DK175543B1 - Rekombinant DNA-sekvens, som koder for et polypeptid, som har beta-1,3-glucanase-aktivitet, og signalpeptid, som den rekombinante DNA-sekvens koder for - Google Patents

Description

i DK 175543 B1

Den foreliggende opfindelse angår rekombinante DNA-sekvenser, som koder for et polypeptid, der har β-ι,3-glucanaseaktivi-tet. Endvidere angår opfindelsen et signalpeptid for tobak-5 β-l,3-glucanase.

Glucan-endo-l,3-(3-glucosidaser (β-l, 3-glucanase) er enzymer, som indgår i en række biologiske processer, herunder planters forsvarsreaktion mod patogener (1). De induceres som reaktion på stresshormonet ethylen (2, 3), 10 infektion (4-10) og udløserstoffer ("elicitors") (9, 10), og har antifungal virkning in vitro (12). En basisk (3-1,3-glucanase fra tobak med MT ~33.000 er en væsentlig komponent (~5-10%) af det opløselige protein i dyrket tobaksvæv og de nedre blade og rødder på tobaksplanter 15 (13, 14). Denne (3-1,3-glucanase hæmmer kompleks hormonal og udviklingsmæssig regulering. Den induceres i tobaksblade behandlet med ethylen (3) eller inficeret med tobaksmosaikvirus (TMV) (8, 10) og nedreguleres på mRNA- niveauet i dyrkede tobaksplanteceller ved kombinationer af 20 plantehormoner auxin og cytokinin (3, 14-16).

Glucanaser er enzymer, som hydrolyserer polysacchari-der. De er derfor vigtige komponenter i nedbrydningen af polysaccharidmaterialer fra planter. De er som sådan nyttige til biomasseomdannelsesprocesser (kompostering).

25 Under visse omstændigheder kan denne aktivitet også udstrækkes til papirfremstillingsprocesser.

Identifikationen af DNA-sekvenserne, som koder for disse enzymer, vil gøre det muligt at foretage ændringer i planter indeholdende disse gener til kontrollering af 30 ekspressionen af de tilsvarende proteiner i disse planter. Endvidere ville fjernelse af disse DNA-sekven-ser fra deres naturlige genomer gøre det muligt at transformere andre organismer med disse DNA-sekvenser og dermed overføre fordelene ved sådanne enzymer til andre 35 organismer end dem, hvori enzymerne forekommer naturligt.

I DK 175543 B1 I

i 2 I

Desuden kunne man kontrollere timingen og omfanget af I

I ekspressionen af disse enzymer og derved optimere disse I

I transformerede planters værdi. Det ville være særligt I

I 5 interessant at transformere en planteart med gener, som I

I koder for glucanase, afledt af en anden planteart. I

I Den foreliggende opfindelse angår rekombinante DNA-sekven- I

I ser, som koder for polypeptider, der har S-l,3-glucanase- I

aktivitet. Disse rekombinante DNA-sekvenser kan være cDNA- I

I 10 sekvenser eller de kan være genomiske DNA-sekvenser udvundet I

I i praktisk taget ren form. DNA-sekvenserne omfatter såvel I

I de sekvenser, som koder for præ-pro-enzymet, som de, der I

I koder for det modne enzym, der dannes naturligt som følge I

I af en posttranslationel behandling. I

I 15 Endvidere omfatter opfindelsen også DNA-sekvenser, som I

I udviser væsentlig sekvenshomologi med sådanne rekombi- I

nant DNA-sekvenser eller genomiske DNA-sekvenser. I

I en foretrukken udføreIsesform koder DNA-sekvenserne for I

I /3-1,3-glucanaser, som forekommer naturligt i planter. I

I 20 Særlig interesse har glucanaserne fra tobaksplanter. I

I Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvis- I

I ning til tegningen, hvor I

fig. 1 er et partielt restriktionskort, som viser længder- I

I ne og positionerne for cDNA-kloneme af tobak-/3-l,3-gluca- I

I 25 nase, som er sekvenseret, I

fig. 2 viser Southern blot-analyse af DNA fremstillet ud I

I fra tobaksblade, Nicotiana tabacum L.cv. Havana 425 (ΤΑ), I

I N. sylvestris (SY) og N-tomentosiformis (TO) spaltet med I

I den anførte restriktionsendonuclease og hybridiseret med I

I 30 insertet tobak-0-1,3-glucanase-cDNA-plasmid pGL43, hvor I

I skalaen til venstre angiver størrelsen af markør DNA’er i I

I kilobaser, I

3 DK 175543 B1 fig. 3 viser et autoradiogram af polypeptider fra tobaks-protoplaster inkuberet i 45 minutter med ^Sg-methionin (PULSE) og derefter ca. 12 timer med 1 mM methionin 5 (CHASE), hvor immunadsorption gennemføres med anti-tobak-/3-1,3-glucanase; R: produkter opnået ved in vitro-translation af total RNA fra celler induceret til at producere /3-1,3-glucanase, T: protoplaster behandlet med tunicamy- cin, skala til venstre: Mr for proteinstandarder, GLU: 10 position for renset /3-1,3-glucanase, fig. 4-11 viser sekvenser, hvor etbogstavsymboler anvendes til betegnelse af nucleotider og aminosyrer; (N) og (C): N- og C-terminale aminosyrer i moden (3-1,3-glucanase, (N-glyc): formodet N-glycosyleringssted, og 15 formodede polyadenyleringssignaler er understreget, idet fig. 4 viser sekvens I, som er sekvens DNA-I svarende til den sammensatte cDNA-sekvens fra kloner pGL28, pGL30 og pGL3l, hvis sekvenser er identiske; under sekvensen er vist den udledte aminosyresekvens AA-I, 20 fig. 5 viser sekvens II, som er sekvens DNA-II svarende til den sammensatte cDNA-sekvens afledt af klonen betegnet pGL43; under denne sekvens er vist den udledte aroinosyre-sekvens AA-II, fig. 6 viser sekvens III, som er sekvens DNA-III svarende 25 til den sammensatte cDNA-sekvens afledt af klonen med betegnelsen pGL36; under denne sekvens er vist' den udledte aminosyresekvens AA-III, fig. 7 viser sekvens IV, som er sekvens DNA-IV svarende til den sammensatte cDNA-sekvens afledt af sekvens DNA-I 30 og hidrørende fra peptid-sekvensering vist som aminosyresekvens AA-IV anbragt under sekvensen DNA-IV; XXX indicerer forskelle i indkodede aminosyrer af sekvens DNA-I og dem, som findes ved peptidsekvensering,

I DK 175543 B1 I

I I

I fig. 8 viser sekvens V, som svarer til det genomiske DNA I

I isoleret i klon pBSGluc39.1, I

I fig. 9 viser sekvens VI svarende til det genomiske DNA som I

I 5 isoleret i klon pBSGluc39.3, I

I fig. 10 viser sekvens VII, hvor sekvens DNA-VII svarer til I

I cDNA-sekvensen udledt af det isolerede genomiske DNA i I

I klon pBSGluc39.1, sekvens V; under denne sekvens er vist I

I den afledte aminosyresekvens AA-VII, og I

I 10 fig. 11 viser sekvens VIII med sekvens DNA-VIII svarende I

I til cDNA-sekvensen udledt af det isolerede genomiske DNA i I

I klon pBSGluc39.3, sekvens VI, og anbragt under denne I

I sekvens er vist den afledte aminosyresekvens AA-VIII. I

I Deponeringer I

I 15 Plasmid pBSGluc39.1 er deponeret ved American Type Culture I

I Collection, 29. december 1988, under deponeringsnummeret I

I ATCC 40526, og I

I plasmid pBSGluc39.3 er deponeret ved Americal Type Culture I

I Collection, 29. december 1988, under deponeringsnummeret I

I 20 ATCC 40527. I

I Den foreliggende opfindelse angår en rekombinant DNA-se- I

I kvens indeholdende en DNA-sekvens, som koder for et poly- I

I peptid med (3-1,3-glucanase-aktivitet, eller en DNA-sekvens I

I med væsentlig sekvenshomologi med sådan en /3-1,3-gluca- I

I 25 nase-kodende sekvens. Dette rekombinant-DNA kan indeholde I

I et molekylært DNA-fragment fra genomisk DNA, som koder for I

I et polypeptid med /3-1,3-glucanase-aktivitet, eller en I

I DNA-sekvens med væsentlig sekvenshomologi til sådant et I

I fragment. Endvidere kan dette rekombinant-DNA være et cDNA I

I 30 fremstillet ud fra mRNA kodende for et polypeptid med I

5 DK 175543 B1 /3-1,3-glucanase-aJctivitet eller ud fra et fragment af sådant mRNA, et DNA med væsentlig sekvenshomologi med sådant et cDNA eller et rekombinant DNA indeholdende 5 sådant et cDNA eller et DNA med væsentlig sekvenshomologi med sådant et cDNA. Den foreliggende opfindelse angår også en genomisk DNA-sekvens, som koder for et polypeptid med /3-1,3-glucanase-aktivitet, i stort set ren form.

Sædvanligvis vil kildeorganismen for det genomiske DNA 10 eller for mRNA'et, som koder for et polypeptid med (3-1,3-glucanase-aktivitet, være en plante. Anvendelige planter er enkimbladede og tokimbladede planter, f.eks. majs, hvede, ris, byg, tobak, tomat, agurk, kartoffel, almindelig bønne, sojabønne, ærter eller gulerødder. Den fore-15 trukne plante er tobaksplanten.

Det fremgår af det efterfølgende, at i tobak koder den genomiske DNA-sekvens for et såkaldt "præ-pro-enzym", som undergår posttranslationel behandling eller processing til dannelse af den modne (3-1,3-glucanase. Det vil sige, at 20 den C-terminale ende og den N-terminale ende af præ-pro-enzymet afspaltes efter translation. Disse spaltningssteder er vist over nucleotidsekvenserne i sekvenser I-IV som (C) for det C-terminale spaltningspunkt og som (N) for det N-terminale spaltningspunkt. Den foreliggende 25 opfindelse omfatter følgelig de DNA-sekvenser, som koder for præ-pro-enzymet, samt de DNA-sekvenser, som koder for det modne enzym. De sidstnævnte DNA-sekvenser kan opnås ved anvendelse af konventionelle restriktions- og spaltningsprocesser, enten ud fra det genomiske DNA eller ud 30 fra cDNA'et, som koder for præ-pro-enzymet. Opfindelsen omfatter også DNA-sekvenser med væsentlig sekvenshomologi til de naturligt forekommende genomiske DNA-sekvenser og til cDNA-sekvenser afledt af naturligt forekommende mRNA-sekvenser. 1

Der foretrækkes en rekombinant DNA-sekvens indeholdende en

I DK 175543 B1 I

I 6 I

I cDNA-sekvens, som koder for en moden (3-1,3-glucanase, I

I eller et fragment deraf indeholdende 5'-enden af kodnings- I

I sekvenserne, især et fragment, som har mindst 700 nucleo- I

I 5 tider eller mindst 900 nucleotider. Specielt foretrækkes I

I en rekombinant DNA-sekvens indeholdende en cDNA-sekvens, I

I som koder for en præ-pro-/3-l, 3-glucanase, eller et I

I fragment deraf, indeholdende 5'-enden af kodningssekven- I

I serne, især et fragment med mindst 800 nucleotider eller I

I 10 mindst 1000 nucleotider. Helt specielt foretrækkes DNA- I

I sekvenser, som indeholder cDNA, der koder for moden I

tobaks-£-l,3-glucanase eller tobaks-præ-pro-/?-l,3-gluca- I

I nase, f.eks. et rekombinant DNA, som indeholder en DNA-se- I

I kvens som vist i sekvens DNA-I, sekvens DNA-II, sekvens I

I 15 DNA-III, sekvens DNA-IV, sekvens DNA-VII eller sekvens I

I DNA-VIII. Desuden foretrækkes især stort set rent genomisk I

I DNA, som koder for tobaks-0-1,3-glucanase, f.eks. stort I

I set ren genomisk DNA gluc39.1 (sekvens V) eller genomisk I

I DNA gluc39.3 (sekvens VI) samt rekombinant DNA, som inde- I

I 20 holder det genomiske DNA. I

I Endvidere foretrækkes en rekombinant DNA-sekvens, som I

koder for et polypeptid med formlen I

I qsigvcygmlgnnlpnhw I

I EVIQLYKSRNIGRLRLYDPN I

I H G ALQALKGS N I EVMLGL P N I

I SDVKHIASG. MEHARWWVQKN I

I VKD FWPDVK I KY I AVGNE I S I

I PV TGTSYLTSFLTPAMVNIY .1

I KAI GEAGLG NNIKVS TSVDM I

I TLIGNSYPPSQGSFR NDARW I

I F V/T DP IVGFLRDTRAPLLVNI I

I YPYFSYSGNPGQI SLPYSLF I

I TAPNVVVQDGSRQYRNLFDA I

I MLDSVYAALERSGGASVGIV I

I VSESGWPSAGA FGATYDNAA I

I T Y L R N/Y L I Q/P HAKEGSPRKPGP I

I IETYIFAMFDENNKNPELEK I

7 DK 175543 B1 hfglfspnkqpkyn i/l n f g især med formlen

MSTSHKH NTP qmaaitllglllvas s/t i d/e i a gaqs igvcygmlgnnlpnhw eviqlyksrn igrlrlydpn hgalqalkgsnievmlglpn sdvkhiasgmeharwwvqkn vkdf wpdvkikyiavgnei s pvt gt s ylts fltpamvn i y kaige aglgnnikvstsvdm tlignsyppsqgsfrndarw F V/T DP IVGFLR D TRA PLLVN I Y P YF S Y S G NP GQ I S LP Y S L F TAP NV VVQDGSRQYRNLFDA MLDSVYAALERSGGAS VGIV VSESGWPSAGAFGATYDNA A TYL R N/Y L I Q/P HAKEG SPRKPGP IETYIFAMFDENNKNPELEK HFGLFSPNKQPKYN I/L N F G V S GGVWD. S SVE TNATASL V/I S E M

5 hvori bogstaverne afskilt med en skråstreg repræsenterer den ene eller den anden amiosyre. Disse aminosyresekvenser svarer til henholdsvis præ-pro-enzymet og det modne enzym og er udledt af aminosyresekvenserne AA-I til IV, VII og VIII.

10 Endvidere omfatter opfindelsen signalpeptidsekvenserne, som er karakteristiske for 0-1,3-glucanaserne. Signalpeptider er aminosyrekomponenter i transiaterede proteiner og muliggør transport af sådanne proteiner fra syntesestedet til udnyttelsesstedet. Når transporten er gennem-15 ført, afspaltes signalpeptidet, og det modne protein aktiveres eller gøres tilgængeligt for yderligere — ' — —j

I DK 175543 B1 I

i 8 I

I processing. Opfindelsen angår især et signalpeptid for I

I tobaks-/3-l, 3-glucanase og rekombinant-DNA-sekvenser, som I

I koder for et sådant signalpeptid, f.eks. peptidet med I

I 5 formlen I

I mstshkhntpqmaaitllgl I

I L L V A S.S/T I D/E I A G A I

I hvori bogstaverne adskilt med en skråstreg repræsenterer I

I den ene eller den anden aminosyre, og en rekombinant I

I DNA-sekvens, som koder for dette peptid. I

I 10 Bestemte DNA-sekvenser er fremstillet og karakteriseret I

I som cDNA eller genomiske sekvenser i overensstemmelse med I

I fremgangsmåderne beskrevet i de efterfølgende eksempler. I

I Resultaterne af karakteriseringerne angives i det følgen- I

I de. I

I 15 Der isoleres tre forskellige klasser cDNA-kloner, hvis I

I kodningssekvenser ligner hinanden. Desuden er der hete- I

I rogenitet i aminosyresekvensen, som ikke er repræsenteret I

I i mRNA'erne svarende til de isolerede cDNA-kloner. Dyrkede I

I tobaksplanteceller induceret til at producere /3-1,3-gluca- I

I 20 nase har således mindt fire transkriptionelt aktive /3-1,3- I

I glucanase-gener. Dette og det lille antal restriktions- I

I fragmenter, som påvises i Southern blot-forsøgene, I

I indicerer, at tobak-/3-l,3-glucanase indkodes af en lille I

I genfamilie. Moderne tobaksplanter er opstået ved hybri- I

I 25 disering af to ancestrale arter, nemlig N. sylvestris og I

N. tomentosiformis (32, 33). Sammenligning af restrik- I

I tionsfragmenterne dannet af DNA fra tobak og de I

I ancestrale arter tyder på, at ca. 2-3 medlemmer af I

I tobaks-/3-1,3- glucanase-familien har deres udviklings- I

I 30 mæssige baggrund i begge disse stamarter. I

I Computerundersøgelser i EMBL-version 14 (38) og NBRF-ver- I

sion 15 (39) databankerne giver kun et protein med signi- I

9 DK 175543 B1 fikant sekvenslighed med tobak-0-l,3-glucanase. Efter indføring af 3 huller eller spring i det modne tobakenzyms sekvens er aminosyresekvensen for bygendosperm (l->3, 1-^4)-5 Ø-glucanase-isozym II (40) identisk med hensyn til 47% af positionerne. Desuden er der stærkt bevarede områder (12 af 15 positioner) ved N- og C-terminalerne i de modne proteiner. Sekvensen for de første 22 N-terminale aminosyrer hos en formodet 0-1,3-glucanase oprenset fra N.

10 plumbaginifolia (41) er identisk med den N-terminale sekvens hos tobaksenzymet, bortset fra den N-terminale aminosyre, som er Glu.

Forsøg med impulsundersøgelser ("pulse chase”) viser, at præ-pro-(5-l,3-glucanase undergår sekvensmæssig processing.

15 Først fjernes det N-terminale signalpeptid, og en oligo-saccharidsidekæde adderes som rapporteret for frøoplagringsproteinerne phaseolin og concanavalin A (42, 43).

Senere fjernes oligosaccharidet og den C-terminale forlængelse til dannelse af det modne enzym. Tab af C-terminale 20 forlængelser er rapporteret for planteproteinerne pro-thaumatin (44), pro-concanavalin A (43,45,46) og isolectin 3 i hvedekimagglutinin (47). Der konstateres ingen væsentlige sekvensligheder mellem disse peptider og den C-terminale forlængelse af tobaksenzymet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 cDNA-Sekvensen vist som sekvenser DNA-VII er udledt af de 2 genomiske DNA-sekvenser for klon pBSGluc39.1, sekvens V.

3

Nucleotider 1 til 121 svarer til nucleotider 1434 til 4 1554, og nucleotider 122 til 1407 svarer til nucleotider 5 2345 til 3630 i den genomiske sekvens. Nucleotider 1555 6 til 2344 i genomisk sekvens V repræsenterer en intron.

7 cDNA-Sekvensen vist som sekvenser DNA-VIII er udledt af de 8 genomiske DNA-sekvenser for klon pBSGluc39.3, sekvens VI.

9

Nucleotider 1-121 svarer til nucleotider 1618 til 1738, og 10 nucleotider 122-1431 svarer til nucleotider 2486 til 3795.

11

Nucleotider 1739 til 2487 i den genomiske sekvens VI repræsenterer et intron.

I DK 175543 B1 I

I 10 I

I Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgen- I

I de eksempler. I

I Eksempel 1 I

I 5 Plantemateriale og dyrkningsmetoder I

Nicotiana tabacum L. cv. Havana 425, N. syl vestris og N. I

I tomentosiformis dyrkes fra frøstadiet i et væksthus. Den I

I klonede linie af Havana 425 marvvæv, 275N (17) dyrkes I

I under betingelser, som inducerer 0-1>3-glucanase-akkumu- I

10 lering (15). Suspensioner af bladprotoplaster fremstilles I

I ud fra axeniske Havana 425-skudkulturer og dyrkes i I

I flydende K3-medium som beskrevet af Paszkowski et al. I

I (18). I

I Eksempel 2 I

I 15 Konstruktion og screening af et cDNA-bibliotek I

I Et cDNA-bibliotek fremstilles af poly(A+) RNA isoleret fra I

I 275N-væv (15) som beskrevet (19) og indsat i Pst I-stedet I

i plasmid pBR322 ved anvendelse af den homopolymere I

I dC-dG-tailingmetode (20). Rekombinantkolonier screenes ved I

I 20 hjælp af kolonihybridisering med 32p_mærket pst χ-insert I

I af tobaks-(3-l,3-glucanase cDNA-klon pGL43, en partiel I

I cDNA-klon for tobak-/3-l, 3-glucanase (15) som en hybridi- I

I seringsprobe. Selv om β-l,3-glucanase-mRNA er en stærkt I

I repræsenteret komponent af poly(A+) RNA'et anvendt til I

I 25 fremstilling af cDNA-bibliotekerne (15), kan kun et lille I

I antal partielle cDNA-kloner identificeres i screeninger af I

I flere biblioteker. I

11 DK 175543 B1

Eksempel 3

Deoxynucleotidsekvensanalyse

Restriktionsfragmenter klones i Ml3-vektorerne mpl8 og 5 mpl9 (21) og sekvenseres i begge orienteringer ved hjælp af dideoxynucleotid-kædetermineringsmetoden (22). Nucleo-tidsekvenser analyseres under anvendelse af computerprogrammet ifølge Queen og Korn (23).

Fem af de syv positive rekombinantkIoner, som viser sig at 10 have de længste cDNA-inserter, sekvenseres (fig. 1). Tre af klonerne indeholder ikke 3'-områderne af mRNA’et. Den sammensatte sekvens viser en enkelt, uafbrudt åben aflæsningsstruktur på 1083 nucleotider begyndende ved position 1. Baseret på tilgængelig information for disse syv kloner 15 foretages følgende bestemmelse af translationsstarten: Consensussekvensen for translationsstarten i planter er AACAAUGGC, hvori purinet ved -3 er vigtigt af hensyn til effektiv translation i et reticulocytlysatsystem, men ikke i et hvedekimsystem (28). Det første tilgængelige 20 initi- eringskodon i strukturen er ved position 7, som giver sekvensen UCAAAUGCG. Translation startende med dette kodon danner et polypeptid med en længde på 359 rester med MT 39.173 svarende i størrelse til det primære translations- produkt af tobaks-0-l,3-glucanase (15, 29). 1 2 3 4 5 6

De overlappende sekvenser af inserterne af kloner pGL28, 2 pGL30 og pGL31 er identiske, hvilket tyder på, at de re 3 præsenterer det samme mRNA (sekvens DNA-I). Sammenligning 4 af inserterne i pGL31 og pGL36, som overlapper med en 5 længde på 328 nucleotider, viser to stille substitutioner 6 ved positioner 555 og 564 og to substitutioner ved positioner 547 og 548, som resulterer i en enkelt aminosyre-substitution af Val med Thr. Sekvensen af pGL43 insertet er forskellig fra sekvenserne for pGL31 og pGL36 inserterne ved 13 positioner; 12 er stille forskelle i den

I DK 175543 B1 I

I 12 I

I tredje såkaldte "wobble" position i kodon'et, og in i I

I position 1006 resulterer i den bevarende ændring fra Leu I

I til Ile, som også påvises ved aminosyresekvensering af det I

I 5 modne enzym. I

I Den sammensatte cDNA-sekvens har to formodede polyade- I

I nyleringssignaler for planter, AAG AAA i position 1285 og I

I ATT AAT i position 1321 (30). De overlappende sekvenser af I

I cDNA inserterne fra pGL28 og pGL30 er identiske op til I

I 10 position 1310, hvor poly(A) halen af pGL28 starter 18 I

I nucleotider efter det første polyadenyleringssignal. I

I Poly(A) halen af pGL30 starter 24 nucleotider efter det I

I andet polyadenyleringssignal. Dette tyder på, at der er en I

I skiftende polyadenylering af /5-1,3-giucanase-transkrip- I

I 15 terne som rapporteret for andre plantegener (31). I

I Eksempel 4 I

Southern Blot-analyse I

I 5 μg DNA fremstillet af tobaksblade (N. tabacum), N. syl- I

vestris og N. tomentosiforrois (32, 33) ved anvendelse af I

I 20 fremgangsmåden ifølge Murray og Thompson (24) spaltes I

fuld- stændigt med restriktionsendonucleaserne EcoRI, I

HindiII eller Xbal. De dannede fragmenter adskilles ved I

I elektro- forese på en 0,8%’s (v/r) agarosegel, overføres I

I til en Zeta-probe "Nylon"®-membran (BioRad) og I

I 25 hybridiseres som anbefalet af producenten. Den afsluttende I

vask gennemføres ved 50eC i 0,2 x SSC (1 x SSC er 0,15 Μ I

I NaCl/15 mM natriumcitrat, pH 7), 0,i% (v/r) natriumdo- I

I decylsulfat (SDS). Pst I insertet af tobaks-/3-l,3-gluca- I

I nase cDNA-klonen pGL43 (15) anvendes som probe og mærkes I

I 30 under anvendelse af et random primer-mærkningssæt I

(Boehringer). I

Restriktionsendonucleasefragmenterne, som hybridiserer til I

I insertet fra tobaks-(5-l,3-glucanase-cDNA-klon pGL43, er I

13 DK 175543 B1 vist i fig. 2. Hver af restriktionsendonucleaserne danner fire fragmenter med tobak DNA. EcoRI- og Xbal-fragmenterne svarer med hensyn til størrelse og hybridiseringsin-5 tensitet til to fragmenter dannet med DNA fra hvert af forældrearterne, N. sylvestris og N. tomentosiformis.

HindiII danner fragmenter med N. sylvestris DNA, som ikke med hensyn til størrelse svarer til fragmenterne dannet med tobak DNA. Analyser under anvendelse af kombinationer.

10 af restriktionsendonucleaser og andre hybridiseringsprober tyder på, at forskelle i hybridiseringsintensiteten viser forskelle med hensyn til homologi og ikke med hensyn til kopiantal.

Eksempel 5 15 Analyse af proteiner

/3-1,3-Glucanase renses fra 275N væv ved hjælp af "CM-Sephadex"® G-50-kromatograferingstrinet for chitinase (16). Fraktioner indeholdende /3-1,3-glucanase hældes sammen, koncentreres ved ultrafiltrering (nedsænkelig 20 CX-10, Millipore), indstilles til 100 mM NaCl/10 mM

Tris-HCl, pH 8,4 og ledes gennem en søjle indeholdende regenereret chitin (25) til fjernelse af spor af chitinase. Slutproduktet har en renhed på >95% bestemt ved SDS-PAGE og farvning af proteinet med coomassie-blåt 25 R-250. Til fremstilling af tryptiske peptider indstilles /3-1,3-glucanase (320 μς i 1 ml) på 8 M urinstof og dialyseres mod 2 M urinstof/0,1 M NH4HCO3. Der tilsættes trypsin (7 /xg, Worthington), og blandingen inkuberes i 6,5 timer ved 37eC. Derefter tilsættes yderligere 7 μg 30 trypsin, og reaktionen afbrydes efter 24 timer ved indstilling af pH-værdien på 3 med HC1. CNBr-spaltning, fraktionering af peptider med hjælp af HPLC, aminosyre-analyse og aminosyresekvensering gennemføres som beskrevet (26).

I DK 175543 B1 I

I 14 I

I Sekvensen for 4 tryptiske peptider og et CNBr-peptid af I

I det rene enzym dækkende i alt 70 aminosyrerester er den I

I samme som de udledte sekvenser, hvilket tyder på, at de I

I 5 klonede cDNA’er er afledt af mRNA'et for /3-1,3-glucanase. I

I Yderligere aminosyrer findes i to positioner i proteinet, I

I 284 og 287, og disse er ikke repræsenteret i de isolerede I

I cDNA-kloner. I

I Aminosyre- og DNA-sekvensinformationen anvendes til at I

I 10 udlede primærstrukturen for præ-pro-0-1,3-glucanase. Under I

I anvendelse af reglerne for proteinprocessing af Von Heijne I

I (34) identificeres et yderst sandsynligt spaltningssted I

I mellem Ala 21 og Gin 22. Processing ved dette sted stemmer I

I overens med iagttagelsen af, at den N-terminale ende af I

I 15 modent /3-1,3-glucanase er blokeret. N-terminale glutaminer I

I blokeres ofte ved spontan eller enzymatisk omdannelse til I

I en pyroglutamylrest (35). Et renset N-terminalt blokeret I

I peptid dannet ved CNBr-spaltning af det modne enzym med I

I sammensætningen Glugf$Ser^oIlel,0^1Y2,0Va^l,1^ΥΓ1,0Hsel,0 I

I 20 (Hse er homoserin) svarer til den N-terminale sekvens Gin I

I Ser Ile Gly Val Cys Tyr Gly Met. Disse resultater viser, I

I at det primære translationsprodukt for /3-1,3-glucanase har I

I et hydrofobt signalpeptid med en længde på 21 rester, og I

I at den N-terminale ende af det modne enzym er Gin 22. I

25 Det primære translationsprodukt af /3-1,3-glucanase har en I

I Mr-værdi, som er ca. 4000 større end værdien for det modne I

I enzym (15, 29). Tilstedeværelsen af et signalpeptid kan I

I kun dække for en forskel i MT-værdi på ca. 2000, hvilket I

I tyder på, at proteinet undergår yderligere processing. I

I 30 Spaltning af enzymet med CNBr giver et peptid, som mangler I

I homoserin, hvilket indicerer, at det er den C-terminale I

I ende af det modne protein. Dets aminosyresammensætning og I

I sekvens bestemmes, og resultaterne viser sig at svare til I

I rester 308 til 337 af de udledte sekvenser. Da stop- I

I 35 kodon'et forekommer 22 aminosyrerester efter Gly 337, I

I tyder det på, at en C-terminal forlængelse er fjernet I

15 DK 175543 B1 under processing.

Eksempel 6

Impuls-opsporingsforsøg

5 5 x 10^ bladprotoplaster inkuberes i 45 minutter ved 26“C

i mørke under omrystning ved 50 o/m i hullerne på en 24-hullers Falcon vævskulturplade (Becton Dickinson), som indeholder 500 /il K3-medium uden fytohormoner og ca. 20 /tCi 35s_L_methionin (specifik aktivitet ca. 1275 Ci/nmol, 10 Amersham). Hvor det indiceres efterfølges impulsmærkningen ved inkubation i 11,75 timer med 1 mM L-methionin sat til hullerne. Til et kopisæt af huller sættes 20 /ig/ml tuni-camycin (Calbiochem) 20 minutter inden tilsætningen af 35s-L-methioninet. Proteinekstrakter fremstilles ved 15 tilsætning af 100 /il 6 mM dithiothreitol, 6% (r/r) "Triton" X-100, 200 mM Tris-HCl, pH 8,0 til hvert hul, hvorpå der inkuberes i 10 minutter ved 26*C, hvorefter prøverne fryses i flydende nitrogen. Ekstrakterne opdeles i to alikvoter. Proteinet i en alikvot fældes med acetone 20 og analyseres ved hjælp af SDS-PAGE (17). Den anden alikvot immunadsorberes med kanin-anti-tobak-/3-l,3-gluca-nase IgG (27) bundet til protein A-"Sepharose"® CL-4B (Pharmacia, og de immunadsorberede polypeptider analyseres ved hjælp af SDS-PAGE (15). 35S-Methionin-mærkede in vitro 25 translationsprodukter fremstilles med et kanin-reticulo-cytsystem. Total RNA fra 275N væv induceret til at producere /3-1,3-glucanase er kilden for mRNA (15). Geler kalibreres med SDS-PAGE-standarder med lav molekylvægt (BioRad). 1

Processingen af /3-1,3-glucanase udledt af strukturundersøgelser (eksempel 5) bekræftes ved impuls-opsporingsforsøg. Hovedpolypeptidet mærket ved impulsmærkning af tobaksprotoplaster med 35$-methionin i 45 minutter immunadsorberes ved hjælp af anti-/?-l, 3-glucanase-anti-

I DK 175543 B1 I

I 16 I

I stof (fig. 3). Det har en MT-værdi, som er lidt større end I

I MT-værdien for in vitro translationsproduktet anvendt ved I

I den samme SDS-PAGE som en standard for præ-pro-enzymet. I

I 5 Efter opsporingen comigrerer størsteparten af det immun- I

I reaktive materiale med den modne form af 0-1,3-glucanase, I

I hvilket viser, at størsteparten af precursorformen af 0- I

I 1,3-glucanase undergår processing til den modne form under I

I den ca. 12 timer lange opsporing (chase). I

I 10 Den udledte sekvens for precursoren har et enkelt formodet I

I sted for N-glycosylering, Asn X Ser/thr (36), som starter I

I ved Asn 350 i den C-terminale forlængelse. Dette tyder på, I

I at processing af /8-1,3-glucanase omfatter glycosylering. I

I Til afprøvning af denne formodning inkuberes kopiproto- I

I 15 plastsuspensioner anvendt i impuls-opsporings-forsøgene I

I med tunicamycin, som hæmmer syntesen af lipidbundne oligo- I

I saccharider, og som er kendt for at blokere N-glycosyle- I

I ring af plantepolypeptider (37). Tunicamycinbehandling I

I hæmmer 35g_methionininkorporering i polypeptides med ca. I

I 20 50%. Det immunreaktive polypeptid opnået efter impulsmærk- I

I ning i nærværelse af tunicamycin har en MT-værdi, som er I

I ca. 2000 mindre end værdien for polypeptidet opnået med I

I ubehandlede protoplaster. På den anden side har det I

I immunreaktive polypeptid opnået efter opsporingsbehand- I

I 25 lingen i nærværelse af tunicamycin samme MT-værdi som I

I modent 0-1,3-glucanase. Plante-N-glycaner (37) og den I

I N-terminale signalsekvens af 0-1,3-glucanase har samme I

I MT-værdi på ca. 2000. Resultaterne indicerer derfor, at I

I precursoren mister signalpeptidet og får tilført en I

I 30 oligosaccharidsidekæde. Dette sker på stedet mærket I

I (N-glyc) i sekvenserne. Senere deglycosyleres det dannede I

I proenzym, og den C-terminale forlængelse fraspaltes til I

I dannelse af det modne enzym. Processing til den modne form I

I kræver imidlertid ikke glycosylering. I

17 DK 175543 B1

Eksempel 7

Isolering af en genomisk klon DNA med høj molekylvægt fremstilles ud fra blade af 5 Nicotiana tabacum cv. Havana 425 ved anvendelse af CETAB-metoden (24). 100 /tg DNA spaltes fuldstændigt med Sacl.

Dette DNA fraskilles ved elektroforese på en 0,8%'s agaro- segel. Det område af gelen, som svarer til et molekyl- vægtsområde på 3-7 kb, udskæres i 6 lige store 10 strimler, og DNA'et elektroelueres fra disse strimler og fældes som separate fraktioner. DNA'et resuspenderes, og en alikvot fra hver fraktion behandles på en agarosegel og analyseres ved hjælp af Southern blotting. Fraktionen, som indeholder DNA, der hybridiserer til /3-1,3-glucanase 15 cDNA-proben (eksempel 4), hældes sammen og anvendes til konstruktion af biblioteker.

Kloningsvektoren XOngC fra firmaet Stratagene Corp. spaltes med Sacl. 1 af dette DNA blandes med 0,1 /tg af det Sacl-spaltede tobak DNA, og DNA'et ligeres med T4-DNA-20 ligase under anvendelse af producentens forskrifter. Det ligerede DNA pakkes derpå i fagpartikler under anvendelse af en in vitro-pakningsmetode ifølge Stratagene. Fagerne udplades med bakterier som foreslået i X-håndbogen. Ca.

75.000 plague screenes under anvendelse af en 32-P-mærket 25 /3-1,3-glucanase cDNA-probe. 11 positive plague identifi ceres. Disse plague renses ved flere ganges udpladning og screening.

DNA isoleres fra de rensede kloner, og klonerne analyseres ved restriktionsspaltning under anvendelse af Hindlll, 30 EcoRI og Sacl. Der er to typer kloner, hvor den ene er repræsenteret ved klonen 39.1, og den anden er repræsenteret ved klonen 39.3. 4,5 og 4,7 kb inserterne i henholdsvis klon 39.1 og 39.3 underklones i bluescript plasmidet spaltet med Sacl, og underkloneme pBSGluc39.1 (Sacl-

I DK 175543 B1 I

I 18 I

I fragment afledt af x-klon 39.1) og pBSGluc39.3 (Sacl-frag- I

I ment afledt af λ-klon 39.3) isoleres. DNA-sekvensen i I

I Sacl-fragmenterne indeholdt i underklonerne pBSGluc39.1 og I

I 5 pBSGluc39.3 bestemmes ved DNA-sekvensering og er vist i I

I henholdsvis sekvens V og VI. Kodningssekvensen bestemmes, I

I og den tilsvarende aminosyresekvens udledes. Disse sekven- I

I ser er vist i henholdsvis sekvens VII og sekvens VIII. En I

I stor mellemliggende sekvens findes nær 5'-enden af I

I 10 kodningssekvensen. I

I Plasmid pBSGluc39.1 er deponeret ved American Type Culture I

I Collection, 29. december 1988, under deponeringsnummeret I

I ATCC 40526, og I

I plasmid pBSGluc39.3 er deponeret ved American Type Culture I

I 15 Collection, 29. december 1988, under deponeringsnummeret I

I ATCC 40527. I

Eksempel 8 I

I Identificering af transkriptionsstartstedet I

I A. Primerforlængelseskortlægning I

I 20 Der fremstilles en syntetisk DNA-primer, som er. komplemen- I

I tær til baserne 2399 til 2416 (sekvens V), under anvend- I

I else et synteseapparatur fra Applied Biosystems og I

I Ø-cyanoethylphosphoramidatmetoden. Oligonucleotidet I

I renses ved højtryksvæskekromatografi med omvendt fase I

I 25 (HPLC). 5 pmol af oligoforbindelsen kinasebehandles (20) I

I under anvendelse af 200 /zCi 32ρ„£τρ (6000 Ci/mmol, 10 I

I μα/μΐ). Efter inkubering ved 37*C i 30 minutter fortyndes I

I reaktionsblandingen til 100 μΐ, hvorpå den ekstraheres med I

I phenol/chloro-form, hvorefter der fældes tre gange med 50 I

I 30 μg bærer-RNA. Bundfaldet fra sidste fældning resuspenderes I

I i 1 X reverse-transkriptase-puffer (50 mM Tris-HCl, pH I

I 7,5, 40 mM KC1, 3 mM MgCl2> ved en koncentration på 2 nM. I

19 DK 175543 B1

Den specifikke aktivitet af det mærkede oligonucleotid bestemmes til ca. 3 x 10^ Cvcpm/pmol.

Total-RNA isoleres fra Phytophthora parasitica var.

5 nicotiana-inficeret tobak i alt væsentligt som beskrevet (48). Væv findeles under flydende nitrogen i en morter med en pistil. Det formalede væv sættes til formalingspuffer (48), idet der anvendes 2,5 ml pr. g væv. Et lige så Stort' rumfang phenol tilsættes derpå, og emulsionen homogenise-10 res i en Brinkman-polytron. Der tilsættes et halvt rumfang chloroform, hvorpå emulsionen blandes forsigtigt i 15 minutter. Faserne adskilles ved centrifugering, og den vandige fase fjernes. RNA fældes ved tilsætning af natriumacetat til 0,3 M og 2,5 rumfang ethanol. Bundfaldet 15 samles ved centrifugering og resuspenderes i 2 ml sterilt vand. Der tilsættes lithiumchlorid med en slutkoncentra-tion på 3 M, hvorpå blandingen henstår natten ved 4°C. Bundfaldet samles ved centrifugering, og pelletten vaskes med iskold 80%’s ethanol. Pelletten tørres og resuspende-20 res i 500 μΐ sterilt vand. Koncentrationen af denne total-RNA-præparation bestemmes spektrofotometrisk. 1

Mg total-RNA lyofiliseres i et 500 μΐ Eppendorf-rør.

RNA’et resuspenderes i 30 /il radioaktivt mærket probeop-løsning, og der opvarmes til 70*C i 10 minutter. Røret 25 afkøles langsomt til 37eC, og der inkuberes natten over, uden at fjerne røret fra 37°C-vandbadet tilsættes 2 μΐ 10 X revers-transkriptase-puffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 400 mM KC1, 30 mM MgCl2>, 1 μΐ 5 mg/ml bovint serumalbumin, 5 μΐ 100 mM dithiothreitol, 5 μΐ 10 X dNTP’er (10 30 mM af hver dNTP i H2O), 3 μΐ Η£θ, 2 μΐ RNasin (80 enh.) og 2 μΐ revers-transkriptase (400 enh.), og reaktionsblandingen inkuberes ved 37eC i 30 minutter. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 5 μΐ 3 M natriumacetat, pH 5, og 150 μΐ absolut ethanol. Røret henstår ved -20eC i 30 minutter, 35 bundfaldet isoleres ved centrifugering, vaskes med 80%'s ethanol og henstilles til lufttørring. Bundfaldet resus-

I DK 175543 B1 I

I 20 I

I penderes i 10-20 μΐ påsætningsfarve (90% formamid, 0,05% I

I bromphenolblåt, 0,05% xylencyanol, 1 mM EDTA), og forlæn- I

I gelsesprodukterne adskilles på en 6%'s sekvenseringsgel I

I 5 (20). Forlængelsesprodukterne gøres synlige ved autora- I

I diografi. I

I Primerforlængelsesprodukterne køres sammen med en molekyl- I

I vægtsstandard, hvori den mærkede primer anvendes i dide- I

I oxy-DNA-sekvenseringsreaktioner med subklonen pBSGluc39.1 I

I 10 som skabelon. Der identificeres forlængelsesprodukter, som I

I svarer til positioner 1432, 1446 og 1447 i 0-1,3-gluca- I

I nase-39.1-sekvensen, sekvens V. Da der findes et stort I

I intron mellem positioner 1554 og 2345 i pBSGluc39.1- I

I sekvensen, afspejler molekylvægtsskalaen ikke den korrekte I

I 15 molekylvægt for forlængelsesprodukterne. Der gennemføres I

I derfor et andet primerforlængelseskortlægningsforsøg under I

I anvendelse af en primer, som er komplementær til positio- I

I ner 1530-1547. Under anvendelse af denne primer kortlægges I

I tre 5'-ender af glucanase-mRNA'et til adeninrester i I

I 20 positioner 1434, 1448 og 1449. I

I B. Sl-Nucleasekortlægninq I Der fremstilles et syntetisk oligonucleotid, som er kom- I plementært til positioner 1415-1504, til anvendelse som en

I probe i Sl-nucleasekortlægning. Oligonucleotidet kinase- I

I 25 behandles ved 5’-enden under anvendelse af 32p_.ATP og T4- I

I polynucleotidkinase i overensstemmelse med leverandøres

I forskrifter. Efter phenolekstraktion og fældning med I

I ethanol resuspenderes det mærkede oligonucleotid i form-

I amidhybridiseringspuffer (49) ved en koncentration på ca. I

I 30 2 nM. 50 μg lyofiliseret, total-RNA fra Phytophthora I

I parasitica-inficeret tobak som ovenfor opløses i 30 μΐ af I probeopløsningen, og rørene opvarmes til 65eC i 10

I minutter, hvorefter de henstår til hybridisering natten I

I over ved 48°C. Sl-Nucleasebehandling og gelelektroforese

I 35 gennemføres i alt væsentligt som beskrevet under I

21 DK 175543 B1 anvendelse af en SI-koncentration på 400 enh./ml og en inkubationstemperatur på 30“C. Den passende Sl-nuclease-koncentration bestemmes ved forforsøg. Efter gelelektrofo-5 rese påvises tre bånd, som svarer til positioner 1434, 1448 og 1449 i pBSGluc39.1-DNA-sekvensen.

C. Bestemmelse af transkriptionsstartstedet

Primerforlængelse og Sl-nucleasekortlægning bestemmer i begge tilfælde 5'-enderne i mRNA'et til positioner 1434, 10 1448 og 1449. Disse steder, som alle er adeninrester, svarer derfor til transkriptionsstartstedet for 0 -1,3-glucanase-genet.

D. Bestemmelse af translationsstartstedet

Ved at sammenligne de sammensatte CD NA- sekvenser med 15 sekvensen af den ene eller den anden genomiske klon er det klart, at der findes et methionininitiatorkodon i struktur (in-frame) anbragt 32 aminosyrer foran aminotermina-len glutamin i det modne protein. Det skønnes, at dette kodon repræsenterer translationsstartstedet, da det er det 20 første . methioninkodon efter transkriptionsstartstedet, og da det dannede signalpeptid har den egnede længde (25-32 aminosyrer) og indeholder en anden methionin 11 rester efter den første, hvilket er almindeligt i signalpeptider.

I DK 175543 B1 I

I 22 I

I Litteraturhenvisninger I

I 1. Boller, T. (1987) in Plant-Microbe Interactions# I

I Molecular and Genetic Perspectives, eds. Kosuga, I

I T. & Nester, E.W. (Macmillan, New York), Vol 2, I

I pp. 385-413. · I

I 2. Abeles, F.B., Bosshart, R.P., Forrence, L.E. & I

I Habig, W.H. (1971) Plant Phvsiol. 47, 129-134. I

I 3. Felix, G. & Meins, F., Jr. (1987) Planta 172, 386-392. I

I 4. Moore, A.E. & Stone, B.A. (1972) Virology 50, 791-798. I

I 5. Pegg, G.F. & Young, D.H. (1981) Phvsiol. Plant Pathol. I

I 19, 371-382. I

I 6. Kearney, C.M. & Wu, J.H. (1984) Can. J. Bot. 62, I

I 1984-1988. I

I 7. Sanada, M., Matsushita, K., Shimokawa, H. & Itoh, R. I

(1986) Ann. Phvtopath. Soc. Japan 52, 320-329. I

I 8. Kauffmann, S., Legrand, M., Geoffroy, P. £ Fritig, B. I

I (1987) EMBO J. 6, 3209-3212. I

I 9. Kombrink, E., Schroeder, M. & Hahlbrock, -K. (1988) Proc. I

I Natl♦ Acad. Sci. USA 85, 782-786. I

I 10. Voegeli-Lange, R., Hansen-Gehri, A., Boller, T. & I

I Meins, F., Jr. (1988) Plant Science. 54, 171-176. I

I 11. Mauch, F., Hadwiger, L.A. & Boller, T. (1984) Plant I

23 DK 175543 B1

Phvsiol. 76, 607-611.

12. Mauch, F. (1985) Ph.D. Dissertation, Univ. of Basel,

Basel.

13. Shinshi, H. & Kato, K. (1983) Agric. Biol. Chem. 47, 1455-1460.

14. Felix, G. & Meins, F., Jr. (1986) Planta, 167, 206-211.

15. Mohnen, D., Shinshi, H., Felix, G. & Meins, F., Jr.

(1985) EMBO J. 4, 1631-1635.

16. Shinshi, H., Mohnen, D. & Meins, F., Jr. (1987) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 84, 89-93.

17. Eicholz, R., Harper, J., Felix, G. & Meins, F., Jr.

(1983) Planta 158, 410-415.

18. Paszkowski, J., Shillito, R.D., Saul, M., Mandåk, V.,

Hohn, T., Hohn, B. & Potrykus, I. (1984) EMBO J. 3, 2717-1722.

19. Gubier, U. & Hoffman, B.J. (1980) Gene 25. 263-269.

20. Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

21. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. & Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-109.

22. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467. 1

Queen, C. & Korn, L.J. (1984) Nucleic Acid Res. 12,

I DK 175543 B1 I

I 24 I

I 581-599. I

I 24. Murray, M.G. & Thompson, W.F. (1980) Nucleic Acid Res. 8. I

I 4321-4325. I

I 25. Boller, T., Gehri, A., Mauch, F. & Voegeli, U. (1983) I

I Planta, 157, 22-31. I

I 26. Hofsteenge, J. & Stone, S.R. (1987) Eur. J. Biochem. 160. I

I 49-56. I

I 27. Felix, G. & Meins, F., Jr. (1985) Planta, 164, 423-428. I

I 28. Luetcke, H.A., Chow, K.C., Moss, K.A., Kern, H.F. & I

I Scheele, G.A. (1987) EMBO J. 6, 43-48. I

I 29. Shinshi, H. & Kato, K. (1983) Aoric, Biol. Chem. 47, I

I 1275-1280. I

I 30. Dean, D., Tamaki, S., Dunsmuir, P., Favreau, Μ., I

I Katayama, C., Dooner, H, & Bedbrook, J. (1986) Nucleic I

I Acids Res. 14, 2229-2240. I

I 31. Heidecker, G. & Messing, J. (1986) Ann. Rev. Plant I

I Phvsiol. 37, 439-466. I

I 32. Gray, J.C., Kung, S.D., Wildman, S.G. & Sheen, S.J. I

I (1974) Nature, 252, 226-227. ' I

I 33. Jamet, E., Durr, A. & Fleck, J. (1987) Gene, 59, 213-221. I

I 34. Von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem. 133, 17-21. I

I 35. Abraham, G.N. & Podel, D.N. (1981) Mol. Cell. Biochem. I

I 38, 181-190. I

25 DK 175543 B1 36. Kornfeld, R. & Kornfeld, S. (1985) Ann. Rev. Biochem. 54/ 631-664.

37. Chrispeels, M.J. (1984) Philos. Trans. R. Soc. Lond.

Ser. B. 304, 309-322.

38. Hamm, G.H. & Cameron, G.N. (1986) Nucl. Acid Res. 14, 5-10.

39. George, D.G., Barker, W.C. & Hunt, L.T. (1986) Nucl. Acid Res. 14, 11-16.

40. Fincher, G.B., Lock, P.A., Morgan, Μ.M., Lingelbach, Κ., Wettenhall, R.E.H., Mercer, J.F.B., Brandt, A. & Thomsen, K.K. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2081-2085.

41. Bauw, G., De Loose, M., Inzé, D., Van Montague, M. & Vandekerckhove, J. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 4806-4810.

42. Bollini, R., Vitale, A. & Chrispeels, M.J. (1983) J.

Cell. Biol, 96, 999-1007.

43. Herman, E.M., Shannon, L.M. & Chrispeels, M.J. (1985)

Planta, 165, 23-29.

44. Edens, L., Heslinga, L., Klok, R., Ledeboer, A.M.,

Maat, J., Toonen, M.Y., Visser, C. & Verrips, C.T. (1982) Gene, 18, 1—12.

45. Bowles, D.J., Marcus, S.E., Pappin, D.J.C.,

Findlay, J.B.C., Eliopoulos, E., Maycox, P.R. &

Burgess, J. (1986) J. Cell Biol. 102, 1284-1297. 1

Chrispeels, M.J., Hartl, P.M., Sturm, A. & Faye, L.

(1986) J. Biol. Chem. 261, 10021-10024.

I DK 175543 B1

I 26 I

I 47. Raikhel, N.V. & Wilkins, T.A. (1987) Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA. 84, 6745-6749. I

I 48. Lagramini, L.M. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. I

I 84, 7542. I

49. Berk, A.J. et al. (1977) Cell. 12, 721. I

Claims (20)

1. Rekombinant DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-sekvens, som koder for et polypeptid med 5 β-l,3-glucanase-aktivitet, og som har væsentlig sekvens-homologi med en DNA-sekvens valgt fra gruppen bestående af sekvens DNA-I, sekvens DNA-III, sekvens DNA-IV, sekvens DNA-V, sekvens VI, sekvens DNA-VII og.sekvens DNA-VIII.

2. Rekombinant DNA-sekvens i følge krav 1, kende tegnet ved, at DNA-sekvensen, som koder for et polypeptid med 0-1,3-glucanase-aktivitet, er et molekylfragment fra genomisk DNA.

3. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kende tegnet ved, at DNA-sekvensen, som koder for et polypeptid med 0-1,3-glucanase-aktivitet, er et cDNA fremstillet ud fra mRNA eller ud fra et mRNA-fragment, eller en DNA-sekvens med væsentlig sekvenshomologi med et sådant 20 cDNA,

4. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er et cDNA fremstillet ud fra mRNA eller ud fra et mRNA-fragment eller en DNA-sekvens med væsent- 25 lig sekvenshomologi med et sådant cDNA,

5. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for tobak-β-Ι,3-glucanase.

6. Renset genomisk DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid med β-l,3-glucanase-aktivitet, med væsentlig sekvenshomologi med en DNA-sekvens valgt fra gruppen bestående af sekvens V og sekvens VI. 1

7. Renset genomisk DNA-sekvens ifølge krav 6, kende tegnet ved, at β-l, 3-glucanasen er tobak-β-Ι,3-glucanase. I DK 175543 B1 I 28 I

8. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendeteg- I I net ved, at den indeholder en cDNA-sekvens, som koder for I I moden /3-1,3-glucanase. I ® 9. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendeteg- I I net ved, at den indeholder et 5'-endekodningssekvensfrag- I ment af en cDNA-sekvens, som koder for moden /3-1,3-gluca- I I nase. I I ^10. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 9, kendeteg- I I net ved, at kodningssekvensfragmentet indeholder mindst I I 700 nucleotider. I

11. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendeteg- I I ^ net ved, at den indeholder en cDNA-sekvens, som koder for I I præ-pro-/S-l, 3-glucanase. I

12. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendeteg- I net ved, at den indeholder et 5'-endekodningssekvensfrag- I 20 ment af en. cDNA-sekvens, som koder for præ-pro-/3-l,3- I glucanase. I 13,. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 12, kendeteg- I net ved, at kodningssekvensfragmentet indeholder mindst I 25 800 nucleotider. I

14. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 5, kendeteg- I net ved, at den indeholder en cDNA-sekvens, som koder for I moden tobak-/3-l,3-glucanase. I

30 I

15. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 5, kendeteg- net ved, at den indeholder en cDNA-sekvens, som koder for tobak-præ-pro-β-Ι,3-glucanase. I 1 DK 175543 B1

16. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den indeholder en DNA-sekvens valgt blandt sekvens DNA-I, sekvens DNA-III og sekvens DNA-IV.

17. Genomisk DNA-sekvens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den er DNA’et fra sekvens V.

18. Genomisk DNA-sekvens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den er DNA'et fra sekvens VI. 10

19. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 5. kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid med formlen QSIGVCYGMLGNNLPNHW 15 EVIQLYKSRNIGRLRLYDPN HGALQA LKG SN IEVMLGLP N S DVKHIASGMEHARWWVQKN VKDFW 'PDVK IKYIAVGNE I S-PVTGTSYLTSFLTPAMVNIY 20 KAIGEAGLGNNIKVSTSVDM TLIGNSYPP SQGSFRNDARW F V/T DP IVGFLRDTRAP LLVN I YPYFSYSGN PGQISLPYSLF TAPN VVVQD GSRQYRNLF DA 25 MLDSVYAALERSGGASVGIV VSESGWP SAGAFGATYDNAA T Y L R N/Y L I Q/P HAKEGSPRKPGP IETYIFAMFDENNKNPELEK HFGLFSPNKQPKYN I/L N F G 30 hvori bogstaver adskilt ved hjælp af en skråstreg repræsenterer den ene af de to aminosyrer. 35 i I DK 175543 B1 I I 30 I

20. Rekombinant DNA-sekvens ifølge krav 5, kendetea- I I net ved, at den koder for et polypeptid med formlen I I mstshkhntp I I QMAAITLLGLLLVAS S/T I D/E I A I I Sgaqsigvcygmlgnnlpnhw I I eviqlyksrnigrlrlydpn I I HGALQALKGSNIEVMLGL PN I I SDVKHIASGMEHARWWVQKN I I VKDFWPDVK IKY I AVGNE I S I I 10PVTGTSYLTSFLTPAMVNIY I I K A I GEAGLGNN I KV S T SVDM I I T L I GN S YP P S QGS F RNDA RW I I F V/T DP IV GFLRDTRAPLLVNI I I YP YFSYSGNPGQI SLPYSLF I I ^ TAPNVVVQDGSRQYRNLFDA I I MLDSVYAALERSGGASVGIV I I V S E SGWP SA GAFGATYDNAA I I T Y L R N/Y L I Q/P HAKEGSPRKPGP I I IETYIFAMFD ENNKNPELEK I I 20HF GLFSPNKQPKYNI/LNFGVS I I G GVW D S SVE T NAT A S L V/I S E Μ I I hvori bogstaver adskilt med en skråstreg repræsenterer den I I 25 ene de to aminosyrer. I

21. Signalpeptid, kendetegnet ved, at det er et sig- I I nalpeptid for tobak-β-Ι,3-glucanase med formlen I I MSTSHKHNTPQMAAITLLGL I I 30 L L V A S S/T I D/E I A G A I I hvori bogstaver adskilt med en skråstreg repræsenterer den I I ene af de to aminosyrer. I I 35 I DK 175543 B1

22. Rekombinant DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et peptid med formlen MSTSHKHNTPQMAAITLLGL L L V A S S/T I D/E I A G A hvor bogstaver adskilt af en skråstreg repræsenterer den ene af de to aminosyrer.