DK175472B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af L-tert.-leucin - Google Patents

Description

DK 175472 B1 i

Optisk aktive, ikke-proteinogene aminosyrer har stor I betydning på grund af deres kendte eller potentielle biolo- I giske aktivitet. Nogle anvendes med held inden for det far- I maceutiske område, såsom L-dihydroxyphenylalanin (L-Dopa) I 5 eller a-methyldopa, eller finder anvendelse inden for plan- I tebeskytteisen, såsom phosphinothricin. Andre er forstadier I til farmaceutika, såsom D-phenylglycin eller β-p-hydroxyphe- I nylglycin ved fremstillingen af halvsyntetiske penicilliner I ampicillin og amoxycillin. De kan ligeledes være værdifulde I 10 forstadier til syntesen af finkemikalier. Inden for den asym- I metriske syntese af aminosyrederivater har især tert.-leu- I cin ligeledes vundet indpas (U. Schollkopf, Pure and Appl.

I Chem. 55, 1799-1806, (1983)].

I De ikke-proteinogene optisk aktive aminosyrer frem- 15 stilles fortrinsvis kun på kemisk måde. I den sammenhæng I er det en ulempe, at man ikke kan arbejde stereoselektivt, I og at man får racematet som slutprodukt. Enzymatiske frem- I ''gangsmåder har derimod særdeles ofte den fordel, at der I ud fra forstadier, der er simple at fremstille, ved hjælp af I 20 et enzymtrin selektivt kan syntetisere en chiral forbindelse.

I Dette er især fordelagtigt, når kun én af de to stereoisomere forbindelser er biologisk.aktiv.

Syntesen af naturlige, såkaldte proteinogene I aminosyrer ved hjælp af biotransformation med transaminaser I 25 er i og for sig kendt. I EP-patentansøgning nr. 152.275 I er beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af phenyl- alanin ved transaminering ved hjælp af en genetisk modifi- ceret mikroorganisme, som'udmærker sig ved overproduktion af aminotransferasen. Ifølge EP-patentansøgning nr.

30 135.846 sker fremstillingen af naturlige L-aminosyrer på den måde, at α-ketosyrer omsættes med L-asparaginsyre som aminogruppedonator i nærværelse af en transaminase, som er blevet isoleret fra E. coli. Der dannes de til α-ketosyren svarende L-aminosyrer samt oxalacetat fra aspara- H 35 ginsyren.

Udvælgelsen og mutationen af mikroorganismer blandt I DK 175472 B1 Η Η Ε. coli, Paracoccus denitrificans, Torula, Rhodotorula og Streptomyces til fremstilling af L-phenylalanin ud fra H phenylpyrodruesyre med forbedret udbytte er beskrevet i DE patentansøgning nr. 3.423.036.

H 5 Ikke-naturligt forekommende, såkaldte ikke-protei- nogene aminosyrer er hidtil ikke fremstillet ved enzymatisk biotransformation.

H Det har nu vist sig, at man kan gennemføre syntesen H af den ikke-proteinogene aminosyre L-tert.-leucin i særdeles H 10 godt udbytte ved hjælp af transaminering. Dette er for så H vidt overraskende, eftersom det er kendt, at man med trans- H aminaser kan syntetisere forskellige naturlige proteino- H gene- aminosyrer, men på baggrund af enzymernes specificitet dog ikke kunne forvente, at der ligeledes på denne måde kan 15 fremstilles ikke-proteinogene aminosyrer med ikke-naturligt forekommende α-ketosyrer som forstadier. På baggrund af dette er det overraskende, at de tilsvarende forstadier på trods af deres hydrofobe gruppe, som ikke forekommer i forstadierne til naturlige aminosyrer, tolereres og omsættes af det akti- 20 ve centrum i transaminasen.

H Opfindelsen angår følgelig en fremgangsmåde til fremstilling af L-tert.-leucin, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 3,3-dimethyl-2-oxo-butansyre eller et H salt af denne forbindelse, hver gang i nærværelse af amino- I 25 syrer som aminogruppedonatorer, transamineres.

I Foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden er angivet i krav 2-11.

I I det følgende belyses opfindelsen i detaljer. I

Enzymer fra talrige organismer, eksempelvis fra 30 mikroorganismer, planter og animalske organer, såsom svine- hjerte, er i stand til at omdanne α-ketosyrer til naturlige I L-aminosyrer ved transaminering. Disse organismer eller deres, enzymer kan anvendes ifølge opfindelsen. Man arbejder dog fortrinsvis med mikroroganismer, som haren transaminase, 35 såsom mikroorganismerne fra slægterne Paracoccus, Alkaligenes,

Rhizobium, Pseudomonas, Serratia, Agrobacterium, Streptomyces 3 DK 175472 B1 samt enterobakterier. Især fordelagtige er mikroorganismer, såsom Alcaligenes faecalis DSM 4115, Alcaligenes denitri-ficans DSM 4114, Pseudomonas paucimobilis DSM 4120, Pseudomonas spec. DSM 4119, Serratia plymuthica DSM 4116, Agrobacte-5 rium tumefaciens, Escherichia coli DH1, Escherichia coli ATCC 11303, Enterobacter agglomerans DSM 4122, Enterobac-ter spec. DSM 4121, Paracoccus denitrificans DSM 65,

Streptomyces hygroscopicus og Streptomyces viridochromoge-nes samt 3 jordisolater DSM 4113, DSM 4117 og DSM 4118.

10 Disse mikroorganismer er, for så vidt de ikke er frit tilgængelige. eller beskrevet, således at de kan fremstilles. . deponeret hos Deutsche Sammlung flir Mikroorganismen (DSM) .

Man kan få højere enzymaktiviteter ved, at man vælger stammer, som er resistente mod phosphinothricin 15 eller udnytter phosphinothricin som eneste nitrogenkilde, eksempelvis Alcaligenes faecalis DSM 4115, Agrobacterium tumefaciens samt jordisolatet DSM 4113. Dette er fordelagtigt, men ikke ubetinget nødvendigt. Ligeledes kan ved selektion og mutation, på i og for sig kendt måde, 20 mod stigende mængder af 3,3-dimethyl-2-oxo-butansyre, phenylpyrodruesyre eller salte deraf i dyrkningssubstraterne til de videre arbejder udvælges mikroorganismer, som på grundlag af deres adaptation til α-ketosyren gennemfører transamineringeni bedre udbytter. 3,3-Dimethyl-2-oxo-25 -butansyre eller salte deraf er let tilgængelige ved forsæbning af trimethyleddikesyre i nærværelse af thionyl-chlorid og KCN ifølge klassiske fremgangsmåder. Fremstillingen af (3-carboxy-3-oxo-propyl)-methylphosphinsyre eller salte deraf sker ligeledes ved kendte fremgangsmåder 30 (Hans Beyer, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag, Stuttgart).

Man får ligeledes gode udbytter ved at anvende genteknisk manipulerede mikroorganismer ved fremgangsmåden ifølge- opfindelsen. Især foretrækker man at arbejde med 35 e. coli ATCC 11303, som er transformeret med et plasmid,

I DK 175472 B1 I

I 4 I

I der indeholder et tyrB-gen eller ilvE-gen, idet tyrB-genet I

I hver gang koder for den aromatiske transaminase og ilvE I

I for den aliphatiske transaminase i E. coli. Således manipule- I

I rede stammer kan eksempelvis fremstilles ifølge DE patent- I

I 5 ansøgning nr. P 3.631.829.9 eller P 3.636.722.2. I

I Transamineringen kan ske samtidig med dyrkningen, I

I idet der i så tilfælde fortrinsvis arbejdes med mikroorga- I

I nismer, som er resistente mod phosphinothricin, eksempelvis I

I Alcaligenes faecalis DSM 4115 og Agrobacterium tumefaciens. I

I 10 Mikroorganismerne dyrkes dog fordelagtigt i et til deres I

I vækst optimalt næringssubstrat under tilsvarende gunstige I

I temperatur- og beluftningsbetingelser indtil en tørvægt I

I på ca. 4-60 g/liter næringssubstrat. De for den hver gang I

I foreliggende mikroorganisme gunstigste betingelser er enten I

I 15 kendt for fagfolk eller kan konstateres ved simple for- I

I forsøg. Cellerne anvendes i så tilfælde, i næringssubstra- I

I tet eller skilt fra næringssubstratet, til aminering af I

I α-ketosyferne. Transaminer ingen kan gennemføres med hele I

I eller også med oplukkede celler, idet man anvender de gængse I

I 20 oplukningsmetoder. Det er ligeledes muligt at gennemføre I

I transamineringen med celleekstrakter, isolerede hele pro- I

I teiner samt rensede transaminaser. Ud fra praktiske over- I

I vej elser, eksempelvis på grund af udgifterne, arbejder man I

I dog fortrinsvis med intakte celler. Dog kan isoleringen af I

I 25 transaminaserne på grund af en længere levetid af enzymet I

I samt en bedre styringsmulighed for reaktionen ligeledes være I

I fordelagtig. Det er endvidere muligt at anvende mikroorganis- I

I merne eller enzymerne ifikseret form. Til fikseringen kommer I

I de kendte fremgangsmåder i betragtning, fordelagtigt frem- I

I 30 gangsmåderne ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. I

I 3.237.341 og 3.243.591 I

I Mikroorganismerne eller det isolerede enzymsystem I

I suspenderes i den foretrukne udførelsesform i en fysiolo- I

I gisk puffer således, at deres transaminaseaktivitet I

I 35 ikke påvirkes nævneværdigt negativt, under tilsætning af I

I α-ketosyren og aminogruppedonatoren. Alt efter mængden af I

DK 175472 B1 5 mikroorganismerne kan den til udgangsblandingen tilsatte enzymatiske aktivitet i form af mikroorganismer eller det isolerede enzymsystem variere inden for brede områder. Hensigtsmæssigt ligger den mellem 10 og 5 20.000 ^imol/min·liter. Fortrinsvis indeholder udgangs blandingen cellemængder med en enzymaktivitet fra 1500 til 2000 μτηοΐ/min: liter.

Som aminogruppedonator finder aminosyrer anvendelse. Hvilken aminosyre, som anvendes fordelagtigt, er i 10 vid udstrækning afhængig af mikroorganismen eller det isolerede enzymsystem, hvilket dog kan fastslås ved korte forforsøg. Egnede er eksempelvis valin, leucin, isoleucin, methionin, tyrosin og phenylalanin, især asparagin, aspara-ginsyre, glutamin, glutaminsyre og glycin. Disse aminosy-15 rer anvendes i L-formen, eftersom kun denne udnyttes ifølge opfindelsen, som fri syre eller egnede salte (svarende til det anvendte substrat). Til fremstilling af L-tert.-leucin anvendes 3,3-dimethyl-2-oxo-butansyre.

Man kan ligeledes anvende salte deraf, idet man 20 naturligvis vælger ioner, som ikke påvirker transaminaseak-tiviteten nævneværdigt i negativ retning. Fortrinsvis er disse natrium-, kalium- og ammoniumsalte. Aminogruppedona-toren sættes i ækvimolære mængder eller i et overskud til or-ketosyren. Forhold på 1:1-5:1, fortrinsvis 1:1-2:1, har 25 vist sig at være egnede.

Tilsætningen af reaktionskomponenterne til reaktionsblandingen kan ske som opløsning i vand eller ved tilsætning af de faste stoffer samtidigt. Man foretrækker imidlertid en portionsvis eller kontinuert tilsætning 30 i mængder fra 0,1-4,5%, især fra 0,2-2%, hver gang beregnet på reaktionsblandingens vægt, i løbet af et tidsrum på 1-90 timer, fortrinsvis 2-40 timer.

Man arbejder fordelagtigt ved en pH-værdi, der ligger mellem 5 og 9, især mellem 7 og 8,5. Det er desuden 35

DK 175472 B1 I

hensigtsmæssigt at gennemføre transamineringen i et tempe- H

raturområde, der ligger fra 10 til 65°C, især fra 20 I

til 50°C. Ved lavere temperaturer forløber enzym-reaktionen H

tiltagende langsommere, medens enzymet ved højere tempera-

5 turer fremadskridende deaktiveres. I

Den mest gunstige fremgangsmåde afhænger af I

den hver gang foreliggende mikroorganisme og kan let

fastslås ved enkle forforsøg. H

Det har især vist sig at være hensigtsmæssigt at H

10 permeabilisere mikroorganismerne forud for eller under trans- H

amineringsreaktionen. Dette kan ske ved at sætte egnede I

midler, såsom toluen, cetyltrimethylammoniumbromid eller I

dimethylsulfoxid, til inkubationsmediet. H

De følgende eksempler tjener til yderligere at il- I

15 lustrere opfindelsen. Procentangivelser refererer, når intet I

andet er angivet, til vægten. H

•Eksempel 1 I

Dyrkning og oparbejdning af mikroorganismerne. I

20 De nævnte deponerede og frit tilgængelige bakterier I

dyrkes i 400 ml væskekulturer i LB-substrat (Luria-Bertani-

-Medium: 10 g Bacto- Trypton/5 g Bacto- Yeast-Extrakt/10 g I

NaCl pr. liter, (pH 7,5)] eller M9- minimalmedium [6 g I

Na2HP04/3 g KH2PO4/0,5 g NaCl/1 g NH4Cl/2 ml 1 M MgS04 + 10 ml I

25 20% glucose + 0,1 ml 1 M CaCl2 + 1 ml 1% vitamin Bl (Thiamin) I

pr. liter (pH 7,4)] ved 30°C (alle bakterier undtagen I

E. coli) eller 37°C (E. coli, DH1) natten over. I

Derpå centrifugeres bakterierne fra, og cellepellets I

vaskes flere gange i 10 mM Na2HP04, 10 mM NaCl (pH =7,0) I

30 (vaskepuffer) og suspenderes til slut i 10 ml vaskepuffer

pr. 3 g cellepellet. Cellerne oplukkes ved hjælp af ultra- I

lydpåvirkning i 5 x 1 minutter, og celleresten centrifuge- I

res derpå fra. De således udvundne lysat-supernatanter kan I

opbevares i flere måneder ved -20°C. I

7 DK 175472 B1

Eksempel 2 Proteinisolering

Til proteinisolering fyldes hver gang 5 ml af lysat-supernatanterne med vaskepuffer ad 50 ml, 5 og proteinerne udfældes ved tilsætning af ammoniumsulfat til 65%. Efter fracentrifugeringen i løbet af 15 minutter ved 10.000 g suspenderes proteinpellets atter i hver gang 5 ml 10 mM Na2HP04 (pH 7,0) 1 mM EDTA, 2% glycerol, l'.mM dithiothréitol (DTT) . Denne suspension 10 kan ligeledes opbevares ved -20°C. For at opnå en bedre rensningsvirkning fældes proteinerne'til dels to gange med ammoniumsulfat.

Proteinbestemmelser foretages ifølge biuret--metoden. Proteinindholdet i de ifølge ovennævnte for-15 skrift behandlede præparater ligger for det meste mellem 5 og 10 mg/ml. Til partiel rensning af transaminasen fra Alcaligenes faecalis DSM 4115 og fra DSM 4113 fældes proteinerne fraktioneret med fra 25% til 75% ammoniumsulfat, - hver gang tilsat i 10%'s trin, og enkeltfraktionerne testes 20 med hensyn til transaminase-aktivitet (se nedenfor).

Proteinfraktionen med den største specifikke aktivitet overføres til en Sephadex G 100-gelfiltreringssøjle og elueres med 10 mM NajHPO^ (pH-værdi = 7,0). Eluatfrektionerne med den højeste specifikke transaminase-aktivitet 25 koncentreres ved hjælp af fornyet ammoniumsulfatfældning og tages for hver 5 mg/ml op i 10 mM NajHPO^ (pH 7,0), 1 mM EDTA, 2% glycerol, 1 mM DTT. Molekylvægten af Sephadex G 100) polydextransøjlefraktionerne bestemmes ved sammenligning med molekylvægt-standard-proteiner. Renheden af 30 de isolerede transaminase-fraktioner kan efterprøves ved hjælp af elektroforese af proteinprøver i 10% SDS/poly-acrylamid-geler.

35

I DK 175472 B1 I

I I

I Eksempel 3 I

I Udvælgelse af Escherichia coli ATCC 11303. I

Escherichia coli ATCC 11303 dyrkes ved gængse frem- I

I gangsmåder og mutageniseres med N-methyl-N-nitro-N-nitro- I

I 5 guanidin (MNG) ifølge E. Adelberg et al., Biochem. Biophys. Res. I

I Comm. 18, 788 (1965). De med MNG behandlede celler udstryges I

I på en autoklaveret agar med følgende sammensætning: I

I Fumarsyre "· 5 g/1 I

I Kødekstrakt 20 g/1 I

10 Asparaginsyre 20 g/1 I

I KH2P04 2 g/1 I

I MgS04·7 H20 0,5 g/1 I

I CaCl2·2 H20 0,1 g/1 I

I Agar 20 g/1 I

I 15 pH-Værdien indstilles til 7,2 med vandig natrium- I

I hydroxid-opløsning. I

I En sterilfiltreret opløsning af phenylpyruvat I

hældes i den endnu varme agar, således at der opnås en I

I slutkoncentration på 24 g phenylpyruvat pr. liter. Plader- I

I 20 ne inkuberes ved 37°C i 4 dage. Kolonier med en diameter, I

I der er større end 1 mm, isoleres. 20% af de voksende I

I stammer har en forøget transaminaseaktivitet i sammenlig- I

I ning med udgangsstammen. I

I Transaminase-aktivitetsbestemmelsen gennemføres I

I 25 ved hjælp af Sigmatest-kit G 0390. I

I Eksempel 4 I

I a. Isolering og nedbrydning af cosmidet pIMS 6026 fra E. coli. I

I Cosmidet pIMS 6026 er afledt af cosmidet pLAFRl I

I 30 (ATCC 37167) ved, at der i dets eneste EcoRI snitsted I

I klones det i handelen gængse EcoRI-fragment, hvorpå kanamy- I

I cin-resistensgenet af transposonen Tn 903 ligger (Pharmacia, I

I Uppsala, Sverige). Ved nedbrydning ved hjælp af BamHI og I

I efterfølgende religering kan den største del af det i hande- I

I 35 len gængse EcoRI-fragment ødelægges, således at der kun bli- I

I ver er kort stykke DNA tilbage som insertion, hvori et BamHI- I

DK 175472 B1 9 -spaltested frankeres af 2 EcoRI-snitsteder.

Til isolering af cosmidet plMS 6026 fra E. coli HB101 går man enten frem efter Humphreys et al. [Biochem.

Biophys. Acta 383, 457-63 (1975)] eller gennemfører en ba-5 sisk lyse ifølge Birnboim og Doly [Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)]. I hvert tilfælde renses plasmid-DNA'en mindst én gang ved hjælp af CsCl/EtBr-massefyldegradientcentrifuge-ring.

Cosmidet plMS 6026 nedbrydes fuldstændigt med restrik-10 tionsenzymet BamHI, idet man går frem ifølge fremstillerens,

New England Biolabs, anvisninger. Til efterprøvning af fuldstændigheden af denne nedbrydning sættes en portion af restriktionsudgangsblandingen til en 0,8% agarosegel og underkastes elektroforese. Tilsynekomsten af kun et bånd efter 15 farvning med ethidiumbromid og bestråling med kortbølget UV-lys (254 nm) tjener til at påpege en fuldstændig nedbrydning. Fra det nedbrudte cosmid-DNA fjernes restriktionsenzymet ved phenolisering, DNA fældes ved hjælp af ethanol, vaskes med 70%'s ethanol, og efter tørring under vakuum tages 20 den op i et egnet rumfang TE-puffer (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-værdi = 8,0). Efter frit valg gennemføres endnu en behandling med basisk phosphatase ifølge fremstillerensj Boehringer Mannheim, anvisninger. Efter tilsætning af 1 ^lliter basisk phosphatase (CIP) inkuberer man i 30 minutter ved 37°C, 25 fjerner enzymet fra reaktionsudgangsblandingen ved hjælp af phenolisering og renser DNA som beskrevet ovenfor.

Endelig suspenderes den atter i TE-puffer.

b. Partiel nedbrydning af DNA fra E. coli ATCC 11303.

Isoleringen af hele DNA'en fra E. coli ATCC 11303 30 gennemføres ved fremgangsmåden ifølge Marmur i J. Mol. Biol.

53, 155-162 (1961). Den isolerede hele DNA nedbrydes partielt med restriktionsenzymet Sau3A, således at der hovedsageligt dannes fragmenter i et størrelsesområdet fra 20-30 kb. Dertil konstateres det hertil optimale forhold mellem 35 DNA og. enzym samt den optimale påvirkningtid af enzymet på DNA ved forforsøg. Den tilsvarende fremgangsmåde er beskrev-

DK 175472 B1 I

10 I

et i det af firmaet BRL udgivne hæfte "focus", bind 7, I

nr. 2 (1985) på side 3. Efter forløbet af den som optimum I

bestemte reaktionstid ødelægges enzymet ved opvarmning til

65°C i et tidsrum på 10 minutter, og dannelsen af DNA-frag- I

5 menter i det ønskede størrelsesområde efterprøves ved I

agarose-gelelektroforese med egnede DNA-markører, eksempel- I

vis med EcoRI-nedbrudt DNA fra phagen λ. I

C. Ligering af restriktions-udgangsblandingerne. I

10 Helt DNA, partielt nedbrudt ved hjælp af Sau3A, I

fra E. coli ATCC 11303 blandes sammen med pIMS 6026 cosmid- I

-DNA, som er fuldstændigt spaltet med BamHI og behandlet med I

basisk phosphatase, i et molært forhold på ca. 1:5. Til den I

fremkomne blanding sættes der en flere gange koncentreret I

15 puffer ifølge anvisningerne fra New England Biolabs således,

at der fremkommer en for enzymet T4-DNA-ligase optimal ion- I

koncentration, og der inkuberes med 1 ^lliter af enzymet i I

mindst 14 timer ved 16°C. Det samlede rumfang af blandingen. I

udgør derved 50 μliter med en total DNA-koncentration I

20 på 20^ig/ml. I

d. Indbygning l-Λ-phager. I

Efter den skete ligase-reaktion indbygges DNA, I

der fås ifølge eksempel 3, in vitro i X-phagernes hoveder.

25 De dertil nødvendige ekstrakter fra to forskellige bakterie- I

stammer kan udvindes ifølge Hohn, B., i Wu, R., editor: I

Recombinant DNA, Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic I

Press, New York, s. 299-309 (1979) eller, fås fra Boehringer I

Mannheim eller Amersham Buchler, Braunschweig. 3 ^lliter I

30 af den ifølge eksempel 3 tilvejebragte blanding blandes I

grundigt med umiddelbart før optøede bakterie-ekstrakter I

fra firmaet Amersham under isafkøling. Blandingen inkube- I

res i 30-60 minutter ved 20°C, og derpå tilsættes der I

200 ^jliter SM-puffer (100 mM NaCl, 10 mM MgS04, 50 mM I

.35 Tris-HCl (pH 7,5), 0,01% gelatine). Denne blanding anvendes I

enten direkte i en transduktions-reaktion eller opbevares I

efter tilsætning af 10 pliter chloroform til senere anvendelse I

DK 175472 B1 11 ved 4°C.

e. Transduktion af E. coli DG 30.

5 ml L-Broth, bestående af 1% bacto-trypton, 5 0,5% gærekstrakt og 0,5% NaCl, tilsættes 0,4% maltose og podes med 50 ^lliter af en væskekultur af E. coli DG 30 i den stationære vækstfase. Der inkuberes i 12 timer ved 37^C, indtil den tidlige stationære fase er opnået.

Bakterierne centrifugeres fra og suspenderes atter forsig-Ί0 tigt i 2,5 ml af en vandig opløsning, som er 10 mmolær med hensyn til MgCl2. Til 10 ^lliter af blandingen ifølge eksempel 4 sættes der 20 filter af den koncentrerede bak-teriesuspension, og der inkuberes i 50 minutter ved stuetemperatur .

15 Derpå tilsættes der 200 ^lliter L-Broth, og man inkuberer i 1 time ved 37°C, idet blandingen lejlighedsvis rystes.

Hver gang 50 ^lliter af udgangsblandingen udpletteres på L-Broth-Agar, som indeholder 20 ^jg tetracyclin pr.

20 ml . Pladerne inkuberes i mindst 12 timer ved 37°C · Ved den beskrevne fremgangsmåde kan der fra en blanding i gennemsnit fås 1000 kolonier.

f. Selektionering af E. coli DG 30 med et aspC- eller 25 ilvE- eller tyrB-gen.

Ca. 800 kolonier, som fås ved transduktion af E. coli DG 30 ved den beskrevne fremgangsmåde på L-Broth--agar, som indeholder 20 ^ig tetracyclin pr. ml, "udstikkes" på minimalagar. Minimalagaren består af M9-substrat med · 30 glucose (Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, 1972) som er suppleret med aminosyrerne isoleucin, leucin, valin, asparaginsyre og phenylalanin. Aminosyren tyrosin, som stammen DG 30 ligeledes ikke længere kan syntetisere, sættes dog ikke til substratet.

35 Af de .800 "udstukne" kolonier kan 7 vokse på minimalsubstratet.

I DK 175472 B1 I

I 12 I

I Til adskillelse af de tre mulige gener aspC, I

I ilcE og tyrB i E. coli DG 30 "udstikkes" disse 7 koloni- I

I er atter på det ovennævnte minimalmedium, som er supple- I

I ret med de angivne aminosyrer, på nær hver gang en, I

I 5 for hvilken en af transaminaserne, som er kodet af en af . I

I generne, viser substratspecificitet. I

I Resultaterne er angivet i den følgende tabel: I

I Klon Minimalsubstrat, suppleret på nær antagen aminosyre I

I 10 _Asp_Leu_Ile_tyr_Gen I

1 + + - + tyrB I

I 2 + + - + tyrB I

I 3 - +- + +- ilvE I

I 4 - +- + +- ilvE I

I is 5 + + - + tyrB I

I 6 + + + tyrB I

I 7 - +- + +- ilvE I

I + = god vækst I

I 20 +- = dårlig vækst I

I - ingen vækst I

I g. Lokalisering af tyrB-genet. I

Ved minilyse ifølge Maniatis et al., Cold Spring I

I 25 Harbor, side 366-370 (1982), fås cosmid-DNA af klonerne I

1-7, som fås ifølge eksempel 6; Derpå indsluses dette I

I cosmid-DNA i E. coli DH1 (ATCC 33849), hvorfra den i gode I

I udbytter atter kan isoleres. I

Plasmid-DNA, som oprindelig er udvundet ud fra I

I 30 klonen 3 fra E. coli DG -30 ( jf. eksempel 6), isoleres fra I

I den med denne DNA transformerede stamme E. coli DH 1 og I

I nedbrydes fuldstændigt med restriktionsenzymerne Sall og I

I Smal, ved at følge fremstillernes, New England Biolabs, I

I anvisninger. Ligeledes fuldstændigt med Clal nedbrudt I

I 35 bliver vektoren pAT 153, som derpå endnu underkastes en I

I behandling med basisk phosphatase. De to DNA'er blandes I

DK 175472 B1 13 sammen, ligeres på den i eksempel 4 allerede beskrevne art og vis med hinanden, og kompetente celler fra stammen E. coli ATCC 11303 transformeres med en portion af ligase-udgangsblandingen, eksempelvis 10 ^pliter.

5 Resistente kolonier selektioneres på L-Broth-plader, . som indeholder 50 ^ig ampicillin pr. ml, og afprøves ved hjælp af "replica plating" på L-Broth-plader med 20 ;ug tetracyclin pr. ml med hensyn til markør-inaktivering og dermed indbygning. Fra kolonier, som har fænotypen AprTcs, 10 isoleres ved minilyse plasmid-DNA, og ved hjælp af fuldstæn-I dig nedbrydning med restriktionsenzymet Clal efterprøves I tilstedeværelsen af Clal-fragmenter i vektoren pAT153.

I h. Efterprøvning af transaminase-aktiviteten.

I 15 De ifølge eksempel 4 tilvejebragte kloner I efterprøves ved hjælp af APPAT-Test (Aspartat-Phenylpyruvat- -Aminotransferase Assay, Sigma Testkit G0390, idet a-glutarat I er erstattet med phenylpyruvat) med hensyn til aktiviteten af den aromatiske transaminase, altså genproduktet af tyrB.

20 Som sammenligning tjener den ikke-transformerede udgangsstam- me E. coli ATCC 11303. Derved kan der i et tilfælde måles en tydelig stigning i tyrB-aktivitet, nemlig en faktor 5-10> i forhold til udgangsstammen E. coli ATCC 11303.

Ved hjælp af agarose-gelelektroforese under anvendelse 25 af egnede markører kan man vise, at i den stamme, som udviser I den øgede tyrB-genaktivitet, er indeholdt en pAT 153-vektor, som H . indbygget indeholder et ca. 2,7 MD stort Clal-fragment. Trans- formerer man atter den plasmidløse stamme E. coli ATCC 11303 med den isolerede plasmid-DNA, kan man således i hvert enkelt 30 tilfælde iagttage en stigning i tyrB-genaktiviteten med en faktor 5-10.

I Transformationen af E. coli ATCC 11303 med ilvE-ge- net sker på analog måde.

B DK 175472 B1

B

H Eksempel 5

Fremstilling af L-tert.-leucin H a. En ifølge eksempel 3 udvalgt stamme af Escherichia coli H ATCC 11303 dyrkes i følgende næringsopløsning.

H 5 Fumarsyre 10 g/1 Kødekstrakt 20 g/1 H Asparaginsyre 8 g/1 KH2P04 2 9/1

MgS04-7 H20 0,5 g/1 10 CaCl2·2 H20 0,1 g/1 3,3-Dimethyl-2-oxo-smørsyre 4 g/1 . Der indstilles en pH-værdi på 7,4 med vandig natriumhydroxid- -opløsning.

15 Efter 48 timers vækst ved 37°C centrifugeres celler- ne fra. I den ovenstående væske bestemmes der ved hjælp af I HPLC på en RPC-8 søjle (mobil fase; gradient af 100 mM Na- -»-acetat (pH 7,2) og methanol) 0,9 g/1 L-2-amino-3,3-dimethyl- -smørsyre (tert.-leucin).

20 b. Cellemateriale dyrkes som i eksempel 8 og inkuberes under I omrystning i en opløsning af 10 g asparaginsyre pr. liter, I 4 g 3,3-dimethyl-2-oxo-sroørsyre pr. liter i 10 mmol/liter I tris-HCl-puffer (pH-værdi = 7,4). Efter 24 timers forløb I 25 ved 37°C kan man ved hjælp af HPLC måle 1,9 g/liter L-2-amino- I -3,3-dimethyl-smørsyre.

H

I 30 I 35

Claims (11)

15 I PATENTKRAV I

1. Fremgangsmåde til fremstilling af L-tert.-leucin I kendetegnet ved, at 3,3-dimethyl-2-oxo-butansyre I eller et salt af denne forbindelse, hver gang i nærværelse I 5 af aminosyrer som aminogruppedonatorer, transamineres. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav l,kendeteg- I net ved, at der transamineres ved hjælp af mikroorganis- I mer. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg- I 10 net ved, at der transamineres ved hjælp af mikroorganis- I mer af slægterne Paracoccus, Alkaligenes, Pseudomonas, I Serratia, Agrobacterium og Streptomyces samt enterobakterier. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2,kendete g- I net ved, at der transamineres ved hjælp af Alcaligenes I 15 faecalis DSM 4115, Alcaligenes denitrificans DSM 4114, I I Pseudomonas paucimobilis DSM 4120, Pseudomonas spec. 4119, I I Serratia plymuthica DSM 4116, Agrobacterium tumefaciens, I I Escherichia coli DHl, Escherichia coli ATCC 11303, Entero- I I bacter agglomerans DSM 4112, Enterobacter spec. DSM 4121, I

20 Paracoccus denitrificans DSM 65, Streptomyces hygroscopicus I og Streptomyces viridochromogenes samt 3 jordisolater DSM I I 4113, DSM 4117 og DSM 4118. I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2,kendete g- I net ved, at der transamineres ved hjælp af genteknisk I 25 manipulerede mikroorganismer.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendete g- net ved, at der transamineres ved hjælp af E. coli ATCC 11303, som er transformeret med et plasmid indeholdende et I tyrB-gen eller et ilvE-gen. I 30

7. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene I 1-6,kendetegnet ved, at der transamineres med I celleekstrakter, isolerede hele proteiner eller med rensede I transaminaser. I DK 175472 B1 Η

8. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-7,kendetegnet ved, at aminogruppedonator og Qf-ketosyre anvendes i et forhold fra 1:1 til 5:1.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendeteg- H 5 net ved, at aminogruppedonator og α-ketosyre anvendes i et forhold fra 1:1 til 2:1.

10. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene H 1-9/ kendetegnet ved, at transamineringen gen- nemføres i et pH-værdiområde fra 5 til 9. H 10

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendet eg - net ved, at transmineringen gennemføres i et pH-værdiom- H råde fra 7 til 8,5. H