JPH03164181A - 豚コレラウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は核酸配列、このような核酸配列を含む組換体核
酸分子、このような組換体核酸分子を含む組換体発現系
、豚コレラウイルスの形質を表すポリペプチド、このよ
うなポリペプチド又は組換体発現系を含むワクチン、及
びこのようなワクチンの製造方法に係る。

古くからの疾病である豚コレラ（ＨＣ）は世界中の多く
の国で経済上、重大な豚疾患である。自然条件下で豚は
ＨＣに感染することが知られている唯一の動物である．
豚コレラは毛細血管の壁に変性を生じ、ひいては内部器
官の出血及び壊死を招く伝染性の高い疾患である．まず
最初に、豚コレラは発熱、食欲不振、嘔吐及び下痢の症
状が現れ、その後、雌豚の不妊症、流産及び出産低下に
より特徴付けられる慢性過程の疾患が生じ得る．しかし
ながら、初期症状が現れてから２週間以内にほぼ全部の
豚は死亡する． 発現因子である豚コレラウイルス（ＨＣＶ）は、畜牛の
ウシウイルス性下痢ウイルス（ｅｖｏｖ）及び羊国境病
ウイルス（ＢＤＶ）に構造的及び血清学的に関係するこ
とが明らかにされている。これらのウイルスはトガウイ
ルス科のペスチウイルス属に分類される．ベスチウイル
スの遺伝物質の本質はＲＮ＾、即ち顕著なボリアデニル
化を欠失した＋！ＲＮ＾であることが古くから知られて
いる，　｝ＩＣＶは３〜５個の構造タンパク質を含むと
考えられ、そのうち２個はグリコシル化されている可能
性がある．非構造ウイルス性タンパク質の数は未知であ
る。

ＨＣ感染を予防するために種々の修飾ＨＣＶワクチン（
弱毒化又は殺したウイルスを含む〉が開発され、現在使
用されている．しかしながら、該修飾ウイルスワクチン
で使用すべき｝ＩＣＶ材料を得るために組織培養細胞を
感染すると、ウイルス収率が低く、ビリオンを精製する
のは困難である．修飾生ウイルスワクチンは、まだ病原
性であって接種動物又は子孫に疾患を生じさせ得る部分
的に弱毒化した病原性ＦＩＣＶを動物に接種する危険、
及びワクチン中の他のウイルスによる汚染の危険を常に
伴う．更に、弱毒化ウイルスは毒性状態に戻ることがあ
る． 不活化ワクチンを使用しても幾つかの欠点があり、例え
ばウイルスを部分的にしか不活化できないという危険、
低レベルの免疫しか達せられず、更に免疫感作が必要で
あるという問題、及び不活化処理により抗原決定基が変
化するので不活化ウイルスの免疫原性をかなり低下させ
るという問題などがある． 更に、修飾ＨＣＶワクチンの使用は根治プログラムには
適していない． 今まで我々の知る処では、ＨＣＶとＢＶＤＶ感染を区別
することが可能な豚の診断試験は存在していない．豚の
ＢＶＤＶ感染はＨＣＶ感染よりも重度が低く、従って、
ＢＶＤＶに感染した豚は根治する必要がないので、この
ことは重要である。

病原体に対する免疫応答を惹起することが可能な必須の
関連ＨＣＶ免疫原物質のみを含有するワクチンは、修飾
ワクチンの上記欠点を示さない．本発明によると、豚コ
レラウイルスに特異的なポリペプチドをコードする核酸
配列が知見された．該核酸配列又は該ポリペプチドのフ
ラグメントも本発明の範囲に含まれる。核酸配列及びポ
リペプチドの両方又はそれらのフラグメントは、ＨＣｖ
感染に対して動物を免疫感作するために必須の関連免疫
ｙＫ物質のみを含有するワクチンの製造に使用すること
ができる．「核酸配列」なる用語はリボ核酸配列及びデ
オキシリボ核酸配列の両方を意味する， 本発明の核酸配列を第２図に示す．当業者に周知のよう
に、遺伝暗号の縮重はコドン中の塩基の置換を可能にし
、その結果、同一アミノ酸をコードする別のコドンが存
在することになり、例えばアミノ酸グルタミン酸のコド
ンはＧＡＴ及びＧ＾＾の両方である．従って、第２図に
示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するため
には、第２図に示す核酸配列と異なるこのような別のコ
ドン組成を有する核酸配列を使用できることが明らかで
ある． 緊縮条件下で第２図に示す核酸配列にハイブリダイズす
る核酸配列も本発明の範囲に含まれる．これらの核酸配
列は第２図に示す核酸配列に関連するが、ヌクレオチド
置換、突然変異、挿入、欠失等を含んでもよく、第２図
に示すポリペプチドと機能的に同等のポリペプチドをコ
ードする。換言するなら関連するポリペプチドのアミノ
酸配列は第２図に示すアミノ酸配列と同一ではないが、
１１ｃＶに特徴的な対応する免疫特性を示す．このよう
な関連核酸配列によりコードされるポリペプチドも本発
明の範囲に含まれる．第２図に示す核酸配列はＩＩＣＶ
のゲノムＲＮ＾から誘導されるｃＤＮ＾配列である．こ
の連続配列は１２２８４ヌクレオチド長であり、３６４
〜３６６位の＾ＴＧコドンから始まって１２０５８〜１
２０６０位の翻訳終止コドンとしてのＴＧ＾コドンで終
わる１つの長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ
）を含む。このＯＲＦは４３５ｋＤａのタンパク質をコ
ードすることが可能な３８９８個のコドンから構成され
る。

ｉｎ　ｖｉｖｏでは、感染細胞におけるＨＣＶの複製中
に、このタンパク質はポリタンパク質前駆物質分子とし
て合戒される．この前駆量畳分子は、その後一（酵素的
）切断を受けて複数のフラグメントボリベプチドとなる
ものである．これらのフラグメントは翻訳後修飾が行わ
れる場合はその後に、ウイルスの構造及び非構造タンパ
ク質を形成する．好適な核酸配列のｌ例は、ＨＣＶに対
する免疫化特性もしくはＨＣＶに特異的な・免疫特性を
有するようなフラグメントの遺伝情報を含むか、又はＨ
ＣＶの形質を表す免疫特性もしくは免疫学的形質を維持
する、このようなフラグメントの一部の遺伝情報を含む
．ＩＣに対する動物の免疫感作又はＨＣの診断に使用可
能な、第２図のポリペプチドのフラグメントポリペプチ
ド及びその部分も本発明の一部を形或する。フラグメン
トコーディング領域は約１〜２４９、２６３〜４８７、
４８８〜６８８又は６８９〜１０６７のアミノ酸位置内
に配置される．１〜２４９領域は本質的にコアタンパク
質を表し、２６３〜４８７，４８８〜６８８及び６８９
〜１０６７領域は本質的に夫々３３ｋＤ、４４／４８ｋ
Ｄ及び５５ｋＤの糖タンパク質を表す．上記コーディン
グ領域の１以上の遺伝情報を含む核酸配列又はその部分
も本発明の範囲に含まれる． ＨＣＶ感染に対するワクチンに取り込むべき好適領域は
ＩＩＣＶの５５ｋＤタンパク質に対応する領域、又は免
疫活性を維持する該領域の一部である．更に、本発明に
よると、少なくとも該５５ｋＤタンパク質のコーディン
グ配列を含む核酸配列又はその一部を有利に適用するこ
とができる．更に、ＩＩｃＶ感染に対する豚の免疫感作
に使用され得るＨＣＶ５５ｋＤタンパク質の好適部分は
、ウイルス中和活性を有する抗５５ｋＤタンパク質モノ
クローナル抗体でＨＣＶ欠失突然変異体を分析すること
により決定される．エビトープを含むこのような部分は
約８１２〜８５９のアミノ酸配列に相当し、約２７９９
〜２９３８のヌクレオチド配列によりコードされる．少
なくとも該アミノ酸配列を含むポリペプチド又は少なく
とも該ヌクレオチド配列を含む核酸配列も本発明の一部
を形成する． 豚のＨＣＶ感染の診断に使用することができ且つＢＶＤ
ＶからＦＩＣＶを区別するために適用することが可能な
本発明の核酸配列は、５５ｋＤタンパク質をコードする
遺伝子から誘導され得る． 好ましくは、このような核酸配列はヌクレオチド配列２
５８７〜２６１９又は２８４２〜２８８０から誘導され
、これらの配列はいずれも５５ｋＤタンパク質をコード
する遺伝子の一部である．診断の目的に好適なオリゴヌ
クレオチドは５“一ＣＣＴ　ＡＣＴ＾＾Ｃ　ＣＡＣ　Ｇ
ＴＴ＾＾ＧＴＧＣ　ＴＧＴ　ＧＡＣ　ＴＴＴ＾＾＾−３
′又は５’　−ＴＴＣ　ＴＧＴ　ＴＣＴ　Ｃ＾＾ＧＧＴ
　ＴＧＴ　Ｇ（：Ｇ　ＧＣＴ　ＣＡＣ　ＴＧＣ　ＴＧＴ
　ＧＣＡ　ＣＴＣ　−３’である． 更に、少なくとも該オリゴヌクレオチドのサブ配列を含
み且つＨＣＶとＢＶＤＶを区別するために使用すること
が可能な核酸配列も本発明の一部を形成する． 本発明はアッセイ（分析・検定）で使用されるテストキ
ットにも係り、このテストキットは本発明の核酸配列を
含む。

好ましくは、テストキットは上記オリゴヌクレオチド又
は少なくともそのサブ配列を含む核酸配列を含む． 同一の免疫特性を維持するならば、第２図に示すポリペ
プチド又はそのフラグメントに変異や修飾があってもよ
く、例えば別の種又は他の誘導体間におけるような通常
の変異が許容される．これらの変異は配列全体における
１以上のアミノ酸の相異又は該ポリペプチド中のアミノ
酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加により示され得る
。

更に、ＤＮ八組換技術を使用して例えば基本ＤＮＡの特
定部位の突然変異誘発により、１又は複数のアミノ酸置
換、欠失、付加又は位置交換（ｒｅｐｌａｃｅｓｅｎｔ
）により種々に修飾された第２図に示すボリペプチド又
はそのフラグメントの種々の誘導体を製造することがで
きる．第２図に示すボリベプチド又はそのフラグメント
の本質的形質活性が本質的に変わらない限り、そのポリ
ペプチド又はそのフラグメントの誘導体をもたらすこの
ようなあらゆる修飾も本発明の範囲に含まれる． ペレット化したビリオンから単離したＲＮ＾を取り出し
、ｃＤＮ＾の合戒に使用した．このｃＤＮ＾をファージ
λｇｔｔｔにクローニングし、夫々のライブラリーを増
幅し、ヤギ抗ＨＣＶ抗血清でスクリーニングした．２つ
の陽性クローンを同定することができ、これらのクロー
ンは０．８ｋｂ及び１．８ｋｂの寸法のインサートを有
することが判明した，　０．８ｋｂ＾ｇｔｔｔインサー
トを部分的に配列決定（第３図）した処、ＨＣＶゲノム
（第２図）上の約１．２〜２．０ｋｂの間に位置するこ
とが判明した． 感染動物の｝ＩＣＶの診断のために使用することができ
、驚くべきことにＨＣＶをＢＶＤＶがら区別するために
適用することが可能な本発明の核酸配列は、第２図に示
すヌクレオチド配列５５５ｌ〜５７９３により表される
． 更に、少なくとも該ヌクレオチド配列のサブ配列を含み
且つＨＣＶとＢＶＤＶとを区別するために使用すること
が可能な核酸配列も本発明の一部を形成する． 本発明は更に、アッセイで使用されるテストキットにも
係り、該テストキットは本発明の核酸配列を含む。

好ましくはテストキットは第２図に示すヌクレオチド配
列５５５１〜５７９３により表される核酸配列、又は少
なくとも上記配列のサブ配列を含む核酸配列を含む． ベレット化したビリオンから単離したＲＮ＾を取り出し
、ｃＤＮ＾の合成に使用した．このｃＤＮ＾をファージ
λｇｔｌｌにクローニングし，夫々のライブラリーを増
幅し、ヤギ抗ＨＣＶ抗血清でスクリーニングした．２つ
の陽性クローンを同定することができ、これらのクロー
ンは０．８ｋｂ及び１．８ｋｂの寸法のインサートを有
することが判明した，　０．８ｋｂのλｇｔｌｌインサ
ートを部分的に配列決定（第３図〉した処、１１ｃＶゲ
／　ム（第２図）上の約１．２及び２．０ｋｂノ間ニ位
置することが判明した． 本発明の核酸配列を、プラスミドＤＮＡ、バクテリオフ
ァージＤＮＡ又はウイルスＤＨ八のような種々のベクタ
ー核酸分子に連結し、組換体核酸分子を形或することが
できる．ベクター核酸分子は好ましくは、転写及び翻訳
を開始、調節及び終止するためのＤＮＡ配列を含む。こ
のような組換体核酸分子を含む宿主を含む組換体発現系
を使用して、本発明の核酸配列に、該核酸配列によりコ
ードされるポリペプチドを発現させることができる．上
記組換体発現系の宿主は例えば細菌（例えば大腸菌、枯
草菌及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ウイルス（例えば
ワクシニア及び鶏痘ウイルス）のような原核起源でもよ
いし、又は例えば酵母やより高等な真核細胞（例えば昆
虫、植物又は動物細胞〉のような真核起源でもよい． １１Ｃに対する動物の免疫感作は例えば、本発明のポリ
ペプチドを所謂「サブユニット」ワクチンとして動物に
投与することにより実施され得る．本発明のサブユニッ
トワクチンは、場合によって医薬上許容可能なキャリャ
ーの存在下で一般に純粋形態のポリペプチドを含む． 小さいフラグメントはその免疫原性を高めるためにキャ
リャー分子と結合すると好ましい．このために適当なキ
ャリャーは高分子であり、例えば天然ボリマーくキーホ
ールリンベットヘモシアニン、アルブミン、毒素のよう
なタンパク質）、ポリアミノ酸（ボリリシン、ボリアラ
ニン）のような合或ボリマー、又はサボニンのような両
親媒性化合物のミセルである．あるいは、これらの７ラ
グメントはそのボリマー、好ましくは線状ポリマーとし
て提供され得る．このようなサブユニットワクチンで使
用されるポリペプチドは、例えば豚コレラウイルスから
の該ポリペプチドの単離、組換ＤＮ＾技術又は化学的合
成により、当業者に既知の方法により製造することがで
きる． 必要に応じてワクチンで使用される本発明のポリペプチ
ドは、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化
又はホスホリル化によりｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖ
ｉｖｏで修飾することができる．サブユニットワクチン
の代わりに「ベクター」ワクチンを使用してもよい．本
発明の核酸配列を組換技術により別の微生物（例えばウ
イルス又は細菌）の遺伝物質に取り込ませ、微生物が本
発明のポリペプチドを発現できるようにする．この組換
発現系を免疫感作すべき動物に投与すると、該系はその
後、接種動物中で複製し、ポリペプチドを発現し、その
結果、動物の免疫系を刺激する。ワクチンベクターの適
当な例は発疹ウイルス（例えばワクシニア、牛痘、ウサ
ギ痘）、鳥ｍ発疹ウイルス（例えば鶏痘ウイルス）、偽
狂犬病ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイ
ルス、バクテリオファージ又は細菌（例えば大腸菌及び
サルモネラ菌）である． 本発明の核酸配列がその核酸配列に挿入されている組換
体発現系は例えば細胞培養で増殖させることができ、必
要に応じて感染細胞から回収し、場合によって凍結乾燥
形態のワクチンに形成することができる．該遺伝操作微
生物は該微生物が感染した生きている動物から回収する
こともできる．上記組換体発現系は本発明のポリペプチ
ドを発現する細胞培養で増殖させ、その後、ポリペプチ
ドを培地から単離してもよい。

本発明のポリペプチド又は組換体発現系を含むワクチン
は、このようなワクチンに関して当業者に周知の手順に
より製造することができる．本発明のワクチンは特に、
完全な宿主、宿主抽出物、部分的もしくは完全に精製し
たポリペプチド又は部分的もしくは完全に精製した上記
のような組換体発現系から構戒され得る。

本発明のワクチンは従来の能動免疫方式で投与すること
ができ、即ち、投与配合に適合可能な方法で治療上有効
且つ免疫原性となるような量を１回又は繰り返し投与す
る。ワクチンの投与は例えば皮肉、皮下、筋肉内、静脈
内又は鼻腔内の経路で実施され得る。腸管外投与の場合
、ワクチンは更に、適当なキャリャー、例えば水、食塩
水又は！！溶液（アジュバント、安定剤、可溶剤、乳化
剤等を含むか含まない）を含有し得る。

ワクチンは更に、多価ワクチンを製造するために、パル
ボウイルス、偽狂犬病ウイルス、豚インフルエンザウイ
ルス、ＴＧＥウイルス、ロタウイルス、大腸菌、Ｂｏｒ
ｄｅｔｅｌ　Ｉａ＋Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ　ｌａ＋Ｅｒｙ
ｓｉｐｅｌａｓ等の抗原のように他の疾患に関連する免
疫原又はこれらの免疫原をコードする核酸配列を含有し
得る。

本発明のポリペプチドは、動物におけるＨＣＶ抗原又は
抗体の存在を検出するための診断法で使用することもで
きる。更に、本発明の核酸配列は上記診断法で使用され
るポリペプチドを製造するため、又はサンプル中のＨＣ
Ｖ核酸の存在の検出のためのハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用することができる。

ＡＩＤ細胞をｌＯ％ＦＣＳを含有するＤＨＥＭ中で増殖
させ、５　ｘ　１０’／ｚｆノＨＡ胞濃度テ２０〜３０
１Ｉ１ノ容量中ノＨＣｖ株＾ｌｒｏｒＬにより、懸濁液
中、３７℃で９０分間０．０１〜０．００１のｍ．ｏ．
ｉ。（蛍光抗体アッセイより決定）で感染させた。その
後、ＰＫ１５細胞を組織培養プレート（直径１５０ｍｍ
）に播種し、一方、懸濁細胞３８＾．Ｄは弱く撹拌しな
がら瓶（スイス、Ｔｅｃｎｏｍａｒａ社）中でインキュ
ベートした。ｃＤＮ八合戒のために、組織培養物上清を
感染から４８時間後に回収し、ＩＺＯＯＯｇで清澄化し
、その後、ウイルスをＴＦ＾２０ローター（イタリー、
Ｃｏｎｔｒｏｎ社）で５４０００ｇで１２時間かけてベ
レット化した． ＨＣｖ゛の　　。標準細胞培養技術により子ヤギの皮膚
生検からフイブロブラスト細胞系を作成した。細胞をま
ず１０％ＦＣＳを含むＦ−１０培地で増殖させ、その後
、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させた．ヤギフ
イブロブラストにＨＣＶを感染させた。感染ｆ＆（ｐ．
ｉ．）の最初の２６時間、細胞を８時間毎にＰＢＳで３
回洗い、その後、１０％プレ免疫ヤギ血清（ＰＧＳ）を
含むＤＭＥＭ中でインキユベートした．感染から４８時
間後、組織培養物上清を回収し、ストックウイルスとし
て使用した。免疫感作前に、３０個の組織培養皿（直径
１５０ｍ＋ｍ）におけるヤギ細胞をｌＯ％ＰＧＳを含む
培地で３継代維持し、その後、スヤギをＸ線で不活化し
たペレット化ウイルス及び感染細胞で免疫感作した。こ
れらの免疫材料はいずれもフロイントアジュバント（基
本免疫（ｂａｓｉｓｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）では完
全アジュバント、ブースター注射では不完全アジュバン
ト）中で乳化し、皮下注射した。変性分子を認識する抗
体を得るために、抗原調製物を注射前５分間０．２％Ｓ
ＤＳ、３ｍＭ　ＤＴＴ中で９５℃でインキユベートした
。

ＲＮ八ｅＤＮ＾ム　　び　ローニン　，Ｃｈｉｒｇｗｉ
ｎ他（１９７９）により記載のグアニジンチオシアネー
ト法を使用することにより、ビリオンからのＲＮＡを単
離した。ペレット化ビリオンからのＲＮ＾（ｈｌ？全Ｒ
ＮＡ、約０．５．ｇＨＣＶ　ＲＮＡ）及び水２〇一中ノ
０．１ｕｙ（１）ランダムへキサヌクレオチドブライマ
ー（スウェーデン、Ｐｈａｒｎａｃｉａ社）を１０分間
で６５℃に加熱し、水冷し、最終容量３２ｕｌ中の第１
Ｍ［衝液（５０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８．３
；　３０ｍＭ　ＫＣＩ；　８ｍＭ　ＭｇＣＩ２：　ＩＩ
ｌＩＭ　ＤＴＴ、ＲＮ＾ガード［スウェーデン、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社コ）に調整した。３５単位の＾ＭＶ逆転
写酵素（米国、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社〉を加えた
。４３℃で１時間後、反応混合物を第２鎖合戒混合物（
スウェーデン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のｃＤＮ八合成キ
ット）の１つのバイアルに加えた．第２Ｍ合或、プラン
ト（ｂｌｕｎｔ）末端の作成並びにＥｃｏＲＩアダプタ
一連結及びホスホリル化を製造業者により推奨されてい
るように実施した。

ｃＤＮ八を調製的アガロースゲル電気泳動でサイズによ
り分画した。０．５ｋｂよりも小さいＤＮ八分子を含む
ゲル部分を廃棄した。ゲルを１５分間逆に流すことによ
り残りのＤＮＡを濃縮し、凍結及び解凍の３サイクル後
にアガロースからフェノール抽出した．エタノールで共
沈させたｃＤＮ八及びλｇｕｔ　ＤＮ＾（米国、Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社のＥｃｏＲ　［消化した脱ホスホリル化アー
ム１μＦＩ）を合計容量１０μｌのリガーゼ緩衝液（３
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ　ｐＨ７．４；　１０ｍＭ　
ＭｇＣＬ；　１０ｍＭ　ＤＴＴ；１ｍＭ　ＡＴＰ）中の
３単位のＴ４　ＤＮ八リガーゼ（スウェーデン、Ｐｂａ
ｒｍａｃｉａ社〉により連結した。製造業者により推奨
されているように、市販抽出物（米国、Ｐｒｏｍｅｇａ
社、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ）でｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケー
ジソグし、大腸菌Ｋ１２細胞（Ｙ１０９０株）を得られ
たファージに感染させた．文献（Ｄａｖｉｓ他、１９８
６）に記載されているようにライブラリーを１回増幅し
た。

λ　１１１−イブラｌ一のス　１−ニング．米国Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社から購入したＰｒｏｔｏｂｌｏｔ系（Ｈｕｙ
ｎｈ他、１９８５）及び１０”の血清希釈液を使用して
文献（Ｙｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ、１９８３）に記載さ
れているように第１次のスクリーニングを行った。バッ
クグラウンド減少のために、ヤギ抗ＨＣＶ血清を０．８
ｍｇ／ｘ１の大腸菌（Ｙ１０９０株）で処理した（Ｈｕ
ｙｎｈ他、１９８５）．夫々０．８ｋｂ及び１８ｋｂの
インサートを有する２つの陽性クロー〉′を同定するこ
とができた。

ニツクトランスレーション　びノー　ンハイブリダイゼ
ーション．ニックトランスレーション（西ドイツ、＾−
ｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ社のニツクトランスレ−
ションキット）により［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ（西ドイツ
、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ社、３０００Ｃｉ
／　ｍＭｏｌｅ）で標識した５０ｎｙの０．８ｋｂ　Ｈ
ＣＶ核酸配列を６８℃で１２〜１４時間、ハイブリダイ
ゼーション混合物（５ｘＳＳＣ；　ｌｘＤｅｎｈａｒｄ
ｔ’ｓ；　２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．８．０．
１％ＳＤＳ及び１００ｌＪｙ／ｚｌの酵母ｔＲＮ＾［西
ドイツ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ＋社
］）濃度５ｎｇ／ｘ１でノーザンフィルターにハイブリ
ダイズした。次に文献（Ｋｅｉｌ他、１９８４）に記載
されているように膜を洗い、＾ｇｆａ　Ｃｕｒｉｘ　Ｍ
Ｒ８００増感スクリーンを使用して時間を変えながら−
７０℃でＫｏｄａｋ　Ｘ−０靖ａｔ　ＡＲフィルムにａ
露した． ０．８ｋｂ核酸配列は無傷のＨＣＶ　ＲＮ＾のみならず
その分解物にもハイブリダイズした。０．８ｋｂ核酸配
列は１．８ｋｂ核酸配列にハイブリダイズせず、従って
、これらの２つの核酸配列はゲノムＲＮ＾の同一領域に
配置されないＨＣＶゲノムのフラグメントに対応すると
考えられる。

ヌクレ　　ド　１′．標準手順（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、
１９８２）に従ってＨＣＶ特異的ファージＤＮＡインサ
ートをプラスミドｐＥＭＢＬ１８＋にサブクローニング
した．組喚体ｐＥＨＢＬブラスミドの一重鎖ＤＮ八を文
献（Ｄｅｎｔｅ池、１９８５）に記載されているように
作成した．製造業者（スウェーデン、Ｐｈａｒ＋ｗａｃ
ｉａ社）により推奨されているようにジデオキシ配列決
定反応（Ｓａｎｇｅｔ他、１９７７）を実施した。

同様に、ＲＮ＾作成、ｃＤＮ＾合成、寸法選択及び共沈
したｃＤＮ＾とλｇｔｌｏ　ＤＮ＾（米国、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社のＥｃｏＲ　Ｉで消化した脱ホスホリル化アーム
１μｇ〉との連結を行った。製造業者により推奨されて
いるように、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ（米国、Ｐｒｏｍｅｇ
ａ社）を使用してファージＤＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏパ
ッゲージングすると共に、大腸菌株Ｃ　６００　ＨＦＬ
上のファージを滴定した．ライブラリーを１回増幅（Ｄ
ａｖｉｓ他、１９８６）　Ｌ、ニトロセルロース膜（西
ドイツ、＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｕｃｈｌｅｒ社）（Ｂｅ
ｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ、１９７７）に移したレプリカ
をノーザンハイブリダイゼーションについて上述したよ
うにオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした，（Ｂｅ
ｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ，　Ｌ９７７）により記載され
ているようにニクトランスレーション（西ドイツ、＾ｍ
ｅｒｓｈａｍＢｕｃｈｌｅｒ社、ニツクトランスレーシ
ョンキット〉により［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したｃ
ＤＮ＾フラグメントでスクリーニングした。陽性クロー
ンをブラーク精製し、インサートをｐＥＭＢＬブラスミ
ド（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２；　Ｉ）ｅｒ＋ｔｅ
他、１９８５；　Ｄａｖｉｓ他、１９８６）にサブクロ
ーニングした。

アミノ酸配列Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ
　ＰｈｅをコードするＲＮ＾配列に相補的な１７塩基の
３　２　ｐ５’末端標識オリゴヌクレオチドを使用して
λｇｔｌｏ　ｃＤＮ＾ライブラリーをスクリーニングし
た，　ＨＣＶの約１２ｋｂのゲノムＲＮ＾にハイブリダ
イズしたこのオリゴヌクレオチドは、同様にＩ｛ＣＶ　
ＲＨ＾にハイブリダイズした０．７５ｋｂのインサート
を有するクローンを特に認識した。ＨＣＶゲノムのフラ
グメントを表すこの０．７５ｋｂ核酸配列を０．８ｋｂ
λｇｔＬ１核酸配列インサートと共に使用して更にライ
ブラリースクリーニングした処、第１図に示す相対位置
及び制限部位地図を有する１組のオーバーラッ７するＨ
ＣＶ核酸配列が確認された。■Ｃ■ゲノムのこれらの核
酸配列フラグメントは次の核酸位置： ４．０ｋｂフラグメント：２７〜４０２７４．５ｋｂフ
ラグメント：５４〜４４９４０．８ｋｇフラグメント：
　１１４０〜２００２４．２ｋｂフラグメント：　３２
４８〜７２５２５．５ｋｂフラグメント：　６６５６〜
１１８１９及びほぼ次の核酸位置： ３．０ｋｂフラグメント：　　８９２０〜１１９２０１
．９ｋｂフラグメント：　　１０３８４〜１２２８４０
．７５ｋｂフラグメント：　１０９１３〜１１６６３に
配置される． レ　　゛　。完全なヌクレオチド配 列決定のために、エキソヌクレアーゼ■及びヌクレアー
ゼＳｌ（西ドイツ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ社から入手した酵素）を使用してｐＥＭＢＬ１８
＋又は１９＋ブラスミド（ｌｌｅｎｎｉｋｏｆｆ，　１
９８７）にサブクローニングしたＨＣＶ誘導ｃＤＮ＾イ
ンサートの欠失ライブラリーを作成した，　Ｔ７ポリメ
ラーゼ配列決定キット（スウェーデン、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社）を使用して、一重鎮（Ｄｅｎｔｅ他、１９８５
）又は二重鎮ＤＮＡ鋳型のジデオキシ配列決定（Ｓａｎ
ｇｅｒ他、１９７７）を行った．ｃＤＮ＾フラグメント
から第２図に示すように１２２８４ヌクレオチド長の連
続配列を決定することができた．この配列は３６４位〜
３６６位の＾ＴＧコドンがら開始して１２０５８〜１２
０６０位の翻訳終止コドンとしての丁Ｇ＾で終止する１
つの長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含
む．このＯＲＦは第２図に示すアミノ酸配列を有する４
３５ｋＤａタンパク質をコードすることが可能な３８９
８個のコドンから構戒される。ウイルス集団に異種性が
存在する場合に生じるヌクレオチド配列の差異の結果と
して３つのヌクレオチド交換が検出され、そのうちの２
つは予想アミノ酸配列の変化（第２図）を生じた。

結論すると、上記手順によりほとんど完全なＨＣＶゲノ
ムのクローニングと配列決定とがなされた。

抗ＨＣＶ血清で同定した免疫｝ＩＣＶボリペブチドをコ
ードする０．８ｋｂλ８ｔ１１核酸配列を部分的に配列
決定（第３図）した処、この配列はＨＣＶ　ＲＮＡ上の
１，２〜２．０ｋｂの範囲に位置することが判明した。

現， ■ＣＶゲノムの２つの領域がら誘導されたｃＤＮ＾フラ
グメント，即ちアミノ酸２６２〜５４６（第２図）をコ
ードする実施例１　ｃｒ）０．８ｋｂ＾ｇｔｔｔインサ
ート及びアミノ酸７４７〜１０７１（第２図）をコード
する核酸配列はｐＥｘ系（ＳＬｒｅｂｅｌ，　Ｋ他、１
９８６）における融合タンパク質として発現させた。

細菌抽出物をＳＤＳ−ＰＡ［：Ｈにより分離し、標準手
順に従って染色し、その後、ウエスタンプロットで実施
例１のヤギ抗ＨＣＶ血清との反応性を試験した．１｛Ｃ
Ｖ特異性融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより部分
的に精製し、ニトロセルロースに移し、ヤギ抗ＨＣ■血
清と共にインキユベートした．溶ｌＩＩ後に該融合タン
パク質に対する特異抗体を得た．上記融合タンパク質に
特異的な抗体を放射線免疫沈降アッセイで使用した． 虻Ｌ ｐＥｘ系で発現された両方の融合タンパク質はヤギ抗Ｈ
ＣＶ血清との反応後にＨＣＶに特異的であることが明ら
かに確認された。

両方の融合タンパク質に対して作成した単一特異性抗血
清はＨＣｖ糖タンパク質を沈降させた．２６２〜５４６
位の融合タンパク質に特異的な抗体は４４／４８ｋＤ及
び３３ｋＤタンパク質を沈降させ、７４７〜１０７１位
の融合タンパク質に特異的な抗体はウイルス感染細胞か
らの５５ｋＤタンパク質を沈降させた。

ｔｌｉｎｒＩ制限部位（ヌクレオチド３７２〉から始ま
り人工ＥｃｏＲ　１部位（ヌクレオチド４０００）で終
わる第１図に示す４．０ｋｂクローンのフラグメント（
ｐＨｃＫ１１）を作成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９
８２）。

５′末端に、ＢａｍＨ　Ｉ適合性の突出部、翻訳開始コ
ドンとして元の＾ＴＣ（３６４〜３６６）及び３′末端
に、Ｈｉｎｆ　Ｉ適合性の突出末端を含むオリゴヌクレ
オチドアダプターを合成した。

５　　　ＧＡＴＣＣ＾［’ＣＡＴＧＣＡＧＴＴ　　　　
　　　Ｆｌｉｎｆ　　ｌＢａｍＨ　Ｉ　　　　ＧＴＧＧ
ＴＡＣＣＴＣ＾＾ＣＴＴ＾　５゜構築物の３′末端にお
いて、ＥｃｏＲ　ｌ突出末端をヤエナリヌクレアーゼで
欠失させ、プラント末端Ｓｔｕ　ｌ　／ＥｃｏＲ　Ｉア
ダプター残基に連結することにより翻訳終止コドンを導
入した（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２）。

５’　ＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣ　　３’　ＥｃｏＲ　（Ｃ
（：ＧＡＣＴＴ八八Ｇ 上記｝ＩＣＶ配列をワクシニアウイルスに挿入する前に
、異種遺伝子を組換体ベクターにクローニングした。こ
のために、４．９ｋｂチミジンキナーゼ配列の内側でＰ
７．５Ｋプロモーターの下流にクローニング部位を含む
ｐｃｓａｚプラスミド（Ｃｒａｎａｇｅ，　Ｍ．Ｐ．池
、１９８６）を使用した。クローニング部位は３つの固
有の制限部位、ＢａｍＨ　Ｉ　．　Ｓｍａ　Ｉ及びＥｃ
ｏＲ　Ｉを含む。上記ＨＣＶ配列（３７２〜４０００）
をアダプターと共にＢａｍＨ　Ｉ　／ＥｃｏＲ　Ｉで消
化したｐＧＳ６Ｚに連結することにより、組換体ベクタ
ーｐＧｓ６２−３．８を作成した。

アラスミドを・基に１５個の欠失突然変異体から成る組
を作成した．続いてエキソヌクレアーゼ■（Ｈｅｎｎｉ
ｋｏｆ他、１９８７）で処理することにより、３′末端
から｝ＩｃＶ　ｃＤＮ＾を短縮した。全欠失は約１００
ｂｐの除去によりＨＣＶ５５ｋＤタンパク質をコードす
る領域の内側に位置し、ヌクレオチド２５８９で終結す
る突然変異体１５では５５ｋＤタンパク質のほとんどが
失なわれている。Ｅｘｏ　ＩＩ［で短縮したｃＤＮ＾ク
ローンをｐＧＳ６２に連結し、ｐＧＳ６２−３．８Ｅｘ
ｏｌ〜１５を得た（第４図）。

ＣＶＩ細胞を０，１のＭＯＩでワクシニア（Ｃｏｐｅｎ
ｈａｇｅｎ株、突然変異体ＴＳ７）に感染させた。感染
がら３時間後、ｐＧｓ６２−３　．８ＤＮＬ＆びワクシ
ニアｌｌＩＲＤＨ八をＣａ。（ＰＯ．＞２沈降法により
トランスフェクトし、２日間インキユベートした．ウィ
ルス子孫を回収し、プロムーデオキシーウリジン（１０
０ｕｙ／ｚ／）の存在下で１４３ｔｋ一細胞上のＬト表
現型を選択した。この選択は少なくとも２回実施し、そ
の後、プラーク精製を更に２サイクル行った， ワクシニア−１１ｃＶ組　　の　　　げＣＶＩ細胞を２
〜１０のＭＯＩでワクシニア−１１ｃＶ組換体に感染さ
せ、８〜１６時間インキユベートした。細胞の固定後、
ＨＣＶ５５ｋＤタンパク質に特異的なモノクローナル抗
体又は多価抗ＨＣＶ血清のいずれかを使用して間接免疫
蛍光を実施した。いずれの場合も細胞質蛍光を確認する
ことができた。

ワクシニア組換体で感染した細胞の放射線免疫沈降及び
ウエスタンプロット分析後、４つのＨＣＶ特異的タンパ
ク質が検出された。［３Ｈ］グルコサミンで標識するこ
とにより、これらのタンパク質のうち３種はグリコシル
化されていることが判明した。

これらのタンパク質の見掛けの分子量は＋１　Ｃ　Ｖ特
異性血清を有するＩＩｃＶ感染細胞に見出されたもの、
即ち２０ｋＤ（コア）、４４／４８ｋＤ、３３ｋＤ及び
５５ｋＤと同一であった． ワクシニアウイルスによる発現により産生されるタンパ
ク質はＨＣＶ感染細胞と同一の見掛けの分子量を有する
ので、タンパク質分解処理及び修飾は信頼できると思わ
れる． マウスにおＣる　ＨＣＶ　　　　　の一４群のマウスく
３匹／群）に ａ．ワクシニアＷＲ野生型（５ｘ　１０’ｐｆｕ／個体
）（ＷＲ）ｂ．ワクシニア３．８組換体（５ｘ　１０’
ｐｆｕ／個体）（ＶＡＣ３．Ｃ．ワクシニア３．８Ｅｘ
ｏ４（５５ｋＤ欠失）（５Ｘ　１０’ｐｆｕ／個体）（
ＶＡＣ．３．８Ｅｘｏ　４） ｄ．ワクシニア３．８Ｅｘｏ５（５Ｘ　１０’ｐｆｕ／
個体）（ＶＡＣ３．８Ｅｘｏ５） ｅ．ワクシニア３．８Ｅｘｏｌ５（５５ｋＤ）（５Ｘ　
１０’ｐｆｕ／個体）（■＾Ｃ３．８Ｅｘｏｌ５） の精製ウイルスを腹腔内注射により１回感染させた． ３週間後にマウスを瀉血した．連続希釈後にＰＫ［１５
］！胞上ノＨＣＶ（Ａｌｆｏｒｔ）テウイルス中和アッ
セイで血清の反応性を検査した（Ｒｉｉｍｅｎａｐｆ，
　Ｔ．他、１９８９）。

史１ｊｌ４ ａ．ｌ４Ｒ　　　　　　　　　　　　　＜１：２ｂ．Ｖ
ＡＣ３．８　　　　　　　　　　　１：９６ｃ．ＶＡＣ
３．８Ｅｘｏ４　　　　　　　　１：９６ｄ．　Ｖ＾Ｃ
３．８Ｅｘｏ５　　　　＜　１　：２ｅ．　ＶＡＣ３．
８Ｅｘｏｌ５　　　　＜　１．２以上の結果から、全構
造タンパク質の遺伝情報を含む核酸配列を含むワクシニ
アウイルス（■八Ｃ３．８〉はマウスにウイルス中和抗
体を誘導できるが、不完全な構築物ＶＡＣ３．８Ｅｘｏ
　５〜ｌ５及びＷＲはそうでないと結論することができ
る． 全欠失はＨＣＶ５５ｋＤタンパク質（５５ｋＤタンパク
質の大部分はヌクレオチド２５８９で終結する突然変異
１５では失われている〉をコードする領域内に位置し、
他の構造タンパク質は依然として組換体ワクシニアウイ
ルスにより発現されているので、５５ｋＤタンパク質が
ＨＣＶ中和抗体の誘導に関与することは明らかである． 夾Ａ』Ｌ［ ３匹の子ブタ（体重約２０＆ｇ）のうちのｌ匹（Ｎｏ．
　２８）を野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ株）に感染
させ、他の２匹（Ｎｏ．　２６．２７）をく夫々静脈内
及び皮肉で〉組換体Ｖ八Ｃ３．８に感染させた．感染に
あたってはｌ×１０’ｐｆｕのワクシニアウイルスを各
動物に適用した。

感染後６日目に乱切の側の紅斑と発熱（４１℃）とが観
察され、ワクシニア感染過程の臨床兆候が現れた． ワ　シニ　　　　コレー　　ルス 感染から３週間後に、ワクシニア（ＣＶＩ＠胞上のＷＲ
）及びＩＩｃＶ（ＰＫ１５細胞上の＾ｌｆｏｒｔ）に対
する夫々の血清の反応性を検査した． 血清の連続希釈後に、６ｐｅの完全な不在（ワクシニア
）又は免疫蛍光中の特異的信号（ＨＣＶ）を検査するこ
とにより中和を調べた（Ｒｊｉｍｅｎａｐｆ　，Ｔ．他
、１９８９），ワクシニアに　　る ブタ２８（阿Ｒ）１：８ ブタ２６（ＶＡＣ３．８）　　　　１：１６ブタ２７（
■＾Ｃ３．８）　　　　１：１６ＨＣＶに・　る ブタ２８（ＷＲ）　　　　　　＜１：２ブタ２６（■＾
Ｃ３．８）　　　　　１　：３２ブタ２７（■＾Ｃ３．
８＞　　　　　１：１６肛ヱ蓋ｊ≧ＬΔ」１ ワクシニアによる免疫感作から４週間後、ブタの各々を
５ｘ　１０’ＴＣＩＤｓｏＨＣＶ＾Ｉｆｏｒｔで感染さ
せることにより攻撃した。感染の天然経路に従ってウイ
ルスを鼻腔に適用した。この量のウイルスはブタの強制
致死量であると実験的に決定されている。

感作後５日目にブタ２８は４１．５゜Ｃの発熱を示し、
この熱は１２日目まで続いた．急性豚コレラの典型的臨
床兆候が現れた日にその瀕死の動物を殺した．ＶＡＣ３
．８テ免疫感作しタ両方のブタ（２６．２７）！，；ｔ
　ＨＣＶで攻撃後、ｌ４日間以上病気の兆候を示さなが
った．犬允ヱ（と クローンｐＨｃＫＬ１を標準方法に従って制限酵素Ｓａ
ｃ　［及びＨｐａ　Ｉで消化した。

ＨＣＶ５５ｋＤタンパク質の大部分を含むヌクレオチド
２６７２　（八ＧＣＴＣ）と３９７１　（ＧＴＴ）との
間に位置する得られた１．３ｋｂフラグメンＩ・を単離
し、偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）ｇＸ遺伝子にクローニ
ングした（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２）。

要約すると、クローニングしたｇＸ配列をＳａｃ　１及
びＡｐａ　ｌで消化した．＾ｐａ　ｌ　５’突出末端を
クレノウフラグメントで充填することによりプラントに
した。連結後、推定されるｇＸリーダーペプチドコーデ
ィング配列は挿入したＨＣＶ５５ｋＤ配列のすぐ上流に
位置した。

突出部をクレノウフラグメントで充填後にＢｇｌＵ　（
［ｌｇｌ　Ｉｆ部位：　３９３６〜３９４１）で消化し
、再連結することによりＨＣＶ配列の下流の翻訳終止コ
ドンを導入した。この構築物をＰＲＶｇＸプロモーター
（クローン１６／４−１．３）の下流に配置した。クロ
ーン１６／４−１．３をＤＥＡＥデキストラン法（Ｍａ
ｎｉａＬｉｓ他、１９８９）によりＨＤＢＫ細胞にトラ
ンスフェクトした．１６時間後、細胞をＰＲＶ（ｍ．ｏ
．ｉ．＝　１）に感染させた。感染から４時間後、細胞
を冷温（−　２０℃）のメタノール／アセトンの混合物
で固定した。モノクローナル抗体（Ｍ八Ｂ＞抗｝１ｃＶ
５５ｋＤタンパクで間接免疫蛍光の結果、細胞の５〜ｌ
Ｏ％に特異的信号が現れた．トランスフェクションなし
のＰＲＶ感染細胞及びクローン１６／４−１．３ｔ，か
トランスフエクトしながった細胞はこのアッセイで何ら
信号を示さなかった。

豊Ｊ１月一 ＢＥＮＴＯＮ，　Ｗ．，　ａｎｄ　ＤＡＶ工Ｓ，　Ｒ．
　（１９７７）．　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｑλｇｔｒａｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ　ｃｌｏｎｅｓ　ｂｙ　ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｓｉｎｇｌｅｐｌａｑｕｅｓ　ｉ
ｎ　ｓｉｔｙ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６，　１８０−
１８２．Ｏ工ＲＧＷ工Ｎ，　Ｊ．Ｍ．，　ＰＲＺＹＢＹ
ＬＡ，　Ａ．Ｅ．，　ＭＡｃＤＯＮＡＬＤ，　Ｒ．Ｊ．
，ａｎｄ　　ＲＵＴＴＥＲ，　　Ｗ．Ｊ．　　（１９７
９）　．　　工ｓｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｌｙ　　ａｃｔｉｖｅ　　　ｒｉｂｏｎｕｃｌ
ｅｉｃ　　ａｃｉｄ　　　ｆｒｏｍｓｏｕｒｃａｓ　　
ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｉｎ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，
　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１Ｂ，５２９４−５２９
９． ＣＲＡＮＡＧＥ，　Ｍ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．　　（１９
８６）．　ＥＭＢＯ，　Ｊ．　Ｓ−，　３０５７−３０
６３． ＤＡＶ工Ｓ，　　Ｌ．Ｇ．，　　Ｄ工ＢＮＥＲ，　　Ｍ
．Ｄ．，　　ａｎｄ　　ＢＡＴＴＥＹ，　　Ｊ．Ｆ。

（１９８６）　．　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９０−１
９１　．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，　Ｌｏｎｄｏｎ．ＤＥＮＴＥ，　
Ｌ．，　ＳＯＬＬＡＺＺＯ，　ｌｉｔ．，　ＢＡＬＤＡ
Ｒ工，　Ｃ．，　ＣＥＳＡＲＥＮ工，Ｇ．，　ａｎｄ　
ＣＯＲＴＥＳＥ，　Ｒ．　　（１９８５）　．　Ｔｈｅ
　ｐＥＭＧＬ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆｓｉｎｇｌｅ−ｓｔ
ｒａｎｄｅｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ．工ｎ：　ＤＮＡ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，　Ｖｏｌ．１，　　　（Ｇｌｏｖｅｒ，　
　　Ｄ．Ｍ．，　　　ａｄ．），　　　工ＲＬ　　　Ｐ
ｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，
　ｐｐ．　１０１−１０７．ＨＥＮＮ工ＫＯＦＦ，　　
Ｓ．　　（１９８７）．　Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａ
ｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａ
ｓｅ　［［　　ｉｎ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎ
ａｌｙｓｉｓ．工ｎ：　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．
　（Ｗｕ，　Ｒ．，　Ｅｄ．）　１５５，　１５６−１
６５．ＨＵＹＮＨ，　　Ｔ．Ｖ．，　　ＹＯＵＮＧ，　
　Ｒ．Ａ．，　　ａｎｄ　　ＤＡＶ工Ｓ，　　Ｒ．Ｗ。

（１９８５）．　　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　　ａｎ
ｄ　　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　ｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｉ
ｅｓ　ｉｎλｇｔ１０　ａｎｄλｇｔ１１．工ｎＨ　Ｄ
ＮＡ　（ｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　
Ａｐｐｒｏａｃｈ，　　Ｖｏｌ．　　２，　　（Ｇｌｏ
ｖｅｒ，　　Ｄ．Ｍ．，ｅｄ．），　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ
ｓ　Ｏｘｆｏｒｄ，　ｐｐ．　４９−７８．ＫＥＩＬ，
　　Ｇ．Ｍ．，　ＥＢＥＬＩＮＧ−ｋｏｌＸＬ，　　Ａ
．，　　ａｎｄ　ＫＯＳＺＤｉＯＷＳＫ工，Ｕ．Ｈ．　
　（１９８４）．　　Ｔｅｍｐｏｒａｌ　　ｒｅｇｕｌ
ａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｍｕｒｉｎａｃｙｔｏｍｅｇａ
ｌｏｖｉｒｕｓ　　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　　ａ
ｎｄ　　ｍａｐｐｉｎｇ　　ｏｆｖｉｒａｌ　　ＲＮＡ
　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｔ　　ｉｍｍｅｄｉａｔ
ｅ　ｅａｒｌｙ　ｔｉｍｅｓａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　５０，　７８４−７９
５．ＭＡＮ工ＡＴ工Ｓ，Ｔ．，Ｆ［ＴＳＣＨ，Ｅ．Ｆ．
，ａｎｄ　ＳＡＭＢＲＯＯＫＳ，Ｓ。

（１９８２）　．　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，　　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ，　ＮＹ． ＳＮｉＧＥＲ，　　Ｆ．，　　［ＣＫＬＥＮ，　　Ｓ．
，　　ａｎｄ　　ＣＯＵＬＳＯＮ，　　Ａ．Ｒ。

（１９７７）．　　ＤＮＡ　　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　
　ｗｉｔｈ　　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．　　Ｐｒｏｃ．　　Ｎａｔｌ．　
　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ．　　Ｕ．Ｓ．Ａ．　　７４．
５３６３−５４６７． ［ＡＴ工Ｓ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｍ．　　（１９８９）　
．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ，　　ｓｅｃｏｎｄ　
ｅｄｉｔｉｏｎ，　　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　　ＮＹ．ＳＴＲＥＢＥ
Ｌ，　　Ｋ．　　ｅｔ　ａｌ．　　（１９８６）．　Ｊ
．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５７，　　９Ｂ３−９９１． Ｒｔ）ＭＥＮＯＰＦ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９
）．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７１，　１Ｂ−２７．ＹＯ
ＵＮＧ，　　Ｒ．Ａ．，　　ａｎｄ　ＤＡＶ工Ｓ，　　
Ｒ．Ｗ．　　（１９８３）．　　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉ
ｓｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｇｅｎｅｓ　　ｂｙ　　
ｕｓｉｎｇ　　ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｐｒｏｂｅｓ．Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ
．Ａ．　８０．　１１９４−１１９８．

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＣＶから誘導される種々のｃＤＮ＾クローン
の物理的地図及びＲＮ＾ゲノム（上段）に対するそれら
の位置を示す．抗体プローブ（０．８ｋｂクローン）又
は縮量オリゴヌクレオチドプローブ（０．７５ｋｂクロ
ーン）のいずれかでスクリーニング後に単離された２つ
のＩ｛ＣＶ誘導ｃＤＮ＾クローンを２段目に示す．更に
その下に、ヌクレオチド配列決定に選択したｃＤＮ＾フ
ラグメントを示す．数字はいずれもＤＮＡフラグメント
の寸法＜ｋｂ）を表す．尚、制限部位はＢ＝　Ｂｇｌ　
Ｉ［　、Ｅ＝　ＥｃｏＲ　Ｉ　、Ｈ＝　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ
、Ｋ＝Ｋｐｎｌ、ｓ＝Ｓａｌ　Ｉ　，　Ｓｍ＝Ｓｍａ　
Ｉを表す．第２図はＨＣＶの核酸配列及び長いオープン
リーディングフレームの推定アミノ酸配列を示す．異な
るｃＤＮ＾クローン間のヌクレオチド交換と、それに伴
うアミノ酸配列の変化を示す．スクリーニングに使用さ
れるオリゴヌクレオチドに対応する配列の部分を下線で
示す． 第３図はλｇｉｌｌクローンの０．８ｋｂ　ＨＣＶイン
サートの一部のｃＤＮ＾配列及び推定アミノ酸（１文字
コードで表す〉を示す． 第４図はｐＧｓ６２ベクターにクローニングされた１１
ＣＶ　ＤＮ＾の長さを示す．エキソヌクレアーゼ■で処
理することにより、ｃＤＮ＾クローンｐＨｃＫ１１から
誘導される１５個ｌ組の欠失突然変異体を作成し、ｐＧ
Ｓ６２ベクターにクローニングし、Ｉ）（；Ｓ６２−３
．８ＥＸＯ　１〜１５を得た．３゜末端ヌクレオチドを
示す．ＧＴＴ　　ＡＧＣ　　’ｒＣＴ　　？ＴＣ　　Ｔ
ＣＧ　　ＴＡ’ｌ’　　ＡＣＧ　　ＡＴＡ　？ｒＧ　　
ＧＡ’Ｓ’　　ＡＣＡ　ＣＴＡ　　ＡＡＴＴ’ＩＴＡＧ
　ＣＣＡ　Ｔｉｃ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＴＡＧ　ＧＡＣ　
ＴＡＧ　ＣＡＡ　ＡＣＧ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　Ｃ’ｒＡ　
Ｇ（ＡＣＡ　　ＧＴＣ　　ＧＴＣ　　ＡＧＴ　　ＡＧＴ
　　ＴＣＧ　　ＡＣＧ　　ＴＧＡ　　ＧＣＡ　　Ｃ？’
Ａ　　ＧＣＣ　　ＣＡＣ　　ＣＴＣ　　ＧＪＴＧＧ　Ｃ
ＧＧ　ＧＧＧ　？ＣＧ　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＴＧＡ　ＭＴ
　ＣＡＣ　ＡＴＴ　ＡＴＧ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　Ｇ＜３３
７　　　ＴＡＴ　　ＡＡＡ　ＡＡＴ　　ＣＴＣ　　ＴＧ
Ｃ　　ＴＧＴ　　ＡＣＡ　’ｒＧＧ　ＣＡＣ　　ＡＴＧ
　　ＧＡＧ　　ＴＴＧ　　ＡＡＴ　ＣＪＩ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｉ，ａｕ　Ａｓｎ　ｋｉ：４２１　　
Ｇ’ｌ’Ｇ　ＧＡＧＧＭＣＣＧ　ＧＴＧＴＡＴ　ＧＡＣ
　ＡＣＣ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　Ａ（ＪＬＣＣＡＣＴＡ？２
０　　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌτｙｒ
　Ａｓｐ　Ｔｈｒ＾工ａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌ
ａｕ　ＰＩＦｉｇｕｒｅ　２　（’ｔ句ｌ） ｒｅ　ＧＡ？　Ｔ’ＴＧ　ＧＴＣ　’Ｉ’ＡＧ　ＧＧＣ
　ＡＣＣ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣ　
ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＧＣＣ ：Ｃ　ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＣＴ
Ｇ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＧＡＧ
　ＴＡＣ　ＡＧＧ八ＧＡτＧ　Ｃ？Ａ　ＣＧτＧＧ＾Ｃ
ＧＡ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　ＧＣＣ　ＣＡ＾ＧＡＣ　ＡＣＡ
　ＣＣＴ　ＴＡＡ　ＣＣＣＮ　？ＡＣ　ＧＡＣ　ＣＴＧ
　ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＴＧＣ　ＴＧＣ　ＡＧＡ　ＧＧＣ　
ＣＣＡ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＧＧＣ　ＴＡＧＡＧＧ　ＧＧ
Ｃ　ＡＣＡ　ＣＣＣ　ＡＧＡ　ＡＣＣ　ＣＴＡ　ＡＡＧ
　ＴＧＧ　ＡＴ？　ＡＧＧ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＡＣＣ　
　８４ＧＭＷ　Ｇｌｙ　Ｔｂｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈ
ｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　’ｒｒｐ　Ｘｉ＠　Ａｒｇ＾ｓｎ
　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　　１５９２０１７　　ＴＴＧ　’ｒ
ＴＧ　Ｃ？Ｔ　ＴＩＪ　Ｃ’ｌ’Ａ　ＧＴＴ　ＡＴＣ　
ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＡＣ　ｆｆｌ”　ＧＣＣ　Ｃ５５２
　　Ｌａｕ　Ｉａｕ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｉａｕ　Ｖａｌ
工１ａ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ａｌｉｐ　Ｐｈａ　Ａｌａ　
Ｐｒｉｇｕｒｅ　２　（（”−） ＭＣ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　Ａ’
ｌ’Ｃ　’Ｉ’ＴＡ　ＴＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣ　ＣＡＴ
ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＧＧＣ　　１６８０Ａｓｎ　Ｖａｌ　
Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌａ　Ｌａｕ　Ｔ
ｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌ
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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）豚コレラウイルスに特異的なポリペプチドをコー
   ドする核酸配列。 （２）第２図に示すアミノ酸配列を有する豚コレラウイ
   ルスに特異的なポリペプチドをコードする核酸配列。 （３）第２図に示すアミノ酸配列を有する豚コレラウイ
   ルスに特異的なポリペプチドのフラグメントをコードす
   る核酸配列。 （４）核酸配列が第２図に示すデオキシ核酸配列の少な
   くとも一部に対応することを特徴と、する請求項２又は
   ３に記載の核酸配列。 （５）ベクター核酸分子と請求項１から４のいずれか一
   項に記載の核酸配列とを含む組換体核酸分子。 （６）請求項５に記載の組換体核酸分子を含む宿主を含
   む、豚コレラウイルスに特異的なポリペプチドを産生す
   ることが可能な組換体発現系。 （７）宿主がウィルス又は細菌であることを特徴とする
   請求項６に記載の組換体発現系。（８）豚コレラウイル
   スに特異的なポリペプチド。 （９）第２図に示すアミノ酸配列を有する豚コレラウイ
   ルスに特異的なポリペプチド又はそのフラグメント。 （１０）請求項６又は７に記載の組換体発現系により合
   成される、豚コレラウイルスに特異的なポリペプチド。 （１１）１以上の翻訳後修飾を含むことを特徴とする請
   求項８から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。 （１２）請求項８から１１のいずれか一項に記載のポリ
   ペプチドを含むことを特徴とする、豚コレラウイルス感
   染から動物を防御するためのワクチン。 （１３）請求項６又は７に記載の組換体発現系を含むこ
   とを特徴とする、豚コレラウイルス感染から動物を防御
   するためのワクチン。 （１４）請求項８から１１のいずれか一項に記載のポリ
   ペプチドから免疫活性を有する医薬調製物を形成するこ
   とを特徴とする豚コレラウイルスワクチンの製造方法。 （１５）請求項６又は７に記載の組換体発現系を培地で
   増殖させ、その後、組換体発現系を回収し、免疫化活性
   を有する医薬調製物に形成することを特徴とする豚コレ
   ラウイルスワクチンの製造方法。