DK175413B1 - Nucleotidsekvens kodende for et polypeptid relateret til kvægdiarré, rekombinant ekspressionssytem for polypeptidet, vektor og værtscelle omfattende systemet, selve polypeptidet, vaccine mod kvægdiarré omfattende polypeptidet, - Google Patents

Description

i DK 175413 B1

Opfindelsen angår en nucleotidsekvens, der koder for et til kvægdiarré relateret polypeptid, altså et vi-ralt polypeptid. Opfindelsen angår yderligere et rekom-binant ekspressionssystem, der i en forligelig værtcelle • 5 er i stand til at foretage produktion af et til kvægdi arré relateret polypeptid, og en rekombinant vektor og rekombinante værtceller. Derudover angår opfindelsen selve polypeptidet og en vaccine, der er effektiv mod kvægdiarrévirus samt fremgangsmåder til fremstilling af 10 henholdsvis polypeptidet og vaccinen. Endelig angår opfindelsen anvendelser af henholdsvis polypeptidet og vaccinen.

Sygelighed og dødelighed forårsaget af kvægdiar-ré-virus (BDV, "bovine diarrhea virus") blandt malke-15 kvæg og okser er et overalt i verden uløst økonomisk problem. En subklinisk form karakteriseret ved høj sygelighed og lav dødelighed er endemisk og er forbundet med nedsat respiratorisk evne, neonatal diarré, ulcerationer i fordøjelseskanalen, immunodeficiens og, hos kalvebæ-2o rende køer, abort og teratogenese. Sygdommen kan erkendes hos kalve, men voksne bærere er vanskelige at identificere.

En akut form af sygdommen skyldes infektion af foetus inden for de første tre graviditetsmåneder. Forløbet af denne form af sygdommen er snigende. Kalvene 25 kan overleve den første infektion, men de, der overlever, bliver immunotolerante og udskiller levende vira.

De kan ikke overleve en anden infektion. Da deres egenskab som bærere ikke kan påvises ved titrering af deres sera, er disse dyr ansvarlige for spredning af sygdommen 30 fra bestand til bestand.

BDV inficerer også svinebestande. Hos svin er det vigtigt at skelne mellem, om dyrene er inficeret med BDV eller svinekolera-virus, da svinekolera er en økonomisk I DK 175413 Bl

vigtig sygdom» mens kvægdiarré-infektion er af forbi- I

gående betydning og i de fleste tilfælde kan ignoreres. I

I Svin inficeret med kolera skal slagtes, og da nuværende I

I diagnosemetoder for svin ikke kan skelne mellem disse to I

I 5 infektionstyper, må svin, der i virkeligheden kun er in- I

I ficeret med BDV, også tilintetgøres. I

I Nuværende påvisningsmidler for BDV-infektion hos I

kalve er ligeså mangelfulde, idet de er baseret på ti- I

trering for antistoffer i sera, hvilken titrering ikke I

I kan påvise de immunotolerante kalve. Der ønskes således I

en diagnosemetode, der er i stand til både at påvise I

tilstedeværelse af virus'en hos nyfødte dyr med kroniske I

I infektioner og at skelne mellem svinekolera-virusinfek- I

tion og BDV-infektion. Dette kunne opnås enten ved at I

anvende antistoffer med høj affinitet og specificitet I

I 15 for virus—partiklerne eller ved at anvende oligomere I

I nucleinsyreprober, der har evnen til specifik hybridi- I

I sering til de virale sekvenser. I

I Foruden behovet for forbedrede diagnostica er der I

I for nærværende heller ingen effektiv vaccine, der er I

I 20 gunstig til at hindre spredning af sygdommen forårsaget I

af BDV. Det er ønskeligt, at en sådan vaccine skal til- I

I vejebringe langvarig immunitet, ikke vil inficere foetus I

I hos det inokulerede dyr og ikke har uønskede bivirknin- I

I ger, såsom inducering af immunotolerance over for vi- I

rus'en eller depression af immunsystemet. Disse karakte- I

I ristika er vanskelige om ikke umulige at opnå hos en I

I svækket eller dræbt virusvaccine. Sådanne vacciner ud- I

I gør for størstedelens vedkommende teknikkens stade I

I (Saurat, P., et al., "La Maladie des Muqueuses" (1972), I

I side 229-251. L'Exapansion scientific francaise, Paris). I

I 30 Nyligt har Fernelius, A.L., et al., (Am. J. Vet. Res. I

I (1971) 32: 1963-1979) rapporteret om en vaccine frem- I

DK 175413 Β1 3 stillet ud fra et højmolekylært opløseligt antigen vundet ved vægtfyldegradient-centrifugering fra BDV-virue dyrket i embryoniske kvægnyreceller.

De på området anvendte veje til påvisning af og 5 beskyttelse mod viral kvæg-diarré har været i høj grad empiriske og har ikke gjort brug af forfinet kendskab til arten af den vektor, der forårsager sygdommen. Kvæg-diarré-virus'en er imidlertid, sammen med svinekolera-virus og tilgrænsende sygdomsvira, blevet klassificeret 10 som en pestivirus, der tilhører familien Togaviridae (Poxrterfield, J.S., "The Togavirions, Biology, Structure, Replication", Schlesinger, W., Ed. (1980), Academic Press, side 17-24).

I analogi med andre togavira skulle disse vira indeholde et kapsidprotein og to eller tre membran-gly-coproteiner (Horzinet, M.C., Non-arthrpod-borne Toga-viruses (1981), Academic Press, London), Epitoper, der er i stand til at fremkalde antistoffer forbundet med neutralisation og beskyttelse mod infektion, forventes at være indeholdt i membran-proteinerne (se f.eks. Bo- 20 ere, W., et al., J. Virol. (1984) 52:572-582). Pestivira er også karakteriseret ved-opløselige antigener, der er omtrent 80 kD proteiner. Et 76 kD protein fra BDV har faktisk været anvendt som en forsøgsvaccine (Fernelius, A.L., et al., supra).

25 Opfindelsen tilvejebringer cDNA-kopier af den to tale genomiske RNA-sekvens fra kvægdiarré-virus. Dette gør hele repertoiret af peptider syntetiseret af virus'en tilgængelig og gør det muligt at fremstille proteiner, der indeholder epitoper, som er effektive og 30 specifikke i henseende til at udvikle ønskede antistoffer og tilvejebringe celler, der er egnede for fremstilling af monoklonale antistoffer. Den primære struktur af genomet tilvejebringer også den nødvendige information

I DK 175413 B1 I

I 4 I

I til at kunne konstruere oligoraere sekvenser, der er an- I

I vendelige som diagnostiske prober. I

I Proteinprodukterne er således i stand til at tje- I

I ne som vacciner til beskyttelse af dyr, der er genstand I

I ^ for infektion med denne virus, mod efterfølgende sygdom. I

I Rådigheden over hele genomet giver mulighed for frem- I

I stilling af effektive proteiner, såsom større virionkom- I

I ponenter og individuelle virion-underenheder, der ville I

I være utilgængelige ved anvendelse af "nativ" produk- I

I tionsteknik, dvs. fra viral infektion af vævdyrkede cel- I

I 10 ler. I

I I overensstemmelse hermed er den ovenfor definere- I

I de nueleotidsekvens ifølge opfindelsen ejendommelig ved, I

I at den er en region af den genetiske sekvens for kvægdi- I

I arrévirus vist på figur 2 eller en kombination af regio- I

I 15 ner i denne sekvens. Hvis den omhandlede nucleotidse- I

I kvens er defineret ved, at den koder for et viralt poly- I

I peptid, er den ejendommelig ved, at dette i det væsent- I

I lige er identisk med det, der kodes for af den genomiske I

I sekvens for kvægdiarrévirus vist på figur 2. Det rekom- I

I 20 binante ekspressionssystem ifølge opfindelsen er ejen- I

I dommeligt ved, at systemet omfatter en DNA sekvens som I

I ovenfor defineret som en nucleotidsekvens, der operativt I

I er forbundet til en med værten forligeligt kontrolse- I

I levens. I en foretrukken udførelses form findes opstrøms I

I 25 for nævnte DNA sekvens og i læseramme hermed en fusione- I

I ret nucleotidsekvens kodende for et værtprotein eller en I

I del deraf. Den rekombinante vektor ifølge opfindelsen er I

I ejendommelig ved, at den omfatter ovennævnte ekspressi- I

I onssystem. De rekombinante værtceller ifølge opfindelsen I

I 3 0 er ejendommelige ved, at de er transformeret med oven- I

I nævnte vektor eller med en vektor omfattende den ovenfor

I definerede foretrukne udførelsesform for det opfinde- I

I riske eksperssionssystem. Polypeptidet ifølge opfindel- I

5 DK 175413 B1 sen er ejendommeligt ved, at det i det væsentlige er identisk med hele aminosyresekvensen som vist på figur 2 eller med en region eller kombinationer af regioner deraf. I en foretrukket udførelsesform er polypeptidet 5 ifølge opfindelsen yderligere fusioneret med et værtprotein eller en del deraf. Den ovenfor definerede vaccine mod kvægdiarrévirus er ejendommelig ved, at den omfatter polypeptidet ifølge opfindelsen samt farmaceutisk acceptable excipienser og i en foretrukket udførelsesform 10 yderligere en immunogen partikel som defineret i underkravene på vaccinen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et polypeptid ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker værtceller ifølge opfindelsen og udvinder 15 det rekombinante polypeptid. Endvidere er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af en vaccine ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man udøver ovennævnte fremgangsmåde og foretagere en yderligere tilsætning af farmaceutisk acceptable excipienser.

20 Et opfinderisk polypeptid kan ifølge opfindelsen anvendes til fremstilling af prøvesæt til immunologisk påvisning af fusionsproteiner af kvægdiarrévirus. Og en opfinderisk nucleotidsekvens kan ifølge opfindelsen dels anvendes til konstruktion af som diagnostiske sonder 25 nyttige oligonucleotidsekvenser, og dels anvendes til fremstilling af en vaccine, der som bærer omfatter levende viral vektor, der tillader ekspression af et ønsket kvægdiarrévirusantigen sammen med et protein fra bæreren i inficerede celler.

30 I det følgende beskrives opfindelen med henvis ning til tegningerne, på hvilke:

I DK 175413 B1 I

I I

I Fig. 1 viser kortet over overlappende segmenter I

I af cDNA, der tilsammen udgør hele BDV-genom-sekvensen, I

og cDNA-fragmenter anvendt til at konstruere E. coli- I

I ekspressionsvektorer, og I

I 5 Fig. 2 viser den fuldstændige nucleotidsekvens I

I for BDV-genomet, cDNA'et indeholder den identiske se- |

kvens med den undtagelse naturligvis, at T vil erstatte I

U. Den reducerede aminosyresekvens, baseret på den åbne I

læseramme, og bekræftet ved ekspression af segmenter, er I

10 også vist. I

I Odførelsesformer for, opfindelsen» I

I A. Definitioner I

Anvendt i nærværende beskrivelse skal en nucleo- I

tidsekvens "i det væsentlige identisk" med det eksempli- I

I 15 ficerede BDV-genom referere til en sekvens, der bevarer I

de afgørende egenskaber af det eksemplificerede poly- I

I nucleotid. Et specifikt, men ikke-begrænsende eksempel på sådan substantiel ækvivalens ville være repræsenteret I af en sekvens, der indkoder den identiske eller i det 20 væsentlige identiske aminosyresekvens, men som, på grund af codon-degeneration, gør brug af andre specifikke co- doner. Nucleotid-forandringer er i virkeligheden ofte ønskelige for at skabe eller udelade restriktionssteder, tilvejebringe oparbejdningssteder eller ændre aminosyre- I 25 sekvensen på måder, der ikke ugunstigt påvirker funktio- I nalitet. "Nucleotidsekvens" refererer både til en ribo- I nucleotid- og en deoxyribonucleotid-sekvens og omfatter den positive streng, som vist, og også den negative streng.

I 30 En DNA-sekvens "afledt af" nucleotidsekvensen, I der omfatter BVD-genomet, refererer til en DNA-sekvens, I der er omfattet af en region af den genomiske nucleotid- sekvens eller en kombination af regioner af nævnte se- I kvens. Disse regioner er ikke nødvendigvis fysisk af- I 35 ledt af genets nucleotidsekvens, men refererer til poly- • 7 DK 175413 B1 nucleotider udviklet på en hvilket som helst måde, og som har den samme eller "i det væsentlige identiske" sekvens af baser som den, der foreligger i den eller de regioner, af hvilke(n) polynucleotidet er afledt. For 5 eksempel omfatter typiske DNA-sekvenser "afledt af" BDV-genomet fragmenter, der indkoder specifikke epito-per, fragmenter, der indkoder dele af det virale poly-peptid, sekvenser, der indkoder kapsid-proteinerne, sekvenser, der indkoder udeladte virioner, og sekvenser, 10 der indkoder andre nyttige virale gener.

"Rekombinante værtceller", "værtceller", "celler", "cellelinier", "cellekulturer" og andre lignende udtryk, der angiver mikroorganismer eller højere euka-ryotiske cellelinier dyrket som unicellulære enheder, er 15 anvendt indbyrdes uvekslelige og refererer til celler, der kan, eller er blevet, anvendt som recipienter for rekombinant vektor eller andet transfer-DNA, og omfatter afkom af den oprindelige transficerede celle. Det skal forstås, at afkommet af en enkelt stamcelle ikke nødven-20 digvis er fuldstændigt identisk i morfologi eller i ge-nomisk eller totalt DNA-komplement med den oprindelige stamcelle, hvilket kan skyldes tilfældig eller forsætlig mutation. Afkom af stamcellen, der har tilstrækkelig lighed med stamcellen til at blive karakteriseret ved 25 den relevante egenskab, såsom tilstedeværelse af en nu-cleotidsekvens, der indkoder et ønsket peptid, er inkluderet i det afkom, der er tilsigtet med nævnte definition, og er omfattet af de ovennævnte udtryk.

"Styringssekvens" refererer til DNA-sekvenser, 30 der er nødvendige for at bevirke ekspressionen af kodningssekvenser, til hvilke de er ligeret. Arten af sådanne styringssekvenser varierer i afhængighed af værtorganismen. I prokaryoter omfatter sådanne styringsse-kvenser i almindelighed en regulationsregionspromotor 35 og ribosom-bindingssted og terminationssignaler, mens i I DK 175413 B1 · 8 I eukaryoter sådanne styringssekvenser i almindelighed om- I fatter promotorer, terminatorer og, i nogle tilfælde, I transkriptionsfremmere. Angivelsen "styringssekvensern I skal som minimum omfatte alle komponenter, hvis til- 5 stede være Ise er nødvendig for ekspression, og kan også omfatter yderligere komponenter, hvis tilstedeværelse er fordelagtig.

"Opererbart forbundet" refererer til en sidestil- ling, hvori de således beskrevne komponenter befinder 10 sig i et indbyrdes forhold, der tillader dem at fungere på den for dem tilsigtede måde. En styringssekvens "ope- rerbart forbundet" til en kodningssekvens er ligeret på en sådan måde, at ekspression af kodningssekvensen op- nås under betingelser, der er kompatible med styrings- H 15 sekvenserne.

B. Generel beskrivelse

Centralt for den foreliggende opfindelse er til- H vejebringelsen af en nucleotidsekvens indeholdende det 20 totale genom fra kvægdiarré-virus. Tilgængeligheden af I dette fuldstændige polynycleotid tillader konstruktion og fremstilling af oligomere prober til diagnose, af vacciner, der er effektive over for BDV, og af protei- I ner, der er anvendelige ved fremstilling af neutralise- I 25 rende antistoffer. Sekvens-information, der er tilgænge- lig fra genomet, muliggør deducering af polypeptidets aminosyresekvens og udtænkning af lokationer for gunsti- I ge epitoper. Når først de ønskede sekvenser er valgt, kan endvidere passende fragmenter af genomet vindes og I 30 eksprimeres uafhængigt, hvorved der tilvejebringes øn- skede polypeptider. Korte polypeptidfragmenter kan også I syntetiseres kemisk og forbindes til bære-proteiner til brug som immunogener. Rekombinantmæssigt eksprimeredes I polypeptider kan tilvejebringes under betingelser, der I 35 giver et gunstigt miljø for oparbejdning til for eksem- • 9 DK 175413 B1 pel konjugation med cellulære eller kunstige membraner, der således kunne bære epitop-stederne uden ulemperne ved at anvende en infektiøs virus. Pattedyr- og gærceller tilvejebringer egnede miljøer for sådan ekspression.

5 Endvidere kan epitoperne frembringes forbundet til et partikeldannende protein.

De ovennævnte fremstillede proteiner kan i sig selv anvendes som vacciner, eller de kan anvendes til at inducere immunokompetente B-celler i værter, hvilke ΒΙΟ celler derefter kan anvendes til at frembringe hydri-domer, der udskiller antistoffer, som er nyttige ved passiv inununoterapi og diagnose.

B.l. Nucleotidsekvens af BDV-genomet 15 BDV-genomsekvensen fandtes ud fra cDNA-kloner, der repræsenterer overlappende sektioner af det totale virale RNA-genom (Fig. 1). Det virale RNA blev isoleret fra virus dyrket på embryoniske kvægnyreceller. Det virale RNA blev fraktioneret på sucrosegradienter, og de 20 fraktioner, der indeholdt RNA af tilstrækkelig længde til at indeholde det intakte genom, blev samlet, etha-nol-fældet og anvendt til at fremstille et cDNA-biblio-tek. cDNA-insertioner blev screenet indledningsvis ved hjælp af et {+/-)-system. Positive hybridiseringer var 25 mod RNA isoleret fra virus efter lysis af inficerede celler, og negative hybridiseringer var mod RNA isoleret fra uinficerede celler. Én insertion med den rette (+/-)-respons anvendtes derefter som reference-klon til kortlægning af den resterende del af biblioteket. Ad-30 skillige kolonier, der hybridiserede til den positive insertion, anvendtes til at opnå yderligere dele af det virale genom ud fra cDNA-biblioteket ved anvendelse af "walking"-teknik. Der vandtes ti cDNA-kloner, der repræsenterede overlappende dele af det virale genom, som 35 vist i Fig. 1, og disse blev underkastet restriktions- I DK 175413 B1 I 10

kortlægning og sekvensbetemmelse. Den totale genom-se- I

kvens blev udledt af disse ti cDNA-insertioner og er I

H vist i Fig. 2. I

Den illustrerede DNA-sekvens og dele deraf er di- I

5 rekte anvendelige som diagnostiske redskaber til påvis-

ning af tilstedeværelse af BDV i inficerede dyr· De er I

I særligt anvendelige til at skelne BDV-infektioner fra svinekolera-virus. Fremgangsmåder til anvendelse af DNA-, hybridisering ved diagnosticering af sygdomme findes ora- I 10 talt i US patentskrift nr. 4.358.535, Falkow. Som deri omtalt, kan biologiske prøver anvendes direkte til op- nåelse af Southern blots ved anvendelse af egnede pro- ber. Da BDV-genomet er forskelligt fra genomet af svine- kolera-virus, kan specifikke dele af BDV-sekvensen an- 15 vendes til at påvise tilstedeværelse af tilsvarende kom- plementære sekvenser i biologiske prøver fra subjekter, der mistænkes for at have infektionen.

B.2. Fremstilling af vlrale polypeptidfragmenter i E.

I 20 coli

Tilgængeligheden af den totale genom-sekvens muliggør konstruktion af ekspressionsvektorer, der ind- koder formodede antigent aktive regioner af virion-pro- teinerne. Fragmenter, der indkoder de ønskede proteiner, 25 vindes fra cDNA-klonerne ved anvendelse af konventionel I restriktions-digerering og ligeres ind i en række vek- I torer indeholdende polylinker-steder i alle mulige læse- I rammer for at frembringe fusionsproteiner ved den C-ter- I minale ende af β-galactosidase. Elleve dele af BVD-geno- I 30 met blev eksprimeret som β-gal-fusioner i E. coli ved I anvendelse af denne metode, som vist i Fig. 1. Disse dele vandtes ved restriktionskløvning og/eller ligation I af de ti oprindelige kloner, eller de oprindelige klone- I de sekvenser anvendtes direkte. De således tilvejebrag- I 35 te fusionsproteiner kan være immunogene.

• 11 DK 175413 B1 B.3. Fremstilling af antigene polypeptider og konjugation med bærer

Peptidregioner, der repræsenterer epitoper, kan syntetiseres ved anvendelse af kemiske metoder eller re-5 . kombinantmetoder og forsynes med for eksempel cystein-grupper ved C-terminus, hvilket tilvejebringer midler til at forbinde peptiderne til neutrale bæreproteiner.

En række teknikker til opnåelse af sådan binding kendes, inklusive dannelsen af disulfidbindinger ved anven-10 delse af sædvanlige reagenser, såsom N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) og succinimidyl-4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-l-carboxylat (SMCC) stammende fra Pierce Company, Rockford, Illinois. Disse reagenser skaber en disulfidbinding mellem dem selv og pep-15 tid-cysteingrupper i det ene protein og en amidbinding gennem ε-amino på en lysin, eller anden fri aminogruppe i det andet. Der kendes forskellige sådanne disulfid/ amid-dannende midler. Se for ekseirøel Immun. Rev. (1982) 62^:185. Andre bifunktionelle koblingsmidler danner en 20 thioether i stedet for en disulf id-binding. Mange af disse thioether-dannende midler er kommercielt tilgængelige og omfatter reaktive estre af 6-maleiraidocapronsy-re, 2-bromeddikesyre, 2-iodeddikesyre, 4-(N-maleimido-methyl)cycldhexan-l-carboxylsyre og lignende. Carboxyl-25 grupperne kan aktiveres ved at kombinere dem med succin-iroid eller l-hydroxy-2-nitro-4-sulfonsyre-natriumsalt.

Den foregående liste er ikke udtømmende, og modifikationer af de anførte forbindelser kan anvendes.

Enhver bærer kan anvendes, der ikke i sig selv 30 inducerer dannelsen af antistoffer, der er skadelige for subjektet, såsom de forskellige serumalbuminer, tetanus-toxoider eller "keyhole limpet hemocyanin" (KLH).

Ved injektion i egnede subjekter resulterer kon-jugaterne i dannelse af antisera, der indeholder iramuno-35 globuliner, som er specifikt reaktive over for ikke blot I DK 175413 B1 I 12 I disse konjugater, men også over for fusionsproteiner bæ- rende de analoge dele af sekvensen# og over for hel BDV.

Η B.4. Fremstilling af pattedyr-cellemembraner lndeholden- 5 de BDV-epitoper

Dele af cDNA-biblioteket omfattende BDV-genomet blev også ligeret ind i ekspressions vektorer, der var kompatible med rekombinante pattedyr-værtceller, neden- for illustreret ved en pattedyr/bakterietransportvektor 10 ("shuttle"-vektor") indeholdende en linkersekvens ned- strøms for den tidlige SV40-promotor, efterfulgt af den ligeledes af SV40 afledte polyA-sekvens. Alternative vektorer til denne særlige værtvektor, pSV7d, kunne na- turligvis også anvendes. De pattedyr-kompatible vektorer 15 indeholdende kodningssekvenserne for de Ønskede polypep- tider transformeres derefter ind i egnede pattedyrcel- ler til ekspression af sekvenserne og, i tilfælde af overflade-glycoproteiner, transport af det fremstillede protein til membranen. Cellerne bliver til slut udvun- 20 det og anvendt som hele celler ved fremstillingen af vacciner, eller membranerne opbrydes, og dele af mem- branerne anvendes tilsvarende, eller proteinerne renses og oparbejdes til vacciner.

I 25 B.5. Fremstilling af hybride partikel-immunogener inde- holdende BDV-epitoper

Immunogeniteten af epitoperne af BDV kan også I fremmes ved at fremstille dem i pattedyr- eller gær-sy- stemer fusioneret med partikel-dannende proteiner, såsom I 30 det der er associeret med hepatitis B-virus(HBV)-over- I fladeantigen (HBsAG). Konstruktioner, hvori en BDV-epi- I top er forbundet direkte til sekvenserne, der koder for I partikeldannende protein, frembringer hybrider, der er immunogene med hensyn til BDV-epitopen såvel som med I 35 hensyn til HBV-epitoper.

13 DK 175413 B1

Hepatitis B-overfladeantigen har vist sig at blive dannet og samlet i S. cerevisiae (Valenzuela et al., Nature (1982) 298:344-350). Dannelsen af sådanne partikler har vist sig at forøge inununogeniteten af den monomere 5 subenhed. Partiklerne kan også dannes ud fra konstruktioner, der indeholder præoverflade (pre-S)-regionen foruden det modne overfladeantigen. pre-S-Regionen indkoder en immunodominant HBV-epitop, og disse proteiner ekspri-meres i gær (Neurath et al., Science (1984) 224:392- 10'394). Ekspression af konstruktioner, der indkoder pre-' B region fusioneret til partikel-dannende protein er be-1 skrevet i offentliggjort europæisk patentansøgning nr.

EP-A-0 174 444. Ekspression af kodningssekvenser for hybridpartikler indeholdende HBsAg og en heterolog epitop 15 findes omtalt i U.S. patent nr. 4,722,840, idet indleveringsdatoen for den hertil svarende U.S. patentansøgning var 13. september 1984. Disse konstruktioner kan også eksprimeres i pattedyrceller, såsom kinesisk hamster-2q ovarieceller, ved anvendelse af enSV40-dihydrofolat-reduktasevektor (Michelle et al., Int. Symp. on Viral Hepatitis (1984)).

Endvidere kan dele af den sekvens per se, der koder for partikel-dannende protein, erstattes med codoner 25 for en BDV-epitop. Ved denne udskiftning kan regioner, der ikke kræves for at formidle aggregationen af enheder under dannelse af immunogene partikler i gær eller pattedyr, udelades, hvorved yderligere antigene hepatitis B-steder elimineres fra konkurrence med BDV-epito-30 pen.

B.6. Vaccinia-bærer

Store virusbærere med bredt værtområde har også været anvendt ved opbygning af vacciner ved integrering 35 af de epitope regioner af det Ønskede immunogen i det I DK 175413 B1 '14

I virale bærer-genora. Vaccinia-virus har navnlig været I

I anvendt til dette formål. For eksempel omtaler Smith, I

G.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80: H 7155-7159, integrationen af hemagglutinin-genet fra in- 5 fluenza-virus i vaccinia-genomet og anvendelse af den resulterende rekombinante virus som en vaccine. Tilsva- I rende klonede Panicali, D. et al., ibid (1982) 79:4927- 4931, thymidinkinase-genet fra Herpes simplex-virus ind i vaccinia. Tilgængeligheden af BDV-genoroet ifølge op- 10 findelen giver tilsvarende muligheder. Rekombinationen foretages i almindelighed ved at co-inficere cellerne både med vaccinia-virus og med et chimerisk plasmid bæ- rende den ønskede kodningssekvens under kontrol af de transkriptionelle regulationssignaler og RNA-startste- 15 det fra det vaccinia-virusgen, der er nabostillet til en sekvens, der koder for translations-startsted/fremmed protein. Under infektion medfører ligheden mellem de flankerende DNA-sekvenser af de fremmede DNA-sekvenser og dem i vaccinia integration af den ønskede del af det 20 chimeriske plasmid i vaccinia-genomet. Den resulterende H rekombinante vaccinia kan udvindes fra de inficerede I celler og anvendes ved dannelsen af en vaccine. Vac- cinia-virus har et meget stort (120 x 106 dalton) genom og kan meget let dyrkes i kultur. Fremstillingen af sto- | I 25 re mængder billig.immunogen vaccine er derfor let mulig.

I B.7. Fremstilling af vacciner I Fremstilling af vacciner, der indeholder peptid- I sekvenser som aktive bestanddele, er også velkendt tek- I 30 nik. Typisk fremstilles sådanne vacciner som injicerba- I re præparater, enten som flydende opløsninger eller sus- pensioner, men faste former egnede til opløsning eller I suspendering i væske forud for injektion kan også frem- I stilles. Præparatet kan også være emulgeret, eller pro- I 35 teinet kan være indkapslet i liposomer. Den aktive immu- 15 DK 175413 B1 nogene bestanddel er ofte blandet med excipienser, der er farmaceutisk acceptable og kompatible med den aktive bestanddel. Egnede excipienser er for eksempel vand, saltopløsning, dextrose, glycerol, ethanol eller lignen-5 de og kombinationer deraf. Vaccinen kan endvidere, om ønsket, indeholde mindre mængder af hjælpestoffer, såsom befugtningsmidler eller emulgeringsroidler, pH-puffermidler eller hjælpemidler, der fremmer vaccinens effektivitet. Vaccinerne indgives konventionelt parente-10 ralt, for eksempel ved injektion, enten subcutant eller intramuskulært. Yderligere kompositioner, der er egnede til andre anvendelsesmåder, omfatter suppositorier og, i nogle tilfælde, orale kompositioner. .Til suppositorier kan traditionelle bindemidler og bærere omfatte for ek-15 sempel polyalkaliglycoler eller triglycerider. Sådanne suppositorier kan fremtilles ud fra blandinger indeholdende den aktive bestanddel inden for området 0,5% til 10%, fortrinsvis 1-2%. Orale konqpositioner omfatter sådanne normalt anvendte excipienser som for eksempel far-20 maceutiske kvaliteter af manitol, lactose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsaccharin, cellulose, raagne-siumcarbonat og lignende. Disse kompositioner foreligger som opløsninger, suspensioner, tabletter, piller, kapsler, kompositioner med forhalet frigørelse eller pulvere 25 og indeholder 10-95% aktiv bestanddel, fortrinsvis 25-70%.

Proteinerne kan oparbejdes til vaccinen som neutral form eller saltform. Farmaceutisk acceptable salte omfatter syreadditionssaltene (dannet med peptidets 30 frie aminogrupper), og som er dannet roed uorganiske syrer, såsom saltsyre eller phosphorsyre, eller sådanne organiske syrer som eddike-, oxal-, vin-, mandelsyre og lignende. Salte dannet med de frie carboxylgrupper kan også været afledt af uorganiske baser, såsom natrium-, 35 kalium-, ammonium-, calcium- eller ferri-hydroxider, og

I DK 175413 B1 I

I 16 I

sådanne organiske baser som isopropylamin, trimethyl- I

amin, 2-ethylaminoethanol, histidin, procain og lignen- I

H de. I

Vaccinerne indgives på en måde, der er kompati- I

5 bel med dosispræparatet, og i en sådan mængde, som vil I

I være terapeutisk effektiv og immunogen. Den mængde, der I

skal indgives, afhænger af subjektet, der behandles, I

evnen hos subjektets immunsystem til at syntetisere an- I

tistoffer og den ønskede beskyttelsesgrad. Præcise mæng-* H 10 der af aktiv bestanddel, der kræves til indgift, bestem- mes af lægen og er speciel for hvert subjekt.

B.8. Fremstilling af kort over for BDV-epitoper

De immunogene proteiner eller immunokonjugaterne 15 fremstillet som beskrevet ovenfor kan anvendes til at vinde lymfocytter fra perifert blod og miltceller i in- jektionsbehandlede pattedyr med henblik på at fremstille | I hybridomaer, der er i stand til at udskille monoklonale I antistoffer rettet mod disse epitoper. De resulterende 20 monoklonale antistoffer er særligt anvendelige ved diag- nose, og de, der er neutraliserende, er anvendelige ved passiv immunoterapi.

I C. Generelle metoder 25 Den generelle teknik, der anvendes ved ekstrak- I tion af RNA fra virus'en, fremstilling og probning af I cDNA-bibliotek, sekvensbestemmelse af kloner, konstruk- I tion af ekspressionsvektorer, transformation af celler, I og lignende er kendt teknik, og der findes laboratories 30 håndbøger, der beskriver disse teknikker. Som generelle I retningslinier er der imidlertid nedenfor omtalt nogle I for nærværende tilgængelige kilder for sådanne metoder og for materialer til deres gennemførelse.

17 DK 175413 B1 C. 1. Varter og ekspressions-styringssekvenser Både prokaryotiske og eukaryotiske værtceller kan anvendes til ekspression af ønskede kodningssekvenser, når der anvendes passende styringssekvenser, der er kora-5 patible med den designerede vært. Prokaryoter er mere anvendelige til kloning. Enten prokaryoter eller eukary-oter kan anvendes til ekspression. Blandt prokaryotiske værter anvendes oftest E. coli, mest for nemheds skyld. Ekspressions-styringssekvenser for prokaryoter omfatter 10 promotorer, eventuelt indeholdende operatordele, og ri-bosora-bindingssteder. Transfer-vektorer, der er kortpa-tible med prokaryotiske værter, er sædvanligvis afledt af for eksempel pBR322, et plasmid indeholdende opero-ner, der medfører ampicillin- og tetracyclin-resistens, 15 og de forskellige pUC-vektorer, der også indeholder sekvenser, som medfører antibiotikum-resistens. De ovennævnte operoner kan anvendes som markører til opnåele af gunstige transformanter ved udvælgelse. Almindeligt anvendte prokaryotiske styringssekvenser omfatter β-lacta-20 mase (penicillinase)- og lactose-promotorsystemer (Chang, et al., Nature (1977) 198:1056), tryptophan(trp)-promotorsystemet (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057) og den λ-afledte PL-promotor- og N-gen-ribosombindingssted (Shimatake et al.. Nature (1981) 292:128)♦ 25 De foregående systemer er særligt kompatible med E. co li. Om ønsket kan der, med tilsvarende styringssekvenser, anvendes andre prokaryotiske værter, såsom stammer af Bacillus eller Pseudomonas.

Eukaryotiske værter omfatter gær- og pattedyr-30 cellekulturer. Saccharomyces cerevisiae, eller bagerigær, og Saccharomyces carlsbergensis er de mest anvendte gærværter, igen for nemheds skyld. Gær-kompatible vektorer bærer markører, der tillader udvælgelse af gunstige transformanter ved at bibringe auxotrope mutanter 35 prototrophi eller ved at bibringe vildtypestammer anti-

I DK 175413 B1 I

I 18 I

I bioticum-resistens eller resistens mod tunge metaller. I

I Gær-kompatible vektorer kan anvende 2 μπι-replikations- I

I starten (Broach, J., et al, Meth. Enz. (1983) 101:307), I

I kombinationen af CEN3 og ARSI eller andre midler til at I

I 5 sikre replikation, såsom sekvenser, der vil resultere i I

inkorporering af det passende fragment i værtcelle-geno- I

I met. Styringssekvenser for gærvektorer omfatter promoto- I

I rer for syntesen af glycolytiske enzymer (Hess et al., I

I J. Adv. Enzyme Reg. (1968), 2:^49, Holland et al., Bio- I

I 10 chemistry (1978) Γ7:4900), og promotoren for 3 phospho- I

glyceratkinase (Hizeman et al., J. Biol. Chem. (1980) I

I 255: 2073). Til gærekspression kan terminatorer også I

I være inkluderet, såsom dem, der er afledt af enolase- I

I genet (Holland, M.J., J. Biol. Chem. (1981) 256:1385). I

I 15 Særligt anvendelige styringssystemer inkluderer de heri I

I specifikt beskrevne, som omfatter glyceraldehyd-(3 phos- I

I phatdehydrogenase) (GAPDH)-promotoren eller den reguler- I

I bare alkoholdehydrogenase(ADH) -promotor, terminatorer I

I ligeledes afledt af GAPDH, og, hvis der ønskes sekre- I

I 20 tion, ledersekvens fra gær-a-faktor. Disse systemer er I

I beskrevet detaljeret i U.S. patent nr. 4,876,197 og U.S. I

I patent nr. 4,870,008, idet indleveringsdatoerne for de I

I hertil svarende U.S. patentansøgninger var henholdsvis I

I 22. august 1983 og 12. august 1983. I

I 25 Pattedyrcellelinier, der er tilgængelige som I

I værter for ekspression, omfatter mange udødeliggjorte I

I cellelinier tilgængelige fra the American Type Culture I

Collection, omfattende HeLa-celler, kinesisk hamster- I

I ovarie(CHO)-celler, babyhamsternyre(BHK)-celler og en I

30 række andre cellelinier. Egnede promotorer for pattedyr- I

I celler omfatter hovedsageligt virale promotorer, såsom I

den fra Simian virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature I

I (1978) 273:113) eller andre virale promotorer, såsom I

I Rous sarcoma-virus (RSV), adenovirus og kvæg-papiloma- I

I 35 virus (BPV). Pattedyrceller kan også kræve terminator- I

19 DK 175413 B1 sekvenser. Vektorer, der er egnede til replikation i pattedyrceller, kan omfatte virale repliconer eller sekvenser, der sikrer integration af de passende sekvenser i vært-genomet.

5 C.2. Transformationer

Den anvendte traneformationsmetode afhænger af hvilken vært, der skal transformeres. Bakteriel transformation benytter i almindelighed behandling med cal-10 cium- eller rubidiumchlorid (Cohen, S.N., Proc. Natl.

Acad. Sci. (USA) (1972) 69:2110, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Press, side 254). Gærtransformationer kan gennemføres ved anvendelse af metoden ifølge Hinnen, A., et 15 al., Proc. Natl. Proc. Acad. Sci. (USA) (1978) 21*1929-1933. Pattedyr-transformationer gennemføres ved anvendelse af calciumphosphatfældningsmetoden ifølge Graham og van der Eb, Virology (1978) 52:546, eller de forskellige modifikationer deraf.

20 C.3. Vektor-konstruktion

Vektor-konstruktion benytter teknik, der nu er ganske godt klarlagt. Positions-specifik DNA-klØvning gennemføres ved behandling med egnet restriktionsenzym 25 under betingelser, der generelt er specificeret af fabrikanterne af disse kommercielt tilgængelige enzymer (se f.eks. The New England Biolabs Product Catalog). I almindelighed bliver ca. 1 μς plasmid eller DNA-sekvens kløvet med 1 enhed enzym i ca. 20 μΐ pufferopløsning i 30 en inkubationstid på ca. 1-2 timer ved ca. 37°C. Efter inkubation med restriktionsenzymet fjernes protein ved phenol/chloroform-ekstraktion, og DNA'et udvindes ved genudfældning med ethanol. De kløvede fragmenter kan adskilles ved anvendelse af polyacrylamid- eller agarose-35 gelelektroforeseteknik ifølge de almene metoder beskrevet i Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

I DK 175413 B1 I

I 20 I

I Kløvningsfragmenter med klæbeender kan gøres I

I stumpendede ved anvendelse af E. coli DNA-polymerase I I

I (Klenow) i nærværelse af de egnede deoxynucleotidtri- I

I phosphater (dNTP'er) under anvendelse af inkubations- I

I 5 betingelser, der er egnede for polymerasen. Polymerasen

I digererer fremspringende 3'-enkeltstrenge, men udfylder · I

I fremspringende 5'-ender, alt efter de i blandingen til- stedeværende dNTP'er. Behandling med Sl-nuclease kan I også anvendes, da dette resulterer i hydrolyse af en- 10 hver enkeltstrenget DNA-del.

Ligationer gennemføres ved anvendelse af stan- dard-puffer- og -temperatur-betingelser under brug af T4 DNA-ligase og ATP. Li gationer med klæbeender kræver min- dre ATP og mindre ligase end ligationer med stumpe en- 15 der. Når der som del af en ligationsblanding anvendes vektor-fragmenter, bliver vektor-fragmentet ofte behand- let med bakteriel alkaliphosphatase (BAP) for at fjerne I 5'-phosphatet og således hindre religation af vektoren.

I Alternativt kan restriktionsenzym-digerering af uønskede I 20 fragmenter anvendes til at hindre religation.

I Ligationsblandinger transformeres ind i egnede kloningsværter, såsom E. coli, og gunstige transforman-

I ter udvælges for eksempel ved antibiotisk resistens og I

screenes for den korrekte konstruktion.

I 25 C.4. Konstruktion af ønskede DNA-sekvenser

Syntetiske oligonucleotider kan fremstilles ved I anvendelse af et automatiseret oligonucleotid-synteti- I seringsapparat, som beskrevet af Warner, B.D., et al., I 30 DNA (1984) 3^:401-411. Om Ønsket kan disse syntetiske strenge kinaseres med henblik på mærkning med ^2p ved I anvendelse af et overskud af polynucleotidkinase i nær- I værelse af mærket ATP under standard-kinaseringsbetin- I gelser.

I 35 DNA-sekvenser inklusive dem, der er isoleret fra genom- eller cDNA-biblioteker, kan modificeres ved posi- 21 DK 175413 B1 tionsrettet mutagenese, som beskrevet af Zoller, M., et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-6499. Kort angivet bliver det DNA, der skal modificeres, emballeret i pbag som en enke Its trenget sekvens og omdannet til et 5 dobbeltstrenget DNA med DNA-polymerase under anvendelse som primer, af et syntetisk oligonucleotid, der er komplementært med den del af DNA'et, der skal modificeres, og har den ønskede modifikation inkluderet i dets egen sekvens. Det resulterende dobbeltstrengede DNA transfor— 10 meres ind i en phag-støttende værtbakterie, og kulturer af den transformerede bakterie, der vil indeholde repli-kationer af hver streng af phagen, udplades i agar til opnåelse af plaquer. Teoretisk vil 50% af de nye plaquer indholde phag, der som enkeltstreng har den muterede 15 form, mens 50% vil have den oprindelige sekvens. Repli-kater af plaquerne hybridiseres til kinaseret syntetisk probe ved temperaturer og under betingelser, der tillader hybridisering med den korrekte streng, men ikke med den umodificerede sekvens. De således identificerede, 20 ønskede, modificerede sekvenser udvindes derefter og klones for at tjene soro kilde for det ønske DNA.

C.5. Hybridisering med probe DNA-biblioteker probes ved anvendele af metoden 25 ifølge Grunstein og Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) (1975) 7^:3961). Kort angivet bliver ved denne metode det DNA, der skal probes, imraobiliseret på nitrocellulosefiltre, denatureret og præhybridiseret med en puffer indeholdende 0-50% formamid, 0,6M NaCl, 60mM 30 natriumcitrat, 0,02% (vægt/vol.) af hvert af kvægserum-albumin, polyvinylpyrrolidon og Ficoll, 50mM natrium-phosphat (pH 6,5), 1% glycin og 100 pg/ml denatureret bærer-DNA. Procentindholdet af formamid i pufferen samt tids- og temperaturbetingelserne ved præhybridiserings-35 og efterfølgende hybridiseringstrin afhænger af den Øns- I DK 175413 B1

I 22 I

I kede stringens. Oligomere prober, der kræver lavere I

I stringensbetingelser, anvendes i almindelighed med lave I

I procentindhold a£ formamid, lavere temperaturer og læng- I

I ere hybridiseringstider. Prober indeholdende mere end 30 I

I 5 eller 40 mucleotider, såsom dem, der er afledt af cDNA I

I eller genom-sekvenser, gør i almindelighed brug af hø- I

jere temperaturer, f.eks. ca. 40-429C, og et højt pro- I

I centindhold, f.eks. 50% formamid. Efter præhybridisering I

I bliver denne samme puffer, nu indeholdende den 32p-kina- I

I 10 serede oligonucleotid-probe, tilsat til opnåelse af hy- I

I bridisering. Radioautografi af de behandlede filtre vi- I

I ser lokationen af den hybridiserede probe, og de til- I

svarende lokationer på replikafiltre, der ikke er blevet I

I probet, kan derefter anvendes som kilde for det Ønskede I

I 15 DNA. I

I C.6. Verifikation af konstruktion og sekvensbestemmelse I

Til rutine-vektorkonstruktioner bliver ligations- I

blandinger transformeret ind i E. coli-stamme HB101 el- I

I 20 ler anden egnet vært, og gunstige transformanter udvæl- I

H ges ved antibiotisk resistens eller andre markører. I

I Plasmider fra transformanterne fremstilles derefter ved I

metoden ifølge Clewell, D.B., et al., Proc. Natl. Acad. I

I Sci. (USA) (1969) 62:1159, sædvanligvis efter chloram- I

I 25 phenicol-forstærkning (Clewell, D.B., J. Bacteriol. I

(1972) 110:667. Det isolerede DNA isoleres og analyseres I

I ved restriktionsanalyse eller sekvensbestemmes ved di- I

I deoxymetoden ifølge Sanger, F., et al., Proc. Natl. I

I Acad. Sci. (USA) (1977) 74:5463, som yderligere beskre- I

I 30 vet af Messing et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:309, I

I eller ved metoden ifølge Maxaro et al., Methods in Enzy- I

I mology (1980) 65:499.

23 DK 175413 B1 D. Eksempler

De følgende ekempler skal Illustrere, men ikke begrænse opfindelsen. De anførte fremgangsmåder, f.eks. under D.l og D.2, kan, om ønsket, gentages, men dette er 5 ikke nødvendigt, da der findes teknikker til konstruktion af de ønskede nucleotid-sekvenser baseret på den gennem opfindelsen tilvejebragte information. Ekspression er eksemplificeret i E. coli og i gær, men andre systemer er tilgængelige, som omtalt mere detaljeret un-10 der C.l. Yderligere epitoper afledt af genomstrukturen kan også fremstilles og anvendes til frembringelse af antistoffer, som omtalt nedenfor.

D.l. Fremstilling af cDNÅ 15

D.l.a. Fremstilling af BDV

Kvæg-embryonyre(BEKI)-celler blev dyrket i MEM (Earl's) indeholdende 0,85 g/l NaHCC>3 og 10% bestrålet 20 foetal kalveserum. Den biologisk klonede Osloss-stamme af BDV blev 5 gange ledt gennem BEKI-celler ved en mul-tiplicitet på 0,11. Cytipatiske effekter, bestående i klyngedannelse af celler efterfulgt af vacuolering og derefter celle-lysis, kunne let observeres fra den før-25 ste passage. Endelige titere (~10® pfu/ml) fandtes efter udvinding af virus ved frysning og optøning af inficerede celler.

Til virus-fremstillingen anvendtes 175 cm^ form-stofkolber af subconfluente BEKI-celler. Cellerne blev 30 vasket 3 gange med infektionspuffer (MEM (Earl's) + 2,2 g/liter NaHC03, pH 7,6) og blev derefter inficeret med 2 ml BDV i infektionspuffer ved en multiplicitet på 0,05 pfu/celle. Efter 1 time ved 35¾ blev der tilsat 18 ml infektionspuffer, og cellerne blev inkuberet i 4-5 35 dage ved 35°C, hvorefter cytopatisk effekt (vacuolering'

I DK 175413 B1 I

I .24 I

B efterfulgt af celle-lysis) var højere end 80%. Ved en I

B typisk produktion blev 150 kolber med celler inficeret. I

B Mediet (ca. 3 liter) blev indsamlet og lagret ved 4¾. I

De resterende celler blev skrabet i 2 ml infektionspuf- I

5 fer/kolbe, underkastet 3 cycler med frysning og tøning, I

og den endelige suspension blev sat til infektionsmedi- I

B et. Efter en centrifugering ved 10.000 g i 30 minutter I

B blev supernatanten koncentreret 10 gange ved ultracen- I

B trifugering ved 120.000 g i 4 timer og 40 minutter ved I

B 10 4°C.

B InfektiØs virus havde en vægtfylde på 1,12 g/ml B målt ved isopicnicbånddannelse i sucrose-vægtfyldegra- B dient, og viste sig ved elektronmikroskopi som 45-55 nm B sfæriske partikler. Virus-præparationerne blev neutrali- B 15 seret med anti-BDV-antiseruro fra kaniner injiceret med B virus eller fra kvæg.

B D.l.b Ekstraktion og rensning af viralt RNA

B RNA blev isoleret fra virus-pellet’en ved CsCl/ B 20 guanidiniumthiocyanat-metoden, som beskrevet af Chirg- B win et al.. Biochemistry (1979) 3UBs3294, og det rensede B RNA blev lagret i 70% ethanol ved -20¾. Dette RNA-præ- B parat indeholdt en stort mængde forurenende lavmoleky- B lært cellulært RNA og intakt viralt RNA. Viralt RNA blev B 25 renset yderligere ved sucrosevægtfyldegradient-centrifu- I gering som følger:

En aliquot indeholdende en vurderet mængde på 5 I μg BDV-RNA blev centrifugeret ved 10.000 g i 15 minutter I ved 4°C. Pellet’en blev vasket med 80% ethanol, denatu- 30 reret i 375 μΐ 99% DMSO (99%), 5 mM Tris-HCl (pH 7,5) og I inkuberet i 5 minutter ved 37¾. Efter tilsætning af 1,125 ml 5 mM Tris HC1 (pH 7,5), 1 nN EDTA, 1% Sarkosyl blev opløsningen opvarmet i 2 minutter ved 70¾ og afkø- I let kraftigt på is. Denne opløsning blev fordelt på I 35 5x15-30% sucrosegradienter i 5 mM Tris HC1 (pH 7,5), 10 25 DK 175413 B1 mM EDTA, 0,1M NaCl, 1% Sarkosyl (i sterile siliconisere-de Beckman SW40-rør). En sjette gradient blev belastet med 31-endemærket RNA som en markør (se nedenfor). Efter en centrifugering i 16 timer ved 19.000 rpm (20¾) blev 5 gradienterne fraktioneret (1 ml fraktioner). RNA'et fra hver-1 fraktion af den gradient, der svarede til den, der indeholdt markør-mærket RNA, blev fældet med 2,5 voluminer ethanol i nærværelse af bærer-gær-RNA (10 pg) og underkastet formaldehyd-agarosegel-elektroforese. Lehrach 10 et al.. Biochemistry (1977) 16:4743, for at bestemme hvilken fraktion, der indeholdt BDV-RNA-bånden. Fraktioner svarende til dem indeholdende BDV-RNA’et blev samlet fra de parallelle gradienter og fældet med 2,5 voluminer ethanol, vasket med 80% ethanol og lagret ved 15 -20°C i 70% ethanol.

Det rensede virale RNA blev mærket med 32p_pCp (3000 Ci/n mol) ifølge England et al., Meth. Enzymol.

(1980) £5:65-74, og analyseret ved agarosegel-elektro-forese i nærværelse af 2,2 M formaldehyd, som beskrevet 20 af Lehrach et al., (supra). Fluorografi gennemførtes med 3H-Enhancer (NEN) som anbefalet af fabrikanten.

Hovedparten af radioaktiviteten var forbundet med lavmolekylært RNA (mindre end 2 kb), men en lille mængde fandtes i et højmolekylært bånd på ca. 12,5 kb, iden-25 tificeret som RNA ved hjælp af mærkningsegenskaber med RNA-ligase, dets sensibilitet over for RNAse og alkali og modstandsevne over for DNAse og proteinase K. I overensstemmelse med andre rapporter vedrørende togavira fra flavivirus-gruppen bandt BDV-RNA'et ikke ti oligo-dT-30 cellulose, hvilket viser enten fravær af en polyA-stræk-ning ved 3’-enden, eller at polyA'et,, om tilstede, er meget kort. Kontrol-Sindbis-virus-RNA blev korrekt tilbageholdt af den samme søjle.

Disse egenskaber hos 12,5 kb båndet var identiske 35 med egenskaberne udvist af RNA ekstraheret fra BEKI—celler dyrket som følger: I DK 175413 B1 26 H BEKI-celler blev dyrket i 25 cm^ formstofkolber, vasket 3 gange med infektionspuffer og inficeret ved multipliciteter på 50-100 pfu/celle med 1 ml BDV-opløs- I ning. Efter 1 time ved 35¾ blev der tilsat 4 ml infek- I 5 tionspuffer, og inkubationen blev fortsat. Efter 12, 15, I 18, 21 og 36 timer (36 timer svarer til en komplet cyc- lus af BDV-replikation) blev det nyligt syntetiserede RNA mærket med 3n«uridin (100 )£i/plade). Unificeret cellulært RNA indvundet efter 18 timere inkubation blev 10 også analyseret. Efter 30 minutters mærkning blev det cellulære RNA ekstraheret under anvendelse af CsCl/gu- anidiniumthiocyanat-metoden ifølge Chirgwin et al., 1979 (supra). Pellet'en af RNA, vundet efter ultracentrifu- gering gennem en 5,7 M CsCl-pude, blev analyseret direk- 15 te ved formaldehyd-agarosegel-elektroforese, og gel blev tørret og fluorograferet. Ved alle de testede inkuba- tionstider kunne et 12,5 kb bånd, der er fraværende i de uinficerede celler, påvises, hvilket bånd har de samme fysisk-kemi ske egenskaber som vist af RNA'et ovenfor.

D.l.c. Fremstilling af cDNA

Det virale RNA isoleret fra virus'en under D.l.b.

blev polyadenyleret ved metoden ifølge Sippel, Eur. J.

I Biochera. (1973), 37:31-40. Kort angivet blev den vurde- 25 rede mængde på 0,7 μg af renset BDV-RNA inkuberet i 5 ml 5 raM methylkviksølvhydroxid i 10 minutter ved stuetem- I pera tur og inkuberet i 6 minutter ved 37¾ med 20 enhe- I der polyA-polymerase (BRL) og 500 pCi ^H-ATP (36 Ci/ I mmol, Amer sham) i 50 μΐ 50 mM HC1 (pH 7,5), 10 raM MgCl2« I 30 2,5 mM MnCl2, 0,3 M NaCl, 1,5 mM 2-mercaptoethanol og indeholdende 2,5 μ9 RNAse-frit BSA og 5 enheder human I placental ribonuclease-inhibitor (BRL). Efter phenol/ chloroform-ekstraktion blev RNA'et renset vef chromato- grafi på Sephadex G50 og fældet med 2,5 voluminer etha- 35 nol. PolyA’et anvendtes til at fremstille prober og som I template for cDNA-biblioteket.

27 DK 175413 B1

Til fremstilling af prober blev 1 pg polyA-RNA inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur i 5 μΐ 10 mM methylkviksølvhydroxid og derefter 45 minutter ved 37¾ med 40 enheder omvendt transkriptase i 100 ml 50 mM Tris 5 HC1 (pH 8,3), 10 mM MgCl2» 1/5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM dATP, dGTP og. dTTP, 10 μΜ dCTP, 0,2 mg/ml actinomy-cin D, 5 enheder human placental ribonuclease-inhibitor, 500 μΟί alpha-32p_jicipp (3000 Ci/mmol, Amer sham) og 20 μg oligonucleotider vundet ved partiel digerering med NDAse 10 I fra kalvethymus-DNA (vilkårlige primere). Efter 15 og 30 minutter blev der tilsat yderligere 10 enheder omvendt transkriptase. Efter phenol/chloroform-ekstraktion og Sephadex G50-søjlechromatografi blev RNA*et hydrolyseret med 0,1 M NaOH (1 time ved 65%), hvorved vandtes 15 enkeltstrengede cDNA-strenge. Opløsningen blev neutraliseret med 0,1 M eddikesyre og sat direkte til hybri-diserings-pufferen.

Til cDNA-biblioteket blev der anvendt to separate klonings-protokoller involverende dT (12-18)-primere 20 eller vilkårlige (kalvethymus), DNA-afledte oligonucleo-tid-primere. RNA polyadenyleret in vitro som ovenfor beskrevet anvendtes. Omtrent 1 peg polyadenyleret RNA blev inkuberet med 10 mM methylkviksølvhydroxid i et 10 μΐ volumen i 10 minutter ved stuetemperatur, og overskud af 25 reagens blev titreret ved tilsætning af 1 μΐ af 3M

2-mercaptoethanol-opløsning. Dette denaturerede polyA-RNA anvendtes straks i nærværelse af 50 roM Tris pH 8,0, 1 mM dATP, dGTP, dCTP og dTTP, 2,5 Mg/ml dT12-18-primere eller vilkårlige kalvethymus-oligonucleotid-primere, 10 30 mM MgCl2/ 10 Mg/ml actinoraycin D, 100 enheder RNAse-in-hibitor (BRL) og 60 enheder omvendt transkriptase i et totalt volumen på 100 μΐ.

Prøverne blev fortyndet til 400 μΐ med en puffer indeholdende 10 mM Tris 7,0, 100 mM NaCl, 10 roM EDTA

35 og 0,2% SDS, ekstraheret med phenol/chloroform, befriet I DK 175413 B1 I 28 H for dNTP’er ved Sephadex G50-chroma tograf i og fældet med ethanol.

Den fældede blanding af RNA- og cDNA-hybrider (10 I μΐ) blev fortyndet i 50 ml Sl-puffer (500 mM NaCl, 50 mM .

H 5 Na-acetat pH 4,5 og 1 mM ZnCl2) og digereret i 15 minut- ter ved stuetemperatur med 20 enheder Sl-nuclease. Reak- H tionen blev stoppet ved fortynding af prøven til 500 ml med en puffer indeholdende 50 mM NaCl, 10 mM EDTA og 50 mM Tris pH 7,0, og digerering blev fortsat i 15 minut- 10 ter ved stuetemperatur ved tilsætning af 20 μ9/ηι1 af RNAse A. Efter phenol- og chloroform-ekstraktion blev RNAicDNA-hybriderne koncentreret ved ethanol-fældning og fraktioneret på en Sepharose CL4B-søjle fremstillet i en 1 ml formstof-pipette. Den udelukkede spids, indeholden- 15 de molekyler større end 80 basepar, blev samlet og etha- nol-fældet, hvorved vandtes 50 ng hybrid for de dT-pri- mede reaktioner og 200 ng hybrid for de med vilkårligt kalvethymus-fragment primede reaktioner.

Begge prøver blev "tail'et" for dC-rester under 20 betingelser, der gav 15-25 rester pr. DNA- eller RNA- termini, og "annealet" til en dG-"tailet" pBR322-vektor lineariseret ved Pstl-stedet (NEN) ved en vektor-koncen- tration på 0,1 μg/ml. De "annealede" plasmider blev transformeret ind i E. coli HB101 til ArapR for at opnå 25 cDNA-biblioteket.

I D.2. Screening af cDNA-biblioteket

Screening gjorde brug af en (+/-)-metode under

anvendelse af mærkede dDNA'er fremstillet ud fra RNA

30 isoleret fra uinficerede BEKI-celler (-probe) og fra RNA

isoleret fra virus'en vundet efter fuldstændig lysis af I cellerne (+probe). Kolonier af det E. coli-husede cDNA- I bibliotek blev dyrket, lyseret på nitrocellulosefiltre I (to replikaer) og probet. Hybridiseringspufferen anvendt

I 35 til +probe indeholdt også et overskud af cellulært RNA

29 DK 175413 B1 isoleret fra uinficerede BEKI-celler (10 mg/xnl). De kolonier, der gav et klart signal med +probe og ingen respons med -proben, blev udvalgt. Ved denne metode blev der udvalgt 95 oligo dT-primede og 185 (vilkårlig pri-5 mer)-primede kloner. Længden af insertionerne efter Pstl-digerering varierede fra 400 til 4.000 basepar. Der vandtes intet virus-specifikt fuldlængde-cDNA.

Én af klonerne, pDT28, med en 880 bp insertion udvalgtes til yderligere analyse. Dette fragment fra en 10 Pstl-digerering af plasmid DNA blev renset ved acryl-amidgel-elektroforese digereret med Ddel og Mbol og derefter mærket med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I og de fire 32p dNTP’er, hvorved vandtes 10®-104 cpm/mg af insertion. Mærket insertion blev verificeret ved hy-15 bridisering til viralt RNA fraktioneret på en 0,9% aga-rosegel-elektroforese i nærværelse af formaldehyd (Smiley et al.. Anal. Biochem. (1983) 131:365-372). Stringente hybridiseringsbetingelser anvendtes: præhybrodise-ringer og hybridiseringer foregik natten over ved 42^0» 20 og 50% formamid emvendtes til hybridiseringer. Vask foregik ved 65°C først med 2xSSC, 0,1% SDS og derefter med 0,2xSSC og 0,1% SDS.

Ved den foregående verifikation anvendtes RNA fra uinficerede celler som negativ kontrol. Fravær af exoge-25 ne virale sekvenser i genomet fra cellerne blev verificeret ved manglende evne hos cellulært DNA digereret med BamHI og EcoRI til at binde til pDT28 probe ved Southern blot-analyse. RNA'et fra inficerede celler efter 24 timers infektion ved en raultiplicitet større end 1, og fra 30 pellet’en af virus efter fuldstændig cellelysis anvendtes som poeitiver. Ingen hybridisering blev påvist med RNA’et fra de uinficerede celler, men insertionerne hy-bridiserede til et omtrent 13 kb-bånd af RNA'et isoleret fra de inficerede celler eller fra virus-pellet*en.

35 Plasmidet pDT28, der var påvist at indeholde en

Pstl-insertion, der binder til det virale RNA, anvendtes

I DK 175413 B1 I

I 30 I

I til at probe cDNA-biblioteket for yderligere kloner, og I

den fuldstændige sekvens udvandtes ved “walking"-teknik. I

På denne måde vandtes otte yderligere plasmider, der I

spændte over hele 12,5 kb genomet af virusen. Positio- I

5 nerne af de overlappende insertioner er vist i Fig. 1. I

H Som vist i Fig. 1, besidder pDT28-klonen en groft set H central del af genomet. De 8 yderligere plasmider vundet fra cDNA-biblioteket på en måde analog med den ovenfor beskrevne, men ved anvendelse af den pågældende overlap- 10 pende sekvens-hol dige klon som probe, blev dyrket i E.

coli, og plasmid-DNA'et blev isoleret. Insertionerne blev sekvensbestemt og påvist at indeholde overlappende dele. Resultaterne af denne sekvensbestemmelse er vist i

Fig. 2, der tilvejebringer den totale genomiske RNA-se- 15 kvens konstateret ud fra insertionerne.

Orienteringen vist i Fig. 2 blev bestemt ved at subklone pDT28 ind i M13 i begge orienteringer, mærke den resulterende phag og anvende den mærkede phag som probe over for RNA, der var kendt som havende positiv 20 polaritet. Dette foregik ved plet-hybridisering på ni- I trocellulosefiltre ved anvendelse af uinficeret celle- I RNA, inficeret eelle-RNA og viralt teirplate-RNA. RNA’et I fra inficeret celle og template-RNA'et skulle være af I positiv polaritet. Derfor indeholder den M13-oriente- 25 ring, der hybridiserer til inficeret celle-RNA og viralt I RNA, en streng af negativ art, og ud fra denne inforroa- I tion kunne 5'- til 3’-sekvensen af insertioner fra pCT63 til pCT185 udledes.

I Denne konklusion blev bekræftet ved analyse af 30 sekvensen af pCT63, der viser dets evne til at danne den I forventede hårnålestruktur ved 5'-enden, og ved fravær I af yderligere kloner i cDNA-biblioteket med yderligere I 5'-sekvenser foruden den fra pCT63.

31 DK 175413 B1 D.3. Ekspression af sekvenser, der indholder gGal-BDV-fusioner i E. coli.

Tolv dele af BDV-genomet vandtes som følger: (1) de totale cDNA-sekvenser per se, (2) produkter fra 5 restriktionskløvning (med PstI eller BamHI eller begge) af de foregående cDNA'er, og (3) en ligeret sekvens vundet ved at ligere pCT185-cDNA1 et med et fragment af et andet* (Se nedenstående tabel). Disse dele anvendtes til at indkode BDV-delene af fueions-proteinerne. Disse el-10 leve BDV-protein-indkodende sekvenser blev klonet ind i én af eller en blanding af pUR290, pUR291 og pUR292, der indeholder restriktionssteder, f.eks. BamHI- og Pstl-steder i alle tre mulige læserammer med β-gal-codonerne, således at der blev indkodet fusionsproteiner ved den C-15 terminale del af β-galactosidaseproteinet (Ruther, U., et al., Embo. J. (1980) 2^:1791-1794). Da alle tre mulige læserammer er tilvejebragt for de anvendte restriktionssteder, sikres den korrekte læseramme i mindst én af vektorerne for fusionsproteinet. Tabel I sammenfatter de 20 fremstillede vektorer og BDV-sekvensen indeholdt i hver. Nucleotid-tal er som vist i Fig. 2.

I DK 175413 B1

I 32 I

I Tabel I I

B Navn pUR- BDV-insertion BDV-nucleotider I

I s tam- afledt af indeholdt i I

I produkt pUBVD-vektorer I

I 5 _______(tal som i Fig.2) I

I pUBVDl pUR290 pCT63 1397-2607 I pUBVD2 pool pCT36 2037-2574 I pUBVD4 pUR292 pCT183 2955-4560 I pUBVD5 pool pDT28 5650-6450 10 pUBVD6 pUR290 pCT174 7225-10718 B pUBVD7 pool pCT174 -9500-10811 I pUBVD8 pUR292 pCT65 10442-10811 pUBVD9 pUR292 pDT65 + pCT185 10442-12470 B pUBVDIO pUR290 pCT185 11030-12457 I 15 pUBVDll pUR290 pCT185 11405-12457 pUBVD12 pUR291 pCT63 597-1397 I PUBVD13 pUR290 pDT28 + pDT17 -6000—7800

Hver af de tolv cDNA-sekvenser blev blandet med 20 T4-ligase i nærværelse af Pstl-digererede blandinger af pUR290, 291 og 292 (eller af én af disse« hvis den kor- rekte læseramme var udledt), og ligationsblandingen blev transformeret ind i E. coli stamme D1210 (Lacl“-mutant B af HB101) til AmpR. Gunstige transformanter blev bekræf- 25 tet ved hybridisering roed mærket insertion, og isoleret plasmid DNA blev analyseret ved restriktoinsanalyse for B at bekræfte korrekt orientering. Ekspression blev indu- B ceret i gunstige transformanter indeholdende korrekt B orienterede insertioner ved behandling med IPTG (1 roM) B 30 på L-dyrkningsmedium indeholdende 40 pg/ml af ampicil- B lin. Tre timer efter induktion blev cellerne indvundet B og lyseret ved lydbehandling. Fusioneproteinerne blev B frembragt som inklusionslegemer, og inklusionslegemerne B blev indvundet ved metoden ifølge Klempnauer et al., ] I 35 Cell (1983) 3_3* 345-355, og lagret ved -20¾ suspende- 33 DK 175413 B1 ret i 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA. Omtrent 10-30 mg inklusions legeme-proteiner vandtes pr. ml kultur.

D.4. Karakterisering af fusions-proteinerne 5 Fusions-proteinerne blev karakteriseret med hen syn til deres antigene egenskaber både i uopløselige og opløseliggjorte former.

Inklusionslegeme-proteiner opløseliggjort i 1% SDS eller 7 M urinstof efterfulgt af dialyse til en en-10 delig koncentration på 1 rog/ml er ikke-reaktive med sera fra inficerede kalve eller fra kaniner inficeret med renset virus.

Fremstilling af antisera.

15 Både opløseliggjorte og ikke-opløseliggjorte in klusionslegemer blev injiceret i kaniner ved anvendelse af peri-lymfeknude-immuniseringer med 500 \iq protein emulgeret med "Freund's complete adjuvant", idet der blev forstærket hver 4 uger (IM-injektion af 500 μg 20 emulgeret i "adjuvant") og foretaget blodudtagning 10 dage efter forstærkning. Kontrol-antisera blev fremstillet fra inficerede kalve eller fra kaniner injiceret med renset virus. Antisera'ne blev testet for immunoak-tivitet ved ELISA og immunofluorescens, og ved Western 25 blot og iramunofældning.

Western blot og immunofældning gav komplementær information med hensyn til reaktivitet. Ved immunofældning omsættes den native proteinblanding med test-serum* et, og immunobundfaldet underkastes SDS-PAGE. Der-30 for fastsætter immunofældning immunoreaktivitet med det native portein.

Ved Western SDS blot-metoden gennemføres PAGE, før antisera'ne testes for fældning med proteinerne på gelen. Derfor fastsætter Western blot reaktivitet med 35 denatureret protein.

I DK 175413 B1 I

I 34 I

I Resultaterne fra disse processer er anført neden- I

I for· I

I Resultater I

5 Kontrol-antisera'ne var immunoreaktive med hen- I

H syn til proteiner ekstraheret fra virus-pellet*en frem- I

I stillet på BEKI-celler og viste immunofældning med 76 kD I

proteinet, der formodedes at være den antigene hovedkom- I

ponent, såvel som mindre komponenter, der formodedes at I

10 være, ihvertfald delvis, virion-proteiner med molekyl- I

vægte på 36, 43, 47, 51 og 56 kD· Ingen immunofældning I

forekom, når kontrol-antisera'ne blev testet på Western I

blot. Kontrol-antisera over for infektion reagerer såle- I

des med antigener i det native protein, men ikke efter I

15 denaturering. I

I Immunofældning og Western blot I

De fleste af de antisera, der var dannet i re- I

spons til fusions-proteinerne, var negative både ved im- 20 munofældningsprøven og, ligesom kontrol-antisera'ne, på

Western blot. I

Der var imidlertid undertageiser. Det antiserum, der var udviklet af fusionsprotein 7, immunofælder 36 kD-proteinet fra BEKI-dyrket virus og reagerer ved I 25 Western blot til 76 kD- og 51 kD-båndene. Antiserum fra I fusion 5 immunofælder 3 størrelser af proteiner: 65, 98 og 105 kD, hvilket er størrelser, der ikke fældes af I kontrol-antisera. Antiserum fra fusion 9 fælder et 58 I kD-bånd, der heller ikke fældes af kontrol-antisera'ne· 30 Betydningen af materialernes molekylvægt er ikke klar, I da det ikke er klart, hvilket, om noget, af disse prote- I iner, der repræsenterer glycosylerede materialer med I tilsvarende skift i molekylvægt.

35 DK 175413 B1

ELISA

ELISA (gennemført ved metoden ifølge Bartlett et al.. Protides of the Biological Fluids, H. Peeters, ed., Pergciinon Press, Oxford, 1976, 24:767-770) gjorde brug af 5 delvis renset virus som antigen. Kun det antiserum, der var fremstillet mod fusionsprotein 7, var positivt ved en 1:40 titer. Serum fremstillet mod fusionsproteiner 5 og 11 havde titere på 1:4 og 1:8. Ikke-immune sera var negative.

10

Immunofluorescens

Immunofluorescens gennemførtes ved anvendelse af mærkede levende eller fikserede inficerede celler. Det antiserum, der var fremstillet mod fusionsprotein 11, 15 var let positivt med hensyn til immunoreaktivitet med levende celler. På celler fikseret med methanol, acetone eller formaldehyd gav serum fremstillet fra fusionsprotein 7 den samme stærke respons som kontrol-antisera fra de inficerede dyr, mens antisera 5 og 3 var svagt posi-20 tive over for proteiner, der var ekstraheret fra viruspellet* en fremstillet på BEKI-celler.

Claims (18)

1. Nucleotidsekvens, der koder for et til kvæg- I I diarré relateret polypeptid, kendetegnet I I ved, at den er en region af den genomiske sekvens for I I 5 kvægdiarrévirus vist på figur 2 eller en kombination I af regioner i denne sekvens. I

2. Nucleotidsekvens kodende for et viralt poly- I I peptid, kendetegnet ved, at dette i det I væsentlige er identisk med det, der kodes for af den I I 10 genomiske sekvens for kvægdiarrévirus vist på figur I I I

3. Rekombinant ekspressionssystem, der i en I I forligelig værtcelle er i stand til at foretage pro- I I duktion af et til kvægdiarrévirusrelateret polypep- I 15 tid, kendetegnet ved, at systemet omfatter I I en DNA sekvens ifølge krav 1, der operativt er for- I bundet til en med værten forligelig kontrolsekvens. I

4. System ifølge krav 3,kendetegnet I I ved, at det opstrøms for den nævnte DNA sekvens og i I I 20 læseramme med denne yderligere inkluderer en fusione- I I ret nucleotidsekvens kodende for et værtprotein eller I I en del deraf. I

5. System ifølge krav 4,kendetegnet I I ved, at den fusionerede DNA sekvens koder for en N- I 25 terminal del af /?-galactosidase. I

6. Rekombinant vektor, kendetegnet I I ved, at den omfatter ekspressionssystemet ifølge krav I I 3. I

7. Rekombinante værtceller, kendeteg- I I 30 n e t ved, at de er transformeret med vektoren if øl- I I ge krav 6 eller med en vektor omfattende systemet I I ifølge krav 4 eller 5. I DK 175413 B1 37

8. Polypeptid, kendetegnet ved, at det i det væsentlige er identisk med hele aminosyre-sekvensen som vist på figur 2 eller med en region eller kombinationer af regioner deraf.

9. Polypeptid ifølge krav 8, kendeteg net ved, at det yderligere er fusioneret med et værtprotein eller en del deraf.

10. Vaccine, der er effektiv mod kvægdiarrévi-rus, kendetegnet ved, at den omfatter po- 10 lypeptidet ifølge krav 8 samt farmaceutisk acceptable excipienser.

11. Vaccine ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den yderligere indeholder en immunogen partikel, hvilken partikel omfatter et polypeptid med 15 en aminosyresekvens, der kan danne en partikel, når sekvensen frembringes i en eukaryotisk vært.

12. Vaccine ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den partikeldannende aminosyresekvens er afledt af hepatits B virus.

13. Vaccine ifølge krav 12, kendeteg net ved, at den partikeldannende aminosyresekvens er afledt af HBsAg.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ifølge krav 8, kendetegnet ved, at 25 man dyrker celler ifølge krav 7 og udvinder det re-kombinante polypeptid.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod kvægdiarré, kendetegnet ved, at den omfatter udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 14 30 med en yderligere tilsætning af farmaceutisk acceptable excipienser. I DK 175413 B1 I I 38 I

16. Anvendelse af et polypeptid ifølge et hvil- I I ket som helst af kravene 8 og 9 til fremstilling af I prøvesæt til immunologisk påvisning af fusionsprotei- I ner af kvægdiarrévirus. I I 5

17. Anvendelse af en nucleotidsekvens ifølge I krav 1 til konstruktion af som diagnostiske sonder I I nyttige oligonucleotidsekvenser. I

18. Anvendelse af en nucleotidsekvens ifølge I I krav 1 til fremstilling af en vaccine, der som bærer I I 10 omfatter levende viral vektor, der tillader ekspres- I sion af et ønsket kvægdiarrévirusantigen sammen med I I et protein fra bæreren i inficerede celler. I I 15 I I 20 I