JPH03224491A - ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法 - Google Patents
ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法Info
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- JPH03224491A JPH03224491A JP2017982A JP1798290A JPH03224491A JP H03224491 A JPH03224491 A JP H03224491A JP 2017982 A JP2017982 A JP 2017982A JP 1798290 A JP1798290 A JP 1798290A JP H03224491 A JPH03224491 A JP H03224491A
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- gene
- porcine growth
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ブタ成長ホルモン遺伝子により組換えられた
蚕核多角体病ウィルス由来のトランスファーベクターｐ
ＢＥ２７４ ＤＮＡ、該ρＢＥ２７４ ＤＮＡを使用し
て組換えられたブタ成長ホルモン遺伝子を含む蚕核多角
体病ウィルス及び膝組換えウィルスを細胞及び宿主に感
染増殖させることからなるブタ成長ホルモンの製造方法
に関する。
蚕核多角体病ウィルス由来のトランスファーベクターｐ
ＢＥ２７４ ＤＮＡ、該ρＢＥ２７４ ＤＮＡを使用し
て組換えられたブタ成長ホルモン遺伝子を含む蚕核多角
体病ウィルス及び膝組換えウィルスを細胞及び宿主に感
染増殖させることからなるブタ成長ホルモンの製造方法
に関する。
（従来の技術〕
近年の遺伝子工学の進歩により、異種の蓋白質を多量に
産生ずることが可能になった。例えば、大腸菌、酵母菌
に於いて組換えプラスミドを用いて有用物質を生産する
方法が多数報告されている。
産生ずることが可能になった。例えば、大腸菌、酵母菌
に於いて組換えプラスミドを用いて有用物質を生産する
方法が多数報告されている。
一方、近年畜産業に於いては家畜成長ホルモンの利用に
対する関心が高まってきており、家畜成長ホルモンの家
畜への投与効果については既に多数の報告がある。例え
ば、Ｔｅｒｒｙ等は子ブタにブタ成長ホルモンを投与し
、著しい成長促進効果のあることを確認している （Ｔ
ｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ａｎｉｍ。
対する関心が高まってきており、家畜成長ホルモンの家
畜への投与効果については既に多数の報告がある。例え
ば、Ｔｅｒｒｙ等は子ブタにブタ成長ホルモンを投与し
、著しい成長促進効果のあることを確認している （Ｔ
ｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ、 Ｊ、Ａｎｉｍ。
Ｓｃｉ、６４：４３３−４４３．１９８７）。
またこのホルモンは、ペブタイドであり、肉への残留と
いう問題もなく、安全性の点で好都合である。
いう問題もなく、安全性の点で好都合である。
そこで、家畜成長ホルモンを上記遺伝子工学的手法によ
り大量生産しようという試みが近年盛んになされている
。
り大量生産しようという試みが近年盛んになされている
。
しかしながら、従来の家畜成長ホルモンを製造する手段
は、大腸菌等の原核細胞の発現系システムを使用するも
のであり、これら原核細胞のシステムは糖鎖の付加、ス
プライシング、ペプチダーゼ等による分解、分泌におい
て真核細胞システムと異なっており、哺乳動物由来の有
用物質を直接多量に生産することができない場合が多く
、この家畜成長ホルモンを製造する場合においても該成
長ホルモンを直接つくれず、発現させたあと２次加工を
必要とし、また発現量も低いものであった。
は、大腸菌等の原核細胞の発現系システムを使用するも
のであり、これら原核細胞のシステムは糖鎖の付加、ス
プライシング、ペプチダーゼ等による分解、分泌におい
て真核細胞システムと異なっており、哺乳動物由来の有
用物質を直接多量に生産することができない場合が多く
、この家畜成長ホルモンを製造する場合においても該成
長ホルモンを直接つくれず、発現させたあと２次加工を
必要とし、また発現量も低いものであった。
そこで、本発明の課題は、このような問題点を解決し、
ブタの成長ホルモンを効率良く多量に製造する手段を提
供することにある。
ブタの成長ホルモンを効率良く多量に製造する手段を提
供することにある。
即ち、本発明は、
１、蚕核多角体病ウィルスＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝
子のプロモーター領域を含むトランスファーベクターｐ
ＢＥ２７４のポリリンカー領域にブタ成長ホルモン遺伝
子を組み込んだ組換えｐＢＥ２７４ ＤＮＡ。
子のプロモーター領域を含むトランスファーベクターｐ
ＢＥ２７４のポリリンカー領域にブタ成長ホルモン遺伝
子を組み込んだ組換えｐＢＥ２７４ ＤＮＡ。
２、上記１記載の組換えｐＢＥ２７４ Ｄ Ｎ Ａと、
蚕核多角体病ウィルスとを蚕培養細胞に同時に感染させ
ることにより、得られたブタ成長ホルモン遺伝子を含む
組換え蚕核多角体病ウィルス、３、上記２記載のブタ成
長ホルモン遺伝子を含む蚕核多角体病ウィルスを蚕培養
細胞又は蚕幼虫に感染増殖させ、ブタ成長ホルモンを取
得することを特徴とするブタ成長ホルモンの製造方法、
に関する。
蚕核多角体病ウィルスとを蚕培養細胞に同時に感染させ
ることにより、得られたブタ成長ホルモン遺伝子を含む
組換え蚕核多角体病ウィルス、３、上記２記載のブタ成
長ホルモン遺伝子を含む蚕核多角体病ウィルスを蚕培養
細胞又は蚕幼虫に感染増殖させ、ブタ成長ホルモンを取
得することを特徴とするブタ成長ホルモンの製造方法、
に関する。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
（１）本発明において使用するトランスファーベクター
ｐＢＥ２７４は前圧等によって調整された蚕核多角体病
ウィルス由来のもので、第１図で示される構造を有する
（Ｍａｅｄａ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ＣｅｌｌＳ
ｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣＰｒｅ
ｓｓ Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ。
ｐＢＥ２７４は前圧等によって調整された蚕核多角体病
ウィルス由来のもので、第１図で示される構造を有する
（Ｍａｅｄａ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ＣｅｌｌＳ
ｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣＰｒｅ
ｓｓ Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ。
１９８８）。Ｊ亥トランスファーベクターｐＢＥ２７４
においては多角体蛋白構造遺伝子の一部がＥｃｏＲ１の
切断部位を有するリンカ−領域に置き換えられ、該リン
カ−の５′−末端上流側に多角体蛋白構造遺伝子のプロ
モーター領域を有するものである。すなわち多角体遺伝
子を含むＥｃｏＲＩ １０．５ｋｂ断片をクローニング
したｐＢＲ３２２（ｐＢｍＥ３６）から、プロモーター
下流のコンサーブド配列をなるべく残したまま多角体遺
伝子を除去し、ポリリンカーを挿入する。多角体遺伝子
の上流と下流はりコンビネーションのため３ｋｂ程度残
す。
においては多角体蛋白構造遺伝子の一部がＥｃｏＲ１の
切断部位を有するリンカ−領域に置き換えられ、該リン
カ−の５′−末端上流側に多角体蛋白構造遺伝子のプロ
モーター領域を有するものである。すなわち多角体遺伝
子を含むＥｃｏＲＩ １０．５ｋｂ断片をクローニング
したｐＢＲ３２２（ｐＢｍＥ３６）から、プロモーター
下流のコンサーブド配列をなるべく残したまま多角体遺
伝子を除去し、ポリリンカーを挿入する。多角体遺伝子
の上流と下流はりコンビネーションのため３ｋｂ程度残
す。
まず、ｐＥｍＥ３６の旧ｎｄＩ［［３，９ｋｂと３．１
ｋｂを、それぞれｐＵｃ９ （ｐ９Ｈ１Ｂ）、 ｐＵｃ
８ （ｐ８Ｈ２５５）にクローンする。この多角体を遺
伝子を含むｐ９８１８プラスミドより多角体遺伝子を除
去するため、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａｌ ３１により
エキソヌクレアーゼ処理を行い、さらに旧ｎｄｌＩ［切
断後、再びｐｕｃ ９のポリリンカーの旧ｎｄ ｍ −
Ｓｍａ ■部位にクローンする。この場合、Ｂａｌ ３
１の反応時間を変えることにより種々の長さのＤＮＡ断
片をクローンでき、これらのプラスミドはＳｍａ Ｉ側
からジデオキシ法により塩基配列を決定できる。シーフ
ェンスはプラスミドを直接シーフェンスするジデオキシ
法を用いれば、多角体遺伝子の塩基配列を決定しないか
ら目的の長さだけ消化したプラスミドを選ふことができ
、そのまま次のベクター構築に使用できる。ｐ９Ｂ３１
０プラスミドは、多角体遺伝子の翻訳開始のメチオニン
のＡＴＧより上流１８塩基まで除去したものである。
ｋｂを、それぞれｐＵｃ９ （ｐ９Ｈ１Ｂ）、 ｐＵｃ
８ （ｐ８Ｈ２５５）にクローンする。この多角体を遺
伝子を含むｐ９８１８プラスミドより多角体遺伝子を除
去するため、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａｌ ３１により
エキソヌクレアーゼ処理を行い、さらに旧ｎｄｌＩ［切
断後、再びｐｕｃ ９のポリリンカーの旧ｎｄ ｍ −
Ｓｍａ ■部位にクローンする。この場合、Ｂａｌ ３
１の反応時間を変えることにより種々の長さのＤＮＡ断
片をクローンでき、これらのプラスミドはＳｍａ Ｉ側
からジデオキシ法により塩基配列を決定できる。シーフ
ェンスはプラスミドを直接シーフェンスするジデオキシ
法を用いれば、多角体遺伝子の塩基配列を決定しないか
ら目的の長さだけ消化したプラスミドを選ふことができ
、そのまま次のベクター構築に使用できる。ｐ９Ｂ３１
０プラスミドは、多角体遺伝子の翻訳開始のメチオニン
のＡＴＧより上流１８塩基まで除去したものである。
方、多角体遺伝子の下流はｐＬｌｃ ｓにクローンした
（ｐ８Ｈ２２５）。これは、ｐｕｃ ８とｐｕｃ ９の
プラスミドは骨格が同じで、ポリリンカーが逆向きとい
う点を利用するためである。第１図のように処理して作
成した外来遺伝子挿入のためのプラスミド（ｐ８９Ｂ３
１０）は、ｐｕｃのへａｔｌｌを境にして、それぞれｐ
ｕｃ ９とｐＵｃ ８由来であり、プロモーターを含む
多角体遺伝子の上流３ ｋｂ、 ｐｕｃ ８由来のポ
リリンカー、そして下流の３ｋｂを順方向に含んでいる
。
（ｐ８Ｈ２２５）。これは、ｐｕｃ ８とｐｕｃ ９の
プラスミドは骨格が同じで、ポリリンカーが逆向きとい
う点を利用するためである。第１図のように処理して作
成した外来遺伝子挿入のためのプラスミド（ｐ８９Ｂ３
１０）は、ｐｕｃのへａｔｌｌを境にして、それぞれｐ
ｕｃ ９とｐＵｃ ８由来であり、プロモーターを含む
多角体遺伝子の上流３ ｋｂ、 ｐｕｃ ８由来のポ
リリンカー、そして下流の３ｋｂを順方向に含んでいる
。
そして最後にポリリンカ一部分よりＥｃｏＲｌ以外のカ
ッティングサイトを除いてｐＢＥ２７４を完成する。
ッティングサイトを除いてｐＢＥ２７４を完成する。
（２） また、本発明において、上記トランスファー
ベクターｐＢＥ２７４に挿入するブタ成長ホルモン遺伝
子のＤＮＡ断片は例えば以下の様に調整される。すなわ
ち常法によりブタ脳下垂体よりｍＲＮＡを抽出し、それ
を鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを作成する。次にそ
のライブラリー中より成長ホルモン遺伝子を持つＥ、ｃ
ｏｌｉを選抜し、そのプラスミドより両側にＥｃｏＲＩ
切断面をもつブタ成長ホルモン遺伝子が得られる。ブタ
成長ホルモン遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を第２図に示す
。
ベクターｐＢＥ２７４に挿入するブタ成長ホルモン遺伝
子のＤＮＡ断片は例えば以下の様に調整される。すなわ
ち常法によりブタ脳下垂体よりｍＲＮＡを抽出し、それ
を鋳型としてｃＤＮＡライブラリーを作成する。次にそ
のライブラリー中より成長ホルモン遺伝子を持つＥ、ｃ
ｏｌｉを選抜し、そのプラスミドより両側にＥｃｏＲＩ
切断面をもつブタ成長ホルモン遺伝子が得られる。ブタ
成長ホルモン遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を第２図に示す
。
（３）次いで、（２）のブタ成長ホルモン遺伝子のＤＮ
Ａ断片を（１）のトランスファーベクターｐＢＢ２７４
のＥｃｏＲＩカッティングサイトに導入して組み換えト
ランスファーベクターｐＢＥ２７４−ｐＧＨを作成する
。
Ａ断片を（１）のトランスファーベクターｐＢＢ２７４
のＥｃｏＲＩカッティングサイトに導入して組み換えト
ランスファーベクターｐＢＥ２７４−ｐＧＨを作成する
。
この組み換えにおいては、トランスファーベクターｐＢ
Ｅ２７４をＥｃｏＲＩで切断し、既にＥｃｏＲ１切断面
を持っているブタ成長ホルモン遺伝子を組み込み、Ｔ４
リガーゼにより結合し、大腸菌に形質転換し、ブタ成長
ホルモン遺伝子を正しい方向に含んだプラスミドを持つ
大腸菌を選抜することにより、組み換えトランスファー
ベクターｐＢＥ２７４−ｐＧ）ｌを得ることができる。
Ｅ２７４をＥｃｏＲＩで切断し、既にＥｃｏＲ１切断面
を持っているブタ成長ホルモン遺伝子を組み込み、Ｔ４
リガーゼにより結合し、大腸菌に形質転換し、ブタ成長
ホルモン遺伝子を正しい方向に含んだプラスミドを持つ
大腸菌を選抜することにより、組み換えトランスファー
ベクターｐＢＥ２７４−ｐＧ）ｌを得ることができる。
第３図は、ｐＢＥ２７４をＥｃｏＲＩで切断し、該切断
部位にブタ成長ホルモン遺伝子ＤＮＡ断片を接続した場
合における、組み換えトランスファーベクターｐＢＢ２
７４−ｐＧ）ｔの構造を示すものである。
部位にブタ成長ホルモン遺伝子ＤＮＡ断片を接続した場
合における、組み換えトランスファーベクターｐＢＢ２
７４−ｐＧ）ｔの構造を示すものである。
（４） （３）で得た組み換えトランスファーベクタ
ーｐＢＥ２７４−ｐＧＨを蚕核多角体病ウィルスＤＮＡ
と共にカイコ培養細胞に例えば燐酸カルシウム法を用い
て感染させる。これにより、上記組み換えトランスファ
ーベクターｐＢＥ２７４上のブタ成長ホルモン遺伝子Ｄ
ＮＡと蚕核多角体病ウィルスの多角体遺伝子ＤＮＡが置
き換えられ、ブタ成長ホルモン遺伝子領域を含む組み換
え蚕核多角体病ウィルスが取得できる。該ウィルスのク
ローニングは、プラークアッセイ法又は限界希釈法によ
って行うことができる。
ーｐＢＥ２７４−ｐＧＨを蚕核多角体病ウィルスＤＮＡ
と共にカイコ培養細胞に例えば燐酸カルシウム法を用い
て感染させる。これにより、上記組み換えトランスファ
ーベクターｐＢＥ２７４上のブタ成長ホルモン遺伝子Ｄ
ＮＡと蚕核多角体病ウィルスの多角体遺伝子ＤＮＡが置
き換えられ、ブタ成長ホルモン遺伝子領域を含む組み換
え蚕核多角体病ウィルスが取得できる。該ウィルスのク
ローニングは、プラークアッセイ法又は限界希釈法によ
って行うことができる。
（５） この後、この組み換え蚕核多角体病ウィルス
を例えば蚕の培養細胞あるいは蚕幼虫等宿主に感染増殖
させて、ブタ成長ホルモンを製造する。
を例えば蚕の培養細胞あるいは蚕幼虫等宿主に感染増殖
させて、ブタ成長ホルモンを製造する。
蚕の培養細胞を使用する場合においては、Ｂｍ −Ｎ細
胞を培養している培地中に該組み換えウィルス液を細胞
あたり感染性ウィルス粒子が２個になるように添加すれ
ば４〜６日目には培地中に５０μｇ／ｒｎｌのブタ成長
ホルモンが認められる。
胞を培養している培地中に該組み換えウィルス液を細胞
あたり感染性ウィルス粒子が２個になるように添加すれ
ば４〜６日目には培地中に５０μｇ／ｒｎｌのブタ成長
ホルモンが認められる。
蚕幼虫を使用する場合においては、５齢幼虫に経皮的に
３Ｘ１０’個の感染性ウィルス粒子を注入すれば、４〜
６日目には体液中に５００μｇ／ｍｌのブタ成長ホルモ
ンが認められる。これらのブタ成長ホルモンは培養液あ
るいは体液よりゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等の一般的な方法で精製される。
３Ｘ１０’個の感染性ウィルス粒子を注入すれば、４〜
６日目には体液中に５００μｇ／ｍｌのブタ成長ホルモ
ンが認められる。これらのブタ成長ホルモンは培養液あ
るいは体液よりゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等の一般的な方法で精製される。
本発明によれば、従来の原核細胞のシステムの様な得ら
れたブタ成長ホルモンの２次加工を必要とせず、ブタに
対してそのまま有効な生物活性を有する成長ホルモンを
直接かつ多量に製造することが出来た。このことにより
本発明は畜産の発展に大いに寄与するものである。
れたブタ成長ホルモンの２次加工を必要とせず、ブタに
対してそのまま有効な生物活性を有する成長ホルモンを
直接かつ多量に製造することが出来た。このことにより
本発明は畜産の発展に大いに寄与するものである。
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１
（１）トランスファーベクターｐＢＥ２７４の調整トラ
ンスファーベクターｐＢＥ２７４の調整は第１図に示す
如（に行った。すなわち常法により精製した蚕核多角体
病ウィルス粒子溶液に５Ｏ３（ラウリル硫酸ナトリウム
、 １．Ｗ／Ｗ％）およびプロテアーゼＫ（メルク社
製、 １＋ｎｇ／ｍｆ）を加え、３７゛Ｃで約２時間
インキュへ−１−した。この溶液に等量のフェノール溶
液（１０ｍＭ ｌ〜リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，６）
−１ｍＭ ＥＤＴＡ飽和）を加え静かに約５分間振盪
し、次に１２．０００ｒｐｍで５分間遠心した。水層を
採り、同様のフェノール処理を２回繰り返した。このＤ
ＮＡを含む水層に等量のクロロホルムを加え、静かに約
５分間振盪し、次に１２．００Ｏｒｐｍで２分間遠心し
た。水層を採り、同様のクロロホルム処理を２回繰り返
した後、水層を１抛門トリス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，
６） １ ｍＭＥＤＴＡに対して約２日間透析した。
ンスファーベクターｐＢＥ２７４の調整は第１図に示す
如（に行った。すなわち常法により精製した蚕核多角体
病ウィルス粒子溶液に５Ｏ３（ラウリル硫酸ナトリウム
、 １．Ｗ／Ｗ％）およびプロテアーゼＫ（メルク社
製、 １＋ｎｇ／ｍｆ）を加え、３７゛Ｃで約２時間
インキュへ−１−した。この溶液に等量のフェノール溶
液（１０ｍＭ ｌ〜リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，６）
−１ｍＭ ＥＤＴＡ飽和）を加え静かに約５分間振盪
し、次に１２．０００ｒｐｍで５分間遠心した。水層を
採り、同様のフェノール処理を２回繰り返した。このＤ
ＮＡを含む水層に等量のクロロホルムを加え、静かに約
５分間振盪し、次に１２．００Ｏｒｐｍで２分間遠心し
た。水層を採り、同様のクロロホルム処理を２回繰り返
した後、水層を１抛門トリス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，
６） １ ｍＭＥＤＴＡに対して約２日間透析した。
得られたウィルスＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、０
．７％アガロースゲル電気泳動により分離したＤＮＡ断
片をサチン法で分析し、多角体遺伝子を含むＥｃｏＲＩ
断片１０．５ｋｂをｐＢＲ３２２（宝酒造社製）にクロ
ーンした。
．７％アガロースゲル電気泳動により分離したＤＮＡ断
片をサチン法で分析し、多角体遺伝子を含むＥｃｏＲＩ
断片１０．５ｋｂをｐＢＲ３２２（宝酒造社製）にクロ
ーンした。
このｐＢＲ３２２（ｐＢｍＥ３６）から、プロモーター
下流のコンサーブド配列をなるべく残したまま多角体遺
伝子を除去し、ポリリンカーを挿入する。
下流のコンサーブド配列をなるべく残したまま多角体遺
伝子を除去し、ポリリンカーを挿入する。
多角体遺伝子の上流と下流はりコンビネーションのため
３ｋｂ程度残す。
３ｋｂ程度残す。
まず、ｐＢｍＥ３６のＨｉｎｄ ｍ ３．９ｋｂと３．
１ｋｂを、それぞれｐＵＣ９（ｐ９）１１Ｂ）、 ｐＵ
Ｃ８（ｐ８Ｈ２５５）にクローンする。この多角体遺伝
子を含むｐ９Ｈ１８プラスミドより多角体遺伝子を除去
するため、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａｌ ３１によりエ
キソヌクレアーゼ処理を行い、さらに旧ｎｄＩ［ｌ切断
後、再びｐｕｃ ９のポリリンカーの旧ｎｄ ｍ −Ｓ
ｍａ Ｉ部位にクローンする。この場合、Ｂａｌ ３１
の反応時間を変えることにより種々の長さのＤ’ＮＡ断
片をクローンでき、これらのプラスミドはＳｍａ Ｉ側
からジデオキシ法により塩基配列を決定できる。シーフ
ェンスはプラスミドを直接シーフェンスするジデオキシ
法を用いれば、多角体遺伝子の塩基配列を決定しながら
目的の長さだけ消化したプラスミドを選ぶことができ、
そのまま次のベクター構築の実験に使用できる。ｐ９Ｂ
３１０プラスミドは、多角体遺伝子の翻訳開始のメチオ
ニンのＡＴＧより上流１８塩基まで除去したものである
。一方、多角体遺伝子の下流はｐＵｃ ｓにクローンし
た（ｐ８Ｈ２２５）。これは、ｐＵｃ ８とｐＵｃ ９
のプラスミドは骨格が同じで、ポリリンカーが逆向きと
いう点を利用するためである。第１図のように処理して
作成した外来遺伝子挿入のためのプラスミド（ｐ８９Ｂ
３１０）は、ｐｕｃのＡａｔＩＩを境にして、それぞれ
ｐｕｃ ９とｐＵｃ ｓ由来であり、プロモーターを含
む多角体遺伝子の上流３ ｋｂ、 ｐｕｃ ８由来の
ポリリンカー、そして下流の３ｋｂを順方向に含んでい
る。
１ｋｂを、それぞれｐＵＣ９（ｐ９）１１Ｂ）、 ｐＵ
Ｃ８（ｐ８Ｈ２５５）にクローンする。この多角体遺伝
子を含むｐ９Ｈ１８プラスミドより多角体遺伝子を除去
するため、ＥｃｏＲＩで切断後、Ｂａｌ ３１によりエ
キソヌクレアーゼ処理を行い、さらに旧ｎｄＩ［ｌ切断
後、再びｐｕｃ ９のポリリンカーの旧ｎｄ ｍ −Ｓ
ｍａ Ｉ部位にクローンする。この場合、Ｂａｌ ３１
の反応時間を変えることにより種々の長さのＤ’ＮＡ断
片をクローンでき、これらのプラスミドはＳｍａ Ｉ側
からジデオキシ法により塩基配列を決定できる。シーフ
ェンスはプラスミドを直接シーフェンスするジデオキシ
法を用いれば、多角体遺伝子の塩基配列を決定しながら
目的の長さだけ消化したプラスミドを選ぶことができ、
そのまま次のベクター構築の実験に使用できる。ｐ９Ｂ
３１０プラスミドは、多角体遺伝子の翻訳開始のメチオ
ニンのＡＴＧより上流１８塩基まで除去したものである
。一方、多角体遺伝子の下流はｐＵｃ ｓにクローンし
た（ｐ８Ｈ２２５）。これは、ｐＵｃ ８とｐＵｃ ９
のプラスミドは骨格が同じで、ポリリンカーが逆向きと
いう点を利用するためである。第１図のように処理して
作成した外来遺伝子挿入のためのプラスミド（ｐ８９Ｂ
３１０）は、ｐｕｃのＡａｔＩＩを境にして、それぞれ
ｐｕｃ ９とｐＵｃ ｓ由来であり、プロモーターを含
む多角体遺伝子の上流３ ｋｂ、 ｐｕｃ ８由来の
ポリリンカー、そして下流の３ｋｂを順方向に含んでい
る。
このプラスミドｐ８９Ｂ３１０を更に加工したものがｐ
ＢＥ２７４である。ｐ８９Ｂ３１０とは、多角体遺伝子
上流の約１８塩基をほぼそのまま残した点及びクローニ
ングサイトをＥｃｏＲＩｌケ所のみにした点で異なる。
ＢＥ２７４である。ｐ８９Ｂ３１０とは、多角体遺伝子
上流の約１８塩基をほぼそのまま残した点及びクローニ
ングサイトをＥｃｏＲＩｌケ所のみにした点で異なる。
（２）ブタ成長ホルモン遺伝子ＤＮＡの調整ブタ成長ホ
ルモンｃＤＮＡはブタ脳下垂体より公知の方法によって
調整された。すなわち、ブタ脳下垂体よりｍ−ＲＮＡを
抽出し、常法によりλｇｔｌｌを発現ベクターとするｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した（にａｔｏ、Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）。
ルモンｃＤＮＡはブタ脳下垂体より公知の方法によって
調整された。すなわち、ブタ脳下垂体よりｍ−ＲＮＡを
抽出し、常法によりλｇｔｌｌを発現ベクターとするｃ
ＤＮＡライブラリーを作成した（にａｔｏ、Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）。
ＹＡＮＧらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、 ８０゜１１９４−１１９８）により、
ニトロセルロース膜上で発現させた５Ｘ１０’個のプラ
ークより抗羊成長ホルモン兎抗体を用いて成長ホルモン
発現クローンを数個特定した。これらのクローンよりブ
タ成長ホルモン構造遺伝子を完全にコードしていると思
われるものを選び、目的遺伝子を取り出した後ＥｃｏＲ
Ｉ ５ｉｔｅを両端にもつＤＮＡ断片とした。
ｃｉ、ＵＳＡ、 ８０゜１１９４−１１９８）により、
ニトロセルロース膜上で発現させた５Ｘ１０’個のプラ
ークより抗羊成長ホルモン兎抗体を用いて成長ホルモン
発現クローンを数個特定した。これらのクローンよりブ
タ成長ホルモン構造遺伝子を完全にコードしていると思
われるものを選び、目的遺伝子を取り出した後ＥｃｏＲ
Ｉ ５ｉｔｅを両端にもつＤＮＡ断片とした。
（３）組み換えトランスファーベクターｐＢＥ２７４−
ｐＧＨの調製 このＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理したｐｔｌｃ９とライゲ
ートし、得られたプラスミドで大腸菌に１２ＪＭ１０６
を形質転換させ、増殖させ、多量のプラスミドを製した
。このプラスミドをＥｃｏＲＩで処理し、アガロース電
気泳動でブタ成長ホルモンｃＤＮＡを含む断片を分離し
得られたブタ成長ホルモン遺伝子を含むＤＮＡを タカ
ラライゲイションキット（宝酒造製）を用いてＥｃｏＲ
Ｉで処理したｐＢＥ２７４に組み込み得られたプラスミ
ドで大腸菌に１２）ＩＢＩＯＩを形質転換させた。これ
らの大腸菌クローンよりプラスミドを取り出し、数種の
制限酵素で処理した後アガロース電気泳動を行い、ブタ
成長ホルモン遺伝子が正しい方向に入っているクローン
を選抜した。
ｐＧＨの調製 このＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理したｐｔｌｃ９とライゲ
ートし、得られたプラスミドで大腸菌に１２ＪＭ１０６
を形質転換させ、増殖させ、多量のプラスミドを製した
。このプラスミドをＥｃｏＲＩで処理し、アガロース電
気泳動でブタ成長ホルモンｃＤＮＡを含む断片を分離し
得られたブタ成長ホルモン遺伝子を含むＤＮＡを タカ
ラライゲイションキット（宝酒造製）を用いてＥｃｏＲ
Ｉで処理したｐＢＥ２７４に組み込み得られたプラスミ
ドで大腸菌に１２）ＩＢＩＯＩを形質転換させた。これ
らの大腸菌クローンよりプラスミドを取り出し、数種の
制限酵素で処理した後アガロース電気泳動を行い、ブタ
成長ホルモン遺伝子が正しい方向に入っているクローン
を選抜した。
このクローンを増殖させ、多量のプラスミドを製した。
これをｐＢＥ２７４−ｐＧＨとした。これは多角体遺伝
子の上流部分に続き１．ＥｃｏＲＩ残基５ｂｐ及び前記
で得られたｐＧＨ遺伝子の５′非翻訳領域３２ｂｐの次
にＡＴＧではじまるｐＧＨ遺伝子が正しい方向に結合し
、更に多角体遺伝子の下流部分（終止コドンから下流約
３００番目のｂρまで約３．１ｋｂｐ）を含んでいる。
子の上流部分に続き１．ＥｃｏＲＩ残基５ｂｐ及び前記
で得られたｐＧＨ遺伝子の５′非翻訳領域３２ｂｐの次
にＡＴＧではじまるｐＧＨ遺伝子が正しい方向に結合し
、更に多角体遺伝子の下流部分（終止コドンから下流約
３００番目のｂρまで約３．１ｋｂｐ）を含んでいる。
なおこのプラスミドｐＢＥ２７４−ｐＧＨは工業技術院
微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ４１１２８として
寄託されている。
微生物工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ４１１２８として
寄託されている。
（４）組み換え蚕核多角体病ウィルスの調整Ｂｍ細胞の
形質転換は市販のトランスフェクションキット（ファル
マシア社製）を用いて行った。上記（１）で示した方法
で得られたウィルスＤＮＡ３μｇとブタ成長ホルモンｃ
ＤＮＡを組み込まれたトランスファーベクターｐＢＥ２
７４ＤＮＡ１５μｇを含むＤＮＡ溶液を同キット付属の
緩衝液と混合し両ＤＮＡと燐酸カルシウムとの共沈澱液
を得た。この共沈澱液４８０μ尼を４減の８ｍ細胞培養
液に加え、２０時間培養後、新鮮な培地と交換し、更に
５日間培養を続けた。次にこの培養液の１０−４〜１０
−７希釈液を１×１０５細胞／ｍ１液と等量混合し、２
００μβずつをマイクロプレートに分注し、更に５日間
培養した後、各プレートについて非感染と感染状態を区
別し、ウィルス感染が見られ、かつ多角体形成の無いク
ローンすなわち組み換え蚕核多角体病ウィルスを選抜し
た。
形質転換は市販のトランスフェクションキット（ファル
マシア社製）を用いて行った。上記（１）で示した方法
で得られたウィルスＤＮＡ３μｇとブタ成長ホルモンｃ
ＤＮＡを組み込まれたトランスファーベクターｐＢＥ２
７４ＤＮＡ１５μｇを含むＤＮＡ溶液を同キット付属の
緩衝液と混合し両ＤＮＡと燐酸カルシウムとの共沈澱液
を得た。この共沈澱液４８０μ尼を４減の８ｍ細胞培養
液に加え、２０時間培養後、新鮮な培地と交換し、更に
５日間培養を続けた。次にこの培養液の１０−４〜１０
−７希釈液を１×１０５細胞／ｍ１液と等量混合し、２
００μβずつをマイクロプレートに分注し、更に５日間
培養した後、各プレートについて非感染と感染状態を区
別し、ウィルス感染が見られ、かつ多角体形成の無いク
ローンすなわち組み換え蚕核多角体病ウィルスを選抜し
た。
（５）ブタ成長ホルモンの製造
Ｂｍ−Ｎ細胞を培養している培地中に該組み換えウィル
ス液を細胞あたり感染性ウィルス粒子が２個になるよう
に添加すれば４〜６日目には培地中に５０μｇ／ｍｌの
ブタ成長ホルモンが認められる。
ス液を細胞あたり感染性ウィルス粒子が２個になるよう
に添加すれば４〜６日目には培地中に５０μｇ／ｍｌの
ブタ成長ホルモンが認められる。
一方、５齢１日目の蚕に上記記載の５日間培養後の培地
０１０５ｍ１７匹を経皮的に注入し、２５°Ｃで５日間
、人工試料で飼育後、豚腸を切断し、体液を氷冷したポ
リスチレン遠心管に採取し、等量のＴＣ−１０培地を加
えて遠心しく１０．０００ｒｐｍ５分）、上清をとり、
ブタ成長ホルモンの定性及び定量を行った。
０１０５ｍ１７匹を経皮的に注入し、２５°Ｃで５日間
、人工試料で飼育後、豚腸を切断し、体液を氷冷したポ
リスチレン遠心管に採取し、等量のＴＣ−１０培地を加
えて遠心しく１０．０００ｒｐｍ５分）、上清をとり、
ブタ成長ホルモンの定性及び定量を行った。
（６）ブタ成長ホルモン遺伝子発現の確認ブタ成長ホル
モン遺伝子発現の確認はウェスタンブロンティング法で
行った。まず上記（５）で示したＢｍ細胞発現培養液及
び全発現体液を採取し、１０〜ｌＯＯ倍に希釈して分析
サンプルとした。
モン遺伝子発現の確認はウェスタンブロンティング法で
行った。まず上記（５）で示したＢｍ細胞発現培養液及
び全発現体液を採取し、１０〜ｌＯＯ倍に希釈して分析
サンプルとした。
これらサンプルを市販のブタ成長ホルモン試薬（フナコ
シ薬品）を対照として１５％ポリアクリルアミド電気泳
動にかけ、次にこのゲル中のブタ成長ホルモンを転写装
置を使い転写膜に移した。この転写膜上のブタ成長ホル
モンに対し、市販の抗ブタ成長ホルモン兎抗体（フナコ
シ薬品）をかけ、更に酵素標識済抗兎抗体をかけた後、
此の酵素の働きによる発色反応によってブタ成長ホルモ
ンの存在を確認した。酵素標識済抗兎抗体を含む発色液
その他は市販の酵素抗体法キノｌ（バイオラッド社製）
を使った。
シ薬品）を対照として１５％ポリアクリルアミド電気泳
動にかけ、次にこのゲル中のブタ成長ホルモンを転写装
置を使い転写膜に移した。この転写膜上のブタ成長ホル
モンに対し、市販の抗ブタ成長ホルモン兎抗体（フナコ
シ薬品）をかけ、更に酵素標識済抗兎抗体をかけた後、
此の酵素の働きによる発色反応によってブタ成長ホルモ
ンの存在を確認した。酵素標識済抗兎抗体を含む発色液
その他は市販の酵素抗体法キノｌ（バイオラッド社製）
を使った。
この結果は第３図に示したが、これによりフタ成長ホル
モンの発現力蝙育認された。
モンの発現力蝙育認された。
（９）ブタ成長ホルモン発現量の確認
組み換えウィルスによって培養細胞あるいは蚕体細胞中
で合成されるブタ成長ホルモンはほとんど培養液中ある
いは体液中に分泌される。
で合成されるブタ成長ホルモンはほとんど培養液中ある
いは体液中に分泌される。
従って培養液あるいは体液の一部を経時的に採取して発
現量確認のサンプルとした。又サンプル中のブタ成長ホ
ルモンの量は一般的に行われている酵素抗体法によって
測定した。
現量確認のサンプルとした。又サンプル中のブタ成長ホ
ルモンの量は一般的に行われている酵素抗体法によって
測定した。
すなわち市販ブタ成長ホルモン純品（フナコシ薬品）を
標準品とし、得られたサンプル液と共に適当に希釈して
マイクロプレートに注入し抗原とする。ついで抗ブタ成
長ホルモンウサギ抗体、酵素標識をした抗ウサギ抗体、
発色剤を順に注入し、その発色濃度を市販の専用測定機
器で測定した。第４図にその測定結果を示す。
標準品とし、得られたサンプル液と共に適当に希釈して
マイクロプレートに注入し抗原とする。ついで抗ブタ成
長ホルモンウサギ抗体、酵素標識をした抗ウサギ抗体、
発色剤を順に注入し、その発色濃度を市販の専用測定機
器で測定した。第４図にその測定結果を示す。
従来このような大量発現例は知られていない。
（１１）発現したブタ成長ホルモンの生物試験ブタ成長
ホルモンを含む蚕体液を出発材料とし、−船釣に行われ
ている蛋白質の精製法により純度約９８％のブタ成長ホ
ルモン乾燥粉末を得た。この乾燥粉末を ４ｍｇ／ｍｌ
となるように生理食塩水に溶かし、以下にのべる生物試
験のサンプルとした。
ホルモンを含む蚕体液を出発材料とし、−船釣に行われ
ている蛋白質の精製法により純度約９８％のブタ成長ホ
ルモン乾燥粉末を得た。この乾燥粉末を ４ｍｇ／ｍｌ
となるように生理食塩水に溶かし、以下にのべる生物試
験のサンプルとした。
２４頭のランドレース×大ヨークシャー×デュロックの
去勢雄豚（平均体重的３０ｋｇ）を試験区群と対照区群
の２群に分け、約６週間飼育した。
去勢雄豚（平均体重的３０ｋｇ）を試験区群と対照区群
の２群に分け、約６週間飼育した。
その間試験区群の豚には毎日体重ｋｇあたり１００μｇ
の生理食塩水に溶かしたブタ成長ホルモンを投与し、一
方対照群には生理食塩水のみを投与した。投与は首付近
への筋肉注射によって行った。試験区の個々の豚の投与
量は週末毎に体重を測定し、それによって調節した。
の生理食塩水に溶かしたブタ成長ホルモンを投与し、一
方対照群には生理食塩水のみを投与した。投与は首付近
への筋肉注射によって行った。試験区の個々の豚の投与
量は週末毎に体重を測定し、それによって調節した。
結果を第１表に示す。
（本頁以下余白）
甲 Ｑ
Δ −ノ
ー−へ曽易
餐 チ
本発明によるブタ成長ホルモンの投与により増体重、飼
料効率とも著しい改善がみられた。
料効率とも著しい改善がみられた。
【図面の簡単な説明】
第１図はｐＢＥ２７４及びｐＢＥ２７４−ｐＧ）Ｉ構築
図、第２図はブタ成長ホルモン遺伝子の塩基配列図、第
３図はブタ成長ホルモン遺伝子の発現図、第４図は組み
換え体ウィルスが感染したカイコおよび培養細胞におけ
るブタ成長ホルモンの産出を示す図である。
図、第２図はブタ成長ホルモン遺伝子の塩基配列図、第
３図はブタ成長ホルモン遺伝子の発現図、第４図は組み
換え体ウィルスが感染したカイコおよび培養細胞におけ
るブタ成長ホルモンの産出を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、蚕核多角体病ウィルスＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝
子のプロモーター領域を含むトランスファーベクターｐ
ＢＥ２７４のポリリンカー領域にブタ成長ホルモン遺伝
子を組み込んだ組換えｐＢＥ２７４ＤＮＡ。 ２、請求項１記載の組換えｐＢＥ２７４ＤＮＡと、蚕核
多角体病ウィルスとを蚕培養細胞に同時に感染させるこ
とにより、得られたブタ成長ホルモン遺伝子を含む組換
え蚕核多角体病ウィルス。 ３、請求項２記載のブタ成長ホルモン遺伝子を含む蚕核
多角体病ウィルスを蚕培養細胞又は蚕幼虫に感染増殖さ
せ、ブタ成長ホルモンを取得することを特徴とするブタ
成長ホルモンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017982A JPH03224491A (ja) | 1990-01-30 | 1990-01-30 | ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017982A JPH03224491A (ja) | 1990-01-30 | 1990-01-30 | ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03224491A true JPH03224491A (ja) | 1991-10-03 |
Family
ID=11958928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017982A Pending JPH03224491A (ja) | 1990-01-30 | 1990-01-30 | ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03224491A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62208276A (ja) * | 1985-11-14 | 1987-09-12 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製造法 |
-
1990
- 1990-01-30 JP JP2017982A patent/JPH03224491A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62208276A (ja) * | 1985-11-14 | 1987-09-12 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製造法 |
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