　ミン 小児の血清に検出される抗プロタミン抗体は、プロタミンによる免疫刺激に帰因 させることはできない、というのは、プロタミンは思春期以後の精巣で新たに合 成されるものであり、精子系以外の細胞の核には組み込まれていないからである 。１２日令以上の新生児の血清中にみられるプロタミン反応性ＩｇＭ抗体（第６ 項参照）を母体起源のものとすることもできない、というのは、ＩｇＭは胎盤を 通過しないからである。プロタミン反応性抗体に対する同定された抗原箇所は、 プロタミン以外のヒトの内因性蛋白においては、極めて限られて生ずる（第６． ２．５項参照）。それゆえ、小児の血清のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体は自然抗 体であり、そして、その延長として、大人血清のプロタミン反応性１ｇＭ抗体の ２個のサブセットの１つは自然抗体から成ると推測するのが合理的である。

プロタミンは、その合成及び細胞による取り込みの間、免疫系から隔離されてお り　（Ｄｙｍ、　Ｍ、及びＦａｗｃｅｔｔ＋Ｄ、Ｗ、　、　１９７０．　Ｂｉｏ ｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、３：３０８−３２６）、そして、本発明者は、プロタミンは 非免疫抑制性、即ち、これは他の精子由来蛋白がそうであるように、Ｔ−ｆａ胞 のインビトロでの分裂を抑制しないことを示した（Ｒｏｄｍａｎ、Ｔ、Ｃ。

ら、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１２１１−１２１５）　、それゆえ 、思春期以降の男性及び性経験のある女性の血清は、プロタミンによる免疫性誘 因に帰することのできるプロタミン反応性の抗体を含むかもしれない。このよう にして、本発明者は、大人のヒトの血清のプロタミン反応性Ｉｇｌｉ抗体は起源 の異なる２つのサブセットを含む；（１）自然抗体、及び（２）誘因された抗体 。

上述の議論及び我々の実験結果は、小児血清のプロタミン反応性抗体は自然抗体 であることを示しており、小児血清中の自然のプロタミン反応性抗体は、大人血 清のプロクミン反応性１ｇＭ抗体の低親和性サブセットに対応することを示唆し ている。

本発明者は、）ＩＩＶ陽性血清中のプロタミン反応性抗体の低親和性（本来的に 自然のもの）のサブセットの不足は、インデックスとして、又は、貢献因子とし て、エイズへの病原的進行に関係するであろうということを提案する。

ここで記述されたアッセイ方法は１．　ＨＩＶ感染者に対するありうべき潜伏期 間を予測するためのモダリティを提供するものである。かかる情報は、個々の患 者の医療管理、医療施設に対する社会的必要性を予測する際に、及び、最も緊急 には、提案された治療法を試みるための相応の被検者を選択する際に有用であろ う。

８、バイブｉ　−マの 抗プロタミンモノクローナル抗体ＨＰｍＡｂを生産するハイブリドーマセルライ ンＨＰｍＡｂが１９８８年３月２３日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（Ｒｏｃｋｖｉ　１１ｅ。

？ｌＤ、）に寄託され、ＨＢ９６６Ｂという受託番号が与えられた。

寄託された態様は本発明の一面の一つの例として意図されたものであるから、本 発明は寄託されたセルラインの範囲に限定されるべきでなく、機能的に均等ない かなるセルラインも本発明の範囲内に含まれる。ここで記載して示したものに加 えて、本発明の種々の修飾が上記記載及び付属の図面から本分野の当業者には明 らかである。かかる修飾も本発明の請求の範囲の中に含まれることが意図される 。

＋０３ｔｏ４＋０５ 逆希釈 第３図Ａ　第６図Ｂ 逆希釈　逆希釈 第４図Ａ　第４図Ｂ 逆希釈　逆希釈 逆ヒト血清希釈 逆ヒト血清希釈 逆ヒト血清希釈 第６図Ａ　第６図Ｂ 逆血清希釈　逆血清希釈 逆血清希釈 逆血清希釈 逆ヒト血清希釈 第９図Ａ　第９図Ｂ 第９図Ｃ ＋００　５００ 逆血清希釈 ヨ 逆血清希釈　逆血清希釈 逆血清希釈 第１１図Ａ 逆血清希釈 逆血清希釈 第１２図 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プロタミンと反応する、ＩｇＭアイソタイプの抗体。 ２．６個のアミノ酸残基の配列内にトリプレットを含む、４個のアルギニル残基 をもつ配列を有して成るペプチド又は蛋白と反応する、ＩｇＭアイソタイプの抗 体。 ３．コンフォメーションに依存するエピトープを含むペプチド又は蛋白と反応す る抗体であって、前記エピトープがトリプレットクラスターを含む、４個のアル ギニル残基をもつものである、ＩｇＭアイソタイプの抗体。 ４．その抗体が、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９６６８が与えられたモノ クローナル抗体ＨＰｍＡｂにより結合される能力によって特徴づけられるエピト ープと反応する、ＩｇＭアイソタイプの抗体。 ５．それがヒトである、請求の範囲第１，２，３又は４項の抗体。 ６．それが自然抗体である、請求の範囲第１，２又は３項の抗体。 ７．健康なヒト成人の血清中に存在する大部分のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体に より示される結合親和性に関連して、低い親和性にてプロタミンと結合する請求 の範囲第１項の抗体。 ８．健康なヒト成人の血清中に存在する大部分のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体に より示される結合親和性に関連して、低い親和性でペプチド又は蛋白と結合する 請求の範囲第２項の抗体。 ９．健康なヒト成人の血清中に存在する大部分のプロタミン反応性ＩｇＭ抗体に より示される結合親和性に関連して、低い親和性でペプチド又は蛋白と結合する 請求の範囲第３項の抗体。 １０．それがポリクローナルである請求の範囲第１，２，３又は４項の抗体。 １１．それがポリクローナルである請求の範囲第７，８又は９項の抗体。 １２．それがＦｖ領域を含む、請求の範囲第１，２，３又は４項の抗体の断片。 １３．プロタミンがヒトプロタミンである、請求の範囲第１項の抗体。 １４．プロタミンがヒトプロタミン１又はヒトプロタミン２である、請求の範囲 第１３項の抗体。 １５．患者から得られた体液中に存在する低親和性で結合するプロタミン反応性 のＩｇＭ抗体を検出し、又は測定することから成り、前記低親和性の結合力をも つ抗体が存在しないこと又はその量が減少していることが、エイズになっている こと、又は、エイズが差し迫って発病することを示すものであるエイズの予知又 は診断のための方法。 １６．低親和性の結合をする抗体が、体液を、６個のアミノ酸残基配列内にトリ プレットを含む、４個のアルギニル残基をもつ配列を有して成るペプチド又は蛋 白と接触させることから成る方法により検出され、又は測定される、請求の範囲 第１５項記載の方法。 １７．低親和性の結合をする抗体が、体液を、トリプレットクラスターを含む、 ４個のアルギニル残基をもつエピトープであって、コンフォメーションに依存す るエピトープであるものを含むペプチド又は蛋白と接触させることから成る方法 により検出され、又は測定される、請求の範囲第１５項記載の方法。 １８．低親和性の結合をする抗体が、体液を、ＡＴＣＣに寄託され、そして受託 番号ＨＢ９６６８が与えられたモノクローナル抗体ＨＰｍＡｂにより結合される 能力によって特徴づけられるペプチド又は蛋白と接触させることから成る方法に より検出され、又は測定される、請求の範囲第１５項記載の方法。 １９．ラベルされた結合パートナーを抗体に加えることによりプロタミン反応性 の抗体の免疫特異的結合を検出することを、さらに含む、請求の範囲第１５，１ ６，１７又は１８項記載の方法。 ２０．ペプチド、又は蛋白が固定されている、請求の範囲第１６，１７又は１８ 項記載の方法。 ２１．ラベルされた結合パートナーを抗体に加え、その結果、免疫特異的な結合 が固定されたラベルの検出により示されるようにして、プロタミン反応性抗体の 免疫特異的結合を検出することを含む請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．上昇するペプチド又は蛋白濃度で方法を繰り返すことにより低親和性の結 合をする抗体を検出することを、さらに含む請求の範囲第１６，１７又は１８項 記載の方法。 ２３．上昇するペプチド又は蛋白濃度で方法を繰り返すことにより低親和性の結 合をする抗体を検出することを、さらに含む請求の範囲第１９項記載の方法。 ２４．上昇するペプチド又は蛋白濃度で方法を繰り返すことにより、低親和性の 結合をする抗体を検出することを、さらに含む請求の範囲第２０項記載の方法。 ２５（ａ）６個のアミノ酸残基配列内にトリプレットを含む、４個のアルギニル 残基をもつペプチド又は蛋白；と （ｂ）ＩｇＭ抗体に対する特異的な結合パートナーと検出しうるシグナルを生ず ることができるラベルの接合体、 を含む診断用キット。 ２６．（ａ）トリプレットクラスターを含む、４個のアルギニル残基を含むエピ トープであって、コンフォメーションに依存するエピトープを含むペプチド又は 蛋白；と （ｂ）ＩｇＭ抗体に対する特異的な結合パートナーと検出しうるシグナルを生ず ることのできるラベルの接合体、 を含む診断用キット。 ２７．（ａ）ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９６６８が与えられたモノクロ ーナル抗体ＨＰｍａｂにより結合される能力によって特徴づけられるペプチド又 は蛋白；と（ｂ）ＩｇＭ抗体に対する特異的な結合パートナーと検出しうるシグ ナルを生ずることのできるラベルの接合体、 を含む診断用キット。 ２８．蛋白がプロタミンである、請求の範囲第２５，２６又は２７項の診断用キ ット。 ２９．ペプチド又は蛋白が固定されている、請求の範囲第２５，２６又は２７項 の診断用キット。 ３０．特異的な結合パートナーが抗−ＩｇＭ抗体であり、そして、ラベルが酵素 である、請求の範囲第２９項の診断用キット。 ３１．（ａ）６個のアミノ酸配列内に、トリプレットを含む、４個のアルギニル 残基をもつ配列から成るペプチド又は蛋白と反応する抗体；及び（ｂ）検出可能 なシグナルを生ずることのできるラベルの接合体、を含む診断用キット。 ３２．（ａ）トリプレットクラスターを含む、４個のアルギニル残基から成るエ ピトープで、コンフォメーション依存性のエピトープを含むペプチド又は蛋白に 反応する抗体；と（ｂ）検出しうるシグナルを生ずることのできるラベルの接合 体、を含む診断用キット。 ３３．（ａ）ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９６６８が与えられたモノクロ ーナル抗体ＨＰｍａｂにより結合される能力によって特徴づけられるペプチド又 は蛋白と反応する抗体；及び（ｂ）検出しうるシグナルを生ずることのできるラ ベルの接合体、を含む診断用キット。