DK175366B1

DK175366B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktiv human vævstype-plasminogenaktivator

Info

Publication number: DK175366B1
Application number: DK198702881A
Authority: DK
Inventors: William R Arathoon; Stuart E Builder; Anthony S Lubiniecki; Robert D Van Reis
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 2004-09-13
Also published as: IL82746A0; GB2191493A; GR3005245T3; DE3718939C2; HU205171B; PT84991A; DD257087A5; NO872395L; ES2032444T3; NO170595C; JPH0574346B2; PT84991B; NO872395D0; ATE75775T1; FI872526A0; NO170595B; EP0248675B1; ZA874054B; HUT43875A; FR2599625B1

Description

i DK 175366 B1

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktiv human vævstype-plasminogenakti-vator og derivater deraf, især ud fra rekombinante værtscellekulturer i suspension.

5

Opfindelsens baggrund

Human vævstype-plasminogenaktivator omdanner plasminogen til plasmin. Det således producerede plasmin spalter 10 proteolytisk fibrinmatriser, som danner skelettet i blodkoagler. Human vævstype-plasminogenaktivator formidler derved opløsningen af blodkoagler og er som følge heraf nyttige til behandling af forskellige trombotiske forstyrrelser.

15

Forkortelsen "t-PA" for human vævstype-plasminogenaktivator blev vedtaget efter forslag på the XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemo-statis, Bergamo, Italien, 27. juli 1982. I denne beskri-20 velse med krav anvendes betegnelserne "human vævstype-plasminogenaktivator", "human t-PA", ”t-PA", "human vævspiasminogenaktivator” eller "vævsplasminogenaktiva-tor“ human ydre (vævstype) plasminogenaktivator produceret f.eks. ud fra naturlig kilde ved ekstraktion og 25 rensning (se Collen et al., EP offentliggørelsesskrift nr. 41766 {offentliggjort d. 16. dec. 1981 baseret på en første indlevering den 11. juni 1980) og Rijken et al.,

Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning) og 30 ved hjælp af rekombinante cellekultursystemer som beskrevet sammen med molekylets aminosyresekvens og andre egenskaber f.eks. i EP offentliggørelsesskrift nr. 93619 (offentliggjort den 9. november 1983 baseret på en første indlevering den 5. maj 1982), der betragtes som in-35 I DK 175366 B1

korporeret i denne beskrivelse ved henvisning. Betegnel- I

serne dækker også biologisk aktive ækvivalenter til hu- I

man vævstype-plasminogenaktivator, som adskiller sig I

mht. glycosyleringsmønstre, der menes at være afhængige I

5 af de specifikke anvendte dyrkningsbetingelser og arten I

af værten, hvorfra den humane vævstype-plasminogenakti- I

vator er opnået, og som adskiller sig mht. en eller flere aminosyrer i den samlede sekvens.

10 Forskere i ansøgerfirmaets laboratorier producerede hu- H man vævstype-plasminogenaktivator i hovedsagen fri for H proteiner, hvormed den almindeligvis er forbundet, via H rekombinant-DNA-teknologi i prokaryotiske og eukaryo- tiske værter (EP offentliggørelsesskrift nr. 93619, 15 ovenfor). Der er flere grunde til, at foretrække produk- tion af human vævstype-plasminogenaktivator i rekombi- H nante eukaryotiske værter, såsom pattedyrceller. Euka- ryotiske værter er i almindelighed effektive ved deres evne til at genkende og glycosylere specifikke amino- 20 syrerester i den humane vævstype-plasminogenaktivators molekyle, som almindeligvis er glycosyleret i den native tilstand, at frembringe de naturligt forekomne covalente tværbindinger mellem forskellige systeinrester i den hu- mane vævstype-plasminogenaktivators molekyle og at komme I 25 tættere på den samlede konformationsstruktur af nativ human vævstype-plasminogenaktivator. Disse træk menes at være vigtige for fremstillingen af et biologisk aktivt I og sikkert human-vævstype-plasminogenaktivator-produkt.

I 30 Imidlertid er produktionen af human vævstype-plasmino- genaktivator ud fra rekombinante værtsceller ikke uden I problemer. Således har det vist sig, at der opstår ud- I bytte begrænsende vanskeligheder på grund af at celler- ne, der producerer human vævstype-plasminogenaktivator, I 35 3 DK 175366 B1 sædvanlig dyrkes i nærvær af serum, forskellige fraktioner afledt fra blod eller andre dyrevæv eller hydro-lysater deraf. Som konsekvens heraf udsættes human vævs-type-plasminogenaktivator, som secerneres af sådanne 5 celler, for store mængder serumproteiner og andre serumkomponenter. Det viste sig, at visse af disse komponenter uvægerligt komplicere rensningen af en intakt human vævstype-plasminogenaktivator til en farmaceutisk acceptabel form, fordi de danner vanskeligt fraskillelige 10 bundne aggregatkomplekser med den humane vævstype-plas-minogenaktivators molekyle. Disse aggregater skader også det humane vævstype-plasminogenaktivator-moles biologiske aktivitet og reducere således i det store og hele de almindeligt forventede udbytter af biologisk aktiv in-15 takt human vævstype-plasminogenaktivator. Tilsætning af serumkomponenter forøger også den masse af urenheder, som må fjernes under rensning. Endvidere nedbryder mange af disse komponenter vævstype-plasminogenaktivator pro-teolytisk. Oprensning af den ønskede humane vævstype-20 plasminogenaktivator fra disse systemer frembyder tekniske vanskeligheder, hvilket kræver anvendelse af mere omfattende og dyrer procedyrer.

1 overensstemmelse med disse iagttagelser er det blevet 25 foreslået at anvende serumfrie medier i forsøg på at undgå problemer ved produktion og rensning af endogent producerede plasminogenaktivatorer secerneret af dyrkede celler; se f.eks. 1) EP offentliggørelsesskrift nr.

113 319 (offentliggjort d. 11. juni 1984 baseret på en 30 første indlevering d. 30. december 1982), som angiver fremstilingen af serumuafhængige naturlige humane cellelinier, som secernere endogent produceret human vævstype-plasminogenaktivator, 2) US patentskrift nr.

4 232 124, 3) OS patentskrift nr. 4 328 314, 4) OS pa-35 I DK 175366 B1

I I

I tentskrift nr. 4 317 882 og 5) Gasser et al., In Vitro I

I Cellular and Developmental Biology 21_, 588 (1985). Ingen I

H af disse referencer angår højdensitets-cellevækst og I

især ikke rekombinante suspensions-værtscelle-kulturer. I

5 På den anden side angår EP offentliggørelsesskrift nr. I

112 940 (offentliggjort d. 11. juli 1984 baseret på en første indlevering d. 30 december 1982) en fremgangsmåde til fremstilling af human vævstype-plasminogenaktivator, som involvere tilsætning af albumin, en proteinkomponent 10 i serum.

H Der kendes også forskellige midler til fraktionering af H cellekulturer for at fjerne f.eks. serumkomponenter; se H f.eks. Van Reis et al., The Journal of Immunology 133, 15 758 (1984), som reducerede plasmaproteinniveauer fra leukocytcellekulturer og derved reducerede urenheder af råt endogent produceret humant γ-interferon (se også Van

Reis et al., Methods in Enzymology 119, 77). I november 1982 rapporterede Van Reis et al. ved the Third Annual Η 20 International Congress for Interferon Research i Miami,

Florida, U.S.A., vedrørende anvendelsen af tværstrøm- ningsfiltrering for at reducere niveauer autologt plas- | H maprotein ved udvinding af endogent produceret humant γ- interferon fra en human cellekultur. Imidlertid kunne 25 den udvundne mængde interferon ikke forøges med yder- I ligere fjernelse under produktionen.

Det er denne opfindelses formål at angive fremgangsmåde H til produktion i stor målestok og udvinding af biolo- 30 gisk aktiv human vævstype-plasminogenaktivator fra en kultur af human vævstype-plasminogenaktivator-produce- I rende værtsceller. Et yderligere formål for opfindelsen H er at angive sådanne fremgangsmåder til fremstilling af biologisk aktiv human vævstype-plasminogenaktivator, som I 35 - — -:...... TJI - * * II ............ - - ' · ' tWBWWM. CTSSa ' .· a DK 175366 B1 5 er i det væsentlig fri for proteolytisk nedbrydning, de-glycosylering, inhibering på grund af forskellige protease inhibitorer og forurening og aggregation med serumkomponenter.

5

Sammenfatning af opfindelsen t-PA-producerende værtsceller, såsom dem, der er blevet transficeret med rekombinante vektorer, som operabelt 10 huser DNa, der koder for human vævstype-plasminogenak-tivator, dyrkes i et vækstunderstøttende medium, fortrinsvis indeholdende én eller flere komponenter, som, medens den lettere cellevækst er skadelig for udvindingen og aktiviteten af det udtrykte humane vævstype-plas-15 mi nogenaktivator-produkt. 1 det væsentlige alle sådanne komponenter udelukkes før dyrkningen eller fjernes fra det vækstunderstøttende medium ved medium udskiftning, fortrinsvis via tværstrømningsfiltrering, under dyrkningen. Efter fjernelsen bevarer værtscellekulturen ud-20 trykkelsesevnen med eller uden behov for yderligere celler replicering.

Biologisk aktiv human vævstype-plasminogenaktivator produceres derefter ved udtrykkelse i cellerne holdt i 25 værtscellekulturen, som er i det væsentlige fri for skadelige komponenter. Den biologisk aktive humane vævs-type-plasminogenaktivator isoleres derpå fra cellerne før yderligere rensning, som tilpasser til den farmaceutisk indgivning.

30

Det har uventet vist sig, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at fremstille renset intakt human vævstype-plasminogenaktivator i udbytter, som ikke hidtil var troet opnåelige. Endvidere tilvejebringer 35 I DK 175366 B1

I I

I fremgangsmåderne ifølge opfindelsen biologisk aktiv hu- I

man vævstype-plasminogenaktivator med en sammensætning I

I på mindst 50% enkelt-kæde-form i modsætning til det pro- I

I dukt med en sammensætning på væsentlig mindre enkelt- I

I 5 kæde-form, som blev opnået før den foreliggende opfin- I

H delse. Dette menes at være signifikant, foruden at være I

I uventet, da det tyder på, at fremgangsmåderne ifølge op- I

I findelsen frembringer produkt, som er i det væsentlige I

frit for proteolytisk nedbrydning ved forskellige spalt- I

I 10 ningscentre. Endvidere viser materialet, som er overvej- I

ende i enkelt-kæde-form, sig at have mindst den samme I

effektivitet som to-kæde-materiale og udviser mindre fi- I

brinogennedbrydning, resultater, som kan være af vigtig- I

hed ved kliniske anvendelser. I

15 I Detailbeskrivelse I A. Alment 20 I tilfælde af pattedyrværtscellekulturer er de skadelige mediumkomponenter typisk fra blod eller andet dyrevæv afledte proteaser, glycosidaser, såsom neuramididase, protease inhibitorer, albumin osv, som oprindeligt er tilstede i det vækstunderstøttende medium.

25 I

I Betegnelsen "biologisk aktiv human vævstype-plasminogen- aktivator" henfører til den ovenfor beskrevne humane vævstype-plasminogenaktivator, som er i stand til at formidle in vivo opløsningen af fibrinblodkoagler.

30

Betegnelsen "værtscel t-PA-producerende vær ViC-lACl 9 ou^uiu wc»u, uc i U1CVCL transficeret af en udtrykkelsesvektor, operabelt huser DNA, som koder for vævstype-plasminogenaktivator. ' 35

—-"-'•'ιλττμ^βγμρ’ΜΓ" c'-’·· - -1-11:-__'__i^Biyg^F^a’m’·!··· - ί-SrM

DK 175366 B1 7 "Rekombinant-værtscelle-kultur" er en "værtscellekultur·* transficeret med en udtrykkelsesvektor, som operabelt huser DNA, der koder for vævstype-plasminogenaktivator.

"Rekombinant-vær tscel le-suspensionskul tur ’’-sy s terner 5 foretrækkes.

En lang forskellige værtsceller kan anvendes ved udøvelsen af opfindelsen. Egnede værtsceller er fortrinsvis i stand til at transficeres med rekombinante vektorer, som 10 operabelt huser DNA, der koder for human vævstype-plas-minogenakt ivator, og ved udtrykkelse producere biologisk aktiv human vævstype-plasminogenaktivator og er modtagelig for vækst og opretholdelse i suspensionskultur. I overensstemmelse hermed er enhver værtscelle, som pro-15 ducerer t-PA og/eller ved rekorobinant teknik kan bringes til at producere t-PA, inden for opfingelsens omfang.

Værtsceller er fortrinsvis pattedyrceller og inkluderer rekombinante human-vævstype-plasminogenaktivator-secernerende kinesisk-hamster-ovarie-(CHO)-celler (se EP 20 offentliggørelsesskrift nr. 93619, ovenfor) (ATCC nr.

CCL61).

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes værtsceller, som er i stand til at producere human vævstype-2S plasminogenaktivator først som en vækstsuspension i et "vækstunderstøttende medium". Dette vækstunderstøttende medium kan være ethvert inden for faget kendt standard medium eller variationer deraf, som er i stand til at understøtte en kultur af den bestemte cellelinie, som 30 anvendes til at fremstille humant vævstype-plasminogenaktivator [se f.eks. ATCC Media Handbook, Ed: Cote et al., American Type Culture Collection, Rockville, MD, U.S.A. (1984)). Et vækstunderstøttende medium for pattedyrceller indeholder f.eks. fortrinsvis et serumsup-35 I DK 175366 B1

I I

piement, såsom fetalt kalveserum, eller en anden supple- I

B rende komponent, der almindeligvis anvendes til at lette I

B cellevækst og -deling, såsom hydrolysater af dyrekød el- I

B ler mælk, væv eller organekstrakter, mascererede koagler I

B 5 eller ekstrakter deraf osv. Det indledende vækstunder- I

B støttende medium kan også være et medium, som muliggør I

B vækst og opretholdelse af værtscellerne og udtrykkeisen I

B af human vævstype-plasminogenaktivator. Desuden kan der I

B anvendes et standard vækstmedium, som er deficient mht. I

B 10 glycin og/eller hypoxanthin og/eller thymidin og/eller I

B indeholdende methotrexat, til at opretholde selektivt B tryk på rekombinante CHO-celler indeholdende en udtryk- B kelsesvektor, der er i stand til at udtrykke human vævs- B type-plasminogenaktivator, såvel som dihydrofolatreduk- B 15 tase med en lav bindingsaffinitet for methotrexat. Andre B selekterbarer og/eller forstærkelige markører kan også B anvendes. Andre egnede mediumkomponenter inkluderer B f.eks. transferin, insulin og forskellige metaller.

B 20 1 en udførelsesform sker der, efter at værtscellerne er B vokset til en passende celledensitet, f.eks. fra omkring B l:10€/ml til omkring 3 x 107/ml for CHO-celler, en fjer- B nelse af de skadelige komponenter i det vækstunderstøt- B tende medium ved mediumudskiftning fortrinsvis via B 25 "tværstrømsfiltrering". Tværstrømsfiltrering henfører B til en filtreringsmåde, hvorved en suspension af human- B vævstype-plasminogenaktivator-producerende celler strøm- mer i det væsentlige parallelt med et filter, som er B permeabelt for en anden komponent i suspensionen end B 30 celler.

B Tværstrømsfiltreringsprocessen er karakteriseret ved et B sæt strøroningsdynamiske parametre, herunder Re = Rey- B nolds tal, = vægforskydningshastighed, ΔΡ = trykfald I 35 9 DK 175366 B1 og TMP = transmembrantryk. Re, yw og ΔΡ vil afhænge af filtreringssystemets geometri, strømningsbetingelserne og væskeegenskaberne· Hvis der f.eks. anvendes et hul-fiber-filtreringssystem, kan man udregne disse parametre 5 som følger:

Re = 2pQs/nsmirh Yw = 4Qs/nurhJ ΔΡ = 8QsLns/nwrh'’ 10 hvor p = cellesuspensionsdensiteten, Qs = suspensionsrecirkuleringshastitheden, gs = suspensionens viskositet, n = antallet af hylfibre, R^ = hulfibrens indre radius og L = hulfiberlængden. Lignende ligninger kan af-15 ledes for andre strømningsvejgeometrier. Det gennemsnitlige transmembrantryk kan udregnes som:

TMP = Pjn-Pf-AP/2 = QfRgf7/A

20 hvor Pin = indløbstryk, Pf = filtrattryk, Qf = filtreringshastighed, R = membranmodstand, A = membranareal og η = filtratsviskositet. I en foretrukken udførelsesform vælges strømningsvejgeometrien og arbejdsparametrene således at celleaflejringen på filtreringsmembranen mini-25 meres, hvorved effektiviteten af separationsprocessen forhøjes, og den forskydningsinducerede cellebeskadigelse formindskes. Celleaflejringen kan bestemmes empirisk som: 30 DP = ν^^λ/Γ^Ύ3/2 hvor DP = aflejringsparameter, v = kinetisk viskositet, U = filtreringshastighed, λ = empirisk funktion af cellekoncentration, Cc, og rc = celleradius. Dermed vil 35

I DK 175366 B1 I

I 10 I

I tværstrømsfiltreringsprocessen blive defineret ved cel- I

I lesuspensionen (p, ns, nf, v, Cc og rc), valg af mem- I

I bran- og strøroningsgeometri n, r^, L, R og A) og sty- I

I ringen af arbejdsparametre (Qs og Qf). 1 en foretrukken I

I 5 udførelsesform vælges strømningsvejgeometrien og ar- I

I bejdsbetingelserne således, at Re < 2100, og DP < 0,35. I

I Koncentrationen af skadelige komponenter reduceres ved I

I en tværstrømsfiltreringsproces, hvorved cellesuspensi- I

I 10 onen recirkuleres igennem filtreringsapparatet, og en I

portion af strømmen tages fra som cellefrit filtrat. Et I

I konstant cellesuspensionsvolumen kan opretholdes ved I

I tilsætning af medier, som ikke indeholder skadelige koro- I

ponenter. Den endelige restmængde af skadelige komponen- I

I 15 ter kan udregnes som: I

I (-vm/vx) I

I CDVxe I

I cp= I

20 Vp I

I hvor Cp = koncentration af skadelige komponenter i pro- I

duktionssuspensionen, C0 = begyndelseskoncentration af I

I skadelige komponenter i cellevækstsuspensionen, Vx = I

I 25 volumen af cellesuspension under medieudskiftning, e = I

I grundtallet for naturlig logoritme, Vm = volumen af ud- I

skiftningsmedie og Vp = endeligt volumen af produktions- I

I suspensionen. Det volumen af udskiftningsmedie, som kræ- I

I ves til at reducere koncentrationen af skadelige kompo- I

I 30 nenter til et forud fastsat niveau, kan udregnes som I

I Vm = Vxln(C0Vx/CpVp)

I 35 I

11 DK 175366 B1 hvor ln = naturlig logoritme. Det er klart ud fra denne ligning, at en foretrukken udførelsesform af denne opfindelse vil involvere en begyndelseskoncentration af cellesuspensionen til en minimal værdi Vx før den før-5 nævnte medieudskiftning med konstantvolumen. Reduktion af koncentrationen af skadelige komponenter gennemføres og ledes ved I) koncentrering af cellevækstsuspensionen fra den oprindelige volumen VQ til Vx; II) gennemførelse af medieudskiftning ved konstant volumen og III) yder-10 ligere reduktion, hvis Vx < Vp.

1 Hvis f.eks. volumenet af startcellekulturen før medium udskiftning er 100 liter, kan der opnås en samlet 10 000 ganges reduktion i koncentrationen af skadelige kompo-15 nenter ved koncentrering af cellesuspensionen til 10 liter, gennemførelse af en medieudskiftning under anvendelse af 45 liter medium og anvendelse af et produktionsvolumen på 1000 liter. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Det er således muligt kvantitativt at bestemme fortyn 2 dingsfaktoren af det indledende vækstunderstøtningsme 3 dium under mediumudskiftning således, at mængden af de 4 skadelige komponenter i den resulterende værtscellesjus- 5 pension er under en forudfastsat koncentration, hvorved 6 de skadelige virkninger af sådanne komponenter minime 7 res. Sådanne fortyndingsfaktorer kan bestemmes for hver 8 tjarch af vækstmedium. F.eks. kan pattedyrvækstmedier 9 suppleret med forskellige koncentrationer af serum kræve 10 forskellige fortyndingsfaktorer for at reducere mængden 11 af uønskelige komponenter til funktionel ækvivalente 12 koncentrationer, som tillader produktionen af farmaceu 13 tisk acceptabel human vævstype-plasminogenaktivator. 1 14 overensstemmelse hermed kan fortyndingsfaktoren, vælges 15 således, at mængden af serum i det endelige pattedyrcel- 16 I DK 175366 B1 I 12

I 3eudtrykkelsesmedium f.eks. er mindre end ca. 1% af den I

totale, som blev anvendt fra starten. De her anvendte I

filtreringsmembraner kan udvælges blandt alle de inden I

for faget kendte, som har en egnet membran og konfigura- I

5 tion, således at de er i stand til at tilbageholde de I

human-vævstype-plasmi nogenak ti vator-producerende celler I

ifølge opfindelsen, medens de tillader de forskellige I

skadelige komponenter at passere igennem. Således kan

man anvende enhver egnet membran, som muliggør tilbage- I

10 holdeisen af celler under de valgte væskedynamiske be- tingelser, medens den tillader de skadelige komponenter

I at passere igennem til fjernelse. En øvre grænse for I

porestørrelse på omkring S pm og en nedre grænse på om- kring 0,1 pm vil være egnede.

I 15

Det friske udskiftningsmedium er i det væsentlige frit for de skadelige komponenter. F.eks. indeholder det ingen væsentlige mængder af sådanne skadelige komponen- ter som proteaser, neuramedidaser, protease inhibitorer I 20 osv. Et sådant medium vil selvfølgelig variere med den celletype, som anvendes til at producere human vævstype- plasminogenaktivator, og kan f.eks. vælges blandt dem, som er til rådighed inden for faget. Det kan være det samme som det endelige udtrykkelsesmedium (af nemheds- 25 grunde) eller et eller andet mindre rigt medium, såsom I et pufret isotonisk saltopløsningsmedium.

Til de her beskrevne human-vævstype-plasminogenaktiva- tor-producerende CHO-celler kan det endelige udtrykkel-^1 30 sesmedium f.eks. dannes ud fra et standard medium til I dyrkning af CHO-celler, som ikke suppleres med fetalt I kalveserum. Et eks. på det endelige udtrykkelsesmedium I er en blanding af lige dele Delbecco-modificeret Eagles medium (højglucose) og Ham's F-12 medium.

I 35 ^- . ——— ......- v-r gr -fia DK 175366 B1 13 1 andre udførelsesformer kan de skadelige komponenter udelukkes eller i det væsentlige udelukkes før dyrkningen, eller de kan fjernes, f.eks. ved centrifugeringseller udfældningsteknik.

5

Den humane vævstype-plasminogenaktivator isoleres og renses derpå fra udtrykkelsesmediet og anvendes som farmaceutisk middel til behandling af forskellige vaskulære tilstande eller sygdomme.

10 B. Foretrukken udførelsesform I en foretrukken udførelsesform dyrkes CHO-celler, som er i stand til at producere human vævstype-plasminogen-15 aktivator, som en suspension i et CHO-medium suppleret med fetalt kalveserum til en forud fastsat celledensitet. Cellesuspensionen koncentreres derpå ved tværstrømsfiltrering. Serumet fjernes derefter fra den koncentrerede suspension ved tværstrømsfiltrering, medens 20 der kontinuert tilsættes serumfrit medium med samme hastighed som serumholdigt medium fjernes. Aktiv human vævstype-plasminogenaktivator produceres derefter af CHO-cellerne suspenderet i det serumfrie udtrykkelses-medium. Den således producerede humane vævstype-plasmi-25 nogenaktivator secerneres af CHO-cellerne til udtrykkelsesmediet og kan separeres fra dette ved standard teknik .

„ Dyrkningsbeholdere af forskellige kapaciteter anvendes 30 til at dyrke suspensioner af CHO-celler. Hver dyrkningsbeholder forbindes via indløb med en række porøse tangentielstrømsfiltre, som igen er forbundet via udløb tilbage til dyrkningskaromeret. Efter væksten pumpes suspensionerne af CHO-celler og medium indeholdende serum 35 I DK 175366 B1

igennem rækken af porøse tangentialstrømsfiltre først I

for at koncentrere suspensionen og derefter for at til- lade fjernelse af serumkomponenterne fra suspensionen under mediumudskiftning· CHO-cellesuspensionen recirku- 5 leres igennem filtrerne og dyrkningsbeholderne, hvilket muliggør fjernelse af en portion af det gamle medium og serumkomponenter. En forsyning af frisk sterilt udtryk- kelsesmedium, som ikke indeholder serum, sættes til cel- lesuspensionen for at opretholde et nominelt volumen i H 10 dyrkningsbeholderen. Efter at serumkoncentrationen er H blevet reduceret på denne måde til en forud fastsat kon- centration ved kontinuert medium udskiftning, overføres H cellerne via seriliserede rør til en andenbeholder inde- holdende serumfrit udtrykkelsesroedium, hvori der secer- 15 neres human vævstype-plasminogenaktivator. Derefter kan den humane vævstype-plasminogenaktivator udvindes ved standard teknik.

C. Eksempler I 20 ' I Cellevækst, mediumudskiftninq og produktionsfaser I Kinsisk-Hamster Ovary (CHO)-celler (ATCC nr. CCL61), I transficeret med udtrykkelsesvektoren pETPFR (se EP of- I 25 fentliggørelsesskrift 93619 ovenfor) og derfor udtryk- I kene rekombinant t-PA, blev genoplivet fra opbevaring over flydende nitrogen og dyrket i medium bestående af I 1:1 blanding af Ham's F-12 og Dulbecco-modificeret I Eagle-medium. Blandingen indeholdt ikke hypoxanthin I 30 eller thymidin. Dialyseret eller diafiltreret fetalt I okseserum (7 vol. %) og methotrexat (til 500 nM) sattes I til mediet. Cellerne blev dyrket i suspensionskultur i glasbeholdere inkuberet ved omkring 37 °C. Celler blev subdyrket, og populationen expanderet i dette medium for I 35 15 DK 175366 B1 hver 3-5 dage. Når der var akkumoleret tilstrækkeligt celler, blev de overført til en 10 liters fermenter af rustfrit stål til en yderligere vækstperiode på omkring 3 dage. Til denne vækstfase blev mediesammensætningen 5 ændret til at give bedre celleudbytter og indeholdte både hypoxanthin og thymidin, men intet methotrexat. I dette medium blev der inkorporeret udialyseret fetalt okseserum (200 vol. %) og under den 3 dages vækstfase forøgedes cellepopulationsdensiteten fra omkring 0,25 x' 10 106 celler/mL til omkfing 1,0 x 106 celler/mL.

Cellerne blev derpå udsat for mediumudskiftning soro beskrevet ovenfor, idet de blev resuspenderet i serumfrit produktionsmedium i omkring 90 timer. Mediumudskift-15 ningen blev frembragt som følger:

Et hulfiber-tangentialstrømsvigter og dermed forbundne indløbs- og udløbsiliconegummirør blev steriliseret i en autoklav og derpå forbundet med 10 liters produktions-20 beholderen via dampsteriliserbare forbindelser. Det anvendte filter var en polysulfon-hulfiberenhed {Fremstiller: A.G. Technology, Inc., filter No. 1BZE100801AL) indeholdende 280 hulefibre med 0,75 mm indre diameter og numinelt 0,1 ym porer langs deres længder. Denne enhed 25 havde et filtreringsarealt på 0,386 m*. Cellerne blev recirkuleret i igennem de hule fibre og tilbage til beholderen ved anvendelse af en Watson Marlow to-labs-pum- pe. Der anvendtes en recirkuleringshastighed på omkring 3,5 liter/min., og samtidig blev en portion af væsken 30 omtrukket og smidt væk som et klart filtrat med en hastighed på ..omkring 211 ml/min. På denne måde blev cellerne tilbageholdt, og kulturvoluminet reduceret til omkring 5,2 liter. Ved dette tidspunkt blev frisk sterilt serumfrit medium (af samme sammensætning som an-35 I DK 175366 B1 I 16 vendt tidligere, men uden indhold af okeserum eller kom- ponenter afledt fra det) pumpet ind i dyrkningsbeholde- H ren med en hastighed på omkring 211 ml/min., hvorved vo- luminet holdtes konstant, medens det gamle medium blev H 5 fortyndet ud.

55 liter frisk serumfrit medium blev pumpet igennem sy- stemet til opnåelse af en beregnet reduktion i serumkon- H centrationen på omkring 190 000 gange eller mindre end H 10 0,0001 vol. %, når en aliquot af cellesuspensionen sat- tes til frisk serumfrit medium i en separat 10 liters H fermenter af rustfrit stål. Cellerne blev derpå inku- beret i produktionsfasen i omkring 90 timer ved 37 °C.

Prøver blev udtaget fra kulturen, klaret ved centrifu- 15 gering og opbevaret ved -20 °C til efterfølgende ana- lyse.

I et andet eksempel, soro blev kørt parallelt, var alle de anvendte betingelser celler og medier magen til und- I 20 tagen hulfilteret. I dette tilfælde indeholdt filteret 290 hule filtre og havde et filtreringsareal på 0,40 m2, roen var i øvrigt magen til det, der er beskrevet ovenfor (Fremstiller: A.G. Technology, Inc., filter No. 1810902 AL).

Analysemetoder.

Prøver blev behandlet og analyseret for at påvise de I skadelige virkninger af okseserum på t-PA produceret af 30 de i disse eksempler anvendte CHO-celler. Prøver af den klarede cellekulturvæske fra den serumfrie produktions- I fase blev optøet, reduceret med β-mercaptoethanol og un- I derkastet S.D.S. elektrophorese under anvendelse af det I diskontinuerte laemmli-system (Laemmli, Nature, 227, 35 17 DK 175366 B1 680, (1970)). De på denne måde separerede proteiner blev underkastet sølvfarvning(Morrissey, Anal. Biochem. 117, 307, (1981)) eller blev overført til et nitrocellulose ark (overførsel i 4 timer ved 8 °C og 0,5 A på 0,45 um 5 nitrocellulose under anvendelse af metoden beskrevet af:

Towbin et al., PNAS 76, 6350, (1979)). t-PA-proteinerne, proteinfragmenter og komplekser med høj molekylvægt indeholdende t-PA blev visualiseret på nitrocellulosearket ved en indirekte enzymforbundet i monoprøvnings-10 teknik beskrevet som følger: en indledende reaktion med de bundne t-PA-proteiner og kanin-anti-t-PA-antistof blev efter fulgt af behandling med et andet antistof.

Dette var et peberrodperoxidase-forbundet anti-kanin-IgG (dannet i geder). Efter denne reaktion resulterede til-15 sætning af chromophoren 4-Cl-nathol i H2O2 og PBS i farveudvikling i områderne af bundet antistof, hvilket viser de elektrophoretiske mønstre af t-PA og forbundne proteiner. Ved anvendelse af disse teknikker kunne t-PA'ens tilstand i de rå dyrkningsvæsker således bestem-20 mes uden yderligere rensning.

Resultater

For at påvise de skadelige påvirkninger af fetalt okse-25 serum på t-PA blev prøver fra produktionsfasen inkuberet med phosphatpufret saltoplønsing (PBS) eller med 0,175 vol. % eller 1,75 vol. % fetalt okseseruro i 22 timer eller 46 timer, før de blev analyseret som beskrevet ovenfor. Resultater åf dette er vist i den sølvfarvede 30 gel i fig. 1 og den tilsvarende immuafdupning i fig. 2.

Fig. 1 er en sølvfarvet gel af t-PA-prøver opnået som beskrevet ovenfor.

35 I DK 175366 B1 I 18

Fig. 2 er en immunoafdupning af en identisk gel vist i I

I fig. 1. I

I figurene viser I

Is

Bane nr. Prøve I

1 Molekylevægtstandarder [92,5 kilodalton I

(K), 66,2K, 45K, 31K, 21,5K, 14,4K) 10 2 Autentisk t-PA-referencestandarder I 3 Cellekulturvæsker indeholdende t-PA (labo- ratoriereference) 15 4 Cellekulturvæske fra produktionsfase-prøve 5 Produktionsfase-prøve; inkuberet i 22 timer ved 37 °C med phosphat pufret saltopløsning I (PBS).

I 20 I 6 Produktionsfase-prøve; inkuberet i 46 timer I ved 37 °C med PBS.

I 7 Tom bane I 25 I 8 Produktionsfase-prøve; inkuberet i 22 timer I ved 37 °C med 0,175 vol.% fetalt okseserum (FBS).

30 9 Produktionsfase-prøve; inkuberet i 46 timer I ved 37 °C med 0,175 vol.% FBS.

I 10 0,175 vol.% FBS alene; inkuberet i 22 timer I ved 37 °C.

I 35 19 DK 175366 B1 lj 0,175 vol. % F'BS alene; inkuberet i 46 timer ved 37 °C.

12 Produktionsfase-prøve; inkuberet i 22 timer 5 ved 37 °C med 1,75 vol.% FBS.

13 Produktionsfase-prøve; inkuberet i 46 timer ved 37 °C med 1,75 vol.% FBS.

10 14 1,75 vol.% FBS alene; inkuberet i 22 timer ved 37 °C.

15 1,75 vol.% FBS alene; inkuberet i 46 timer ved 37 °C.

15 I fig. 1 og 2 er banerne 2 og 3 t-PA-referencestandarder (hvor enkelt-kæde-t-PA viser sig som båndet ved høj molekylvægt og 2-kæde-t-PA viser sig som båndene ved den lavere molekylvægt).

20

De iagttagne skadelige virkninger af at have fetalt okseserum (FBS) tilstede er a) at forårsage en forsvinden af intakt t-PA med en ledsagende opsamling af forskellige proteolytisk spaltede former og fragmenter 25 deraf (se banerne 8 og 9 i fig. 2) og b) dannelsen af kompleks materiale med højere molekylvægt i området 90-200 kilodalton (se banerne 12 og 13 i fig. 2.

Resultaterne viser, at når den serumfrie cellekultur-30 væske, opnås som beskrevet ovenfor under "cellevækst, mediumudskiftning og produktionsfaser", blev inkuberet i nærvær af PBS i 22 eller 46 timer, forblev den i det væsentlige uændret (se banerne 5 og 6 i fig. 1 og 2).

Derimod sker der både proteolytisk nedbrydning og dan-35 I DK 175366 B1

I 20 I

nelse af komplekser af t-PA med høj molekylvægt, hvis I

fetalt okseserum får lov til at blive i produktionsfase- I

cellekulturmediet. Fjernelse af serum ved den her be- I

skrevne mediumudskiftningsproces fjerner i det væsent- I

I 5 lige dets skadelige virkninger. I

I 10 I

I 15 I

I 20 i

I 25 I

30 I

35 I

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af biologisk aktiv vævstype-plasminogen-aktivator i en rekombinant-værts-celle-kultur, sora er i stand til ved rekombinant-ekspres-10 sion at producere biologisk aktiv human vævstype-plasminogen-aktivator, kendetegnet ved, at a) rekombinant transficerede værtsceller i suspensionskultur dyrkes i et vækstunderstøttende medium, som mulig- 15 gør væksten og opretholdelsen af værtscellerne, b) komponenter i dyrkningsmediet, som er skadelige for udvindingen og den biologiske aktivitet af den humane vævstype-plasminogen-aktivator, fjernes fra mediet under 20 bevarelse af værtscellernes ekspressionsevne ved hjælp af en tværstrømsfiltreringsproces karakteriseret ved et sæt af fluiddynamiske parametre under anvendelse af et filtreringsapparat med en egnet membran, således at cellesuspension recirkuleres gennem filtreringsapparatet, og 25 en portion af mediet fjernes som cellefrit filtrat, idet den homogene karakter af cellekultursuspensionen bibeholdes, c) filtrat erstattes med et medium uden komponenter, som 30 er skadelige for udvindingen og den biologiske aktivitet af human vævstype-plasminogen-aktivator, d) den biologisk aktive humane vævstype-plasroinogen-akti-vator isoleres fra den mediumudskiftede kultur, 35 _ I DK 175366 B1 I - 22

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tværstrømsfiltreringen gennemføres over en flad filtreringsmembran. |

3. Fremgangsmåde ifølge krav l,kendetegnet ved, at tværstrømsfiltreringen gennemføres over væggen af H en porøs hul fiber.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at tværstrømsfiltreringen gennemføres over en spi- ralopvundet membran.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de vækst- og cellereplicerings-understøttende 15 mediumkomponenter er afledt fra blod eller væv eller de- rivater deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet H ved, at værtscellerne omfatter pattedyrceller, som er i 20 stand til at producere human vævstype-plasminogen-aktiva- tor.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at pattedyrcellerne omfatter rekombinant transfice- I 25 rede CHO-celler.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtscellerne indeholder en ekspressionsvektor, som er i stand til at udtrykke human vævstype-plasmino- 30 gen-aktivator og en opformérbar markør, og at cellerne dyrkes i et medium valgt således at der opretholdes se- lektionstryk til gunst for celler, der indeholder multi- pie kopier af den opformérbare markør, forud for trin I (d). I 35 DK 175366 B1

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den opformérbare markør er dihydrofolatreductase med lav bindingsaffinitet for methotrexat, og at mediet 1 valgt således, at der opretholdes selektionstryk, inde- 5 holder methotrexat.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tværstrømsfiltreringsprocessen er karakteriseret ved en celledeponeringsparameter, DP, og et sæt af fluid- 10 dynamiske parametre, som inkluderer Reynolds tal, Re, og at cellesuspensionen, apparatet og apparatets driftsbetingelser vælges således, at Re er mindre end 2100, og DP er mindre end 0,35. 15 20 25 « 1 35