DK175184B1 - Rekombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosisvirus, fremgangsmåde til fremstilling af peptider eller et önsket protein, plasmid omfattende DNA fra ovennævnte virus og fremgangsmåde til rekombinant fremstilling af sådant DNA - Google Patents

Description

i DK 175184 B1

Den foreliggende opfindelse angår rekombinante Bombyx mor i (silkeorm) nucleare polyhedrosis-virus og en fremgangsmåde til fremstilling af peptider under anvendelse af sådanne rekombinante virus.

5 En fremgangsmåde til fremstilling af peptider ved anvendelse af Bombyx mori nuclear polyhedrosis-virus (BmNPV) er allerede blevet rapporteret (reference 1; med hensyn til de heri anførte referencer, se slutningen af den foreliggende beskrivelse).

10 Det centrale træk ved denne fremgangsmåde består i, at man konstruerer et rekombinant BmNPV med et strukturgen for et ønsket protein, hvilket strukturgen erstatter den polyedriske proteinkodende strukturgendel, under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik, og propage-15 rer rekombinanten i dyrkede silkeorme(Bombyx mori)celler eller i levende silkeorme (Bombyx mori), således at det ønskede protein akkumuleres deri. Denne fremgangsmåde er imidlertis stadig utilfredsstillende med hensyn til udbytterne af de ønskede proteiner.

20 Desuden foregår produktionen af sammensmeltede proteiner allerede i praksis i Escherichia coli. udbytterne kan imidlertid ikke siges at være blevet forbedret signifikant (referencerne 2-8).

Den foreliggende opfindelse angår således et re-25 kombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis-virus, der er ejendommeligt ved, at det i den polyedriske proteinkodende strukturgendel af det Bombyx mori mucleare poly-hedrosis-virus-DNA har et strukturgen for et ønsket protein knyttet til hele eller en del af det polyedriske 30 proteinkodende strukturgen med eller uden indskydning af en linkerbasesekvens.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et sammensmeltet protein ved progagering af det rekombinante virus i dyrkede Bombyx mori celler 35 eller i levende Bombyx mori.

2 DK 175184 B1

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af det ønskede protein ved spaltning eller sønderdeling af det sammensmeltede protein ved sammen-bindingsstedet deri.

5 Der henvises i øvrigt til tegningen, hvorpå fig. 1-6 som eksempel skematisk viser konstruktionsskemaerne for visse plasmider til rekombinant-vi-rus-produktion, og fig. 7 og 8 viser det elektroforetiske mønster 10 for det ønskede sammensmeltede protein.

BmNPV er almindeligt kendt blandt silkeavlere. Stammen T3 er en typisk stamme isoleret af opfinderne af den foreliggende opfindelse. Det virale DNA (BmNPV DNA) fra denne stamme er blevet deponeret ved ATCC i USA, 15 hvor det har fået accessionsnummeret ATCC 40188·

Til isolering af en del,· der indeholder strukturgenet for polyedrisk protein fra dette virale DNA, er bl.a. behandling med EcoRI hensigtmæssig som beskrevet i reference 1. En Escherichia coli stamme (Ej_ coli K12JM83 20 DGB-0036), der bærer plasmidet pBmE36 med et EcoRI-EcoRI-fragment (ca. 10,5 kb) fra det virale DNA indføjet i plasmidet ved EcoRI-spaltningsstedet, er blevet deponeret ved Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Interna-25 tional Trade and Industry i japan, hvor det har fået accessionsnummeret FERM BP-813.

Som beskrevet i reference l giver endvidere pBmE36, når det behandles med Hindlll, et ca. 3,9 kb langt fragment, der indeholder strukturgenet for poly-30 edrisk protein. Fragmentet indføjes derefter i det i handelen gående plasmid pUC9 (fås i handelen fra Pharmacia P-L Biochemicals). Den efterfølgende EcoRI-spalt-ning, Bal31-behandling (hvorved fragmenter af forskellig længde kan fremstilles ved indstilling af behandlings-35 tiden) og endvidere HindiIl-spaltning, eller en lignende 3 DK 175184 B1 procedure, giver et fragment, der omfatter hele eller en del af det polyedriske proteingen.

Et strukturgen for et ønsket protein kan knyttes til hele eller en del af det polyedriske proteingen ved 5 anvendelse af en passende linker (DNA) (reference 19), og det fremstillede sammensmeltede protein giver, når det spaltes ved hjælp af et passende middel på stedet for peptidet eller aminosyren (den sammenbindende del), der er translateret i overensstemmelse med linkerbase-10 sekvensen, det ønskede protein, som derefter kan isoleres ved konventionelle metoder. Når det sammensmeltede protein er nyttigt i sig selv, er det selvsagt ikke nødvendigt med en spaltningsproces. I et sådant tilfælde kan linkeren mangle.

15 Velkendt som peptidet eller aminosyren (den sam menbindende del), der svarer til linkeren, og midlet til spaltning eller sønderdeling af samme er bl.a. sekvensen Ile-Glu-Gly-Arg og blodkoagulationsfaktoren Xa (i det følgende forkortet til "F-xa"), der er i stand til at 20 spalte sekvensen; Pro-Ama-Gly-Pro (hvori Ama er en vilkårlig slags aminosyre), og collagenase, der er i stand til at spalte sekvensen; Arg eller phe og trypsin, der er i stand til at spalte peptidbindingen bag samme;

Tyr eller phe og chymotrypsin, der er i stand til spal-25 te peptidbindingen bag samme; Pro-Arg og thrombin, der er i stand til at spalte peptidbindingen bag samme; tryptophan og N-bromsuccinimid, der er i stand til at sønderdele samme; og methionin og bromcyan, der er i stand til at sønderdele samme (referencerne 2-10)· Den 30 sammenbindende del og midlerne til spaltning eller sønderdeling er ikke begrænset tiL de ovenfor nævnte, og mange andre passende kombinationer af forskellige peptider eller aminosyrer og forskellige kemiske eller enzymatiske fremgangsmåder kan også anvendes til hen-35 holdsvis den sammenbindende del og spaltnings- eller sønderdelingsmidlet.

4 DK 175184 B1

Det ønskede protein skal hensigtsmæssigt ikke indeholde noget som helst peptid eller nogen som helst aminosyre, der kan sønderdeles ved udsættelse for en spaltnings- eller sønderdelingsproces for en sammenbin-5 dende del, såsom nævnt ovenfor. Det er imidlertid også muligt at sønderdele det sammensmeltede protein i begrænset grad under anvendelse af passende begrænsede, moderate betingelser, således at formålet derved opnås.

Udtrykket "ønsket protein" som anvendt heri kan 10 være et eukaryotisk protein, fortrinsvis et mammalialt protein. Som specielle eksempler på det ønskede protein kan der nævnes forskellige fysiologisk aktive stoffer og stoffer, der er nyttige som diagnostiske reagenser, såsom interferoner (iPN’er), tumornekrosefaktor (TNF), 15 interleukiner og andre lyraphokiner, insulin, væksthormon og andre hormoner, hepatitisvaccine, influenzavaccine og forskellige andre antigen-proteiner, vævsplasmi-nogen-aktiveringsfaktor (TPA), somatomediner, til industriel anvendelse nyttige enzymer, såsom steorid-om-20 dannende enzymer, acylaser, amylaser, lipaser og lignende, fødevareadditiver og foderadditiver, med mere. Nogle af disse materialer kan have en sukkerkæde føjet dertil.

I overensstemmelse med opfindelsen produceres peptider i eukaryotiske celler. Når et gen afledt fra en eukaryot 25 anvendes, kan det producerede peptid undergå den eller de samme modifikationer som den eller de, der optræder in vivo i eukaryoten. De ifølge den foreliggende opfindelse producerede produkter kan derfor siges at have større nytteværdi sammenlignet med dem, der produceres i 30 bakterier.

Generne, der koder for disse proteiner, kan være chromosomale DNA’er isoleret fra naturligt forekommende materialer, cDNA’er fremstillet ved mellemkomst af fra naturen stammende mRNA’er, kemisk syntetiserede DNA'er, 35 eller DNA’er fremstillet ved en passende kombination af 5 DK 175184 B1 metoderne til de netop nævnte eksempler (referencerne 18 og 19).

I tilfælde af at et produkt adskiller sig i nogen grad med hensyn til aminosyresekvens (substitution, 5 udeladelse eller tilføjelse) fra det påtænkte materiale, men stadig har de krævede funktioner, såsom fysiologisk virkning, kan der bevidst foretages modificering med et sådant formål. Når f.eks. methionin skal sønderdeles med bromcyan i relation til den ovenfor nævnte sammenbinden-10 de del, kan methioninresten eller -resterne, der optræder i det ønskede protein, erstattet med en anden amino-syrerest eller andre aminosyrerester eller kan udelades.

I dette tilfælde er det tilrådeligt, at peptidet produceret på basis af den basesekvens, der er udformet i 15 overensstemmelse med den ovennævnte idé, undersøges med hensyn til om aktiviteten deraf er egnet til det påtænkte formål eller ej.

I visse tilfælde kan en del af en aminosyrerest være tilbage i det ønskede proteinprodukt, som det 20 f.eks. ses i tilfælde af kemisk sønderdeling af cystein med 2-nitro-5-thiocyanobenzoesyre. Også i dette tilfælde er det tilrådeligt, at produktet undersøges for aktivitet som nævnt ovenfor for derved at bestemme, om produktet er egnet til det påtænkte formål eller ej.

25 Plasmider (plasmider til rekombination) med en basesekvens, der omfatter hele eller en del af det poly-edriske proteingen fra Bombyx mori nuclear polyhedrosis-virus-DNA (BmNPV DNA) og et strukturgen for et ønsket protein som sammenføjede (enten med eller uden indskyd-30 ning af en linker), nemlig et gen for et sammensmeltet protein, indføjet deri, kan fremstilles ved anvendelse af konventionel rekombinant-DNA-teknik under anvendelse af de plasmider, restriktionsenzymer og andre materialer, der fås i handelen. Fremstillingen af sådanne plas-35 mider kan udføres rutinemæssigt i henhold til de nedenfor beskrevne eksempler.

6 DK 175184 B1

Til fremstilling af rekombinante virus under anvendelse af de ovennævnte plasmider udsættes celler af en etableret Bombyx mor i cellelinie for blandet infektion med et plasmid til rekombination og BmNPV, om nød-5 vendigt efterfulgt af rekombinant-virus-isolering ved f.eks. plaque-metoden (reference 11) eller fortyndingsmetoden (reference 12). Egnede etablerede Bombyx mor i cellelinier, der kan anvendes, indbefatter bl.a. kendte Bm-celler (BM-N-celler beskrevet i referencerne l, 11 og 10 13; deponeret under ATCC nr. CRL-8910) og BM-N-celler deponeret under ATCC nr. CRL-8851. Til fremstilling af et ønsket materiale i silkeorm udsættes silkeorm for viral infektion ved injektion af viruset (enten en blanding af det rekombinante og ikke-rekombinante virus 15 eller det rekombinante virus isoleret derfra), progage-ret i dyrkede celler, perkutant deri eller i legemshulrummet deri, eller ved indgivning af viruset med foder gennem munden. Silkeormene fodres da med kunstigt foder eller morbærblade i et passende antal dage, således at 20 det ønskede sammensmeltede protein akkumuleres i dem.

Det sammensmeltede protein er almindeligvis ikke opløseligt i vand og er suspenderet i silkeormens legemsvæske og kan fraskilles eller renses ved konventionelle metoder, såsom chromatografi (ionbytterharpiks, affinitet, 25 gelpermeation osv.), centrifugering, ekstraktion og lignende .

Når silkeormen findeles og blandes med et opløsningsmiddel, såsom vandig SDS-opløsning, vandig urinstofopløsning, vandig alkalisk opløsning og lignende, 30 eller findeles i nærværelse af et sådant opløsningsmiddel, kan det sammensmeltede protein fraskilles eller oprenses fra opløsningen ved en metode som beskrevet ovenfor. Når det sammensmeltede protein skal spaltes, kan spaltnings/sønderdelings-processen udføres på den 35 ovenfor beskrevne måde.

DK 175184 B1 7

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, hvori insulinlignende vækstfaktorer (IGF-i og IGF-II) og α-interferon er de ønskede proteiner. Det skal imidlertid bemærkes, at disse ek-5 sempler ikke på nogen måde skal begrænse opfindelsens omfang. Skemaerne for plasmidkonstruktion er gengivet i fig. 1-5. Med mindre andet er angivet, er 5'-siden (opstrømssiden) af DNA-sekvensen vist til venstre og 3'-siden (nedstrømssiden) til højre i overensstemmelse med 10 sædvanlig praksis.

Syntese, spaltning, screening, isolering og andre behandlinger af det polyedriske proteingen, gener for ønskede proteiner og gener for sammensmeltede proteiner kan udføres ved anvendelse af de i reference 1 beskrevne 15 metoder samt sædvanligt benyttede genmanipuleringsraeto-der (jf. f.eks. referencerne 18 og 19).

Eksempel i A. Konstruktion af plasmidberøvet polyhedrin-gen.

20 plasmidet pBmE36 (reference l) spaltedes med EcoRl, og spaltningsproduktet blev gjort stump-endet ved anvendelse af DUA-polymerase I (Klenow-fragment) i nærværelse af dNTP'er (fire deoxynucleosid-triphosphat-25 species), partiel digestion med HindiiI efterfulgt af agarosegel-elektroforese gav et polyhedrin-gen-holdigt fragment. Under anvendelse af T4 ligase ligeredes dette fragment med et pUC9-fragment, der var blevet fremstillet ved at spalte puC9 (der fås fra Pharmacia P-L Bio-30 chemicals) med EcoRl, gøre spaltningsproduktet stump-endet ved anvendelse af Klenow-fragment og spalte yderligere med Hindlll, til opnåelse af et ligeringsprodukt.

Det opnåede ligeringsprodukt anvendtes til transformering af Eschericia coli K-12JM83· Plasmidet blev der-35 efter udvundet, og det betegnedes p9BinE36. (Den ovennævnte metode er beskrevet i reference 19).

8 DK 175184 B1

Et EcoRV genkendelsessted og et Aa ti genkendelsessted indførtes i p9BmE36 ved henholdsvis stedet for startcodonet ATG og stedet for stopcodonet TAA ved in-vitro-mutagenese (reference 14). p9BmE36 behandledes så-5 ledes med DNase I i nærværelse af ethidiumbromid til dannelse af et "nicked" plasmid (reference 14), som derefter svejsedes med følgende to kemisk syntetiserede DNA-fragmenter: 10 ACCTATAGATjATCCCGAATTA (21mer) og

ECORV

GGTCCGGCGTAgJcCTTAAAACAC (24mer)

AatI

15

Efterfølgende behandling med polymerase I og T4 ligase gav et heteroduplex plasmid, som derefter anvendtes til transformering af Escherichia coli K-12JM83· Transformationen udførtes igen til opnåelse af en ønsket 20 mutant. Der opnåedes således et plasmid p9BmM36·

Til polyhedrin-gen-eliminering fra p9BmM36 og polylinker-indføjelse blev følgende to DNA-fragmenter (hver 38mer) kemisk syntetiseret: CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG og .

25

CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG

Disse to fragmenter er komplementære med hinanden og har Saci, Smal, EcoRI, Ncol, EcoRV og Xbal genkendelsessteder.

30 De ovennævnte to fragmenter phosphoryleredes ved den respektive 5'-ende under anvendelse af T4 kinase og svejsedes derefter sammen. Det sammensvejsede produkt ligeredes, i nærværelse af T4 ligase, med et polyhedrin-gen-frit fragment opnået ved spaltning af p9BmM36 med 35 EcoRV og AatI. Denne procedure resulterede i dannelsen 9 DK 175184 B1 af et Bglll genkendeIsessted og et AatI genkendelsessted på henholdsvis 5'-siden og 3'-siden af linkeren.

Det opnåede plasmid anvendtes til transformering af Escherichia coli K-12JM83 og udvandtes derpå, og det be-5 tegnedes pBM030· DNA-Sekvensen af og spaltningstederne i polylin-kerdelen af pBM030 er vist nedenfor sammenstillet med polyhedrin-gen-delen af p9BmE36* p9BmE36 ---------TGTAATAAAAAAACCTATAAATATGl - 10 , : PBM030 ---------TGTAATAAAAAAACCTATaIGATCTA - il

Bgl II

* ,n ____ Polyedrisk _____ 13 proteingen iCAGCTfcCCibaaAATTcbATGaATATCTAGATAGGCCTjS;--- ^ i u—1 ii i l

SacI Smal EcoRI Ncol EcoRV Xbal AatI

20 Afledt af ! ----------' syntetisk DNft-----------)< i B. Konstruktion af plasmid med delvis mangelfuldt poly-hedrin-gen.

25 plasmidet p9H18 (reference l) spaltedes med EcoRI og behandledes derefter med Bal31, således at der derved blev afklippet en del af hver side af spaltningsstedet. ved variering af tiden for Bal31 behandlingen 30 fremstilledes der fragmenter af forskellig længde. Disse fragmenter behandledes med Hindlll og separeredes ved 0,7% agarosegel-elektroforese efterfulgt af ekstraktion, hvilket gav forskellige virus-afledte DNA-fragmenter af forskellig længde.

35 Plasmidet puC9 behandledes med Smal og Hindlll, efterfulgt af ligering med de tidligere opnåede DNA- 10 DK 175184 B1 fragmenter (med en stump ende og en Hindlll-ende) . Under anvendelse af de således fremstillede plasmider transformeredes Escherichia coli K-12JM83 og dyrkedes derefter, plasmiderne udvandtes, og basesekvensen fra 5 3-siden af hvert virus-afledet indføjet DNA-fragment bestemtes ved dideoxy-metoden (reference 15) under anvendelse af en primer (15-basesekvenerende primer for M13) for derved at identificere den virale polyedriske gendel. Man fandt således en basesekvens svarende til ami-10 nosyresekvensen for polyedrisk protein som beskrevet af Serebryani et al. (reference 16) blandt basesekvenserne af de virus-afledte DNA-fragmenter. Det translationale startcodon ATG og stopcodonet TAA identificeredes også.

Blandt de forskellige plasmider (p9B-række-plas-15 mider), der opnåedes afhængig af tidslængden af Bal31 behandlingen, blev plasmiderne med 212 bp, 338 bp, 662 bp og 727 bp efter det translationale startcodon AGT for det manglende polyhedrin-gen, betegnet henholdsvis P9B240, p9B120, p9BH5 og p9B086· Polyhedrin-genet har 20 en længde på 738 bp medregnet stopcodonet TAA.

11 DK 175184 B1 123 40

ATGCCGAATT ATTCATACAC CCCCACCATC GGGCGTACTT

ACGTGTACGA CAATAAATAT TACAAAAACT TGGGCTGTCT

TATCAAAAAC GCCAAGCGCA AGAAGCACCT AGTCGAACAT

5 GAACAAGAGG AGAAGCAATG GGATCTTCTA GACAACTACA

TGGTTGCGCA AGATCCCTTT TTAGGACCGG GCAAAAACCA '

AAAACTTACC CTTTTTAAAG AAATTCGCAG TGTGAAACCC

p9B240<—

10 GATACCATGA AGTTAATCGT CAACTGGAGC GGCAAAGAGT

TTTTGCGTGA AACTTGGACC CGTTTTGTTG AGGACAGCTT

CCCCATTGTA AACGACGAAG/AGGTGATGGA CGTGTACCTC p9Bl20<J 15

GTCGCCAACC TCAAACCCAC ACGCCCCAAC AGGTGCTACA

AGTTCCTCGC TCAACACGCT CTTAGGTGGG AAGAAGACTA

CGTGCCCCAC GAAGTAATCA GAATTATGGA GCCATCCTAC

20 GTGGGCATGA ACAACGAATA CAGAATTAGT CTGGCTAAAA

AGGGCGGCGG CTGCCCAATC ATGAACATCC ACAGCGAGTA

CACCAACTCG TTCGAGTCGT TTGTGAACCG CGTCATATGG

GAGAACTTCT ACAAACCCAT CGTTTACATC GGCACAGACT

25 CTGCCGAAGA AGAGGAAATC CTAATTGAGG TTTCTCTCGT

p9Bll5<-*

TTTCAAAATA AAGGAGTTTG CACCAGACGC GCCTCTGTTC

ACTGGT2CGG CGTATTAA 30 p93086 35 12 DK 175184 B1 C. Konstruktion af gen for sammensmeltet protein sammensat af α-interferon og polyedrisk protein.

PIFN2B310 (reference 1} spaltedes med Smal, og et a-IFN-J fragment isoleredes ved agarosegel-elektrofore-5 se. Dette ligeredes med Smal-spaltet pBM030 under anvendelse af T4 ligase, og det opnåede plasmid anvendtes til transformering af Eschericia coli K-12JM83* Det rekom-binante plasmid betegnedes pBT310, efter at det var bekræftet, at det havde a-IFN-J-genet indføjet i den kor-10 rekte orientering.

pBT3l0 spaltedes med Bglll, og spaltningsproduktet blev gjort stump-endet ved anvendelse af et Klenow-fragment i nærværelse af dNTP'er og spaltedes derefter med Seal. Et α-IFN-J-gen-holdigt fragment isoleredes ved 15 agarosegel-elektroforese.

p9B086 spaltedes med EcoRl og Seal, og et poly-hedrin-gen-holdigt fragment isoleredes ved agarosegel-elektroforese. Dette fragment blev gjort stump-endet ved anvendelse af SI nuclease og ligeredes med det ovennævn-20 te a-IFN-J-gen-holdige fragment under anvendelse af T4 ligase. Escherichia coli K-12JM83 transformeredes med det opnåede plasmid. Det bekræftedes derefter ved dide-oxy-metoden, at DNA-sekvensen i den sammenbindende del i det således opnåede plasmid var korrekt. plasmidet be-25 tegnedes plFNF086- DNA-Sekvensen i den sammenbindende del var: 036 <-j

Polybed r in-gen ---GGT|_GGG—3AT-CTA-AGA-GCT- 30 CCC-GGG-ATG-GCG--- (a-INF-J)

Met-Ala--- D- Konstruktion af gen for sammensmeltet protein sammensat af IGF-I og polyedrisk protein.

13 DK 175184 B1

Plasmidet pIGPOOl udvandtes fra Eschericia coli Kl2 MC1061 IGF001 (PERM BP-932) og spaltedes med Sall, Spaltningsproduktet blev gjort stump-endet ved anvendelse af Klenow-fragmentet i nærværelse af dNTP'er og spal-5 tedes med Avail, og et IGF-I-gen-holdigt fragment isole-redes ved polyacrylamidgel-elektroforese.

Særskilt spaltedes pBM030 med EcoRV og Sacl.

Det viste sig, at aminosyresekvensen Ile-Glu-Gly-Arg skulle indføres mellem polyedrisk protein og IGF-I 10 ved fremstillingen af et sammensmeltet protein, således at det sammensmeltede protein kunne genkendes og spaltes af blodkoagulationsfaktoren Xa (F-xa). Til dette formål blev følgende to DNA-fragmenter kemisk syntetisereti ATTGAAGGCAGAG (limer) og 15 GACCTCTGCCTTCAATAGCT (20mer).

Disse to fragmenter er komplementære med hinanden, og efter sammensvejsning danner de på opstrømssiden en klæbrig ende, der kan sammenbindes med en Sacl-spalt-20 ningsende, og på nedstrømssiden en klæbrig ende, der kan sammenbindes med en Avall-spaltningsende.

Disse to fragmenter phosphoryleredes hver i 5‘—enden under anvendelse af T4 kinase og svejsedes derefter sammen. Det sammensvejsede produkt, det ovennævnte 25 IGF-I-fragment og det ovennævte spaltede pBM030 ligere-des sammen under anvendelse af T4 ligase. Escherichia coli K-12JM83 transformeredes med ligeringsproduktet til frembringelse af et plasmid. DNA-Sekvenering ved di-deoxy-metoden bekræftede, at bindeleddet mellem F-xa 30 genkendelsesstedet og iGF-I-genet i dette plasmid (pIFG-1030) var korrekt. plGF-1030·spaltedes med Bglll, blev derefter gjort stump-endet ved anvendelse af Kle-now-fragmentet i nærværelse dNTP'er og spaltedes med Seal, og et IGF-I-gen-holdigt fragment isoleredes ved 35 agarosegel-elektroforese.

14 DK 175184 B1 Særskilt spaltedes p9B086 med EcoRl og Seal og blev gjort stump-endet ved anvendelse af SI nuclease, og et polyhedrin-gen-holdigt fragment isoleredes ved agarosegel-elektroforese og ligeredes med det ovennævnte 5 IGF-i-gen-holdige fragment under anvendelse af T4 ligase. Under anvendelse af det opnåede plasmid transformeredes Eschericia coli K-12JM83, og der opnåedes et plasmid med det sammensmeltede protein-gen konstrueret ved korrekt ligering, og det betegnedes pIGF-lF086. DNA-Se-10 kvensen for den sammenbindende del er vist nedenfor.

----Polyhedr in-gen\- —GGTGGGGATCTAAGAGCT- ATT-GAA-GGC-AGA-GGT-CCA-GAA-ACOTTG-

Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-15 I || x 1-F-Xa-1 1-IGF-I - E. Konstruktion af gener for sammensmeltede proteiner sammensat af IGF-II og polyedriske proteiner af forforskellig længde.

20

Plasmidet pIGF002 udvandtes fra Escherichia coli K12 MC1061 IGF002 (FERM BP-933), underkastedes partiel digestion med Sall, blev gjort stump-endet under anvendelse af Klenow-fragmentet i nærværelse af dNTP'er og 25 spaltedes derefter med Haeill efterfulgt af polyacryl-amidgel-elektroforese, hvorved der isoleredes et IGF-II-gehholdigt fragment. Dette fragment ligeredes med Smal-spaltet pBM030 under anvendelse af T4 ligase, og ligeringsproduktet anvendtes til transformation af Escheri-30 chia coli K-12JM83. For den således opnåede transformant bekræftedes det, at den bar et-plasmid (pIGF-11030) med IGF-II-genet indføjet deri i den korrekte orientering.

pIGF-11030 underkastedes partiel digestion med EcoRl og spaltedes derefter med Seal, og et IGF-II-gen-35 holdigt fragment isoleredes ved agarosegel-elektrofore- 15 DK 175184 B1 se. Dette fragment ligeredes i nærværelse af T4 ligase med et fragment indeholdende en del af polyhedrin-genet som isoleret ved agarosegel-elektroforese efter spaltning af hver af p9B240, p9B120 og p9B115 med EcoRI og 5 Seal.

Escherichia coll K-12JM83 transformeredes med de opnåede plasmider. DNA-Sekvenering ved dideoxy-metoden bekræftede, at de af de opnåede transformanter bårne plasmider havde de respektive gener for sammensmeltede 10 proteiner konstrueret på den rette måde.

Disse plasmider betegnedes henholdsvis PIGF-IIF240, pIGF-IIF120 og pIGF-IIF115.

DNA-Sekvensen for den sammenbindende del i hvert plasmid er vist nedenfor: 15 pIGF-IIF240 -ACCC3GGAATTC-ATG-GCT----------

240<J Met-Ala----IGF- II

20 pIGF-IIF120 -GACC GGGAATTC-ATG-GCT----------

120-H Met-Ala-----IGF- II

PIGF-IIF115 25 -atccJgggaattc-atg-gct----------

115«- Met-Ala----IGF- II

16 DK 175184 B1

Eksempel 2

Transfektion af Bm-celler.

5 BmNPV T3 stamme viralt DNA (ATCC nr. 40188) og PIFNF086, i et molforhold på 1;100, blandedes med opløsningerne I og II med henholdsvis følgende sammensætninger; 10 I. Destilleret vand 2,1 ml Bærer-DNA (laksetestikel, 1 mg/ral) 50 μΐ

BmNPV DNA 10 μΐ PIFNF086 DNA 50 μg 2 M calciumchlorid 300 pg 15

II. 50 mM HEPES puffer (pH 7,1) indeholdende 0,28 M

natriumchlorid 2,5 ml phosphat-puffer (35 mM Na2HP04- 20 35 mM NaH2P04) 50 μΐ

En l-ml portion af den opnåede suspension sattes til 4 ml af et Bm-cellekulturmedium (TC-10 medium indeholdende 10% kalvefosterserum? reference 17), og blandingen sattes til Bm-celler (ATCC nr. CRL-8910, 2 x 10^ 25 celler) til indføring af det ovennævnte DNA i Bm-celler.

20 Timer senere erstattedes mediet med en frisk portion.

Efter yderligere inkubation i 5 dage udvandtes mediet og centrifugeredes, og supernatanten underkastedes plaque-assay (reference 11), hvorved det rekombinante virus ud-30 vandtes som en klon. Denne betegnedes VIFNF086.

Rekombinante virus-kloner, VIGF-IF086, VIGF-IIF240, VIGF-IIF120 og vlGF-IIFUS, opnåedes på samme måde som ovenfor under anvendelse af henholdsvis pIGF—IF086, PIGF-IIF240, pIGF-IIFl20 og plGF-HFll5.

17 DK 175184 B1

Eksempel 3

Ekspresion af sammensmeltet protein i Bm-celler.

5 Bm-celler (ATCC nr. CRL-8910, 2 x 106 celler) in ficeredes med VIFNF086 ved dertil at sætte en VIFNF086-suspension (5 x 107 pfu). 30 Minutter senere bortkastedes supernatanten, en frisk 4» 5 ml portion af medium tilsattes, og inkuberingen fortsattes ved 25°C i 4 dage.

10 Derefter centrifugeredes kulturblandingen (1.000 o/m, 10 minutter) til opnåelse af et precipitat. En frisk 500 μΐ portion af mediet sattes til precipitatet, og efter fem gentagelser af en frysnings-optønings-cyclus centrifugeredes blandingen (15-000 o/m, 10 minutter). Til det så-15 ledes opsamlede precipitat sattes 200 μΐ af 4% natrium-dodecylsulfat (SDS)-10% mercaptoefhanol. En 5 μΐ portion af den opnåede opløsning anvendtes som en prøve til SDS-14% acrylamidgel-elektroforese.

Efter elektroforese blev der på gelen iagttaget 20 et bånd svarende til det forventede sammensmeltede protein. Derfor måltes densiteten af båndet under anvendelse af et densitometer, og den sammenlignedes med densiteten af hver markør (idet hvert markørbånd indeholdt 1 μg protein). Det således skønnede udbytte var 0,3 mg 25 pr. ml af den først opnåede cellekulturblanding. Da IFN-delen tegner sig for ca. 40% i dette sammensmeltede protein på molekylvægtsbasis, skulle dette udbytte nogenlunde svare til et IFN-udbytte på 0,12 mg/ml efter vellykket spaltning og IFN-udvinding. Dette udbytte er 30 mere end 20 gange højere, når man sammenligner med værdien på 5 x 10^ enheder/ml (der svarer til 0,005 mg/ml) som angivet i en rapport om ekspressionen af IFN i Bomby x mori celler (reference l).

Udbytterne af sammensmeltede proteiner produceret 35 af Bm-celler inficeret med VIGF-IF086, VIGF-IIF240, 18 DK 175184 B1 VIGF-IIF120 og VIGF-IIF115, målt på samme måde som beskrevet ovenfor, var henholdsvis 0,5 mg, 0/1 mg, 0,4 mg og 0,5 mg pr. ml cellekulturblanding, eller, når de udtrykkes som mængden af IGF-I eller IGF-II indeholdt i 5 disse sammensmeltede proteiner, henholdsvis 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml og 0,1 mg/ml.

Eksempel 4 10 A. Ekspression af sammensmeltet protein i Bm-celler.

Bm-celler (ATCC nr. CRL-8910, 2 x 10^ celler) inficeredes med VIGF-IIF120 ved dertil at sætte en vIGF-IIF120 suspension (5 x 10^ pfu). 30 Minutter senere 15 blev viruset fjernet, en frisk 4,5 ml portion af medium tilsattes, inkubationen fortsattes ved 25°C i 4 dage, og kulturblandingen centrifugeredes (1.000 o/ra, 10 minutter). Til det således opsamlede precipitat sattes 500 μΐ frisk medium. Efter fem gentagelser af en frys-20 nings-optøningscyclus centrifugeredes blandingen (15-000 o/m, 10 minutter) til opnåelse af et precipitat. Dette precipitat vaskedes med destilleret vand, opløstes i 0,5% SDS og underkastedes højtryksvæskechromatografi [HPLC: TSK Gel Phenyl 5PWRP (fremstillet af Toyo Soda 25 Manufacturing Co., Ltd.); opløsningsmiddelsystem: 0,1% trifluoreddikesyre-20-75% acetonitril med en lineær koncentrationsgradient]. Der opsamledes således en 2 ml fraktion indeholdende det sammensmeltede protein.

30 B. Spaltning med bromcyan (BrCN)·

Til denne fraktion sattes 50 μΐ af 1% SDS, blandingen koncentreredes til tørhed, og koncentratet opløstes i 50 μΐ destilleret vand. Til en 15 μΐ portion af 35 opløsningen sattes 35 μΐ myresyre og 45 μΐ 70%'s myre- 19 DK 175184 B1 syre, efterfulgt af yderligere tilsætning af 5 μΐ af en bromcyanopløsning (200 umol/ml) i 70%' s myresyre. Efter 24 timers reaction ved stuetemperatur koncentreredes reaktionsblandingen til tørhed, koncentratet opløstes i 5 7,5 μΐ destilleret vand, og opløsningen underkastedes elektroforese, hvorefter der påvistes et bånd svarende til IGF-II.

Ved SDS-16% polyacrylamidgel-elektroforese gav fraktionen, der opnåedes ved ekstraktion af VIGF-IIF120-10 inficerede Bm-celler med en vandig SDS-opløsning og efterfølgende partiel rensning ved højtryksvæskechroraato-grafi, således et ca. 23 K bånd svarende til det sammen-smeltede protein sammensat af det polyedriske protein (delvis) og IGF-II, medens bromcyan-sønderdelingspro-15 duktet viste et ca. 7 K bånd svarende til IGF-II sammen med flere bånd ved 10-14 K, der formodentlig skyldes sønderdelingsprodukter fra det polyedriske protein (se fig. 8; hvori A er markører, B er det sammensmeltede protein, og C er bromcyan-sønderdelingsproduktet).

20 C. Bestemmelse af N-enden af IGF-IP.

på lignende måde som beskrevet ovenfor opnåedes ca. 20 mg af det sammensmeltede protein ud fra en 50 ml 25 kultur af Bm-celler inficeret med vIGF-HFi20, og det sammensmeltede protein spaltedes med bromcyan, og reaktionsblandingen koncentreredes.

Koncentratet opløstes i 5 ml af 200 mM pyridin-eddikesyre-puffer (pH 3,0), og opløsningen underkaste-30 des kolonnechromatografi [sp-Toyopearl (fremstillet af Toyo Soda Manufacturing CO·, "Ltd.'·); opløsningsmiddelsystem: 200 mM pyridin-eddikesyre-puffer (pH 3,0)-2,0 M pyridin-eddikesyre-puffer (pH 5,0) med en lineær koncentrationsgradient]. Der opsamledes således en fraktion 35 indeholdende IGF-II. Denne fraktion lyofiliseredes, op- 20 DK 175184 B1 løstes i destilleret vand og underkastedes højtryksvae-skechromatografi [HPLC: ODS-120T (fremstillet af Toyo

Soda Manufacturing Co., Ltd.); opløsningsmiddelsystem: 0,1% trifluoreddikesyre-10~65% acetonitril med en lineær 5 koncentrationsgradient]. Det opnåede rene 1GF-II underkastedes peptid-sekvenering [470 A protein Sequencer (fremstillet af Applied Biosystems)]. Den således bekræftede amino-terminale aminosyresekvens i IGF-II er vist nedenfor.

-1·® Ala Tyr Arg Pro- Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu

Leu Val Asp Thr Leu Gin Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser 15

Eksempel 5 A. Ekspression af sammensmeltet protein i Bm-celler.

20 Plasmidet plGFOOl udvandtes fra Escherichia coli K12 MC1061 IGF001 (FERM BP-932) og spaltedes med Sall. Spaltningsproduktet blev gjort stump-endet under anvendelse af Klenow-fragmentet i nærværelse af dNTP’er og spaltet med Avail, og et IGF-i-gen-holdigt fragment iso-25 leredes ved polyacrylamidgel-elektroforese.

Særskilt spaltedes pIGF-IIF120 med EcoRV og EcoRI til fjernelse af det iGF-II-gen-holdige fragment.

Det viste sig, at aminosyresekvensen Gly-Pro-Ala skulle indføres gentagne gange mellem polyedrisk protein 30 og IGF-I ved fremstillingen af et sammensmeltet protein, således at det sammensmeltede protein kunne genkendes og spaltes af en collagenase, som genkender aminosyresekvensen Pro-Ama-Gly-Pro (Ama: en hvilken som helst slags aminosyre) og spalter mellem Ama og Gly. Til dette for-35 mål blev de følgende to DNA-fragmenter syntetiseret kemisk : 21 DK 175184 B1

AATTGGGCCCAGCTGGTCCAGCTGGTCCCGCGGGTGAATTCATTGAAGGCAGAG

(54mer)

GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC

5 (53mer)

Disse to fragmenter er komplementære med hinanden, og efter sammensvejsning danner de på opstrømssiden en klæbrig ende, der kan sammenbindes med en EcoRI-10 spaltningsende, og på nedstrømssiden en klæbende ende, der kan sammenbindes med en Avail-spaltningsende.

Disse to fragmenter phosphoryleredes hver i 5'-enden under anvendelse af T4 kinase og svejsedes derefter sammen. Det sammensvejsede produkt, det ovennævnte 15 IGF-1-fragment og det ovennævnte spaltede pIGF-HF120 ligeredes sammen under anvendelse af T4 ligase. Escherichia coli K-12JM83 transformeredes med ligeringsproduktet til fremstilling af et plasmid, og det betegnedes PIGF-IF120. DHA-Sekvenering ved dideoxy-metoden bekræf-20 tede, at bindeleddet mellem collagenase-genkendelses-stedet og IGF-I-genet i dette plasmid var korrekt. DNA-Sekvensen for den sammenbindende del er vist nedenfor.

collagenase 25 12½ genkendelsessted i i i GACCGG GAA TTG GGC CCA GCT GGT CCA GCT GGT CCC GCG GGT GAA Glu Leu Gly Pro Ala Gly.Pro Ala Gly Pro Ala Gly Glu TTC ATT GAA GGC AGA GGT CCA----- 30 Phe Ile Glu Gly Arg Gly Pro

^-Ϊ IFG-I

35 på lignende måde som beskrevet i eksempel 2 op nåedes rekombinant virus VIGF-IF120 under anvendelse af PIGF-IF120* 22 DK 175184 B1 på lignende måde som beskrevet i eksempel 4 (a) inficeredes Bm-celler med VIGF-IF120, og efter frysningoptøning opsamledes Bm-cellerne fra en 50 ml kulturblanding, og cellerne centrifugeredes (15.000 o/m, 10 minut-5 ter) til opnåelse af et precipitat. Dette precipitat opløstes i 6 M guanidin-hydrochlorid-opløsning og centrifugeredes (15.000 o/m, 5 minutter) til fjernelse af en rest. Opløsningen dialyseredes mod destilleret vand, og det opnåede precipitat opsamledes ved centrifugering 10 (15.000 o/m, 10 minutter).

B. Spaltning med collagenase.

Det således opnåede precipitat opløstes i 800 μΐ 15 10 M urinstofopløsning, efterfulgt af tilsætning af 100 μΐ 200 mM calciumchlorid, 200 μΐ 250 roM tris-hydro-chlorid-puffer (pH 7,4) og 900 μΐ collagenaseopløsning (fremstillet af Sigma Chemical Co.) (1.500 u/ml). Efter inkubering i 2 timer ved 30¾ centrifugeredes denne 20 blanding (15.000 o/m, 5 minutter) til opsamling af en supernatant. Denne supernatant underkastedes ionbytnings chromatografi [DEAE-Toyopearl (fremstillet af Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.),· opløsningsmiddelsystem: 25 mM tris-hydrochlorid-puffer (pH 7,4)]. Der opsamledes 25 således en fraktion indeholdende IGF-I med ekstra amino-syrerester ved amino-enden (i det følgende forkortet til "IGF-IP").

C. Bestemmelse af N-enden af IGP-IP.

30

Fraktionen indeholdende TGF-IP koncentreredes, og koncentratet underkastedes højtryksvæskechromatografi [HPLC: RpSC (fremstillet af Beckman Co.); opløsningsmiddelsystem: 0,1% trifluoreddikesyre-10-65% acetoni- 35 tril med en lineær koncentrationsgradient]. Det opnåede 23 DK 175184 B1 rene IGF-IP underkastedes peptid-sekvenering [470 A Protein Sequencer (fremstillet af Applied Biosystems)], og det afsløredes, at det sammensmeltede protein var blevet spaltet af collagenase på det forventede sted.

5 Den således bekræftede amino-terminale aminosyresekvens for IGF-IP er vist nedenfor.

Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe~I le-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-

Cys-Gly-Ala-Glu-Leu 10

Eksempel 6

Ekspression af polyhedrin-lGF-I sammensmeltet protein i silkeorme (Bombyx mori).

15

Silkeorme (Bombyx mori) injiceredes perkutant på dag 1 af det 5. stadium med en vIGF-lF086-suspension i en dosis på 0,5 ml/hoved (10^ pfu) og fodredes derefter med morbærblade ved 25°C i 3 dage. Derefter indførtes en 20 opsamlingsnål i det abdominale vedhæng, og legemsvæsken opsamledes i et isafkølet Eppendorf-rørglas. Legemvæsken centrifugeredes (15.000 o/m, 10 minutter), sedimentet opløstes i 200 μΐ af 4% SDS-10% mercaptoethanol, og en 2 μΐ portion af den opnåede opløsning anvendtes som prøve 25 til SDS-14% acrylamidgel-elektroforese. Et bånd svarende til det sammensmeltede protein bemærkedes på gelen efter elektroforese. Derfor måltes densiteten af båndet under anvendelse af et densitometer, og den sammenlignedes med densiteten af hver markør (idet hvert bånd indeholdt l 30 μg protein). Det således skønnede udbytte var 5 mg pr. ml legemsvæske (molekyl vægt-bas«ret beregning angiver, at IGF-I kunne udvindes i et udbytte på 1 mg/ml efter fraskillelse af IGF-I fra dette sammensmeltede protein).

Ved SDS-14% polyacrylamidgel-elektroforese gav 35 den fra BmNPV-T3-stamme-inficerede silkeorm opnåede le- 24 DK 175184 B1 gemsvæske et tydeligt bånd ved ca. 30 K svarende til polyedrisk protein, medens legemsvæsken fra VIGF-IF086-inficerede silkeorm ikke gav noget bånd svarende til polyedrisk protein, men viste et ca. 36 K bånd karakte-5 ristisk for det sammensmeltede protein sammensat af polyedrisk protein og IGF-I (se fig. 7; hvori A er markører, B er legemvæske inficeret med VIGF-IF086, og C er legemsvæske inficeret med BmNPV-T3).

DNA-Sekvensen for hver af det syntetiske gen for 10 IGF-I og det syntetiske gen for IGF-II som anvendt i de ovenstående eksempler er vist nedenfor sammen med den tilsvarende aminosyresekvens.

IGF-I

15

Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly

---TCGAATTC ATG GGT CCA GAA ACC TTG TGT GGT

Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe Val Cys

GCT GAA TTG GTT GAC GCT TTG CAA TTC GTT TGT

20

Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr

GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTC AAC AAG CCA ACT

Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin

GGT TAC GGA TCC TCT TCC AGA AGA GCT CCA CAA

25

Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser

ACT GGT ATC GTC GAT G AA TGT TGT TTC AGA TCT

Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala

30 TGT GAC TTG AGA AGA TTG G AA ATG TAC TGT GCT

Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala

CCA TTG AAG CCA GCT AAG TCT GCT TAG TCGACTG

DK 175184 B1 25

IGP-II

Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu.

—AATTC ATG GCT TAC AGA CCA TCT GAA ACC TTG

5 Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gin Phe

TGT GGT GGT GAA TTG GTC GAC ACC TTG CAA TTC

Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg

GTT TGT GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTT TCC AGA

^ Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly

CCA GCC TCC AGA GTT TCT AGA AGA TCC AGA GGT

Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp

ATC GTC GAA GAA TGT TGT TTC AGA TCC TGT GAC

15 Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro

TTG GCT TTG TTG GAA ACT TAC TGT GCC ACC CCA

Ala Lys Ser Glu GCC AAG TCC GAA TAG---- 20 25 30 35 26 DK 175184 B1

Referencer: 1: Nature, ^15, 592 (1985) 2: Science, 198, 1056 {1977} 5 3: Japansk patentansøgning (OPI) nr. 145289/79 (Udtrykket "OPI" som anvendt heri betyder en "ikke-for-undersøgt offentliggjort ansøgning").

4: japansk patentansøgning (OPI) nr. 19092/80 5: Japansk patentansøgning (OPI) nr. 45395/80 10 6: japansk patentansøgning (OPI) nr. 104886/80 7: Japansk patentansøging (OPI) nr. 145221/81 8: japansk patentansøgning (OPI) nr. 166200/81 9: Nature, 309, 810 (1984) 15 10: Nature, 285, 456 (1980) 11: J. Serie. Sci. Jpn, 53, 547 (1984) 12: J. Invertebr. Pathol., 29, 304 (1977) 13: ADpi. Environ, Microbiol., 44, 227 (1982) 20 14: Nucleic Acids Res., j), 3647 (1981) 15: Science, 214, 1205 (1981) 16: J, Invertebr. Pathol., 30, 442 (1977) 17: J. Invertebr. Pathol., 25, 363 (1975) ^ 13: Am. J. Hum. Genet., 31, 531 (1979) 19: T. Maniatis et al.: Molecular Cloning;Cold Spring

Harbor Laboratory (1982)

Claims (4)

1. 2· Fremgangsmåde til fremstilling af peptider, 10 kendetegnet ved, at man konstruerer et rekombinant nuclear polyhedrosis-virus, der i den polyedriske proteinkodende strukturgendel af det Bombyx mor i nucleare polyhedrosis-virus-DNA (BmNPV DNA) har et strukturgen for et Ønsket protein 15 knyttet til hele eller en del af det polyedriske proteinkodende strukturgen med eller uden indskydning af en linkerbasesekvens, og propagerer nævnte virus, således at der produceres et sammensmeltet protein bestående af nævnte ønskede 20 protein og hele eller en del af det polyedriske protein som sammenknyttet med eller uden indskydning af en sammenbindende aminosyre eller peptid.
2. 3- Fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket protein, kendetegnet ved, at man 25 konstruerer et rekonibinant nuclear polyhedrosis- virus, der i den polyedriske proteinkodende strukturgendel af det Bombyx mor i nucleare polyhedrosis-virus-DNA (BmNPV DNA) har et strukturgen for et ønsket protein knyttet til hele eller en del af det polyedriske pro-30 teinkodende strukturgen med eller uden indskydning af en linkerbasesekvens, propagerer nævnte virus, således at der produceres et sammensmeltet protein bestående af nævnte Ønskede protein og hele eller en del af det polyedriske protein DK 175184 B1 som sammenknyttet med eller uden indskydning af en sammenbindende aminosyre eller peptid, og derefter spalter nævnte sammensmeltede protein ved sammenbindingsstedet deri, således at der fremstil-5 les det ønskede protein.
3. 4. Plasmid, kendetegnet ved, at det indeholder en 51-opstrømsbasesekvens omfattende promotordelen af det Bombyx mori nucleare polyhedrosis-virus-DNA {BmNPV DNA), hele eller en del af det polyedriske 10 proteinkodende strukturgen fra BmNPV DNA'et, eventuelt en linkerbasesekvens, et strukturgen for et ønsket protein (eventuelt indbefattet en basesekvens af termina-toren for det ønskede protein), og en 3‘-nedstrømsbase-sekvens indbefattet terminatordelen for nævnte BmNPV 15 DNA.
4. 5. Fremgangsmåden til fremstilling af et rekombi-ant Bombyx mori nuclear polyhedrosis-virus-DNA, kendetegnet ved, at man underkaster en dyrket Bombyx mori cellelinie eller en stamme af Bombyx mori co- 20 transfektion med et Bombyx mori nuclear polyhedrosis-virus-DNA (BmNPV DNA) og et plasmid indeholdende en 5'~ opstrømsbasesekvens omfattende proraotordelen af det Bombyx mori nucleare polyhedrosis-virus-DNA (BmNPV DNA), hele eller en del af det polyedriske proteinkodende 25 strukturgen for BmNPV DNA'et, eventuelt en linkerbasesekvens, et strukturgen for et ønsket protein (eventuelt indbefattet en basesekvens af terminatoren for det Ønskede protein), og en 31-nedstrømsbasesekvens indbefattet terminatordelen af nævnte BmNPV DNA.