DK175771B1 - Rhoptrymembranantigen fra Plasmodium falciparum - Google Patents

Description

DK 175771 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår identifikationen af et antigen fra de aseksuelle blodstadier af Plasmodium falciparum, hvilket angigen potentielt er i stand til at frembringe et immunrespons, og antistoffer, der er i stand til at forhindre væksten af parasitten og 5 anvendelsen af dette antigen og antistoffer mod det til immunisering, diagnostiskemetoder og behandlingsfremgangsmåder.

De molekylære begivenheder, der opstår når en malariamerozoit invaderer værterythrocyten, forstås dårligt. Parasitmolekyler 10 indeholdt i "rhoptries", kolbeformede sekretoriske organeller i merozoitens apikale ende, antages at spille en afgørende rolle i invasionen. I elektronmikroskopet forekommer rhoptrierne som mem-branbundne elektrontætte strukturer. Invasionsprocessen falder sammen med udtømmelsen af rhoptryindholdene, der formodentlig 15 udtømmes via den apikale kanal, selvom Bannister et al. (1986) har foreslået, at udtømning også kan forekomme på tidspunktet for schizontsprængning. Elektronmikroskopi under anvendelse af tannin-syreholdige fikseropløsninger har afsløret mulilamellære membranforsynede spiraler hidrørende fra rhoptrysekretioner. Dette antyder, at 20 der er lipid i rhoptrysekretionen og det er blevet foreslået, at dette kan bidrage til dannelsen af den parasitophore vakuolemembran.

Et antal forskellige proteiner er blevet identificeret i rhoptrierne fra P. falciparum. Der er blevet identificeret to antigenkomplekser.

25 Et kompleks med høj molekylvægt udgøres af tre antigene polypeptider på ca. ~Mr 105.000, Mf 135.000 og Mr 145.000 (Campbell et al. 1984;

Holden et al. 1985; Cooper et al. 1988 og lustigman et al. 1988) og et kompleks med lav molekylvægt udgøres af adskillige polypeptider afledt fra et protein med 83.000 og en doublet på ca. Mr 40.000 30 (Campbell et al. 1984; Howard et al., 1985; Braun-Breton et al., 1986; Schofield et al., 1986; Bushell et al., 1988).

Rhoptryantigener anses for at være potentielle vaccinebestanddele, oprindeligt fordi et rhoptryantigen fra P. voelii (Mr 235.000) 35 effektivt immuniserede mus mod infektion (Holder og Freeman, 1981). Efterfølgende blev det vist, at visse monoklonale antistoffer, der inhiberede væksten af P. falciparum in vitro var rettet mod rhoptry-bestanddele (Schofield et al., 1986). Yderligere var aber immuniseret med oprensede antigener delvis beskyttet mod angreb af Pj.

I DK 175771 B1 I

I 2 I

I falciparum (Perrin et al., 1985; Siddiqui et al., 1987). I

I Ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt I

I et rhoptrymembranantigen af de aseksuelle blodstadier fra Plasmodium I

I 5 falciparum, hvilket antigen er ejendommeligt ved: I

(i) at det syntetiseres i ni ti elt som et polypeptid med en I

B relativ molekylmasse på ca. 80.000: . I

I 10 (ii) at det forekommer i halsområdet (pedunklen) af rhoptrierne i I

B merozoiter; I

B (i i i) at det har solubilitetskarakterer og et hydrofobt domæne, I

B der er typisk for et helt membranprotein; I

I I

B eller et antigent fragment heraf. I

B Antigenet er fortrinsvis et polypeptid med en primær struktur, der I

B omfatter den i figur 1 angivne amminosyresekvens, eller et antigent I

B 20 fragment heraf. I

Med opfindelsen tilvejebringes også en metode til aktiv immunisering I

af en vært mod Plasmodium falciparum, hvilken metode omfatter I

indgivelse til værten af et antigen ifølge den foreliggende opfin- I

25 del se eller et antigent fragment heraf. I

Der tilvejebringes med opfindelsen en vaccine omfattende et antigen I

H ifølge opfindelsen eller et antigent fragment heraf, en farmaceutisk I

acceptabel bærer eller fortyndingsmiddel og eventuelt en adjuvans. I

I I

Den foreliggende opfindelse vedrører også et rekombinant DNA-moleky- I

le, der omfatter hele eller en del af en nukleotidsekvens, der er i I

stand til at blive udtrykt som et polypeptid med antigeniciteten af I

et antigen som ovenfor beskrevet eller et antigent fragment heraf I

35 eller en rekombinant kloningsvehikel eller vektor eller en værtscel- I

H le omfattende det rekombinante DNA-molekyle. I dette aspekt omfatter I

H det rekombinante DNA-molekyle, den rekombinante kloningsvehikel I

H eller vektor eller værtscellen fortrinsvis hele eller en del af en I

i

H nukleotidsekvens som beskrevet i figur 1. ! I

DK 175771 B1 3

Endelig omfatter opfindelsen et syntetisk polypeptid fremstillet ved ekspression af hele eller en del af en nukleotidsekvens som ovenfor beskrevet og en vaccinesammensætning omfattende det syntetiske polypeptid.

5

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt rhoptryantigen, der har sol ubilitetskarakterer og primære struktur egenskaber som et helt membranprotein. Dette antigen, der er blevet benævnt rhoptry-membran antigen-1 (RMA-1), forekommer at blive transporteret til 10 merozoitoverfladen i sene schizonter og frie merozoiter. RMA-l-se- kvensen er stærkt bevaret mellem to i sol ater af P. falciparum og mellem P. falciparum og murinmalaria P. chabaudi.

Yderligere træk ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den 15 detaljerede beskrivelse i følgende eksempel og de ledsagende fi gurer.

I figurerne: 20 Figur 1 viser nukleotidsekvensen af RMA-1 genet fra P. falciparum isolat DIO (øverste linje) og et RMA-1 cDNA fra isolat NF7 (nederste linje, stjernerne viser sekvensens udstrækning). Den forudsagte polypeptidsekvens er translateret. cDNA-Sekvensen er kun vist, hvor den adskiller sig fra den genomiske sekvens. Hvor dette også fører 25 til en aminosyreændring er ændringen vist i parenteser. Der er understreget to strækninger af hydrofobe aminosyrer; Cysteinrester er vist med fed skrift.

Figur 2 viser nukletidsekvensen af RMA-1 genet fra P. chabaudi adami 30 DS. Den forudsagte polypeptidsekvens transiateres. Der er under streget to strækninger af hydrofobe rester.

Figur 3 er en sammenligning af de forudsagte aminosyresekvenser fra RMA-1 fra P. falciparum isolat DIO (øverst) og P. chabaudi adami DS 35 (nederst). Stjerner betegner identiske aminosyrer og prikker betegner spring i sekvensen.

Figur 4 viser ekstraktionen af RMA-1 i Triton X-114. Når total inficerede erythrocyter (A) blev fraktioneret ved SDS-PAGE, — — - -

I DK 175771 B1 I

I i

I elektroblottet på nitrocellulose og immunoblots blev probet med I

I affinitetsoprensede kaninantistoffer mod det af klon Ag352.24 I

I producerede fusionsprotein, blev to polypeptider påvist: et med Mr I

I 80.000 og det andet med Mr 62.000. Inficerede erythrocyter blev I

5 fraktioneret ved temperaturafhængig faseadskillelse med detergenten I

I Triton X-114 til frembringelse af tre fraktioner; vandig fase (B), I

I hvori polypeptidet med Mr 80.000 var relativt beriget; Triton X-114 I

I fase (C), hvori polypeptidet med 62.000 var relativt beriget; og I

I uopløseligt pellet (D) fri for begge RMA-1 polypeptiderne. I

I 10 I

I Figur 5 viser indirekte immunofluorescensmikroskopi med antistoffer I

mod RMA-1. Der blev anvendt antistoffer, der var affinitetsoprenset I

I på det af Ag352.24 fra serumet fra en kanin, der var immuniseret med I

I dette fusionsprotein, producerede fusionsprotein til mærkning af I

I 15 erythrocyter, der indeholdt forskellige aseksuelle blodstadier af l\ I

I falciparum FC27: (a) rhoptry-fluorescence på en moden schizont; (b) I

I og (c) rhoptry og merozoit; (d) overflademærkning på modne merozo- I

I ieter. I

20 Figur 6 viser stamme og stadiespecificiteten af RMA-1. Til undersø- I

gelse af stammespecificitet blev erythrocyter, der var inficeret med I

ni forskellige i sol ater af P. falciparum, fraktioneret ved SDS-PAGE, I

I elektroblottet på nitrocellulose og probet med affinitetsoprensede I

I kaninantistoffer mod det af klon Ag352.24 producerede fusionsantigen I

I 25 (A) eller det monoklonale anti-QF3 antistof 7H850 (B). Vandringsvej I

1, uinficerede erythrocyter; vandringsvej 2, NF7; vandringsvej 3, I

I K-l; vandringsvej 4, FC27; vandringsvej 5, VI; vandringsvej 6, FC27 I

klon D10; vandringsvej 7, FC27 klon E12; vandringsvej 8, ITG2; I

I vandringsvej 9, NF54 klon 3D7; vandringsvej 10, CSL2. I

I 30 I

Til undersøgelse af stadiespecificitet blev forskellige aseksuelle I

I blodstadier af isolat FC27 fraktioneret ved SDS-PAGE, elektroblottet I

på nitrocellulose og probet med affinitetsoprensede kaninantistoffer I

mod det af klon Ag352.24 producerede fusionsprotein (C) eller det I

35 monoklonale anti-QF3 antistof 7H850 (B). Vandringsvej 1, uinficerede I

erythrocyter; vandringsvej 2, ringstadietrophozoiter; vandringsvej I

3, modne trophozoiter; vandringsvej 4, schizonter; vandringsvej 5, I

merozoiter. I

DK 175771 B1 5

Figur 7 viser processeringen af RMA-1. "Pulse-chase" forsøg blev udført, hvori modne stadier af P. falciparum i sol at FC27 blev narket med 35S-methionin i 15 minutter og herefter dyrket i fravær af 35 S-methionin i 0 mintter (vandringsvej 1); 15 minutter (vandrings-5 vej 2); 30 minutter (vandringsvej 3); 60 minutter (vandringsvej 4).

De radioaktivtmærkede parasitter blev behandlet til immuhopræcipita-tion med enten kaninanti-Ag352.24 (A) eller det monoklonale QF3 antistof 7H850 (B) som beskrevet i afsnittet "materialer og fremgangsmåder". Immunopræcipitationerne blev fraktioneret med SDS-PAGE 10 og de mærkede antigener blev visualiseret ved autoradiografi.

Figur 8 viser lokaliseringen af RMA-1 ved immunoelektronmikroskopi. Mærkning efter indlejring af sektioner af P. falciparum i sol at FC27 med humane anti-352 antistoffer (A,B,C) eller med kaninanti-QF3 15 antistoffer (D) fulgt af protein A-5nm guld. Mærkning forekom over rhoptriernes hals med anti-352 antistoffer og over rhoptrykroppen med anti-QF3 antistoffer.

Figur 9 viser immunogeniciteten af rekombinant RMA-1. Der er vist 20 ElISA-aflæsninger af individuelle kaninsera fra de under grafen angivne kaninnummerbetégnelser. Øverst vises reaktionerne på GST-fusionsproteinet. Nederst vises reaktionerne på RMA-1 udtrykt i baculovirus. Anvendte adjuvanser var: AL » alun (aluminiumphosphat); FC (eller FCA) * Freund's fuldstændige adjuvans; S/A * 25 squalen/Arlacel A (Ciba Geigy) SF = SAF-1 (Syntex).

Eksempel

Materialer og fremgangsmåder 30

Parasitter: P. falciparum i sol at FCQ27/PNG (FC27) blev fremskaffet gennem samarbejde med Papua New Guinea Instituet of Medical . Research. D10 og E12 er klonede FC27-linjer (Anders et al., 1983). Oprindelserne til P. falciparum i sol aterne NF7, Kl, VI, ITG2, 307 og 35 CSL2 er blevet beskrevet (Peterson et al., 1988). Parasitterne blev vedligeholdt i kultur som beskrevet af Trager og Jensen (1976).

Antisera: Der blev fra Queenslang Institute of Medical Research fremskaffet monoklonalt antistof 7H850, der er specifikt for QF3

I DK 175771 B1 I

I 6 I

I antigenet og kaninantisera, der er produceret ved immunisering med

I QF3 antigen affinitetsoprenset på det monoklonale antistof. Produk- I

I tion af det monoklonale antistof og oprensning af QF3-antigen er I

I beskrevet andetsteds (Schofield et al., 1986). I

I5 I

I Kaniner blev immuniseret med det af klon pG£X-2T 352.24 (Ag352.24) I

producerede fusionspolypeptid og affinitetsoprenset på glutathion- I

agarose som beskrevet (Smith og Johnson, 1988). I

10 Human· og kaninantistoffer blev affinitetsoprenset på adsorbenser I

I fremstillet ved at koble Ag352.24 fusionsproteinet med CNBr-aktive- I

I rede Sepharose som beskrevet (Crewther et al., 1986). I

Immunelektronmikroskopi: Immunmærkning efter indlejring blev udført I

H 15 som beskrevet af Culvenor et al., (1986). Dyrkede parasitter blev I

I fikseret i 10 minutter i 0,25% glutaraldehyd, dehydreret i 70% I

ethanol og indlejret i L.R. hvid harpiks. Tynde sektioner blev I

inkuberet på antistofsmådråber i 1 time, vasket, herefter inkuberet I

med protein A-5nm kolloidalt guld (Janssen) og farvet med uranyla- I

20 cetat. I

H Radioaktivmærkning af parasitter og immunopræsipitation: I

Parasitter blev rutinemæssigt synkroniseret 1 gang med sorbitol I

H 25 (Lambros og Vanderberg, 1979), modne trophozoiter og schizonter blev I

vasket en gang i methioninfrit RPKI 1640 medium tilsat 10% human- I

35 I

serum og mærket i 2 timer ved 37*C i samme medium med S-methionin

ved 200/iCi/ml. På lignende måde blev modne parasitter mærket med I

L-[2,3,5,6-3H]tyrosin, L-[2,5-3H]histidin, L-[2,3,4,5-3H]prol in I

I 30 eller L-[4,5-3H]lysinmonohydrochlorid i det passende aminosyrefrie I

medium ved 100/iCi/ml eller med [p9,10(n)- HJmyristinsyre i regulært

medium ved 100/xCi/ml. I

Til pulsmærkningseksperimenter blev parasitter synkroniseret 2 gange I

35 med sorbitol i et interval på 33 timer således, at der ved starten I

af eksperimentet kun var 0-4 timer gamle ringstadieparasitter til I

H stede. Prøvemængder af disse synkrone parasitkulturer blev mærket i I

35 I

30 minutter med 60*zCi/ml S-methionin ved 1,10,20,26,29,32,35,38, I

H 41,44 og 48 timer efter anden synkronisering. Efter mærkning blev I

DK 175771 B1 7 cellerne vasket to gange i serumfri RPMI 1640 med l,7nM kold methi-onin og pellet blev lynfrosset. Duplikatkulturer blev høstet, vasket 3 gange i serumfri RPMI 1640 og udstrøjet til efterfølgende immuno-fl uorescensanalyse.

5 "Pulse-chase" mærkningsforsøgene blev generelt udført med parasitter, der havde fået to sorbitol behandl i nger, hvilket resulterede i en 4-5 timers spredning af modning. Disse synkrone parasitter blev 35 mærket med 100/iCi/ml S-methionin i 15-45 minutter ved 37eC. Efter 10 mærkningsperioden blev celler høstet og en prøvemængde blev fjernet, vasket to gange i serumfri RPMI 1640 indeholdende l,7mM kold methi-onin og cellepelleten blev lynfrosset. Den resterende kultur blev vasket 2 gange i fuldstændigt medium med l,7mM kold methionin og inkuberet ved 37*C i dette samme medium. Yderligere prøvemængder 15 blev efterfølgende høstet, som ovenfor beskrevet, og efter forskellige tidsintervaller. Giemsa-farvede udstrygninger blev undersøgt på hvert tidspunkt og bekræftede parasitternes modenhedsstadium. Frosne cellepelleter blev ekstraheret i 30 minutter ved 4*C i mindst 10 rumfang NaCl-EDTA-Tris-puffer tilsat Triton X-100 (T-NET) som 20 beskrevet af Kessler (1975) indeholdende en cocktail af proteasein-hibi torer omfattende 4mM phenyl methyl sulfonylfluorid (Sigma Chemical Co.), 5mM iodoacetamid (BDH), ImM L-l-tosylamid-2-phenyl-ethylchlor-methylketon (Sigma Chemical Co.) ImM Ν-α-p-tosyl-L-lysinchlorme-thylketon (Sigma Chemical Co.), 25/ig/ml leupeptin (hemisulfatsalt) 25 (Sigma Chemical Co.), 25øg/ml antipain (dihydrochlorid) (Sigma Chemical Co.), 25pg/ml chymostatin (Sigma Chemical Co.) og 25/tg/ml pepstatin (Sigma Chemical Co.). Uopløseligt materiale fjernedes ved centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter ved 4eC. De mærkede ekstrakter blev forklaret under anvendelse af formalinfikseret Staphv-30 lococcus aureus Cowan 1 stammer (Commonwealth Serum Laboratories) og Sepharose 4B perler (Pharmacia) i 30 minutter ved 4*C. Forklaringsmidler blev fjernet ved centrifugering i 5 minutter ved 5000g ved 4*C. Der tilsattes specifikke antisera til prøvemængderne af de mærkede ekstrakter og der blev inkuberet ved 4*C i 2-4 timer.

35 Immunkomplekser blev præcipiteret ved tilsætning af protein A-Se-pharose 4B (Pharmacia). Perlerne vaskedes 4 gange med T-NET indeholdende proteaseinhi bi torer. Kultursupernatanter opsamlede efter mærkning af parasitter, centrifugeredes i 1 time ved 100.000g forud for immunopræcipitation.

I DK 175771 B1 I

I I

I SDS-PAGE: SDS-PAGE blev i det væsentlige udført som beskrevet af I

I Laeironli (1970). Immunoblotting blev udført som beskrevet (Crewther I

I et al, 1986). I

5 Molekulær kloning og DNA-sekventerinq: I

I Konstruktion og screening af P. falciparum NF7 cDNA-biblioteket i I

I Agtll-Amp3 er tidligere blevet beskrevet (Stahl et al., 1984). Det I

partielle P. falciparum Sau4AI genombibliotek' i EMBL3 blev fremstil-

I 10 let som følger: en partiel Sau3AI fordøjelse af DlO-genomisk DNA

I blev størrelsesfraktioneret (10-20 kb) på en agarosegel og ligeret I

I ind i BamHI fordøjet, dephosphoryleret AEMBL3. De resulterende I

kloner blev screenet med NF7 cDNA-klonen Ag352 under anvendelse af I

I standardprocedurer (Maniatis et al., 1982). Det partielle P. falci- I

I 15 parum SspI genombibliotek i AgtlO blev fremstillet som følger: en I

I partiel Ssol fordøjelse af P. falciparum DlO-genomisk DNA blev I

methylerét med EcoRI-methyl ase, ligeret med EcoRI-1i nkere og fordø- I

jet med EcoRI. Overskydende linkere blev fjernet ved størrelses- I

I fraktionering på en agarosegel og fragmenterne blev ligeret ind i I

I 20 EcoRI-fordøjede, dephosphoryleret XgtlO. De resulterende kloner blev

I screenet med NF7 cDNA-klonen Ag352. Det skårede P. chabaudi adami DS I

I genombibliotek i AgtlO blev fremstillet som følger: P. chabaudi I

I adami DS genomisk DNA blev skåret gennem en 26 gauge nål, methyleret I

I med EcoRI-methylase og ligeret med EcoRI-linkere. Overskydende I

I 25 linkere blev fjernet, og fragmenterne blev størrelsesfraktioneret I

I (4-7 kb) på en agarosegel, derpå ligeret i EcoRI-fordøjede, I

I dephosphoryleret AgtlO. De resulterende kloner blev screenet med NF7 I

I cDNA-klonen Ag352. Positivt hybridiserende kloner blev I

I plaqueoprenset gennem successive screeningsrunder, ADNA blev frem- I

30 stillet og insertionerne blev isoleret og subklonet under anvendelse I

I af standardprocedurer (Mani ati s et al., 1982). DNA insertioner blev I

I yderligere subklonet ind i M13 vektorer (Messing og Vieira, 1982) og I

I sekventeret under anvendelse af kædetermineringsmetoden (Sanger et I

I al., 1977). I

I 35 I

I Ekspression af de 52 C-terminale aminosyrer i RMA-1 i E. coli: I

I De 52 C-terminale aminosyrer i RMA-1 blev udtrykt i E. coli under I

I anvendelse af pGEX-2T plasmidvektoren beskrevet af Smith og Johnson I

DK 175771 B1 9 i (1988). De delvis komplementære oligonukleotider 5'GATCCGGAAATGCTG-AAAAATATGATAAAATGGATGAACCACAAC og 5'TAATGTTGTGGTTCATCCATTTTATCATA-TTTTTCAGCATTTCCG, der koder for de komplementære strenge af C-termi-nalen med 15 aminosyrer til det transmembrane forankringsområde blev 5 hybridiseret (annealeret) herefter ligeret med et Fok! til EcoRI (linker)-fragment (nukleotider 2083-2255, figur 1) fra klon NF7, og BamHI og EcoRI fordøjet pGEX-2T. Ligeringen blev transformeret ind i E. coli JPA101 og den korrekte rekombinant udvalgt. Denne klon betegnes Ag352.24.

10

Ekspression af RMA-1 med næsten fuld længde i E. coli:

Et RMA-1 segment bestående af de endefyldte HinPl til Rsal stednu-kleotider 366 til 1833 (fra figur 1) blev indsat i det fyldte BamHI 15 sted af Ag352.24, transformeret og udvalgt som ovenfor. Denne klon betegnes Ag352.2.

Ekspression af RMA-1 i Baculovirus: 20 RMA-1 genet med fuld længde blev fjernet som et BahmHI/BqlII fragment (nukleotider 327-2247 i figur 1) fra en pIC20H subklon (Marsh et al., 1984) og blev indsat i det unikke BamHI sted i baculovirus-transfektionsvektoren pAcRP23 (tilvejebragt af dr. P. Possee) efter bacul ovi ruspolyhedringenpromotoren. pAcRP23/Ag352 DNA Blev blandet 25 med vildtype baculovi rus-DNA og transficeret ind i Sf9 insektceller.

Plaques stammende fra transfektionen blev screenet mikroskopisk og de, der manglede polyeder blev underkastet to yderligere runder med plaquedannelse. Der blev screenet et antal af de resulterende polyedernegative plaques for forekomst af Ag352 genet og alle viste 30 sig at være positive. Virus fra rekombinante plaques (betegnet baculovirus 352) blev anvendt til at inficere friske kulturer af Sf9 celler og produktion af Ag352 med inficerede celler undersøgt med SDS-PAGE, Western blot og immunofluorescens..

35 Immunooenicitet: Kaniner blev immuniseret med 1,0 ml antigenformulering I/M i venstre bagben. Der blev givet en anden dosis i højre bagben, 4 uger efter den første dosis. Blodet blev tappet på immuniseringsdagen og med to ugentlige intervaller med den undtagelse, at den sidste aftapning blev taget 7-8 dage efter den anden dosis.

I DK 175771 B1 I

I 10 I

I Til dyr, hvortil squalen/Arlacel A (Ciba Geigy nor-MDP formulering) I

blev anvendt som adjuvans, blev anvendt 100/jg nor-MDP/dosis. Alle I

I antigener blev anvendt med 200pg/dosis. I

I 5 RESULTATER I

I Struktur af RMA-1 oa dets gen i P. falciparum I

I Ved screening af Xgtll-Amp3 cDNA-klon bibliotek (NF7) med humane I

10 antimalaria antistoffer (Stahl et al., 1984) blev en hidtil lille I

cDNA klon, betegnet Ag3S2, identificeret. ONA sekvensen af Ag352 er I

vist i figur 1. For at fuldende den kodende sekvens blev 2 overlap- I

I pende genomfragmenter af i sol at FC27 (et delvist 5' Sau3A og et I

I delvist 3' Sspl-fragment) klonet og sekventeret (figur 1). I

I 15 I

FC27 genomsekvensen udvider 1438 nukleotidet NF7 cDNA sekvensen med I

yderligere 514 nukleotider 3' og 809 nukleotider 5'. Der forekommer I

I i FC27 genomsekvensen mellem nukleotider 333 og 2202 en enkelt lang I

åben Isseramme, der koder for et polypeptid med 622 aminosyrerester I

I 20 med en forudsagt molekylvsgt på 71.929 daltons. Baseret på de I

I nedenfor præsenterede subcell ulære lokaliseringsresultater blev I

I dette polypeptid benævnt rhoptrymembranantigen-1 (RMA-1). I

FC27 genomsekvensen og NF7 cDNA-sekvensen er stærkt homologe med 9 I

I 25 nukleotidforskelle ud af 1438 nukleotider og 7 aminosyreforskelle. I

Det er bemærkelsesværdigt, at kun 1 nukleotidforskel er tavs og 5 af I

I aminosyreforskellene fører til ladningsændringer. Disse data tyder I

I på stærkt selektion, måske immunologisk, af polypeptidsekvensen. I

30 Ved sammenligning af RMA-1 sekvensen med Genebank- og NBRF-databaser I

I kunne der ikke identificeres nogle tilsvarende proteiner. RMA-1 I

I polypeptidsekvensen havde imidlertid et antal iøjnefaldende træk. 1

modsætning til de fleste andre blodstadieantigener fra P. falciparum I

I mangler RMA-1 repetitive sekvenser. Antigenet har den for et helt I

I 35 membranprotein forventede primære struktur. Det indeholder 2 hydro- I

I fobe strækninger, en nær N-terminalen, formodentlig en del af et I

I signalpeptid og en anden lokaliseret 55 aminosyre fra C-terminalen.

I Denne udgøres af 21 overvejende hydrofobe aminosyrerester og mangler I

I ladede rester. Det følger efter en lysinrest og følges af I

DK 175771 B1 11 tripeptidet Lys-Arg-Lys i overensstemmelse med, at dette område er et membrantraverserende domæne.

Alle 17 cysteinrester går forud for det forudsagte membrantravers-5 erende domæne. Oet cystein, der ligger nærmest N-terminalen, fjernes formodentlig sammen med signalpeptidet. De resterende 16 rester kunne danne intramolekulære disulfidbindingér og kunne derfor være afgørende for opretholdelsen af molekylets sekundære struktur. I overensstemmelse med denne ide blev mobiliteten af RMA-1 nedsat 10 under elektroforese under reducerende betingelser sammenlignet med ikke-reducerende betingelser (data ikke vist). Vigtigheden af cysteinresterne understreges af den observation, at alle 16 findes bevaret i RMA-1 fra P. chabaudi (se nedenfor).

15 RMA-1- struktur og dets gen i P. chabaudi

Et skåret P.chabaudi adami DS genombibliotek i XgtlO blev screenet med P. falciparum NF7 cDNA klonen (beskrevet ovenfor) til identifikation af det homologe gen i denne art, DNA-Sekvensen af en positiv 20 klons hydridiserende område er vist i figur 2. Der forekommer mellem nukleotider 556 og 2229 en enkelt lang åben læseramme, der koder for et polypeptid med 558 aminosyrer med en forudsagt molekylvægt på 63901 daltons.

25 Det forudsagte RMA-1-polypeptid fra P. chabaudi og P. falciparum viser en bemærkelsesværdig grad af overensstemmelse. Som P. falciparum homologen forudsiger P. chabaudi RMA-1 polypeptidsekvensen 2 hydrofobe strækninger (understeget i figur 2), lokaliseret i meget lignende stillinger. Disse virker formodentlig som en N-terminal 30 signal sekvens og en transmembranforankring. Sekvensen mangler gentagelser og de 16 cysteinrester, der var en så iøjnefaldende træk ved det (forudsagte) modne P. falciparum molekyle, findes alle bevaret i P. chabaudi molekyle. Den totale aminosyresekvenshomologie mellem de to arter er 43% (figur 3).

35 RMA-1 adskillelse til Triton X-I14 Når celleekstrakter fraktioneres ved temperaturafhængig faseadskillelse med den ikke-ioniske detergent Triton X-114 genvindes hele

I DK 175771 B1 I

I I

I membranproteiner i detergentfasen. RMA-l's solubilitetskarakteri- I

I stika blev undersøgt under anvendelse af denne procedure. Parasit· I

I cellepelletter fra isolat FC27 blev sol ubiliseret i Trion X-114 og I

adskilt i en vandig fase, en Triton X-114 fase og en uopløselig I

5 pellet og fraktioneret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Et I

I immunoblot af disse fraktioner blev probet med antistoffer, affini- I

tetsoprenset (Crewther et al., 1986) på et glutathion S-transferase I

fusionprotein (Smith og Johnson, 1988), der kun indeholder de 52 I

C-terminale aminosyrer (571 til 622, figur 1, Ag352.24). Antistof- I

I 10 ferne reagerede med 2 polypeptider med Mr 80.000 og 62.000, hvilke I

forekom i varierende mængder i det totale parasitmateriale i den I

vandige fase og i Triton X-114 fasen (figur 4). Polypeptidet med Mr I

62.000 forekommer at være et processeret fragment af Mr 80.000 (se I

nedenfor). Begge Mr 80.000 og 62.000 polypeptider er delvist oplø- I

15 selige i Triton X-114, men det mindre fragment er mere opløseligt I

sandsynligvis fordi det har mistet hydrofile N-terminale aminosy- I

rerester. I

RMA-1 er lokaliseret i rhoptrierne oo merozoi toverfladen I

I 20 I

Indirekte immunofluorescensmikroskopi med affinitetsoprensede humane I

I antistoffer (beskrevet nedenfor) farvede modne aseksuelle blodfor- I

I mer. Segmenterede schizonter viste et punktformigt immunofluor- I

I escensmønster inden for merozoitter (figur 5a) kendetegnet for I

I 25 antigener lokaliseret i roptrierne (Holder et al., 1985). Dette I

H mønster var også tydeligt i nogle merozoiter fra sprængte schizon- I

I ter, selvom andre klynger af merozoiter gav en drueklasefluore- I

I scensmønster, der er karakteristisk for en merozoitoverfladelokali- I

sering (Holder et al., 1982) (figur 5d). Intermediære fluorescens-

30 mønstre var også tydelige i nogle modne schizonter (figur 5b og 5c), ‘I

hvor der var merozoitoverfladefluorescens med "hot-spots" ved hver I

merozoitapex. I

I RMA-1 forekommer i alle P. falciparum i sol ater H

I I

I 9 P. falciparum isolater med forskellig geografisk oprindelse blev I

I undersøgt ved immunoblotting for reaktivitet med antistoffer mod I

RMA-1. Asynkrone parasitpræparationer opløst i SDS-prøvepuffer og I

fraktioneret på 10% SDS-polyacryamidgeler blev probet med I

I DK 175771 B1 affinitetsoprenset kanin anti-Ag352.24 antistoffer, der var blevet præadsorberet på den Triton X-100-uopløselige fraktion af normale humanerythrocyter. Der blev i hver isolat identificeret polypeptider med Mr 80.000 og 62.000, nogle gange adskilt som doubletter (figur 5 6a). I nogle i sol ater var der svag reaktivitet med et yderligere polypeptid med Mr 70.000.

Et tidligere identificeret rhoptryantigen, QF3, har polypeptidbe-standdele med tilsvarende størrelse som de to polypeptider, der er 10 genkendt med anti-Ag352.24-antistoffer. Det monoklonale antistof 7H850, der genkender QF3 (Schofield et al., 1986; Bushel! et al., 1988), genkendte også, når det blev anvendt til at probe et immuno-blot af P. falciparum i sol aterne, polypeptider på ~Mr 80.000 og Mr 62.000, der ligesom de med anti-Ag352 antistoffer genkendte polypep-15 tider var invariante i størrelse blandt disse isolater (figur 6b).

RMA-1 findes i modne aseksuelle blodstadier Når synkroniserede parasitter blev undersøgt ved immunoblotting, 20 blev RMA-1 påvist i schizonter og frie merozoiter, men ikke i ringe elle andre aseksuelle blodstadier (figur 6c). QF3 antigent adskilte sig fra RMA-1 ved, at det forekom tydeligt i ringstadiumparasitter foruden i schizonter og merozoiter (figur 6d).

25 I pulsmærkningsundersøgelser blev syntese af både Ag352- og QF3-an-tigener først påvist i modne trophozoiter, 29-32 timer gamle.

Maksimal syntese af RMA-1 forekom i modne schizonter (39-41 timer), mens maksimal QF3-syntese forekom i middelschizonter, 36 timer efter anden synkronisering (data ikke vist). Der blev ikke påvist nogen 30 syntese af hvert antigen efter 44 timers tidspunktet. I overensstemmelse med immunoblottingsundersøgelserne immunopræcipiterede affinitet soprensede kanin anti-Ag352.24 antistoffer specifikt doubletter med M„ 80.000 og 62.000 fra Triton X-100-lysater af modne tropho-“ 35 zoiter og schizonter mærket med S-methionin. Det monoklonale 35 anti-QF3-antistof, 7H850, immunopræcipiterede polypeptider med Mr 80.000 og 62.000 (og et mindre polypeptid med Mr 70.000) sammen med en doublet med Mr 39.000 og 38.000. Lignende resultater blev opnået, når begge antistoffer blev anvendt til immunopræcipitation af de relevante antigener fra parasitlysater mærket med tritieret prolin, ________

I DK 175771 B1 I

I 14 I

I tyrosin, lysin eller histidin. Der var ingen tydelig intensitetfor- I

I skel i mærkningen af de to antigener med en hvilket som helst af I

I disse aminosyrer (data ikke vist). I

I 35 I

5 Gentagen klaring af S-methi oni nmærkede parasitlysater med speci-

I fikke antistoffer mod RMA-1 kunne ikke formindske intensiteten af de I

I med specifikke monoklonale antistoffer for QF3-antigenet immunopræ- I

I cipiterede bånd. Det samme galdt for det modsatte eksperiment (data I

I ikke vist). I

I RMA-1, Mr 80.000 polypeptidet processeres hurtigt til en Mf 62000 I

form_;_ I

"Pulse-chase" forsøg under anvendelse af mærkningsperiode på 15 I

H 15 minutter, viste, at polypeptidet med Mr 80.000 fra RMA hurtigt I

I processeredes til Mf 62.000 formen (figur 7). Ca. 50% af det i modne I

schizonter syntetiserede antigen i løbet af en 15 minutters puls- I

mærkning blev processeret til formen med lavere molekylvægt i løbet I

af 1 "chase''periode på 1 time. Når dette antigens skæbne blev fulgt I

H 20 over en længere "chase"periode, sås den samme hurtige processering I

I (data ikke vist). Hverken Mr 80.000 eller 62.000 molekylerne blev I

påvist i nye ringe efter reinvasion. Dette samme processeringsmøn- I

ster blev også observeret, når antigenet blev pulsmærket i modne I

trophozoiter og umodne schizonter, hvilket viser, at kløvning af de I

25 større molekyler ikke er begrænset til et bestemt stadium i livscy- I

klus (data ikke vist). RMA-1 mærkning kunne ikke påvises ved immuno- I

præcipitation af klarede kultursupernatanter (data ikke vist). I

Det fandtes tværtimod, at under de samme betingelser for "pulse- I

30 chase"forsøg blev QF3-antigenet syntetiseret som et kortlivet I

præcursor molekyle med Mp 84.000, der alle blev processeret til Mr I

80.000 formen i løbet af en en-times "chase"periode (figur 7B). I

Processering af Mr 80.000 molekylet til Mr 62.000 formen af QF3 var I

ikke åbenbar, når modne schizonter blev pulsmærket. Men, når modne I

35 trophozoiter og umodne schizonter blev pulsmærket og "chased" i I

adskillige omgange fandtes hovedparten af denne processering at I

forekomme i modne schizonter under reinvasion. Kun Mr 80.000 mole- I

kylet af QF3 blev bragt ind i ringe. Ingen af molekylerne af QF3- I

komplekset kunne påvises ved immunopræcipitation af klarede I

DK 175771 B1 15 kultursupernatanter, der var opsamlet efter 12 timers ’'chase"perioden i dette eksperiment.

RMA-1 og QF3 forekommer i forskellige områder i rhoptrien 5

Immunoguldmærkningsundersøgelser viste konsekvent lokalisering af RMA-1 antigenet i halsen af rhoptrier fra modne merozoiter inden for schizonter (figur 8a) og på samme måde i frie merozoiter (figur 8b og c). Tilfældige guldpartikler blev fundet langs merozoitper i ferien 10 (figur 8b og c) og over mikronemer, der havde lignende elektrondensitet som rhoptryhalsen (figur 8a). Sektioner, der var afledt fra samme harpiksblok af FC27 inkuberet med kanin anti-QF3 antistoffer, viste mærkning over rhoptriens krop, hvilken mærkning ikke var forbundet med halsen eller plasmamembranen (figur 8d).

15

Ekspression af RMA-1 i baculovirus:

Baculovirus udtrykte RMA-1 som en proteindoublet med Mr 84-87.000 med sekundære bånd med Mr 67-77.000. Proteinet blev genkendt i 20 immunoblot af baculovirus RMA-1 inficerede celler med kanin antisera mod RMA-1 og også ved humane antistoffer. Proteinet kunne påvises som et mindre bånd på Coomassie-farvet gel (data ikke vist).

Rekombinant RMA-l-irnmunooenicitet i kaniner: 25

Til undersøgelse af immunogeniciteten af RMA-1 med næsten fuld længde udtrykt i E. coli ("materialer og fremgangsmåder") og af RMA-1 udtrykt i baculovirus (se ovenfor) blev kaniner immuniseret med 1 ml antigenformulering, boosted efter 4 uger og tappet 7-8 dage 30 senere (figur 9). Det fremgår af ELISA-aflæsn i ngerne, at Freund's fuldstændige adjuvans i gennemsnit gav en større reaktion end nor-MDP adjuvansen og RMA-1 udtrykt i baculovirus gav en større reaktion end når det var udtrykt som et fusionprotein.

35 Diskussion

Der er i tidligere studier blevet identificeret to antigenkomplekser i P. falciparum merozoitrhoptrierne, refereret af Anders (1988).

Foruden disse antigenkomplekser er mindst to andre rhoptryantigener

BDK 175771 B1 I

tskarakte- I

58) og et I

I 225.000 I

ter viser, I

og repræ- I

len. RHA-1 I

r hurtigt I

hovedkom- I

;3) (Scho- I

ilekylmas- I

, forskel - I

jrskellige I

tiderne er I

I herefter I

schizont- I

3 at være I

itigen, I

des også i I

er blevet I

;r lokal i- I

ryindhold, I

a ret, men I

ialsen, er I

loptrykom- I

‘yens krop I

tur- eller I

H. Brown, I

for lipid ' I

^proteiner I

rmodentlig I

, muligvis I

sstemmel se I

frigivelse I

mister et I

og dermed I

i ner stærk I

ft-1 er et I

DK 175771 B1 17 naturligt immunogen, der inducerer antistoffer i individer, der er inficeret med P. falciparum.

Henvisninger 5 1. Anders, R. F. et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6652-6656.

2. Anders, R. F (1988). In: The Biology of Parasitism. (Eds. P. T.

10 Englund and A. Sher), side 201-204. Alan R. Liss Inc., New

York.

3. Bannister, L. H. et al., (1986). Parasitology 92:291-303.

15 4. Braun-Breton, C. et al., (1986). Holec. Biochem. Parasitol.

20:33-43.

5. Bushell, G. R. et al., (1988). Molec. Biochem. Parasitol.

28:105-112.

20 6. Campbell, G. H. et al., (1984). Am. J. Trop. Ned. Hyg.

33:1051-1054.

7. Cooper, J.A. et al., (1988). Hol. Biochem. Parasitol.

25 29:251-260.

8. Crewther, P. E. et al., (1986). J. Immunol. Methods.

86:257-264.

30 9. Culvenor, J.G. et al., (1986). Exp. Parasitol. 63:58-67.

10. Holder, A. A. and Freemann, R. R. (1981). Nature 294:361-364.

11. Holder, A. A. and Freeman, R. R. (1982). J. Exp. Med.

35 156:1528-1538.

12. Holder, A. A. et al. (1985). Molec. Biochem. Parasitol.

14:293-303.

-__ __________

I DK 175771 B1 I

I I

I 13. Howard, R. F. et al., (1984), Am J. Trop. Med. Hyg. I

I 33:1055-1056. I

I 14. Kessler, S. W. (1975). J. Immunol. 117:1482. I

I 5 I

I 15. Laemmli, J. K. (1970). Nature 227:680. I

I 16. Lambros, C. and Vanderberg, J. P. (1979). J. Parasitol. I

I 65:418-420. I

I I

I 17. Lustigman, S. et al., (1988) Nol. Biochem. Parasitol. H

I 30:217-224. I

I 18. Maniatis, T. et al., (1982). Molecular Cloning - A Laboratory Η

Η 15 Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. I

19. Marsh, J. L. et al., (1984). Gene 32:481-485. I

I 20. Messing, 0. and Vieira, J. (1982). Gene 19:269-276. I

I 20 I

I 21. Perrin, L. H. et al., (1985). J. Clin. Invest. 75:1718-1721. I

I 22. Peterson, M. G. et al., (1988). Molec. Cell Biol. I

I 8:2664-2667. I

I I

I 23. Roger, N. et al., (1988). Molec. Biochem. Parasitol. I

I 27:135-142. I

I 24. Sanger, F. et al., (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 30 74:5463-5467. I

I 25. Schofield, L. et al., (1986). Molec. Biochem. Parasitol. I

I 18:183-195. I

I 35 26. Siddiqui, W. A. et al., (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 84-3014-3018. I

I 27. Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988). Gene 67:31-40. I

DK 175771 B1 19 28. Smythe, J. et al., (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5195-5199.

29. Stahl, H. D. et al., (1984). Proc. Nat!. Acad. Sci. USA

5 81:2456-2460.

30. Trager, W. and Jensen, J. B. (1976). Science 193:673-675.

10 15 20 25 30 35

Claims (12)

1. Rhoptrymembranantigen fra de aseksuelle blodstadier af Plasmodium fal- I I ciparum kendetegnet ved, at I I 5 (i) det syntetiseres initielt som et polypeptid med en relativ molekyl- I I masse bestemt ved S DS polyacrylamid gelelektroforese på ca. I I 80.000; I I (ii) det er lokaliseret i rhotriemes halsregion i merozoiter; I (iii) det har solubilitetskarakter og et hydrofobt domæne, der er typisk I I 10 for et helt membranprotein; I I eller et antigent fragment deraf, som er i stand til at inducere et beskyttende I I immunrespons. I

2 Z 2 Z 2 7*2 27 LlJ UJ LU LlJ qj £j q jjj I o oooo aS o *3 I DK 175771 B1 I I 22 I I OO OO σ' O O' Ο θ\ o O'® o o I Η (N -i vO -3· CO CO ο {N (N Ό i 00 I CM ΓΟ Ό T— I— I— CN O I <>—< <<<<< I -<ci— _ti— c3<c >i— ><— *:<· I h- < t— < <-j 0 tn < I <<<<<<o< I << Ol lj Cl u cco <X lj >(— I H t— i— t— lj uj < cj o I t— < < >— < < < Η- I <t— >h- JZ < <£ lj h-(-J >- < I . t— < 0 . 0 < < t- I f— C uj < uj h~ < < I LJ O LJ O t-U < CL U 00 —ι^— iC < I < <£ t— O uj LC> < I lj C3 uj O < < t— I <»— >- < CTO ω < lo lj U_K- 2< I t— η- »— < 0 »— ♦— < I f— <C -«ΐ *— « > 1— ♦— i— I t— C _J I— rc < < «-> 00 I— ^ C3< I I—<»— UJOO<l3 I < < < < I— f- ►“ < I <<r ixi< uj <£ 00 n: < h—<_> ic< I < < <£. o U3 UJ < < I < C < «_» <£ b- f- t— I >—c cr id <C ω < >»— >- < I t—< < < 0 0 < j- I << C3 lj uj < < I— I << 221— ·—· Η- nr < UJ < l/lLJ UL K— I < I— < <t LJ O f— t— I 01— C < uj < h- t— I 0 >— <r cl lj o <t ua< 2: < u; < I t— I— < UJ IT3 ID < lj I ^B ·<ι— < 1— <t f— 0 · <C I H c t— (_» zc <C ►—<t— ·—> 1— ui < a □ I H < 1— < 1—> < C ΰ Η < I ^ < i— 1— 1— 1— oc q I <1— cj>-<CL*-ia<— i— -et re i— I ^B 01— 1— l·- uj o < »— < I < t— (— 0 *— 1— h- m < I H < 1— <>»->-<>-< >-·ι— uj < I H 01- < 0 '— 1— < < 0 I < v- < 1— < < <z η- I H <i— *— o<r<u^<— h-oq< I H << < 0 0 < <u 0 I ^B < ►— 1— 1— lj < j— < I ^B <1— v— ι/i a nr < <<—> 00 —* ι— I < Η- 0 <i *-J o CD 1— I ο 1— »— c ·< ο < < I 00 ·— v: < a <t -si >- ^ < η- lj I ^B OO uj C t~J <t <t < I <t- <t <c <t t— η- ο I ^B ’ <<*— a<c_ih >-<00 22 i— I uj < 0 uj ►— 1— 0 < I <ik— t— t— <i <C (— <C I ^B < I- <t >- <C I— LJ UJ < LU 1— Q. UJ I ; o^— < »— Cu3h- uj I ^B <<l— <(— 0<< I ^B <£ ^— \— CL (_I Z <ί I— UJ > H 1/1 U I << <UJ<<II3 I— I < UJ < I— < UD < ο I < uj < nr< uj<. cluj 2:1— I ^B < <_»_»__uj C3__j—_uj_ < I DK 175771 B1 23 Γ < i— o 5 <r jz:--- o< z < σ < or o 1—3 <-3 < < σ «_» < << »- >- o— t- h- z< υο o a< O < o <t H-1_I < < o o o o c *— < < o < j__ Q< 3 < 3 I— LO u <3 C ,, o >— i— c) o ^ 3 I— (— ·

2. Antigenfragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er i det væsentlige I I 15 frit for andre P. falciparum proteiner. I Η H

3 Q <£ 2 <C <C<—» <f _ , o o < O < < Η- < 13 (— )— ,_, ~ *- ^ ^ < Wo U_ i— >-c < < < < (- H- ° < o ►— <

21. Z < HG —J t— < 1_) U)U < < < l— o l·— *— t— < (_ <f Z< 3 0 Q_»_J uj. <t OO I/) u < 1 3 O o l_ < I— t—» I— t— OO >-< «30 Ll_ J— I— O I— l— I— < <£ < <. I— I— 13 CCKD > I— > I— CL 3 2 < 0 < O O 3 5 rc< CL 13 m C 3 (— 31— —.1— *-J . «3 "i I— 3 <J- "ί ·— *«ί. < t— qco oo lu c :*: < u. η 3i_ < o o < i— fZ < f— O I— H- t— LO «—> 2 < 5 O 2 < < u «3 O 1 "'i I— <t o (— >- >- >3 η- p: ^ 30 2 < Z C 30 LO o f— 3 ►— < <£ f— < <r -< ·< I— < < <f —1 i— 3 <t O <ί 3 C y < r> i t— O o O < 3 H* <C K— I— 3 <r H L3 C5 ^ 1— LU f— — —· y~ ν' <-γ <· 3 o >—2: <? < o 1- < I— o 3 —* ·— <3 > t— 3 H~ O 2I(— >l·— i— O O 3 -*- < n < < i- ί_ £· 3< <3 Ζ2Γ < □ < —- «/) O 2C< o o < o — < - <r H- Η- ·< »— I— I— O <t —1 I— < —I I— <t <X3 LU I_ o < < < O >_ <ί I— 1— <t 3 I_ 31— >- <£ LO O C 3 2< _ μ_ ►- t— < o < < •— <C <t <. o <r Z < 3 1— 3 1— 103 < 3 < - 1— I— 1— lZ 3 < 3 <£ 3 <£ 3< 3 < 3 Z Z 22: Z z 2 2 2: 2: 3 o 3 Q 3 J—) 30 3 <—1 3 r^i O«-» O u O u 0¾ O y O S3 DK 175771 B1 I o o o o o o o o o o o o -i O ® O Csl fsl »O J O Ό ^ uq (m o n μ mm m -j- ir>-— o-o H — ^ — X *- 4 i— t— l·— i— o < —' f— >-< U_ I— 2 4 U o-^ UJ< H < t— t— 4 i— n h- < < < < a (— x 4 h- iu LU < nc < o 4 o — <<< H I— I— I— O (_I i_j o >-< z 4 u_ y— σ< i— I— 4 o t— lu <j- o o 4 *- (— <J_ ' NC 4 24 > I— oo I— (U 5_ c < 4 OX O < 4. t— -— 444 ^ 4 04 X < LU < LU < _JH < LU LU O O O 1— Η- H- 4 < < < O < U-l— CL· LU NiC < H— LU t/)LU o >— lu < < . 4 4 4 I— »_) i_ ^ 4 L/l L_? ·—· Η- h- 2 4 LU la H

3. Antigen ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det har en primær struk- I I tur, der omfatter aminosyresekvensen svarende til den følgende sekvens: I ___—————— I DK 175771 B1 I . < < ►—* c ~ w < jz i H J— UJ<£ 0<i il U UJin _JL- <»- *- O o u, £ t3 55 5:0 uj < 2 < 2 < q. 0 55 < o o O O oo LlJ < << <1- 0 0 0 S 55 ° »2 < o < < I I 55 iz ^ 5 ^ o ς: ►- nu f_ Cj : I << t- < < μ £ Η I I 55 ^ 00 ω< ·2< au I I 55 5 o o < i_> g I I 55 < < < »— <t i_ I << ao o <c wa cc o u_i- I o< < c »u < Γ I 55 < ^ < < ί- ίΐ I << i- o o o < er o >- c < G I o< vu o ui < Z: Jr I << o h- < <c g I o< < u_ ►— >- <t uj < a c u_ JZ I oo < i— i— o S μ I *-0 < ui <ί < Η- ΓΖ I I 3 *5 ^ >— O > V— I— o O I I 55 < < < o < g I t—< < H- < < I I Jz 5 !z ^ ^ o o o o I 1 < < z: I— uj <£ uj <£ < u o < I Z"< < c o o o o I I >- * *“ *— O h— <C «5 I I < *— 1— I— o <t t-j << I I <—it_jc <r I I o -< < ·— <—> zxz <t uo o uj i >_ I *Ζ*~ «— < o < O f- I I << I— I— <£ <£ I— I *~z * 1— u_ >— —* i— η u < u >~ <r I I < < ·— i— .1— H- o i— I I < o <t t- . {r < i— uj-o; O-lj u_h- oc c3<r I o i i— o <u i— I I Oh— I— U_ J— y~ <£. —i I— LiJ <; 2 <r I I 5<»-i-h-i- o < I <h-i— i—* <C i— <£ <r I t“<C <<coC3<C2<OOOn I << ·- O lu < o ^g I <h— < 1—1 1_J < c Jr I h-h- i— oo o >-< a < _j h_ (_ Jz Oh— < <C h- UJ ·— < < o < < h— r: <1- I— —II— UJ < UJ <t o C <f M O < o I— oooo I o UJ LU ω uj uj< UJ< I

4. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det omfatter en nukleo-5 tidsekvens, der koder for et polypeptid med samme antigenicitet som et antigen ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, eller et antigent fragment deraf, som er i stand til at inducere et beskyttende immunrespons.

4. O *— lu i_t 4 iu lu 4 f— i_> LO LU LO O lu 1— 04 ι/l o i/Ilu ·— 4 t— LU < (_ . I— LU 4 4 4 o 24 24 NC 4 NC < NC < _j i— 4 4 4 — 4. <t 1— H 4 4 4 LU H- H- NC 4 QCO 4 LU CL lu >- 4 <lu _4__4__O_LU __(—_ lD Ι· DK 175771 B1 I < i— Π— *— P u u <— °< *< -2 c^3 5 i=gg °g -g "I < '255 S S- S S3 2<S ^ g0" S ^ < 32S “ 1 *—J I— in i, <« n ° < ^ ^ >- < *- h-<h- £33 3 g jztg Z < u. (- 2 X <C < <<< ^ 1 " ^ UJ < O t— <ί < <— *— < <μ-ιη<ί -Jt- 2<o o< σ <c . < •T <UJ O LJ h- "5 ^ h UK< >“< °-y >-< ->-o CCO LO O Qlu O < CL CJ i ^ < <-J O LJ £3£ ^ 5 2: t- ^ 3 <<< 5 < c < < »_ Cj »- ^ y 00 S3 ^ 10 ** ^ < uj < S33 < <-> < o »— »— t— ^ ' " *£ 1— O I— f— <r ω·< >l--uj < O < ΣΤ t- <<S g g < 2SS- ^ r— ϋ I— Η- n .w »_ i— . cco -i— Q- u >-< —i f— i— <: < c

4 I— I— LU 4 < H- h- 4 4 H- l_) >-< LL h— -U 1— UJ< OO CL LU 1— I— I— O O LU l— O 4 I— I— I— 2 4 Έ. O O >— 4 X 4 x <

4 I— O 4 O L_J NC 4 LUO 3 O O 4 _ NC 4 *—(—

4 I— 4 4 <C i_ lu 4 i— 4 i— H 04 —' I— O 4 NC 4 >- < cl lu O 4 O 4 H-.lu _ -H •— I— 4 4 i— i_ 2: 04 04 lu c lu 4 24 u_ . H O O O O 4 H- o ►— 4 I— H- C I_ H >- 4 NC 4 LUO >- 4 OO 24 *- 4 Η- ·— O 4 X 1— 4 I— !— O LU -- >»— 4 LU 24 04 3:0 X< O O 4 O 1— *—f<f 1— 4 4 4 1— < 4«U CL LU OO I— LU 24 LU c O LU O < < ia 4 4 1— 4 t— j— O-LU CCO 04 —I (— >-4 > 1_ LU 4 LD h— (—- t *"] H (— t— LU L— t— <£ >-4. U-f— > I— X 4 OO LU 4 I— I— O LU o O

5. Rekombinant DNA molekyle ifølge krav 4, kendetegnet ved, at nukleotid-10 sekvensen omfatter hele eller en del af følgende sekvens: I DK 175771 B1 I I I <i y— <( lj <£ I— y— <t t— I— <£ <£ LU o I— < ►— h- O O I_I h- LU I ^ < i— ΰ ^ i— ^ k— I <<t— o < < <£ i_j ' <<<»-· O <<.lj O < <C i— <£ i— o <t· fl <£<►—< O OCJ< ' < < <£ H- O O O O fl << O t- C O < < < < i— <. u i— lu lu <C <£»—<< i— < i— <£ ~ fl < < h- O t— f— <.< LU I H <i < I— l_J O I— 1_J LU fl <£ < t— < C K— μ- μ- B ^ ^ h* O <C <ί I— *_j I <i <£ <i O LD <C LU \_J· << <. <i C I— < y— <i <£ l·- O <£ O O y— O <£ <i <C l_j <£ c y— H <<<<£<<>—»— H << f— o <c o < «_> H O <C lj O lu <£ i— o fl C < *—» 1— I_» -et < ,— H i—* <C <£ t— <£<!<£ I— 130 < ►— H— O lu I— ·— O <. LU <£ <C y— y— Η "“ΐ <C <i <t i— cj o fl <<<<co< o H i— <t <t t— <t <£ <t fl B i— < i— i— < i— o o fl t— <£ I— <1 LU <i LU B t— < t— O ·< < t— t— fl Η i— <C <£ i— fl Η Η—<<ί<ίΟθ ΟΟ I t— i— I— t— O 1— c c fl H t— ^ <£ <ί. <t t— I— ^ fl <ί I— t—· I— i_> <t < fl »—I— <£ <C lu v_/ <i C > fl ' lu < < lu . <t o < y— fl : H- ♦— I— C LU <£ C3 y— fl <t < t— t— <C <C i— y— fl t—»— h- I— I— LU LU c fl <C <£ t— I— .t~~ i— ID *— i— t— <t O C t— . J— < < i— I— <£ i_j i— < <t B O I— H O U I— O i_; O < y— \— >— <C <C i— *—* I— y— i— <i )— <ζ H <t<th-V— I < h- t- u <C >— C C I— <C C l-J c c o o Η < < I— O « i <£ in (_□ <<_<»«»<< o I Η I— i— y— O <t <t i— t_j B i— 4 l·— * i i— <ζ ' H-<<o<<H- y— U m <t i— i— i— c c c c_i o<oi— oooo B LU Uj' LU LU LU LU <f LU <ϊ B H 2: LU LU LU LU LU CD CD LU Q OOOOOOwOlj fl DK 175771 B1 29 O O O O O O O O O O 0*5 o o Cw »J1 vO —3" CO CO O (\l CM Ό O Ό «—<nj m ό t— r* co evi o* <£!—<<<<< <f <(— y— <C < l·— 1— < h— <£ ►— C LU O O < << < < < < O < < C l·— LU LU o LU H- f— I— I— LU LU <£ LU O I— <<l— <<< h— < H- ►— <£ LU J— LU < i— <t o lu o < <£ i— >— C «_» <c %_» t— <c c UD LD <C 1—’ O ( < <c C ►— O lu O < t_r O O O <t <£ 1— I— C t— C O <i lu H- < y— b- h- <C o t— ·— < i— <1 <t i— lu t— ·— (— H- < I— <£ LU O ·—J < i— <t i— lu O O <· O << <<>—►—»— < , <£ < <i <t O < lu < < C < O o LJ < < < C c LU C h~ f— H- t— < O C < (— < < t— < < C O O < t— << O LU LU < < H- <( <ί »— I— <£ <£ *—1 i— C h— C <t LU O H- t— O I— <C <C '—> <C I— H- OH- <£ LU <. < <£ <c t— I— <c LU O O <£ LU <ί I— < t— <£ I— O* <t <f. I— LU <£ t— I— ·«< o C»— C lu <C C LU H- c <C < (— !— C I— H— CC LD <1— O C LU < H- < H- OH- 1— 1— LU O <H C <»— H-OH-t— H-l/)< < 1— <t I— <£ <£ H- < OH- C O H- H- < C O < t— <t l·— C < <Z H- <Η· l— <£ t_i < t— O <C <<£ ·< O O < < *-i O < H- l— I— LU < H- C <1— H- O C LU O H- <►-=0 <£ LU o O H- O i— I— <C <£ O <t C OO t— <. <. H- <£ Lu OO lu C LU C C C < I— < <t < I— I— o < <t- J— <t H- < O t— LU <1 O LU I— t— O < <t I— I— I— <£ < I— <t <t >— < < LU <£ H- LU o >— < l— < O I— LU < < t— < H- O < < < H- l·— LU <C · LU H- LU <£ <i <i LU < O H- < LU < Η- < O < O i < LU c C C O LU t— 1 < <_LU^ LU O__H-_ LU__< I DK 175771 B1 I I 30 I jZ < V— O < < ~ < < < < O UJ o < < σ . <-» < < H i— i— o — f— i— y— < O < < < I_j < < «_> u to o < . t— < < O < H- ' < < h- UJ <_/ CJ o es >— *— o o <i uj i— i— <£ i— H <_r <i <i UJ1 <ί I— H «_) O < o < < (— < O f— t— UJ K— < < O I— < <<<<f-h- LD t— < LD h- < I— < O i— i—; i_j H < < < Η- O I— I— )— i— <t <t <( ID u_> <ί CD »—i H < *— UJ UD O I— <i i— <_i i— i— i— o < o h— 1_J < H O i— 1— 1— <ί <C H < < t— I— 1—> I_I i_J O I— I— < I < O ·< O LD LU < i— i— <C C y— i— < UJ < I— I— )— <_j t_j . <c i— (-j < <t i— ^ <i y— <ί H o U3 < < i— t— < O O <£ ►— I— <f |— o i— t— (— 1_> <£ LD <C <_> U3 J— <£ I— <i O Η- I— I— t_J I— - I— < o < <T O LD LJ y— <t <£ i— <f <£ H H <t <c i— “ί t— <£ < <C <C i_J I—O LD O < LJ i— <i i— t— uj H H <_/ *<C »— ·— — i— <£ H <· «_» . O ·— z <£ < Η o i— < ·— O t_i H H i— i_> j— i— o i— h— H j— O O LU <t LD < < h- i— i— i— < LU < < — o < LD O <t UD — <t <i H i_ t— < i— ·— i— tu H Η <ζ i— <C i— <i *—> t— o <c < < O I— H <f i— K~ 4 < i Η· B <ί O ι_/ < K- i— i— < O < < j— < < < O < < t— <_J < < < l·— t— „ ·— < ID I LU< UJ < tu < ^ < UJ < UJ < 2. z 2 21 z Z Z 22 UQ ώ O tu Q LU O LU Q LU Q H i π q u O o O u vD u tO u H 31 DK 175771 B1 O o O O o o o o o o oo 3 co co o csiosi vo-j o vo j-oo cni o cnj cni mm mj· ^lo — ^j-vo <£ *— l— l— I— O <J I— < H- < LD <c < i— I— <X I— n i— < < < < σ H- < o < < . < — < 3 < o — < < < I— I— I— O <—j < I— <£ O < <1 · h- < <f l— I— <t o t— 3 < O 3 <*-»— < t— < < H- O 3 < < < O X O < t— < < I— — <i < < <t <t < < < i— ' < 3 <—» LD O O i_ • i— t— < < < <f < t— «_J <X i i u O I— 3 < < i— . < < < 1— 3 i— < 3 t— l— <t · O < t— < < < i— 3 < >— < l— <f . < t— < < < l_J C) < 13 < I— LJ - t— *— < C i— j— 2 < < < < < |— 0.0 O O < i— o 1— < I— I— < i— < < 13 < 13 < I— < f— I— O <ζ JZ l·— < I— I— O u -—- I— « » < <£ <3 < O 13 < 13 H- 3 < I— < < < I— < v_j 3 o u : < < o 3 ir» c < o < < *— < t- j- i_> O < t— < I— 3 < O I— *- o I— h- '—1 Η Ϊ— <£ C I— 1— C L3 < 1— l·— O 3 O O <1— O < 13 o <13 1-3 < < H- <1— ►— »-> < < I— I— < < I— 3 < I— 1— ' < 13 i > I— 1— I— 13 13 t i h— 13 < H- t— (— < t— O < < < < < 13 t— 3 < 3 13 < t— 3 3 13 I— < 13 3 I— < I— 3 < i— I— 3 < < < O < < < :< < < <.<—' < < t— < < <31— I— I— < 13 3 3 < 3 < ___<___13_3_h-___Q Η I DK 175771 B1 I I I I f < i— ►— i— f— lZTv3~9 H ! < o *— < < i— < < OH- <<< J— << H- < < < H- h- iDO < < i— o < h- o o H 0<<l— <H-<< - Η H* l·— < H- <i <i < < O H- <<h— <U O f— <<(— <f— < l·— < C O O < < o <1-- <£ O < H- < < < o α: < o < (— f_o i— f— O I— O O < O < l—o f— < H- i— < i— o I— C I— O 1— I— o i— O < I— I— i— i— < H . < f— z < < < < < <( <1-- < *-J < O t— < <C 1— I— < < (— o < I— CO C < · < < |— H- (—<«-» O »-Jh-h-l— < < h- I— < H- o t— < < O < *—> < y— h- LD H <C I— t 1—# I— i— I— i__i h- < h- <£ o »— t— < H- O l-J < < < < < < < < O h- I— O I— < i— < i— < < i— i— H O O LU < I / )— I— (— O<Lj0OH-OH- < i— -— <C O C i— u i— H <<;£·< t— < < < < H <<<<<)— u l·- < i— o i— < < <£ j— o O-1- C <C C i— i— i— H- C o < O )— i— i— ' < < — < »— O f— t— < < H— ·— < < H- < < I— O O O O < I— O O t— < l·— o H- f— O < I— Η— 1— O i— l_j < h- i— <; < <c < <£ <-J I— O < < v » i— < < H- <£ I— i— < O < <<H-<|— <(— << O O < <C O i— uuu H oh- i— <C < t— < i— i— H t— o < 0.1— < < u < o O O o < < i— <UJ<CI— <f l·- h < h H <. < <_i <_> i—i <c <( <t i— H O O O O <1— I— I— < H <i f— i— t— <t < i— i—» <t < O <C . < «-i < i— < i- < I— >— <t <<01—0 o <<<»— 1— h-<o t— O < O < < I— I— h— < O O O O h— i— < < H <t o i— < < i— i— i— < H-0<<01— <0< < f— O < i— -C i— i— i— tii u_l < UJ < UJ <t UJ <; LU UJ UJ UJ 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 UJ Π LU O LU O LU □ LU Q LU LU LU LU O u O <_/ Ou OuOuOOOO I DK 175771 B1 £8 SS S3 Sg g°3s OD U"1 CN LO O Ό Ό <N LO O vO CM ίΜ CM CM CM CM CM < <c <£ <t >— *— < < < < o t-J < f— I— < < < < O (-<»-!_ <£ H- <C <t <t <C <£ LJ f— <ί <£ O i— i— < < ti »- < < < ♦- < < *— <t 1— <t I— < < I— 3 < < < < < H- o < O Η- <t 1— O <i <£ S ^ il 5 < »- < o <C < I— <C H— i— h- < O CO UJ O < uK < ·<. ·<. i— <1 C h— I— <3; < < <C < <<t<<t i < < £ O < lj <t C *Z t ·“ o < uo< < f— I O <1—13*— O O O O < I— <1— *— < O O < I— i_» -c < I— t— L3 4 < < u O O < I- < < i i i-i < h~ c i— < < < ir UJ e- »— t— < (_ o < *— O I— ·— < < < *— < J- »- *- < o < < *— < H- t-1 LJ 2 t— < UJ <· O < »— D □ *— < < •— ·— I— < I— u L3 < )— 1— < u> LJ < < < < ♦— < <C O )— Q o < I— ·— < o t— z: *— < u» i— <t i_> < i— uj i— y— <C < <C 13 O t— t— < *- < ^ "ί Ϊ— LJ · t I ί 1 < O UJ I— lj i— < i > < I— ||— LJ ur H- < < Η “ί. '·*ΐ I— V— 1— o o LJ Ul I— <i h- I— I— I— LJ < <3 O LJ t— I— t— *— <t 1— < o I— I— I— I_i 1— LJ I— < < |— < O O O I— UT u < O < <£ < > O t— i— OH— (— <£ i— y— < i— o < < o o < <i—<< f— <t I— <t I— < I— < ·— ur Ul < < »— < < C O O O I— < »— *— < 13 I— 1— < O < < < O UJ < O O UJ < < < O O h- t_t k— <_i <Z <(. < l— LJ I— 0<t <C 13 uj <t i— < i— < < <£ H- < o L_J<0 •— <£ <C < ui i— o i— < <£ uj O < uj<<t < (3 y— < < o<< 13 < < < UJ>— << <3 i— uj lj y— <t <X < _L3___O__o___y~_y-__t— *- < i I DK 175771 B1 I I I

5. UJ I— U <f < (J I_ uj < uj< ~3 ^3 >3 <S<< S g 2 < <3<g^ —'h- CL· V_J 0<C UJ “< CL LJ f— < < U < UJ O O LJ < < H- h_ ^ UJ < {7- <£ 1— |_ <f |_ UJ< 0< < UJ C UJ (—o <<<h *5 ud o o < 1— 3 p: < *— i— i— < < (_ lj <r ^ < UJ o >- < Z < 1- t—/ 3 3 < S < < < <Uh-lD uj < <t <C t— i— l_ <r .-i Σ t— O-LJ UJ < OO X< <|_|_ir. < UJ O O LJ l·— i— <( < “*< UJ I— < <( Η- I— I— < '-h- UO 0< un LJ f-<oc * UD <i I— <£ i— i— UJ ,<t UJ <i UlJ <( UJ<i UJ UJ UJ UJ ‘ - · 2 2 2 z 2 2 2 2 2 Z 2 2 2 2 UJ O UJ O uJ O uj o uj q uj uj uj CD O u O u O «_> O o O u OG G LU Μ I I DK 175771 B1 I I 26 I Hl O' o Oo O O o 0 N0 OOOfvJ I ffl O CJ (Μ Ό O vQ OM CO O (N *j· «ο I H o· oo ui o t n O Ό r— Ό cm j· m ό ο I ·— «r-OMC-JOMCMOMCMCM I < < < <C i— t— < <c I ao < lu <(_!—< I < <£ < O I— -ei t— t— I H < i— <c <i < < < lu I —· t— >- < pu < a o i- i-< < I i— i— < < < >— ·< <t I Η i— <£ i— <X i— < ^ ^ I l/l o LJ < >- < M<t <<»—03 I < o i— <t »— up < < I O < »— < < »-< o I o < lu< —il— tu < i— i— ►— <j I O ID LU UP < u I- < I < < i— < < i— i— <j I . iu < >-< lu< <<<< I H < < h- up < lu < < I »— *— · up < lu up < I o< > *— >1— O O < I— 03 I— I UP O UP O < 1- <»— I H- < UP UP <1— LU< I 0< > »— 21 I— ϋ UP < < < 1_> I U3 O < I— < <ua I ^B < »— < i— < < < i- I M i/) U > I— i I— LL. I— < I— U3 <£ I H »— 03 I— ►— < < < »- I l·— < I— I— I— < UP <£ < I Η —* I— LU < — I— l/l U U2 »-<u I H < up < i— up o »— < < I ^B I— *— I— < I— L> U3 < 1— I ^B Ll_ I— ~Zi <t I— LU < i_i < <<<t I »— < < up i— o up < V— I i— i— < up 1—2: i— < (_i I Η —. i— z: < < lu tu < »—lui—μ-< I < < up up i— i— < i— I ^B < < < i— v—j · t_> lu < I ^B cd o on«_/ —il— a_ i_i t— i— < o> I ^B <»— I— t_> LU I— < < I ^B < < < i— i— i— up up I ^B Cl lu i— lu > i— O < i— i— i— i— I ^B i_i < UP UP LUI—I— H- I ^B i— < i— < up »—»— i— I < LU i— < '—I —II— < < I— < I ^B UP UP O I— Lu LU < U3 I ^B < < v_> up i— i— up i— I ^B «1— LU < _> I— 21 i— < t— LJ < I Η < up up < <i—<< I ^B i— < *— <»— <i—< I ^B ·—· I— <LU < LU LU < < I— < < I H < UP UP-U3 i— <1—1— I < O I— I— <U3<< I ^B *: < ce o <»_» o < up up <_j < I ^B < < up up i— . uj i— tu I H << <1— l i I— UP < I ^B PsC < CC UP WU Z < I— <1— < I < < *— < up l_i < up I I— < < < LJ b- UP I— I H z < lu< lou er up < uj<< I ^B < up i— < < -—o < < I ^B up < < < lu i— < < I H UP UP > I— < Lu L/l u I— <<< I ^B _O__UP_O__Hl_H;__i— i— < I DK 175771 B1 27 eller et antigent fragment deraf, som er i stand til at inducere et beskyttende immunrespons.

6. Rekombinant DNA-molekyle ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at det I I er en rekombinant kloningsvehikel. I I 5

7. Værtscelle kendetegnet ved, at den indeholder et rekombinant DNA- I I molekyle ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til 6. I

8. Syntetisk polypeptid kendetegnet ved, at det er fremstillet ved ekspression I I af en nukieotidsekvens ifølge krav 4 eller krav 5 og udviser samme antigeni- I I 10 citet som et antigen eller et antigent fragment ifølge et hvilket som helst af I I kravene 1 til 3. I

9. Vaccinesammensætning kendetegnet ved, at den omfatter et antigen iføl- I H ge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, eller et antigent fragment deraf, eller I H 15 et syntetisk polypeptid ifølge krav 8 tillige med mindst én farmaceutisk accep- I tabel bærer eller excipient. I

10. Sammensætning ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den ydermere omfat- I ter en adjuvant. I

11. Anvendelse af et antigen ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3 eller I et syntetisk polypeptid ifølge krav 8 til fremstillet af en vaccinesammensæt- I ning til anvendelse til aktiv immunisering af en vært mod P. falciparum. I 25

12, Antistof kendetegnet ved, at det binder et antigen ifølge et hvilket som I H helst af kravene 1 til 3. I