DK175229B1 - For en eftersögt mikrobe specifikt medium til detektering af tilstedeværelsen eller fraværelsen af en eftersögt mikrobe samt fremgangsmåde til detektering af tilstedeværelsen eller fraværelsen af en eftersögt mikrobe i en miljöpröve eller en...... - Google Patents

Description

i DK 175229 B1

Den foreliggende opfindelse angår et for en eftersøgt mikrobe specifikt medium til detektering af tilstedeværelsen eller fraværelsen af en eftersøgt mikrobe i en flydendegjort miljøprøve eller biologisk prøve, hvilket medium omfatter 5 a) en virksom mængde vitamin-, aminosyre-, grundstof og saltbestanddele, der er i stand til at tillade levedygtighed og reproduktion i logaritmisk fase af den eftersøgte mikrobe i nærværelse af en næringsmiddel-indikator og i stand til at hjælpe den eftersøgte mikrobe gennem latent 10 fase og ind i logaritmisk fasevækst i prøven, b) en virksom mængde af mindst ét antibiotikum, der inhiberer vækst af en potentiel, ikke-eftersøgt mikrobe i mediet, og c) en virksom mængde af en næringsmiddel-indikator, 15 der tilvejebringes i en mængde tilstrækkelig til at understøtte logaritmisk fasevækst af den eftersøgte organisme, indtil der frembringes et detekterbart, karakteristisk signal i mediet under den logaritmiske fasevækst, idet næringsmiddel-indikatoren i nærværelse af antibiotiket ikke er i stand 20 til at understøtte fortsat logaritmisk vækst af nogen levedygtige, ikke-eftersøgte mikrober i prøven til frembringelse af et detekterbart, karakteristisk signal, og næringsmiddel--indikatoren er i stand til at ændre et detekterbart karakteristikum for prøven, såfremt det metaboliseres af den efter-25 søgte mikrobe, til bekræftelse af .tilstedeværelsen eller fraværelsen af den eftersøgte mikrobe i prøven, hvorhos mediet ikke indeholder et geldannelsesmiddel, således at der, når mediet blandes med den flydendegjorte prøve,' dannes en væske, hvorhos bestanddelene i a) og b) og næ-30 ringsmiddel-indikatoren vælges således, at væksten af ikke--eftersøgte mikrober ikke interfererer med væksten af den eftersøgte mikrobe.

Fordelagtige udførelsesformer for mediet, jf. det følgende, er angivet i krav 2-12.

35 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til detekte ring af tilstedeværelsen eller fraværelsen af en eftersøgt

I DK 175229 B1 I

I 2 I

I mikrobe i en miljøprøve eller en biologisk væskeprøve, hvil- I

I ken fremgangsmåde omfatter trinnene: I

I a) blanding af den flydende prøve med mediet ifølge I

I krav 1 og I

I 5b) derefter bedømmelse af prøven til bestemmelse af, ' I

I hvorvidt det detekterbare karakteristikum er blevet ændret. I

I Fordelagtige udførelsesformer for fremgangsmåden, I

I jf. det følgende, er angivet i krav 14-18. I

I Når man skal påvise mikrobielle patogener i I

I 10 prøver, hvadenten disse er af human, animalsk eller mil- I

I jømæssig oprindelse, anvendes i reglen følgende generel- I

I le procedure: de eftersøgte (og andre) mikrober i prø- I

I ven inokuleres med prøven i et dyrkningsmedium, hvori I

I de forsynes med alle de næringsstoffer, som de kræver I

I 15 for at gro. Prøven kan være en ubehandlet naturlig prø- I

I ve, eller det kan være en prøve, som er blevet behandlet I

I forud, f.eks. ved membranfiltrering. Dyrkningsmediet I

I har de næringsstoffer og andre selektive kemikalier, såsom I

I antimetabolitter eller antibiotica, som er selektivt aktive I

I 20 mod andre mikrober end de eftersøgte mikrober. Dyrknings- I

I mediet er et "generelt medium", selv med de selektive ke- I

I mikalier, fordi det støtter væksten af både de søgte mi- I

I krober og beslægtede mikrober, og er således kun til dels I

I specifikt over for de eftersøgte mikrober. I

I 25 Dyrkningsmediet, som kan være en vandopløsning I

I eller en vandgel, steriliseres for at blive fri for even- I

I tueile forurenende mikrober, der kan forekomme og som I

I derfor kunne forstyrre analysen. Dyrkningsmediet skal I

I opbevares i køleskab og emballeres på en sådan måde, at I

I 30 man undgår forurening efter fremstillingen. I

I Efter at et eller flere af dyrkningsmedierne I

I er inokuleret med prøven, inkuberes de inokulerede me- I

I dier i mindst 16-18 timer eller længere under kontrol- I

I lerede atmosfæriske betingelser. Efter inkubation un- I

I 35 dersøges dyrkningsmedierne for vækst, der er forenelig I

I med den eftersøgte mikrobe. Hvis en sådan vækst iagttages, I

I tages der en prøve til yderligere analyse, eftersom til- I

DK 175229 B1 3 stedeværelsen af den eftersøgte mikrobe kun kan fastslås ved at isolere den i ren tilstand, ikke blandet med andre mikrober. Når første de eftersøgte mikrober er isoleret på efterfølgende dyrkningsmedier, kan disse identificeres ved 5 afprøvning for en række forskellige fysiske og kemiske karakteristika . Hvis de tilsyneladende søgte mikrobevækster ikke isoleres, kan dette resultere i forkerte negative prøver.

Det er indlysende, at denne mest almindelige 10 analyseprocedure er tidsrøvende og skal udføres omhyggeligt for at opretholde sterilitet.

Et område, hvor der er blevet anvendt betydelige anstrengelser for at forenkle prøvemetoderne og gøre dem hurtigere, er afprøvning af vand for mikrober. Ne-15 denstående er eksempler på sådanne anstrengelser.

Der er tidligere udtænkt en feltprøve til påvisning af fækal forurening af drikkevand ved hjælp af hydrogen-sulfid-analyse direkte fra en reaktionsvæske. Denne prøve har endnu ikke vundet udbredelse, fordi den er mest anven-20 delig til isolering af Salmonella og ikke udvælger

Escherichia coli (E. coli). Der er tidligere udviklet en hurtig bekræftende prøve med kun et enkelt glas for E. coli.

Man modificerer lauryl-tryptose ved at halvere mængden af lactose og tilsætte 10% tryptophan. Der er tidligere udviklet' 25 en hurtig fækal coliform 7-timers prøve baseret på membranfiltreringsmetoden. Efter at en prøve på 100 ml er filtreret gennem en membran, anbringes den på et medium kaldet m-7 og inkuberes ved 44,5°C i syv timer. Fækale coliformer er gule, hvilket tyder på lactosefermentering. Selv om metoden er 30 hurtig, er den ikke egnet til arbejde i felten og lider af den samme mangel på specificitet som MPN- (most probable number)-metoden.

Flere forskere har forsøgt at påvise bakterielle biprodukter som et middel til analyse af vandtilførsler. Der 35 er tidligere anvendt en Limulus-lysat-analyse til at påvise bakterielle endotoksiner. Tilstedeværelsen af bakterier er

I DK 175229 B1 I

I 4 I

I også blevet konstateret ved hjælp af elektriske impedans- I

I målinger, ATP-analyser og analyse med kulstof-14-mærket I

I substat. Ingen af disse prøver er dog blevet accepteret på I

I området, der forbindes med en intra-koloni-forekomst, og I

I 5 som kan benyttes som varselsbakterier, der forudsiger til- I

I stedeværelsen af gastrointestinale patogener. I

I Der findes indikatorer for mikrobiel vækst, I

I som først ændrer farve, når mikroben vokser. De optræ- I

I der imidlertid ikke som næring for mikroben. De er et I

I 10 tilbehør til de kemikalier, der tilvejebringer næring for I

I de eftersøgte mikrober. De deltager udelukkende ved at reage- I

I re kemisk med et metabolisk biprodukt, frembragt af de I

I pågældende mikrober. De udøver ikke nogen stimulerende I

I virkning på de søgte mikrober. Kemikalier, der ændrer far- I

I 15 ve, når pH ændres, er blevet anvendt til at markere til- I

I stedeværelse eller fravær af bakteriel vækst. Alminde- I

I ligt anvendte pH-indikatorer omfatter phenolrødt, brom- I

I cresolblåt og neutralt rødt. Når disse indikatorer skal I

I anvendes, skal det medium, hvori mikroben vokser, være I

I 20 komplet. Kilder for carbon, aminosyrer, salte, vitami- I

I ner, fedtsyrer og energi er nødvendige. Indikatoren er I

I et tilbehørsstof. I den mikrobiologiske terminologi er I

I mediet generelt for talrige mikrober, fordi det støtter I

I væksten af talrige mikrober, når der er tilsat en indi- I

I 25 kator. I

I Der er blevet gjort forsøg på at måle bakte- I

I riel vækst ved hjælp af andet end pH-indikatorer. Mar- I

I kører, såsom elektrisk impedans, elektrisk ledningsev- I

I ne, mængden af ATP (adenosintriphosphat) , uklarhed (op- I

I 30 tisk densitet) er blevet målt på mikrober, der vokser i I

I et generelt medium, ved tilsætning af et kemikalie, der I

I måles. Således anvender Golber (US patentskrift nr. I

I 3.206.317) triphenyltetrazoliumchlorid i et medium inde- I

I holdende protein, gærekstrakt, dekstrose, natriumchlo- I

I 35 rid og kilder for andre næringsstoffer. I samme patent- I

I skrift beskrives der endvidere et generelt medium med I

DK 175229 B1 5 en pH-indikator, phenolrødt. En prøve, som menes at indeholde de(n) pågældende mikrobe(r) inokuleres i mediet.

Mediet indeholder alle de bestanddele, der er nødvendige for vækst, metabolisme og formering ikke blot af de 5 pågældende mikrober, men også andre mikrober. Efter at mikroberne er begyndt at vokse, metaboliserer de én eller flere bestanddele i mediet. Efter metabolisering eliminerer mikroberne affald og andre produkter. Affaldet og andre produkter kan måles ved hjalp af reak-10 tion med indikatoren. Således er én type affaldsprodukter fra mikrober ionisk hydrogen, som skaber en sur tilstand og ændrer phenolrødt fra rødt til gult. Andre affaldsprodukter er reduktionsmidler. Disse vil reagere med tetrazoliumchlorid og omdanne dette farvestof 15 fra farveløst til blå-blåligrød.

I US. patentskrift nr. 3.496.066 beskrives anvendelsen af en ny serie forbindelser, som bakterier omdanner fra precursorer til farvestoffer. Det omtales, at forskellige bakterier kan omdanne forskellige precur-20 sorer til forskelligt farvede stoffer. I alle tilfælde fungerer precursorerne ikke som næring for bakterierne.

Når mikroberne metaboliserer, vokser og formeres i generelle medier, omdannes precursorerne til farvestoffer.

I US patentskrift nr. 4.129.483 beskrives 25 et middel til identificering eller afprøvning for en mikrobe ved hjælp af ændringen af en oxidations-reduktionsindikator. Mikroben kataboliserer oxidations-reduktionsindikatoren, en tetrazoliumforbindelse, der gennemgår en farveændring. Et krav ved denne opfindelse er, at der i 30 mediet medtages et næringsstof, som støtter væksten af mikroorganismen uden selv at påvirke indikatoren. Det er nødvendigt, at indikatoren ifølge denne opfindelse er en ikke-bionedbrydelig forbindelse og deltager ved at ændre farve efter at være blevet reduceret.

35

I DK 175229 B1 I

I 6 I

I Ved den foreliggende opfindelse påvises de på- I

I gældende mikrober i en prøve ved hjælp af en indikator, I

I som er det foretrukne eller primære næringsmiddel for den I

I pågældende mikrobe, men som ikke i væsentlig grad kan me- I

I 5 taboliseres af eventuelle andre levende mikrober, der kan I

I forekomme i prøven sammen med den eftersøgte mikrobe. Ved op- I

I findelsen anvendes således en aktiv udvælger af de eftersøgte I

I mikrober i stedet for de passive reaktorer, der anvendes I

I i kendt teknik. Indikatoren vil ændre et karakteristi- I

I 10 kum ved prøven, når næringsstoffet er metaboliseret af I

I den eftersøgte mikrobe. Dette karakteristikum kan være: far- I

ve (enten synlig, ultraviolet eller infrarød), elektrisk I

I ledningsevne, elektrisk impedans eller lignende. Den fo- I

I retrukne udførelsesform for opfindelsen indebærer påvis- I

I 15 ning af de eftersøgte mikrober ved hjælp af en næringsstof- I

I -indikator, som, når den metaboliseres, ændrer den syn- I

I lige eller fluorescerende farve på en vandig opløsning I

I indeholdende prøven. I

I ' Næringsstof-indikatoren tager aktivt del i I

I 20 væksten af de pågældende mikrober ved at fungere som den I

I foretrukne eller primære næringskilde. De pågældende mi- I

I krober kan vokse, metabolisere og formere sig, fordi de, I

I og hovedsagelig kun de, kan anvende indikatoren som de- I

I res primære næringsstof. Indikatorer kan omfatte chro- I

I 25 mogener bundet til: salte, carbon, nitrogen, svovl, ami- I

I nosyrer, fedtsyrer, peptider eller andre selektive primæ-_ I

I re næringsmidler for mikrober. Fordi alle andre mikro- I

I t>er end de eftersøgte mikrober forhindres i at vokse, metabo- I

I lisere eller formeres, er mediet ifølge opfindelsen så I

I 30 specifikt, at det ikke behøver at blive steriliseret før I

I brug. Konkurrencen mellem de eftersøgte mikrober og de andre I

I med hensyn til de til rådighed værende næringsstoffer i I

I mediet elimineres ved den foreliggende opfindelse. Me- I

I diet kan fremstilles og emballeres i pulveriseret form I

I 35 °9 tilsættes til den prøve, der skal analyseres. Som I

I bemærket kræves der ingen sterilisation. Mediet kan I

DK 175229 B1 7 opløses t vand, og prøven kan sættes til opløsningen, eller hvis prøven er vandig, kan mediet sættes direkte til prøven. Der er intet behov for en minimumsinkubationstid for at sikre vækst af de eftersøgte mikrober, ef— 5 tersom ingen andre mikrober i prøven vil være i stand til i væsentlig grad at metabolisere næringsstoffet i mediet.

Udviklingen af en bestemt farve viser tilstedeværelse af de eftersøgte mikrober. Det kan ske nogen tid, 10 efter at' proceduren er gået i gang. Det er ikke nødvendigt at rense de eftrsøgte mikrober. Det er ikke nødvendigt at udføre nogen kemisk analyse af prøven for at konstatere, om de eftersøgte mikrober er til stede.

Benævnelsen af mikrober er en videnskab, der 15 kaldes klassifikation. Man begynder med visse grove karakteristika og arbejder sig frem til en afgørelse.

Jo længere man når, jo mere specifikke er de karakteristika, der skal_ placere en bestemt mikrobe på det pågældende niveau. Hvert niveau har sit eget navn,, såsom orden, 20 stamme, familie etc. Slægt og art er de sidste tø niveauer i klassifikationen. Mikrober kendes ved deres slægt og art..

Mikrober har lige som mennesker to navne til at beskrive deres plads i den videnskabelige verden.

25 Det er slægtsnavnet og artsnavnet. Slægten referer til en gruppe mikrober, der har karakteristika fælles. Dette er analogt roed et menneskes familienavn. Arten er den klassifikation, der ikke kan inddeles yderligere.

Den svarer til et menneskes fornavn. Lige som navne på 30 mennefeker kan mikrober dog med samme slægts- og artsnavn (f.eks. Escherichia coli) ikke alle være identiske.

Slægtsnavnet kommer før artsnavnet (som i de lande, hvor efternavnet nævnes først).

35

I DK 175229 B1 I

i 8 I

I I den foreliggende beskrivelse kan udtrykket I

I "target-mikrober" eller de eftersøgte mikrober referere I

I til en enkelt mikrobe, en beslægtet art mikrober eller I

I en stor slægt af mikrober, der har en fælles taksonomisk I

I 5 karakteristik. Indikatoren behøver kun være specifik med I

I hensyn til den søgte mikrobe. Der findes således in- I

I dikatorer til påvisning af en enkelt mikrobe, såsom Esche- I

I richia coli (E. coli), eller til påvisning af en hvilken I

I som helst af en nært beslægtet mikrobeart, såsom Klebsiel- I

I 10 la, Enterobacter, Serratia eller en hvilken som helst af I

en stor slægt af mikrober, såsom gram-negative bakteri- I

I er. De chromogener, der anvendes i næringsstof-indi- I

I katoren, kan frembringe farve inden for det synlige in- I

I terval, det ultraviolette interval eller det infrarøde I

I 15 interval. Som det vil fremgå af det ovennævnte, er næ- I

I ringsstof7indikatoren fortrinsvis farveløs i ikke-meta- I

I boliseret tilstand og afgiver fortrinsvis en farve-mole- I

I kyldel efter at være blevet metaboliseret af mikroberne. I

I Farven kan være synlig, fluorescerende eller maskin-af- I

I 20 læselig/ Som tidligere bemærket findes der ved anven- I

I delse af opfindelsen meget ringe eller ingen konkurrence I

I med hensyn til føde og næring blandt mikroberne i mediet, I

I fordi kun det næringsstof, der er til stede i mediet, I

I kan metaboliseres i signifikant omfang udelukkende af I

I 25 de søgte mikrober. Følgelig elimineres et signifikant I

I antal forkerte negative prøver, der vil forekommer ved I

I de kendte procedurer, ved hjælp af opfindelsen. Det an- I

I vendte næringsstof er ét, som de eftersøgte mikrober i høj I

I grad foretrækker frem for andre næringsstoffer og tilli- I

I 30 ge ét, som andre mikrober kun i ringe omfang eller slet I

I ikke foretrækker. Således kan kun tilstedeværelsen af I

I de eftersøgte mikrober i prøven resultere i tilstrækkelig I

I metabolisering af næringsstoffet til at bevirke ændring af I

I farve eller et andet karakteristikum i prøven. I

I 35 I

DK 175229 B1 9

Eftersom næringsstof-indikatoren er specifik i det væsentlige udelukkende over for den eftersøgte mikrobe og er det foretrukne eller primære næringsstof i mediet for den søgte mikrobe, vil den eftersøgte mikrobe blive til-5 trukket af næringsstoffet og vil således fremskynde farve-skiftet.

Med opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til påvisning af mikrober i en prøve ved metabolisk at ændre et påviseligt karakteristikum ved prøven.

10 Med opfindelsen tilvejebringes også en fremgangsmåde af den beskrevne art, hvor prøvens farve ændres ved metabo-lisering af en eftersøgt mikrobe.

Med opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde af den beskrevne art, hvor farveskiftet tilvejebringes ved 15 metabolisme af et næringsstof, der er tilsat prøven, hvilket næringsstof omfatter en chromogen molekyldel, der kun kan påvises, når næringsstoffet er metaboliseret.

Med opfindelsen tilvejebringes også en fremgangsmåde af den beskrevne art, hvor næringsstoffet med den chromogene 20 molekyldel kun kan metaboliseres i signifikant omfang af den eftersøgte mikrobe.

Herefter vil blive omtalt tre eksempler på anvendelse af opfindelsen til påvisning af en slægt og en art af gram-negative mikrober (Escherichia coli), en slægt 25 og en art af gram-positive mikrober (Streptococcus faeca-lis) og en taksonomisk klasse bestående af en stor gruppe med mange medlemmer (gram-negative mikrober) . Når en prøve undersøges for en af disse tre, vil de blive omtalt som de eftersøgte mikrober.

30 35

I DK 175229 B1 I

I 10 I

I Escherichia coli I

I Næringsstoffet er et substrat for enzymet B- I

I glucuronidase. Hvis man ønsker at bestemme tilstede- I

I værelse af E. coli ved farveændring, kan næringsstof- I

I 5 -indikatoren være orthonitrophenyl-B-D-glucuronid (gul)/ I

I B-naphthalamid-B-D-rglucuronid (violet) , a-naphthol-B-D- I

I -glucuronid (rød) eller methylumbelliferyl-B-D-glucuro- I

I nid (fluorescerende) eller lignende. I

I Næringsstof-indikatoren tjener som væsentlig I

I 10 carbon-kilde. Resten af mediet er afpasset, så at hver I

I bestanddel opfylder et af E.coli's krav.

I For at forhindre konkurrence fra mikrober, I

I der ikke er omfattet af den brede kategori af gram-ne- I

I gative bakterier, tilsættes først antibiotica'ene "Van- I

I 15 comycin" og ''Ansiomycin" i en vægt% på 5. Disse anti- I

I biotica kan forekomme i en mængde fra 1-10 vægt%. I

I For at udvælge E.coli blandt gram-negative I

I bakterier anvendes dernæst følgende bestanddele: I 1

20 Foretr. Vægt%- I

I Bestanddel_Kilde___vægt%_interval I

I Nitrogen ammoniumsulfat 37 10-50 I

I Aminosyrer histidin 0,0697 0,02-0,1 I

I methionin 0,1860 0,02-0,4 I

I 25 tryptophan 0,2325 0,02-0,5 I

I Vitaminer biotin 0,000232 0,0001-0,001 I

I pantothenat 0,0093 0,001-0,03 I

I folinsyre 0,000232 0,0001-0,02 · I

I inositol 0,0186 0,01-0,02 I

I 30 p-aminabenzoesyre 0,046 0,01-0,1 I

I pyridoxin-hydr.chl. 0,093 0,05-0,3 I

I riboflavin 0,037 0,01-0,06 I

I thiamin 0,037 0,01-0,06 I

I Grundstoffer ferrichlorid 0,046 0,02-0,1 I

I 35 kobbersulfat 0,001860 0,001-0,002 I

I mangansulfat 0,0037 0,002-0,007 I

DK 175229 B1 11

Foretr. Vægt%-

Bestanddel_Kilde_ vægt%_interval

Grundstoffer kaliumchlorid 0,0000009 0,00001-0,001 (forts.) kaliumiodid 0,0000046 0,000001-0,00001 5 zinksulfat 0,046 0,01-0,08 borsyre 0,460 0,01-0,5 negnesiunchlorid 0,019 0,01-0,05

Salte kaliurrphosphat mondbasisk 9,0 1-15 10 kaliumphosphat dibasisk 23,0 2-30 natriumkarbonat 23,0 2-30 magnesiumsulfat 4,6 1-10 natriumchlorid 0,9 0,2-5 15 calc iumchlorid 0,9 0,2-5 natriumpyruvat 0,023 0,01-0,1 Næringsstof- -indikator 0,345 0,2-2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Streptococcus faecalis 2

Streptococcus faecalis er en mikrobe, der har 3 vist sig at være årsag til urinvejsinfektion. Det er 4 ligeledes den overvejende bakterie, der findes ved ana 5 lyse af vand i svømmebassiner.

6 Næringsstof-indikatoren er et substrat for en 7 zymet L-pyronidonyl-aminopeptidase. Hvis man ønsker at 8 bestemme tilstedeværelse af S.faecalis ved farveændring, 9 kan næringsstof-indikatoren være orthonitrophenyl-B-L- 10 -pyronidonyl (gul), B-naphthalamid-B-L-pyronidonyl (vio- 11 let), α-naphthol-B-L-pyronidonyl (rød) og methylbelli- 12 feryl-B-L-pyronidonyl (fluorescerende).

13 Næringsstof-indikatoren fungerer som væsantr’ 14 lig carbonkilde. Resten af mediet afpasses således, at 15 hver bestanddel opfylder et af S.faecalis17 krav.

16 Først tilsættes, for at forhindre konkurrence fra mikrober, der ikke hører under den brede kategori af gram-positive bakterier, antibioticaene "Colistin", "Na- 17

I DK 175229 B1 I

I 12 I

I ladixinsyre" og "Ansiomycin". I

I For dernæst at udvælge S.faecalis fra gram-po- I

I sitive bakterier, anvendes den samme blanding af bestand- I

I dele som angivet for E.coli sammen med den ovennævnte næ- I

I 5 ringsstof-indikator og antibiotica. Næringsstof-indika- I

I toren forekommer i en koncentration på 0,345 vægt%, idet I

I det anvendelige interval er ca. 0,2 til ca. 2,0 vægt%, I

I og antibioticaene forekommer i en koncentration på 5 I

I vægt%, idet det anvendelige interval er ca. 1 til ca. I

I 10 10 vægt%. I

I Gram-negative bakterier I

I Der findes to store bakterieklasser: gram-posi- I

I tive og gram-negative. Gram-negative bakterier er vigti- I

I ge, fordi de indeholder et giftigt stof som en del af I

I 15 deres legeme, kaldet endotoksin. De kan også forurene I

I pharmaceutica og andre medicinske tilberedninger. I

I Næringsstof-indikatoren er et substrat for en- I

I zymet L-alanin-aminopeptidase. Hvis man ønsker at be- I

I stemme tilstedeværelsen af gramnegative bakterier ved hjælp I

I 20 af farveændring, kan næringsstof-indikator-molekylet væ- I

I re L-alanin-B-orthonitrophenyl (gul), β-naphthalamid-B- I

I -L-alanin (violet), α-naphthol-B-Lralanin (rød) og me- I

I thylumbelliferyl—B-L-alanin (fluorescerende) . I

I Næringsstof-indikatoren fungerer som væsent- I

I 25 lig carbon-kilde. Resten af mediet er afpasset således, I

I at hver bestanddel opfylder et behov hos gram-negative I

I bakterier. I

I For at eliminere mikrober, der ikke hører ind I

I under den brede kategori af gram-negative baktierier, til- I

I 30 sættes først antibioticaene "Ansiomycin" (eliminerer gær) I

I og "Vancomycin" (eliminerer gram-positive) i en mængde på I

I 5 vægt%. I

I Der anvendes den samme blanding af bestanddele I

I som anført ovenfor sammen med næringsstof-indikatoren, I

I 35 der foreligger i en mængde på 0,345 vægt% og i interval- I

I let fra ca. 0,2 til ca. 2,0 vægt%, og antibioticaene I

DK 175229 B1 13 kan forekomne i et interval fra ca. 1 til ca. 10 vægt%. Yderligere eksempler

En primær carbon-kilde kan anvendes som iet primære næringsstof ved påvisningen af familien Klebsiellae i vand. Bakterier i familien Klebsiellae kan metabolise-re carbon-kilder, hvor carbonet i sukkermolekyler er bundet ved B-D-bindinger. En påvisningstilberedning til den-^ ne art omfatter som den primære carbon-næringsstof-kilde et glucose-molekyle bundet ved B-D-binding til orthonitro-phenyl, en chromogen molekyldel. samt antibioticaene "Colistin" og "Naladixinsyre". En prøve inokuleres med påvisningstilberedningen. Hvis familien Klebsiellae er ^ til stede, vil orthonitrophenyl-B-D-glucosen blive meta-boliseret med frigørelse·af orthonitrophenyl-molekyldelen.

Denne molekyldel bliver gul, når den frigøres. Derfor viser den gule farve i prøven tilstedeværelsen af de eftersøg te..mikrober , dvs. jE amil i en Klebsiellae. Andre mikrober vil ikke vokse, fordi de ikke kan metabolisere indikato- 20 ren, orthonitrophenyl-B-D-glucose. Der vil ikke være mikrobiel konkurrence med andre mikrober, fordi de ikke vil vokse og metabolisere.

Staphylococcus aureus kan identificeres i nær- __ vær af andre Staphylococci i en blandet vandprøve, fordi 25 denne søgte mikrobe kan metabolisere PO^. Orthonitrophen-yl bundet til phosphat kan anvendes som metaboliserbar indikator i prøvemediet til påvisning af denne art. Efter at prøven indeholdende blandingen er blandet med me-diet, vil kun Staphylococcus aureus metabolisere næringsstoffet i mediet og frigøre indikatoren, hvilket vil fremkalde en gul farve, der kan iagttages. Gram-negative bakterier og gær elimineres fra prøven ved tilsætning af hhv. "Colistin", "Naladixinsyre" og "Ansiomycin".

Nitrogen og svovl metaboliseres af mikrober hovedsagelig i deres reducerede former som aminogrupper eller ammoniumsalt (NH^) - og sulfhydryl-(SH)-grupper.

I DK 175229 B1 I

I 14 I

I Lige som carbon er nitrogen og svovl absolut nødvendige I

I for vækst. Ved den foreliggende opfindelsen benyttes I

I det samme princip, der er beskrevet for carbon, til syn- I

I tetisering af prøver, ved hvilke der anvendes hydrolyser- I

I 5 bare substrater bundet til nitrogen eller svovl til at I

I påvise og specificere mikrober. I

I Et eksempel er påvisningen af Mycobafcterium I

I fortuitum. Denne bakterie kræver som svovl-kilde sul- I

I fat-ionen SO^. Phenolphthaleinsulfatet, der anvendes som I

I 10 næringsstof-indikator, er normalt farveløst. I et medium I

I med alle de bestanddele, der kræves for vækst, undtagen I

I en svovl-kilde, kan kun Mycobacterium fortuitum af siæg- I

I ten Mycobacterium udnytte sulfat. Derfor vil kun denne I

I art gro og metabolisere. Dens tilstedeværelse viser sig I

I ved den røde farve, der produceres af den frigjorte chro- I

I mogene molekyldel phenolphthalein. I

I Et andet eksempel på anvendelsen af et nærings- I

I stof, som kan omdannes til en næringsstof-indikator, er I

I forbindelsen triglycerid-orthonitrophenyl. Slægten Fu- I

I 20 sobacterium er den eneste gram-negative anaerobe bakterie I

I af medicinsk betydning, som benytter triglycerid til I

I at vokse og metabolisere. Hvis en prøve indeholdende Fu- I

I sobacterium inokuleres i et anaerobt medium indeholden- I

I de alle de for vækst nødvendige bestanddele samt trigly- I

I 25 cérid-orthonitrophenyl som primær triglycerid-kilde, vil I

I kun Fusobacterium metabolisere. Dens metabolisme vil I

I vise sig ved den gule farve, der frigøres som molekyl- I

I delen orthonitrophenyl. I

I Den foreliggende opfindelse er tilpasset in- I

I 30 dividuelt, til arter eller slægter af eftersøgte mikrober, I

I ved at vælge en næringsstof-indikator, som kun de eftersøgte I

I mikrober kan anvende.· som primært næringsstof, til er- I

I statning for et alment næringsstof i mediet. Mediet er I

I således et specifikt og ikke et alment medium. I

I 25 e. coli kan ikke metabolisere sukkerforbindel- I

I sen adonitol, hvorimod Klebsiella pneumoniae (K. pneumo- I

DK 175229 B1 15 niae) kan. Derfor vil E. coli ikke vokse, metabolisere og formeres, hvis adonitol er det eneste næringsstof i mediet, og K. pneumoniae vil. Et rriedium kan sammensættes på basis af denne kendsgerning for at tilvejebringe 5 alle de vækstfaktorer, som K. pneumoniae kræver, med adonitol som det primære næringsstof, hvorved K. penumoniae vil metabolisere og vokse. Hvis E. coli, en beslægtet bakterie, er til stede i det samme medium, vil den ikke metabolisere og vokse. Derfor vil en chromogen molekyl-10 del bundet til adonitol fungere som næringsstof-indikator til påvisning af vækst og metabolisme af K. pneumoniae i en prøve blandet med E.coli.

Næringsstof-indikatorer er kunstige molekyler, der aldrig tidligere har været anvendt som primære næ-15 ringsstoffer. Lige som eksemplet med adonitrol vil et særligt næringsstof-chromogen blive angrebet af den eftersøgte mikrobe og frigøre en farvet molekyldel. Eftersom andre mikrober ikke kan metabolisere det, vil de ikke vokse.

20 En prøve sættes til en beholder, f.eks. en fla ske. Mediet ifølge opfindelsen sættes til prøven, og der blandes godt. Hvis prøven er et fast stof, kan der anvendes vand som fortyndingsmiddel. Hvis den eftersøgte mikrobe eller gruppe af mikrober er til stede, vil mediet 25 ifølge opfindelsen ændre farve (på et hvilket som helst tidspunkt efter inokulationen). Der kræves ingen teknisk indsats efter inokulationen.

Eftersom slutpunktet er en klar farveændring:, kræves der heller ikke uddannet personale for at afgøre, om 30 prøven er positiv.

Der findes substrater til specifikt at påvise fækale coliformer (E. coli), totale coliformer, Kleb-siella-Enterobacter-Serratia-gruppen og Streptococcus faecalis.

35 Mediet ifølge opfindelsen er særlig egnet til vandanalyse. Når vandet analyseres, kan der om nødven-

I DK 175229 B1 I

I 16 I

I digt tilsættes natriumthiosulfat eller natrium-EDTA for I

I at neutralisere antibakterielle midler, der findes i I

I vandet. I

I Når man skal analysere vand for E. coli, føl- I

I 5 ges nedenstående fremgangsmåde: I

I 1. Der tages en vandprøve. Ved hjælp af en kali- I

I breret pipette sættes 1,0, 0,1 og 0,01 ml til hvert af I

I tre glas. Det ovennævnte medium ifølge opfindelsen til- I

I sættes i pulveriseret form (alternativt kan mediet iføl- I

I 10 ge opfindelsen være til stede i pulveriseret form i glas- I

I sene). I

I 2. Glassene inkuberes mellem 20 og 44°C. I

I 3. Tilstedeværelse af E.coli ses ved ændring af I

I farven i glasset, I

I 15 4. Hvis der er mere end 100 E.coli/ml til stede, I

I vil 0,01 glasset være positivt; hvis der er mere end 10 I

I E.coli/ml til stede, vil 0,1 ml glasset være positivt; I

I hvis der er mindre end én E.coli/ml til stede, vil kun I

I 1 ml-glasset være positivt. I

I 20 En positiv prøve kan fremkomme på et hvilket I

I som helst tidspunkt kort efter inokulation med en svært I

I inokuleret prøve, op til 20 timer, hvis der kun forekom- I

I mer én bakterie pr. ml prøve. Den eneste tekniske mani- I

I pulation er tilsætning af vand til glassene med de kali- I

I 25 brerede pipetter. I

I Det samme medium som beskrevet ovenfor anven- I

I des til at analysere vand for tilstedeværelse eller man- I

I gel på E.coli (P-A-prøve). I

I 1. En prøve på 100 ml vand sættes til en beholder I

I 3 0 indeholdende det ovennævnte medium ifølge opfindelsen. I

I 2. Når reaktionsblandingen ændrer farve (maksi- I

I malt 18 timer), forekommer der E. coli, og prøven er po- I

I sitiv. I

3. Bekræftende eller andre prøver er ikke nødven- I

I 35 dige. I

DK 175229 B1 17

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen afprøves med flere forskellige B-glucuronidase- og B-galactopyranosid--substrater på markedet. Der foretages en sammenligning mellem fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved et P-A-prø-5 vesystem og en gængs membranfiltreringsteknik, og der , analyseres ifølge EPA-protokollen for nye apparaters at test. Metoden ifølge opfindelsen er specifik og kræver ingen bekræftende prøver. Prøven foretages med henblik på to eftersøgte mikrober, E. coli og totale coliformer.

10 Grundtilberedningen fremstilles som beskrevet ovenfor; kun . det hydrolyserbare substrat ændres med henblik på påvisning af de bestemte eftersøgte mikrober.

Nedenstående omhandler det hurtige autoanalyse-tilberedningssystem.

15 Autoanalysetilberedningen fremstilles med fle re substrater for B-glucuronidase og B-galactosidase og afprøves i marken. B-Glucuronidase-substratet er til E.coli, B-galactosidasetilberedningen er til totale colif ormer; de to substrater vil tilsammen identificere 20 begge mikrober samtidigt. Der foretages sammenligning af autoanalysetilberedningen ved P-A-prøvesystemet med membranfiltreringsteknikken.

Autoanalysetilberedningen fremstilles til to typer søgte mikrober: E. coli og totale coliformer.

25 Forskellige substrater for B-glucuronidase (E.coli) og B-galactosidase (totale coliformer) afprøves. Substraterne varieres med hensyn til de farveproducerende (chro-mogene) dele af molekylet.

Substrater til B-glucuronidase 30 1. Følgende substrater for B-glucuronidase afprø ves separat med hensyn til evne til at påvise E.coli: orthonitrophenyl-glucuronid: bliver gul, når det hydrolyseres.

methylumbelliferon-glucuronid: bliver fluore- 35 scrende ved 366 nm, når det hydrolyseres.

I DK 175229 B1 I

I 18 I

I - brom-chlor-indol-glucuronid: bliver blåt, I

I når det hydrolyseres. I

I 2. Følgende substrater for B-galactosidase afprø- I

I ves separat med hensyn til evne til at påvise totale co- I

I S liformer. I

I - orthonitrophenyl-galactosid: bliver gult, når I

I det hydrolyseres. I

I - methylumbelliferon-galactosid: bliver fluore- I

I scerende ved 366 nm, når det hydrolyseres. I

I 10 3. Følgende kombinationer afprøves for evne til I

I samtidig at bestemme tilstedeværelse af E.coli og/eller I

I totale coliformer: I

I - methylumbelliferon-glucosid + orthonitrophenyl- I

I -galactopyranosid: hvis E.coli {fækale colifor- I

I 15 mer) er til stede, bliver prøveopløsningen flu- I

I orescerende ved 366 nm; hvis totale coliformer I

I er til stede, bliver den gul; hvis begge typer I

I coliformer er til stede, bliver opløsningen I

fluorescerende og gul. I

I 20 “ brom-chlor-indol-B-glucosid til påvisning af I

I E.coli (fækale coliformer) + methylumbellife- I

I ron-galactopyranosid til påvisning af totale I

coliformer: hvis der forekommer E.coli (fæka- I

I le coliformer), bliver prøveopløsningen blå; I

I 25 hvis totale coliformer er til stede, bliver I

I den gul; hvis begge forekommer, bliver opløs- I

ningen både blå og fluorescerende. I

I Afprøvede basemedier I

I 1. Følgende grundformler anvendes: I

I 30 - chromogene substrater i autoanalyse-tilbered- I

I ning. I

I - chromogene substrater i lauryl-lactose-tryp- I

I tose-næringsvæske. I

I Resultater I

I 35 1. Prøve for tilstedeværelse af E.coli ved anven- I

I delse af methylumbelliferon-glucuronid i lauryl-lactose- I

DK 175229 B1 19 -tryptose-næringsvæske.

75 prøver af råt ubehandlet vand fra en reservoirsø afprøves. Membranfiltreringsteknikken giver 12 positive resultater for totale coliformer og 12 for fæ-5 kale coliformer. Lauryl-lactose-tryptose-næringsvæsken, der indeholder indikatoren, påviser 6 tilfalde af totale coliformer og 2 tilfælde af E.coli. Den gennemsnitlige identifikationstid er 16,5 timer. Slutpunkterne er vanskelige af konstatere på grund af uklarhed og lactose-10 -fermentering fremkaldt af bakterier, der ikke er coliformer. Anvendelsen af lauryl-lactose som basis afbrydes, og dette medium undersøges ikke yderligere.

2. Prøve for tilstedeværelse af E.coli (fækale coliformer) ved anvendelse af orthonitrophenyl-galacto-15 sid i autoanalyse-tilberedning.

35 prøver af råt ubehandlet vand fra en reser-voir-sø afprøves. Membranfiltrering og autoanalyseme-toden giver hver ét positivt resultat. Den gennemsnitlige identifikationstid er 18 timer.

20 3. Methylumbelliferon-B-glucuronid-substrat for E. coli (fækale coliformer) + orthonitrophenyl-B-galac-topyranosid for totale coliformer, afprøvet samtidigt.

80 prøver af råt ubehandlet vand fra en reservoir-sø afprøves. Med membran-filtreringsteknikken fås.

25 ingen positive resultater for fækale coliformer og 8 for totale.coliformer. Autoanalyse-tilberedningen påviser . ingen E.coli og 8 positive tilfælde af totale coliformer.

Den gennemsnitlige påvisningstid er 18 timer.

4. Brom-chlor-indol-B-D-glucuronid for E.coli 30 (fækale coliformer) + methylumbellieferon-galactopyra- nosid for totale coliformer, afprøvet samtidigt.

10 prøver af råt ubehandlet vand fra en reservoir-sø afprøves. Membranfiltreringsteknikken giver ét positivt resultat for totale coliformer. Den autoanaly-35 tiske tilberedning giver §t positivt resultat for totale coliformer i samme prøve. Den gennemsnitlige identifi-

I DK 175229 B1 I

I 20 I

I kationstid er 22 timer. I

I 5. Orthonitrophenyl-B-galactopyranosid for totale I

I coliformer. I

I 50 prøver af færdigbehandlet vand fra forde- I

I 5 lingssystemet afprøves. Membranfiltreringsteknikken I

I giver to positive resultater for totale coliformer (<2 I

I CFU/100 ml). Autoanalysetilberedningen påviser de samme I

I to totale coliformer. Den gennemsnitlige påvisningstid I

I er 17 timer. I

I 10 6. Methylumbelliferon-B-galactosid. for totale I

I coliformer. I

I 20 prøver af færdigbehandlet vand fra forde- I

I lingssystemet afprøves. Membranfiltrering og autoana- I

I lysetilberedningsteknik giver begge ét totalt og sam- I

I 15 me positive tilfælde af totale coliformer. Den gennem- I

I snitlige identifikationstid er 18 timer. I

I 7. Methylumbelliferon-B-glucuronid for E.coli I

I (fækale coliformer) + brom-chlor-indol-B-galactosld for I

I totale coliformer afprøvet samtidigt. I

I 20 50 prøver af råt ubehandlet vand fra et sø- I

I -reservoir afprøves. Membranfiltreringsteknikken giver I

I 16 positive resultater for totale coliformer og to for I

I E.coli. Tilberedningen påviser de samme 16 plus yderli- I

I gere to tilfælde af totale coliformer og to tilfælde af I

I 25 E.coli. Den gennemsnitlige identifikationstid er 18 I

I timer. I

I Næringsstof-indikatorer, der kan anvendes i I

I forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan frem- I

I stilles på følgende måde: , I

I 30 Orthonitrophenyl-derivater I

I Reaktionsblandingen består af 42 g O-nitrophen- I

I yl, der opløses i 420 ml destilleret vand indeholdende I

I 16,8 g NaOH. Til denne opløsning sættes tetracetyl-B-D- I

I -galactopyranosylbromid i 620 ml acetone. Efter reak- I

I 35 tion ved stuetemperatur i fem timer fjernes opløsnings- I

I midlet ved evakuering. 1 g af denne reaktant suspende- I

21 DK 175229 B1 res i 50 ml methanol indeholdende 0,4N bariummethoxid.

De krystaller, der dannes ved denne reaktion, er O-ni-tropheny1-B-D-galactopyranosid.

Paranitrophenylsulfatase 5 Der foretages følgende reaktion: 47 ml dime- , thylanalin og 50 ml carbondisulfid blandes og afkøles til 4°C, der tilsættes 9,2 ml chlorsulfonsyre tillige med 13,9 g p-nitrophenol, der blandes, og blandingen henstår natten over. Derpå tilsættes 100 ml kaliumhy-10 droxid 0,4N. Der fås lysegule krystaller ved opvarmning af blandingen ved 80°C, idet carbondisulfidet fordamper. Overskydende methylanalin fraskilles ved centrifugering. Substratet, p-nitrophenyl, omkrystalliseres fra alkohol.

15 Det fremgår klart, at det specifikke medium ifølge opfindelsen kan fremstilles i pulverform og emballeres i mængder færdin til bruq oq specifikke over for en række forskellige eftersøgte mikrober. Det fremstillede medium kan omfatte antibiotiske komponenter, om ' 20 ønsket.

25 1 35

Claims (18)

1. For en eftersøgt mikrobe specifikt medium til I I detektering af tilstedeværelsen eller fraværelsen af en I I eftersøgt mikrobe i en flydendegjort miljøprøve eller biolo- I I 5 gisk prøve, hvilket medium omfatter I I a) en virksom mængde vitamin-, aminosyre-, grundstof- , I I og saltbestanddele, der er i stand til at tillade levedyg- I I tighed og reproduktion i logaritmisk fase af den eftersøgte I I mikrobe i nærværelse af en næringsmiddel-indikator og i I I 10 stand til at hjælpe den eftersøgte mikrobe gennem latent I I fase og ind i logaritmisk fasevækst i prøven, I I b) en virksom mængde af mindst ét antibiotikum, der I I inhiberer vækst af en potentiel, ikke-eftersøgt mikrobe i I I mediet, og I I 15 c) en virksom mængde af en næringsmiddel-indikator, I I der tilvejebringes i en mængde tilstrækkelig til at under- I I støtte logaritmisk fasevækst af den eftersøgte organisme, I I indtil der frembringes et detekterbart, karakteristisk signal I I i mediet under den logaritmiske fasevækst, idet næringsmid- I I 20 del-indikatoren i nærværelse af antibiotiket ikke er i stand I I til at understøtte fortsat logaritmisk vækst af nogen leve- I I dygtige, ikke-eftersøgte mikrober i prøven til frembringelse I I af et detekterbart, karakteristisk signal, og næringsmiddel- I I -indikatoren er i stand til at ændre et detekterbart karakte- I I 25 ristikum for prøven, såfremt det metaboliseres af den efter- I I søgte mikrobe, til bekræftelse af tilstedeværelsen eller I I fraværelsen af den eftersøgte mikrobe i prøven, , I I hvorhos mediet ikke indeholder et geldannelsesmiddel, således I I at der, når mediet blandes med den flydendegjorte prøve, * I I 30 dannes en væske, hvorhos bestanddelene i a) og b) og næ- I I ringsmiddel-indikatoren vælges således, at væksten af ikke- I I -eftersøgte mikrober ikke interfererer med væksten af den I I eftersøgte mikrobe. I

2. Medium ifølge krav 1, hvor mediet tillader vækst I I 35 af Escherichia coli og er specifikt for Escherichia coli. I

3. Medium ifølge krav 1, hvor mediet tillader vækst I DK 175229 B1 af én eller flere coliform-bakterier og ingen andre bakterier og dermed er specifikt for coliform-bakterier.

4. Medium ifølge krav l, i hvilket de nævnte bestanddele omfatter en kilde til salte, der er til stede i en 5 mængde på ca. 62 vægt-%, og en kilde til nitrogen, der er til stede i en mængde på mindst 10 vægt-%.

5. Medium ifølge krav 4, i hvilket bestanddelene er til stede i en mængde i området fra mindst ca. 1,5 til ca. 2,5 vægt-%.

6. Medium ifølge krav 5, i hvilket næringsmiddel-indi katoren er til stede i en mængde i området fra ca. 0,2 til ca. 2,0 vægt-%.

7. Medium ifølge krav 1, hvor mediet befinder sig på en fast form.

8. Medium ifølge krav 1, hvor mediet befinder sig på en pulverform.

9. Medium ifølge krav 1, i hvilket næringsmiddel-indikatoren omfatter et chromogen, der ved frigørelse ved metabolisering af næringsmiddel-indikatoren vil ændre farven 20 af prøven.

10. Medium ifølge krav 9, i hvilket chromogenet er et glucuronid, der er valgt fra gruppen bestående af ortho--nitrophenyl-E-D-glucuronid, S-naphthalamid-S-D-glucuronid, a-naphthol-S-D-glucuronid og methylumbilliferyl-fi-D-glucuro- 25 nid.

11. Medium ifølge krav 9, i hvilket chromogenet er valgt blandt ortho-nitrophenyl-fé-L-pyronidonyl, S-naphthal-amid-E-L-pyronidonyl, cx-naphthol-S-L-pyronidonyl og methyl- * umbilliferyl-fi-L-pyronidonyl.

12. Medium ifølge krav 9, i hvilket chromogenet er valgt fra gruppen bestående af L-alanin-£-ortho-nitrophenyl, S-naphtalamid-S-L-alanin, o'-naphthol-S-L-alanin og methylum-billiferyl-6-L-alanin.

13. Fremgangsmåde til detektering af tilstedeværelsen 35 eller fraværelsen af en eftersøgt mikrobe i en miljøprøve eller en biologisk væskeprøve, hvilken fremgangsmåde omfatter I DK 175229 B1 I I 24 I I trinnene: I I a) blanding af den flydende prøve med mediet ifølge I I krav l og I I b) derefter bedømmelse af prøven til bestemmelse af, I I 5 hvorvidt det detekterbare karakteristikum er blevet ændret. I

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, ved hvilken mediet I I tillader vækst af Escherichia coli og er specifikt for Es- I I cherichia coli. I

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, ved hvilken mediet I I 10 tillader vækst af én eller flere coliform-bakterier og ingen I I anden bakterie, hvorved det er specifikt for coliform-bakte- I I rier. I

16. Fremgangsmåde ifølge krav 13, der yderligere I I omfatter trinnene: I I 15 a) tilvejebringelse af mindst ét kendt rumfang af I I den flydende prøve, I I b) dannelse af en blanding af prøve og medium ved I I tilsætning til.prøven af en forudbestemt mængde af en fast I I form af mediet ifølge krav 1, der er opløselig i prøven, og I I 20 c) overvågning af blandingen af prøve og medium i I I mindst ca. 20 timer eller indtil det detekterbare karakteri- I I stikum er blevet ændret, til bestemmelse af tilstedeværelsen I I eller fraværelsen af den eftersøgte mikrobe. I

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, ved hvilken mediet I I 25 sættes til en 1,0 ml-prøve af prøven, til en 0,1 ml prøve I I af prøven og en 0,01 ml-prøve af prøven, og hver blanding I I af prøve og medium overvåges med henblik på ændring af detek- I I bart karakteristikum til detektering af tilstedeværelsen af I I den eftersøgte mikrobe i prøven. . I I 30

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, der yderligere I I omfatter trinnet inkubering af blandingen af prøve og medium I I ved en temperatur i området fra ca. 20°C til ca. 44°C under I I overvågning deraf. I