DK175800B1

DK175800B1 - Resistensgen, genstruktur indeholdende resistensgenet, vektor indeholdende resistensgenet eller genstrukturen, værtscelle indeholdende vektoren, plantecelle, planter.............

Info

Publication number: DK175800B1
Application number: DK198800239A
Authority: DK
Inventors: Eugen Uhlmann; Friedrich Wengenmayer; Peter Eckes; Guenter Donn; Wolfgang Wohlleben; Alfred Puehler; Eckhard Strauch; Walter Arnold; Renate Alijah; Friedrich Hein
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-01-21
Filing date: 1988-01-20
Publication date: 2005-02-28
Also published as: GR3007859T3; CN87100603A; DK23988D0; DE3878699D1; EP0275957A2; FI116067B; JPS63273479A; NZ223227A; EP0275957B1; JP3093686B2; CA1321364C; HUT47636A; EP0275957A3; DK23988A; JP3062125B2; JPH1080278A; HU215079B; AU609082B2; JPH1080289A; CN1057120C

Description

i DK 175800 B1 t

Den foreliggende opfindelse angår et phosphinothricin-resistens-gen, en genstruktur indeholdende resistensgenet, en vektor indeholdende resistensgenet eller genstrukturen, en værtscelle indeholdende vektoren, en plantecelle, planter, 5 dele heraf og frø indeholdende resistensgenet, samt anvendelsen af resistensgenet eller genstrukturen til tilvejebringelse af phosphinothricin-resistente planteceller, plantedele, planter og frø.

I den vesttyske patentansøgning nr. P 3.628.747.4 20 foreslås et resistensgen mod phosphinothricin (PTC), der kan fås ud fra hele DNA'et fra for phosphinothricyl-ala-nyl-alanin (PTT)-resistens selekteret Strepcomyces viri-dochromogenes DSM 40736 (fra den almindelige samling) eller DSM 4112 (deponeret i henhold til Budapest-traktaten) ved 25 snit med BamHI, kloning af et 4,0 kb-stort fragment og selektion for PTT-resistensen, samt anvendelsen af dette ! gen til fremstilling af PTC-resistente planter, som PTT- j resistens-markør i bakterier og som PTC-resistens-markør I i planteceller. Det 4 kb-store BamHI-fragment, i hvilket 20 resistensgenet ligger, er nærmere defineret ved hjælp af et restriktionskort (figur 1).

Ved kloning af delområder af dette 4 kb-fragment blev beliggenheden af kodeområdet nærmere lokaliseret.

Herved viste det sig, at resistensgenet ligger i 1,6 25 kb Sstll-Sstl-fragmentet (positionerne 0,55 til 2,15 i figur... . 1 i hovedansøgningen). Ved fordøjelse med Bglll udvindes et 0,8 kb-stort fragment, der efter indbygning i et plasmid og transformation af S. lividans formidler PTT-re-sistens. Denne resistens er betinget af N-acetylering af 30 PTC. Resistensgenet koder dermed for en acetyltransferase.

I den vesttyske patentansøgning nr. P 3.642.829.9 gengives DNA-sekvensen af det i det forestående nævnte 0,8 kb-fragment. Ud fra sekvensen kan startcodonnet og gensekvensens åbne læseramme bestemmes. Det sidste nucleo-35 tid er en del af stop-codonnet TGA.

I DK 175800 B1 I

I 2 I

Gener fra Streptomyceter har med et forhold mellem I

adenin (A) + thymin (T) : guanin (G) + cytosin (C) på I

ca. 30% : 70% en meget stor andel af G + C. GC-Andelen I

af plantegener ligger med ca. 50% langt lavere. Af disse

H 5 grunde bliver resistensgenets DNA-sekvens optimeret i I

yderligere udformning af opfindelsens ide ved nysyntese I

af et for den vegetabilske RNA-polymerase II gunstigt I

codonbrug. I

I Opfindelsen angår en modifikation af det resistens- I

I 10 9©n, der er foreslået i de tyske patentansøgninger nr. H

I P 3.628.747.4 og P 3.642.829.9, nemlig en tilpasning til I

I codonbrugen i planter I

Opfindelsen angår nærmere bestemt følgende: I

I et resistensgen, der koder for proteinet med amino- I

I 15 syresekvensen I (anført nedenfor), idet der som start- I

I codon anvendes ATG og som stopcodon TGA, og genets I

I GC-andel er tilpasset GC-andelen i planter, I

- en genstruktur, som er kendetegnet ved, at DNA-sekven- I

I sen I er koblet til i planter aktive regulations- og I

I 20 ekspressionssignaler, H

I en vektor, som er kendetegnet ved resistens- H

genet ifølge opfindelsen, H

en vektor, som er kendetegnet ved en genstruk- I

I tur ifølge opfindelsen, I

I 25 vektorer indeholdende én eller flere DNA-sek- H

I venser valgt blandt: I

I I (nucleotid nr. 1-152) I

I II (nucleotid nr. 153-312) I

I 30 III (nucleotid nr. 313-436) eller I

I IV (nucleotid nr. 437-558), I

I - en værtscelle, som er kendetegnet ved en vektor H

I ifølge opfindelsen, H

I 35 - en plantecelle eller planter, dele heraf og H

I frø, som er kendetegnet ved et gen ifølge H

3 DK 175800 B1 opfindelsen, og anvendelsen af genet eller genstrukturen ifølge opfindelsen til tilvejebringelse af phosphino-thricin-resistente planteceller, plantedele, 5 planter og frø.

Den genetiske kode er som bekendt således beskaffen, at en.enkelt triplet koder kun for 2 aminosyrer, -medens hver af de resterende 18 aminosyrer, som der kan kodes for 10 genetisk, er tilordnet 2-6 tripletter. Til syntesen af genet er der derfor teoretisk mulighed for en stor mangfoldighed af codonkombinationer. Da den nævnte relative andel af de enkelte nukleotider i hele DNA-sekvensen er af indflydelse, er dette lagt til grund for et af kri-^5 terierne ved sekvensoptimeringen.

Følgende ændringer er gennemført i det sekvenserede gen: 1. Streptomycetgen-startcodonnet GTG (position 258-260 i sekvensen fra den vesttyske patentansøgning) udskif-20 tes mec* det vegetabilsk RNA-polymerase II benyttede startcodon ATG.

2. Inden'for genet forandres Streptomycet-gencodonnerne således, at -det resulterer i i plantegener egnede codon-ner (G/C-forhold).

2£ 3. Til afslutning af translationsforløbet sættes TGA- stopcodonnet på sekvensens afslutning.

4. Gensekvensens begyndelse og afslutning forsynes med overhængende afslutninger af restriktionssteder for at kunne amplificere genet, og for at kunne ligere 30 genet mellem vegetabilske regulationssekvenser.

5. Palindromiske sekvenser reduceres til et mindstemål.

DNA-Sekvensen I ifølge opfindelsen (med den tilsvarende aminosyresekvens) er anført nedenfor.

Tre interne singulære skæringssteder for restrik-35 tionsenzymerne Xbal (position 152), BamHI (312) og Xmal (436) gør det muligt med subkloning af delsekvenser, der kan være indbygget i velundersøgte kloningsvektorer, såsom pUC18 eller PUC19. Endvidere er der inden for genet Η

DK 175800 B1 I

I I

indbygget en række yderligere singulære genkendelsessteder I

for restriktionsenzymer, der på den ene side skaffer ad- I

gang til acetyltransferases delsekvenser og på den anden I

H side tillader gennemførelse af variationer: I

I 5 i

I Snit efter nucleotid-nr. I

I Restriktionsenzym_(kodende streng)_ I

I BspMII 11 I

I SacII 64 I

I 10 EcoRV 74 I

I Hpal 80 I

Aatll 99 I

BstXI 139 I

I I Apal 232 I

15 Seal 272 I

I Avrll 308 I

AfIII 336 I

Stul 385 I

I BssHII 449 I

I 20 Fokl 487 I

I Bgll 536 I

Bglll 550 I

Opbygningen af delsekvenserne ved hjælp af kemisk I

I 25 syntese og enzymatisk ligeringsreaktion udføres på i og I

H for sig kendt måde (de europæiske patentansøgninger nr. I

0.133.282, 0.136.472, 0.155.590, 0.161.504, 0.163.249, I

I 0.171.024, 0.173.149 eller 0.177.827). Detaljer, såsom I

I restriktionsanalyser, ligering af DNA-fragmenter og trans- I

30 formation af plasmider i E. coli, er udførligt beskrevet I

i Maniatis' lærebog (Molecular Cloning, Maniatis et al., I

Cold Spring Karbor, 1982). I

Den således klonede gensekvens, Indføjes herefter . I

I under kontrol af vegetabilske regulationssignaler i plan- I

I 35 ter, og den bringes til ekspression. Den europæiske pa- I

I tenansøgning nr. 0.122.791 giver en oversigt over kendte I

I metoder. Der fås således PTC-resistente planteceller (dvs. I

DK 175800 B1 5 man har et selektionskendetegn for transformerede celler), planter eller plantedele og frø.

I de følgende eksempler illustreres i enkeltheder nogle udformninger af opfindelsen. Procentangivelser er 5 baseret på vægten, når andet ikke er anført.

Eksempler

De følgende medier anvendes: a) til bakterier: •jo YT-medium: 0,5% gærekstrakt, 0,8% ; bacto-trypton, 0,5%

NaCl, LB-medium: 0,5% gærekstrakt, 1% bacto-trypton, 1% NaCl som fast medium: hver gang tilsætning af 1,5% agar, b) til planter: 15 M+S-medium: se Murashige og Skoog, Physiologica

Plantarum 15 (1962) 473, 2MS-medium: M+S-medium med 2% saccharose, MSCIO-medium: M+S-medium med 2% saccharose, 500 mg/1 cefotaxim, 0,1 mg/1 naphthyleddikesyre 20 (NAA), 1 mg/1 benzylaminopurin (BAP), 100 mg/1 kanamycin, MSCl5-medium: M+S-medium med 2% saccharose, 500 mg/1 cefotaxim, 100 mg/1 kanamycin.

25 1. Kemisk syntese af et enkeltstrenget oligonucleotid.

Som udgangsmateriale til syntesen af fragmentet II, der er et af de fire delfragmenter I - IV, tjener det endestillede oligonucleotid Ile (nucleotiderne nr. 219 til 312 i DNA-sekvensen I's kodende streng). Til fast-30 fasesyntesen anvendes nucleosidet i 3'-enden, i det foreliggende tilfælde altså guanosin (nucleotid nr. 312), via 3'-hydroxyfunktionen kovalent bundet til et bærestof. Bærestofmaterialet er med langkædede aminoalkylgrupper funktionaliseret CPG ("Controlled Pore Glass"). I øvrigt 35 følger syntesen de kendte metoder (fra de på side 3, linje 27-28, nævnte europæiske patentansøgninger).

Synteseplanen er indtegnet i DNA-sekvensen II, der

I I DK 175800 B1 I

I 6 I

i øvrigt svarer til DNA-sekvensen I. I

2. Enzymatisk binding af de enkeItstrengede oligonucleo- I

I tider til genfragmentet II. I

I Til phosphorylering af oligonucleotiderne i 5’- I

5 terminalen behandles hvert 1 nmol af oligonucleotiderne I

I IIb og Ile med 5 nmol adenosintriphosphat og 4 enheder I

I T4-polynucleotid-kinase i 20 pi 50 mM tris-HCl-puffer I

(pH-værdi 7,6), 10 mM magnesiumchlorid og 10 mM dithio- I

I threitol (DTT) i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktive- I

I to res ved fem minutters opvarmning til 95°C. Oligonucleo- I

tiderne Ila og ild, der danner den "overhængende" sekvens I

H i DNA-fragmentet II, phosphoryléres ikke. Dette forhindrer I

I ! ved den efterfølgende ligering dannelse af større subfrag- I

I menter end de, der svarer til DNA-fragmentet II. I

I 15 Oligonucleotiderne II (a-d) ligeres som følger til I

I subfragmentet II: hvert 1 nmol af oligonucleotiderne Ila

I og Ild samt 5 '-phosphaterne af Ilb og Ile opløses sammen I

I i 45 pi puffer, der indeholder 50 mM tris-HCl {pH-værdi I

I 7,6), 20 mM magnesiumchlorid, 25 mM kaliumchlorid og 10

20 mM DTT· Til annealing af oligonucleotiderne ifølge DNA- I

I fragmentet II opvarmes opløsningen af oligonucleotiderne

I i 2 minutter til 95°C, hvorefter der langsomt (2-3 timer) H

afkøles til 20°C. Til enzymatisk binding sættes herefter I

I 2 pi 0,1 M DTT, 8 pi 2,5 mM adenosintriphosphat (pH-værdi I

I 25 7) samt 5 ul T4-DNA-ligase (2000 Units) til blandingen, I

I og der inkuberes i 16 timer ved 22°C. I

I Oprensningen af genfragmentet II sker ved gelelek- I

I troforese på en 10%'s polyacrylamidgel (uden tilsætning I

af urinstof, 20*40 cm, 1 mm tyk), hvorved der som mærknings- I

I 30 substans anvendes ØX 174 DNA (Fa. BRL), der er skåret H

I med HinfI, eller pBR322, der er snittet med Haelll. I

I Fremstillingen af genfragmenterne I, III og IV I

sker analogt hermed, idet dog de "overhængende" sekvenser I

I omdannes til 5'-phosphaterne før annealingen, da det I

I 35 ikke er nødvendigt med noget ligeringstrin. I

7 DK 175800 B1 3. Fremstilling af hybridplasmider, der indeholder genfragmenterne 1, II, III og IV.

a) Indbygning af genfragmentet I i pUC18.

Det handelsgængse plasmid pUC18 åbnes på kendt måde 5 med restriktionsendonucleaserne Sall og Xbal som beskrevet af fremstilleren. Fordøjelsesblandingen adskilles på kendt måde på en 1%'s agarosegel ved elektroforese, og brudstykkerne gøres synlige ved farvning med ethidiumbromid.

Plasmidbåndene (ca. 2,6 kb) udskæres derefter fra agarose-10 gelen og adskilles fra agarosen ved elektroelution.

1 pg Plasmid, der er åbnet med Xbal og Sall, ligeres herefter med 10 ng af DNA-fragmentet I natten over ved 16°C.

b) Indbygning af genfragmentet II i pUCl8.

15 Analogt med a) opskæres pUC18 med Xbal og BamHI, og det ligeres med genfragmentet II, der forud er phosphory-leret i den overhængende ende som beskrevet i eksempel 2.

c) Indbygning af genfragmentet III i pOC18. ! 20 Analogt med a) opskæres pOC18 med BamHI og Xmalll,- og de.t ligeres med genfragmentet III.

d) Indbygning af genfragmentet IV i pUC18.

Analogt med a) skæres pUCl8 med. Xmalll. og Sall, og der ligeres med genfragmentet IV.

25 4. Opbygning af det komplette gen og kloning i et pUC- -plasmid.

a) Transformation og amplifikation af genfragmenterne I - IV.

De således opnåede hybridplasmider transformeres.i E. coli. Hertil gøres stammen E. coli K 12 kompetent ved 30 behandling med en 70 mM calciumchloridopløsning, og hertil sættes suspensionen af hybridplasmidet i 10 mM tris--HCl-puffer (pH-værdi 7,5), der er 70 mM med hensyn til calciumchlorid. De transformerede stammer selekteres på gængs måde under anvendelse af den plasmid-overførte 35 antibiotikaresistens eller -følsomhed, og hybridvektorerne amplificeres. Efter at have dræbt cellerne isoleres hybrid-plasmiderne, og de opskæres med de oprindeligt anvendte

I DK 175800 B1 I

I I

restriktionsenzymer, hvorefter genfragmenterne I, II, III I

I og IV isoleres ved genelektroforese. I

I b) Binding af genfragmenterne I, II, III og IV til et I

I helt gen. I

I 5 De ved amplifikation opnåede subfragmenter I og II I

forbindes som følger. Hver 100 ng af de isolerede fragmen- I

I ter I og II opløses sammen i 10 pi puffer, der indeholder I

I 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 20 mM magnesiumchlorid og 10 I

I mM DTT, og denne opløsning opvarmes i 5 minutter til 57°C. I

I 10 Herefter afkøles opløsningen til stuetemperatur, hvor- I

I efter man til blandingen sætter 1 pi 10 mM adenosintri- I

phosphat (pH 7) samt 1 μΐ T4-DNA-ligase (400 enheder), og I

I der inkuberes i 16 timer ved stuetemperatur. Efter at have I

I efterklippet med restriktionsenzymerne Sall og BamHI oprenses I

I 15 det ønskede 312-bp-fragment (nucleotiderne 1-312, Sall- I

I -BamHI) ved gelelektroforese på en 8%’s polyacrylamidgel, I

I hvorved der som mærkningssubstans anvendes ØX 174 RF DNA I

I (Fa. BRL), der er skåret med restriktionsenzymet Haelll. I

I På samme måde forbindes genfragmenterne III og IV I

I 20 med hinanden, hvorved man efter oprensning får et 246- I

I -bp-fragment (nucleotiderne 313-558, BamHI-Sall). Som I

I markør ved gelelektroforese anvendes pBR322, der er skå- I

I ret med restriktionsenzymet Mspl. I

I Til opbygning af hele genet.(DNA-sekvens I) ligeres I

I 25 15 ng af 312-bp-fragmentet og 12 ng af 246 bp-fragmentet I

I som ovenfor beskrevet med 1 jig af det handelsgængse plas- I

I mid pUCl8, der forud er udskåret med restriktionsenzymet I

I Sall, og som er dephosphoryleret i enderne. Efter trans- I

I formationen og amplifikationen (som beskrevet i eksempel I

I 30 4a) identificeres ved Sall-fordøjelse den rigtige klon I

I med 558 bp-fragmentet ifølge DNA-sekvensen I. I

I 5. Transformation af hybridplasmiderne. I

I Kompetente E. coli-celler transformeres med 0,1-1 I

I pg af hybridplasmidet, der indeholder DNA-sekvensen I, I

I 35 og cellerne udspredes på agarplader, der indeholder ampi- I

I cillin. Dernæst kan kloner, der indeholder de korrekt I

I integrerede sekvenser i plasmidet, identificeres ved I

9 DK 175800 B1 DNA-hurtigoparbejdning (Maniatis i føromtalte bog).

6. Fusion af det syntetiserede gen: til regulationssignaler, der genkendes i planter.

Det med Sall-snitsteder i enderne forsynede optime-5 rede resistensgen ligeres til polylinkersekvensens

Sall-snitsted i plasmidet pDH51 (Pietrzak et al.. Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5857). På dette plasmid er igangsætteren og afslutteren af 35S-transkriptet fra Cauliflower Mosaic Virus lokaliseret, der kan genkendes af det 10 vegetabilske transkriptionsapparat.

Ved ligering af resistensgenet indføjes dette bagved igangsætteren og foran afslutteren af 35S-transkriptet.

Den korrekte orientering af genet bekræftes ved restriktionsanalyser .

15 Igangsætteren af ST-LSl-genet fra Solanum tuberosum (Eckes et al., Mol. Gen. Genet. 205 (1986) 14) anvendes ligeledes til ekspression af det optimerede acetyltrans-ferase-gen i planter.

7. Indsætning af resistensgenet med regulationssekvenser- 20 ne i Agrobacterium tumefaciens.

a) Kointegrat-metode.

Den samlede transkriptionsenhed for igangsætteren, optimeret resistensgen og afslutter (eksempel 6) udskæres med restriktionsenzymet EcoRI, og den ligeres i den inter-25 mediære E. coli-vektor'pMPKllO1 s EcoRI-snitsted (Peter Eckes, Dissertation, Univ. Koln, 1985, s. 91 f.). Denne intermediære vektor er nødvendig for at overføre resistensgenet med dets regulationssekvenser til Ti-plasmidet fra Agrobacterium tumefaciens. Denne såkaldte konjugation 30 gennemføres ifølge den af Van Haute et al. (ΕΜΒ0 J. 2 (1983) 411) beskrevne fremgangsmåde. Herved integreres genet med dets regulationssignaler ved homolog rekombination via de i pMPKUO-vektoren og i Ti-plasmidet pGV3850kanR (Jones et al., EMBO J. 4 (1985) 2411) indeholdte sekvenser 35 af standardvektoren pBR322 i Ti-plasmidet.

Hertil sammenblandes hver 50 pi friske bouillonkulturer af E. coli-stammerne DH1 (pMPKUO-derivatets

I I DK 175800 B1 I

I I

værtsstamme) og GJ23 (Van Haute et al., Nucleic Acids Res. I

H 14 (1986) 5857) på en tør YT-agarplade, og der inkuberes I

il time ved 37°C. Bakterierne suspenderes igen i 3 ml 10 I

H mM MgS04, og de udspredes på antibiotika-agarplader I

5 (spectinomycin 50 pg/ml: selektion for pMPKUO, tetracy- I

clin 10 pg/ml: selektion for R64drdll, kanamycin pg/ml: I

selektion for pGJ28). De bakterier, der vokser på de selek- I

tive agarplader, indeholder de tre plasmider, og de opfor- I

meres til konjugationen med Agrobacterium turoefaciens i I

10 YT-bouillonmedium ved 37°C. Agrobakterierne dyrkes i I

H LB-medium ved 28°C. Hver 50 jil bakteriesuspension sammen- I

blandes på en tør YT-agarplade, og der inkuberes i 12-16 I

timer ved 28°C. Bakterierne suspenderes igen i 3 ml 10 mM I

MgSO^, og der udspredes på antibiotikaplader (erythromy- I

I 15 cin 0,05 g/1, chloramphenicol 0,025 g/l: selektion for I

agrobakteriestammen; streptomycin 0,3 g/l og spectinomycin I

I 0,1 g/l: selektion for integrationen af pMPKUO i Ti-plas- I

midet). På disse selektive plader kan der nu kun vokse I

agrobakterier, ved hvilke pMPKUO-derivatet ved en homo- I

20 log rekombination er integreret i det bakterielle Ti-plas- I

mid. I

I Foruden det allerede forud eksisterende i planter I

aktive resistensgen mod antibiotikumet kanamy.cin er også.. I

resistensgenet mod PTC nu lokaliseret på Ti-plasmidet I

25 pGV3850kanR. Før disse agrobakteriekloner anvendes til I

H transformationen, undersøges det ved hjælp af en "Southern- I

I Blot"-undersøgelse, om den ønskede integration er sket. I

I b) Binær vektor-metode. .il

I Der anvendes det binære vektorsystem, der er beskrevet I

I 30 af Koncz et al. i.Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383. Den af I

I Koncz et al. (PNAS 84 (1987) 131) beskrevne vektor pPCV701 I

I forandres på følgende måde: ved hjælp af restriktionsen- I

I zymerne BamHI og Hindlll fjernes et fragment, på hvilket I

I igangsætterne TRI og TR2 bl.a. er lokaliseret, fra vektoren. I

I 35 Det fremkomne plasmid ringsluttes igen. I det tilstedeværen- I

I de EcoRI-snitsted på denne vektor indføjes et ca. 800

basepar langt fragment fra vektoren pDH51, på hvilket igang- I

11 DK 175800 B1 sætteren og afslutteren af 35S-transkriptet fra Cauliflower Mosaic Virus ligger (Pietrzak et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 5858). Det resulterende plasmid pPCV801 har et singulært Sall-snitsted mellem 35S-igang-5 sætteren og -afslutteren. I dette snitsted indføjes det optimerede PTC-resistensgen. Ekspressionen heraf står nu under 35S-transkript-regulationssekvensernes kontrol.

Dette plasmid (pPCV80lAc) transformeres i E. coli-stammen SM10 (Simon et al., Bio/Technology 1 (1983), 10 784). Til overførsel af plasmidet pPCV80lAc til Agro- bacterium tumefaciens sammenblandes hver 50 jxl af SM10--kulturen og en C58-agrobakteriekultur (GV3101, Van Lare-beke et al., Nature 252 (1974) 169) med Ti-plasmidet PMP90RK (Koncz et al., Mol. Gen. Genet. 204 (1986) 383) i ! 15 som hjælpeplasmid på en tør YT-agarplade, og der inkuberes i ca. 16 timer ved 28°C. Bakterierne resuspenderes derefter i 3 ml 1 mM MgSO^, og der udspredes på antibiotikaplader (rifampicin 0,1 g/1: selektion for GV3101, kana-mycin 0,025 g/1s selektion for pMP90RK, carbenicillin 20 0,1 g/1: selektion for pPCV80lAc). På disse plader kan kun vokse agrobakterier, der indeholder begge plasmider (pMP90RK og pPCV801Ac). Før disse agrobakterier anvendes til plantetransformationen, blev det ved hjælp af "Southern Blotting" undersøgt, om plasmidet pPCV801Ac er til stede 25 i dets korrekte form i agrobakterierne.

8. Transformation af Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens.

Det optimerede resistensgen overføres ved hjælp af den såkaldte "leaf disc"-transformationsmetode til tobaks- ; 30 planter.

Agrobakterierne fremdyrkes i 30 ml LB-medium med de tilsvarende antibiotika ved 28°C under stadig omrystning (ca. 5 dage). Herefter sedimenteres bakterierne ved en 10 minutters centrifugering ved 7000 opm i en Christ-35 centrifuge, og der vaskes én gang med 20 ml 10 mM MgSO^.

Efter yderligere en centrifugering suspenderes bakterierne i 20 ml 10 mM MgS04, og de overføres til en petriskål. Til

I DK 175800 B1 I

I 12 I

bladskive-infektionen anvendes blade af i sterilkultur I

på 2MS-medium voksende Wisconsin 38-tobaksplanter. Alle I

I sterilkulturer holdes ved 25-27°C i en rytme med 16 timers I

hvidt lys/8 timers mørke. I

I 5 Blade fra tobaksplanten snittes af, 09 bladoverfladen I

såres med sandpapir. Efter at have såret bladene snittes I

I de i mindre stykker, og de dyppes i bakteriekulturen. Her- I

efter overføres bladstykkerne til M+S-medium, og de holdes I

I i 2 dage under normale kulturbetingelser. Efter to. dages I

I 10 infektion med bakterierne vaskes bladstykkerne i et flyden- I

I de M+'S-medium, og de overføres til MSCIO-agarplader. Trans- I

I formerede spirer selekteres på baggrund af den medoverførte I

I resistens mod antibiotikumet kanamycin. 3-6 Uger senere I

I bliver den første spire synlig. Enkelte spirer videredyrkes I

I 15 på MSC15-medium i glasbeholdere. I de følgende uger danner I

I nogle af de afskårne spirer rod på snitstedet. I

Transformerede planter kan også selekteres direkte I

på PTC-holdige plantemedier. Ved DNA-analyse ("Southern I

Blotting") og RNA-analyse ("Northern Blotting") af de I

20 transformerede planter påvises tilstedeværelsen og eks- I

pressionen af PTC-resistensgenet. I

9. Påvisning af de transformerede planters PTC-resistens. I

Til undersøgelse af resistensgenets funktionalitet I

i transformerede planter overføres bladfragmenter af I

25 transformerede og ikke-transformerede planter til M+S- I

-4 I

næringsmedier med 1·10 M L-PTC. Fragmenter af ikke-trans-

formerede planter uddør, medens der på fragmenter af trans- I

formerede planter kan regenereres nye spirer. Transforme- I

rede spirer danner rod og vokser uden problemer på M+S- I

30 næringsmedier med 1·10-3 M L-PTC. Transformerede planter I

plantes under sterile betingelser i jord, og de sprøjtes I

med 2 kg/ha og 5 kg/ha PTC. Mens ikke-transformerede plan- I

ter ikke overlever denne herbicidbehandling, viser de I

transformerede planter ingen af de skader, som herbicidet I

35 bevirker. Udseendet og vækstforholdet af de sprøjtede, I

transformerede planter er mindst lige så godt som ved de I

usprøjtede kontrolplanter. H

DK 175800 B1 13 10. Acetyltransferase-undersøgeIse til påvisning af PTC-acetyleringen i transgene, PTC-resistente planter.

Ca. 100 mg bladvæv fra transgene, PTC-resistente tobaksplanter eller fra ikke-transformerede tobaksplanter 5 homogeniseres i en puffer, der består af: 50 mM tris/HCl, pH 7,5; 2 mM EDTA; 0,1 mg/1 leupeptin; 0,3 mg/ml oksese rumalbumin; 0,3 mg/ml DTT; 0,15 mg/ml phenylmethylsul-fonylfluorid (PMSF).

Efter en efterfølgende centrifugering inkuberes 20 10 μΐ af den klare ovenstående væske med en 1 μΐ 10 mM radioaktivt mærket'D,L-PTC og 1 μΐ 100 mM acetyl-CoA i 20 minutter ved 37°C. Herefter sættes 25 ul 12%'s trichloreddikesyre til reaktionsblandingen, og der fracentxifugeres.

Fra den ovenstående væske overføres 7 μΐ til en tyndtlags-15 chromatografi-plade, og i en blanding af pyridin, n-buta-nol, eddikesyre og vand (50:75:15:60-rumfangsdele) fremkaldes opstigning to gange. PTC og acetyl-PTC adskilles således fra hinanden, og de kan påvises ved autoradiografi.

Ikke-transformerede planter viser ingen omsætning af PTC 20 til acetyl-PTC, mens transgene, resistente planter er i stand dertil.

25 30 35

DK 175800 B1 I

5 ggg SSS 3S“ . 555 32¾ 1§8 · I

i~»-< eoo veu oeu Jh< <<(- ^B

tn i- < kus - J(-< *<(- «<(- ofc< H

ZOO (- (- < >00 DUO <-<<- >OU ^B

ZUO B<H £<h <00 >;K B<f·

»<(- BOO XUS .300 JOO KOD ^B

<<(- <<(- (-<(- <øl) DUU BUO H

Jh< tu (- < W O O 300·. O O (3 POU H

<h< tn<H sou j < i- «oo 5S0 H

> S3 O <(3U (-(-< DOO < (3 O <<(- H

MUO Z<H CU (- < HOO <UO ρ<(· I

jh< -n < (- in < (- ui-< Juo soo H

-<(- OOO <OU E < (- <00 S (3 O H

10 CU t- < 300 HOO B(-< S<(- Of-< H

tn < (- Wf-< >“<h UUO SUO KUO H

<00 -3(-< (-♦-< U3(-< (-<(- , O.UO ^B

m(-< . poo <(-< «ου kuo <(-<

UK< <<(- <OU (-H< <Ot> M

JH< 300 ZOO 3t*< >- < (- O < t-

<(-< O < I- »<(- Ut-< -3(30 EUO ^B

>(30 (300 <<(- JOO (3(30 BUO ^B

<30 O < I- O t3 O 300 300 3CU

-30(3 U(-< KOU W(-< WH< W(-< H

<oo οθ(3 <<(- ji-< -) (- < jk ^B

<0(3 B(-< <<-< M(-< <(-< 300 H

00(3 (0<l- -30(3 -*<(- >30(3 J < f- ^B

<C30 <(30- <(3<-> =0(3 <(30 (3(3 0 H

^5 (-(SO B(-< (600 S<(- 3 (3 O !*)(-< H

b)t-< (0<(- X(- ZO(3 -3 < (- =f-< H

3C<(- < O O -3 < t- (-<(· C3 (3 O CU (- < ^B

ru f- < bi(-< cu o o eoo «(-< B(-<

tn<(- oh< eoo y <(- — < (- ui<e M

<(30 — < t- (- (- < Ϊ- (- < =0(3 <(3 0 H

< ¢- < BOO 00(3 0(30 =(3 0 (3 0 0

0 0(3 OCQO =0(3 Wt-< WH< Bt C3 O ^B

<(3 0 (— (- < CU O O -3(-< -3 I- < <<(· ^B

< < t- - »OO >-(30 B<(- 0(30 Z < H - 2 M

00(3 -3<(- -3(30 =0(3 CCC30 -3 < (- O ^B

<(30 (300 OOO l-<(- <<(- 00(3 >Λ B> ^B

S < (— E<t- <f-< =0(3 OI-< CL O O φ

ZOO O < (- OOC3 100(3 < I-< KDU > ^B

2Q (» < (- (30(3 <(30 O (- < > O O (-1- < χ H

<«-< 0<(- BOO >-<i- B I-< Uh< Si

o o o eoo 5-<t- ooo ωυο = (-< , H

<oo eoo (-(-< ooo «(-< 0 i>< ^ H

O < f- =<l- <t-< = <(- O <t- o >-(-< 2

kuo zoo ooo ωμ< κυο -<« ooo α ^B

tu O C3 *-<(- <(30 00(3 eoo (3(30 H

ooo z<t- *3t-< >- o o cu t- < uf-« o' SOO O < (- JK ooo (13 < H < I- <

<<(- (30(3 — < [- OOO <00 > O O I H

Ut-< 0<l- >-(-< »OO ZOO ΕΚ ® H

o*-< boo ooo uj>-< tn < t- tn < t- ^ H

— <i- eoo ooo ox <<h <oo >> ^B

300 S(3U <l-< OOO r-u 0<l·- ®h< O

rse O < h- *J<H JUO KUl; · = Οΐ U O ·- < H C

25 O U L> ooo < C5 u i < I--^ β*ϋΙί xuo —<

O H < CU < H JUU X < Dh< &.QU J H

<h< x o ϋ <f-< j<é- ω h < ccc?o **·· >ϋϋ μ<Η > ϋ U ϋ ϋ U h-f^< 0<Η OOD α>(-< >ϋϋ >-<Η Η «ϋϋ coy <*~< «— < μ- Jou ο ο l> r Q.UC9 <<μ* >(9θ ΐϋϋ ΰΰϋ ϋϋ ϋ η U<f- UH< Οϋϋ >- f- < Η <<Η ϋϋϋ g <<t- -<Η ooo < Η ooo zoo »»»- in i- < oi-< in v- <

soo tn < t- J<>- — < (- <c< —<(- . - >. H

<<(- <<(- OOO XOO >00 =0(3 ' < Q

OOO -300 -J < B<(- < (- < «ου (p< H

30 0<(- <(-< <(-< UOO -300 XH

ooo >oo >(30 «(-< <oo U><(- wcj o H

0C3O B<(- OOO 0(30 -3(-< BOO ^ H

ecpo (-<(- ooo >oo >oo (-(- < ζομ H

E (— < Bt-< o <l-< gop -300 X(- S" H

HOO eoo - O OOO >- < (- < H < 000 UUP

ΙΛ (-< «H< rH <00 »-(-< >00 OOO ^ -

1-00 BC30 -3(-< J(-< E(-< <(-< soy H

<(- (-<(- >WO >0(3 tn (- < <00 ^ H

oo »oo ooo £►·< BOO <<(- £ S H

< J<(- U(-< =(30 >- < (- JOC3 5Sg H

o OOO >3(-< (- < (- -3 < (- <00 >0(3 H

as ο ωχ eoo «»"< e (- < ooo Qrtfi H

«33 t- T Jh< Boo wop = (- i EOO KOO H

— <(- (- (- < tn < (- ei-< <oo. euP ^B

15 DK 175800 B1

Eli Isf ilt Iff UV 111 . iss eh iga §*g . in i aga ill lig 1¾ 311 s S6|T Iff m ns m ug ufr sig 311 aiagg Ile 611 .f»8 Ibs ug §εγ eh ni m !ii •o m ug m gu in m 555 , 5S6-r SSt 2 355 ·α é§S lb§ 388 8S8 vS^H BBS 222 <DO ?<<H Jh< Μ 3fc-3 JH< S«σ £*-< <f< a>f-< <h< <ou <ou ^<ouo *uo < o u oou t-pu m coop h «<*- PDU ISfc5

Uh< tt<h h>“5^ Sup J<h SH< £<«- <oo J <H h<(- ODU Ch< m- 15 t.i~< hou «ο» λη< a.*-< ^ so<h 3*-< Sou S* < P «<h to < *- <ou n<h Pk (· h < suo < u u w

355 £88 888 B22 BB8 §88 S

<bu Fk Euo 3h< < < i- ®

<<(-> soo >>ou s < t- eoo i<i- S

H Jus J « l·- JUO xvp Sou J < l·· <OC X} BBO OBO P<P , <<H OUO 0) £55 55£ SSS β&8-£ it5 |S8 “ P<t- DUO «OO βί-4<1' >BU P«-< ^

555 855 es*£t i_5Sfe £5f sti I

20 <eo kuo (·►<], O C O 03 t- < E t- < ‘-J

p<i- s < l·* <h< ' »<i- n) o <»- X) >-»-< ^

Suo ZOO , JUS Hl<< H KUOH fl JDU ^

kuo F<h < olo Sus H kuo μ - ij oou O

BBU X < l·- . ΙΐΗ< V· O P W H J(-<

Sou j2i- 3*-2 jqu tg<f- <·-< i < < H OUO ·-«<*- O O O Sou >συ φ SH< 0<f- >-H< OBO ZUB fc*«< 1-1 Ϊ-} Sup JDU EF« O < H «0 < l·- w, μ<». EoS ooo j i- 2 <<h <ou ·* OBU »OU _ ODU P<*- BH< n j < i- J < |- Λ jus ξου Suo «< i- 2

oou <0 soUh <ou S<t> kuo zuo C

ji-< H k<*- j o o z<i- »i-< n, p u ti

25 <μ< suo < h < 3<i- » Η < Ξου E

>ou F<i~ »>oo ouo 3uo -Pi-< *$·

f<l- OOU Jh< B3H< HOO >-<W

oo Sou <F-2 «<«- j3u jou

UO <<H O-OU SUO OOU OOU

o<(- Ml·« »·»·< OOU M<l· ►- H <

Sou :l·« jpu SSu 3i-< jou f- k 5<t- kh3 ODU <<l- OOU O '

* BDU ZUO OOU «*-< j t* i »·-< O

Sou n«h J«l· »«i- <►-< M«h « <<(- <2l· oou . buo »-ou suo 1' ou »ou jpu to jk<xi o «««-τι <»-< mou < < *-

J<l·- <f-< H <k«H H "UP H JUO >-5»- 1 OU

oou > o u H >OU^| £ U3l·- < [_] <OU J < l·- lt-< 30 oou »ou Jpu Jl·« suo suo £8S 222 éS& 553 5§3 Είί B&S £55 355 £S2 2E2 5|5 5S2 „

Qh< «··< <OU hh< P U OOU OUO

gu 111 iga iga in m

i°+ Ilt §11 ISI sil 3§8 " itS

35 1 s 311 111 ill 313 111 Ibs

Claims

1. Resistensgen, der koder for proteinet med amino- I syresekvensen I, idet der som startcodon anvendes ATG og I som stopcodon TGA, og genets GC-andel er tilpasset GC-andelen ^ I 5. planter. I

2. Resistensgen ifølge krav l,kendetegnet . I B ved DNA-sekvensen I (nucleotidposition 9-554). I

3. Genstruktur, kendetegnet ved, at DNA- I B sekvensen I er koblet til i planter aktive regulations- og I 10. ekspressionssignaler. I

4. Vektor, kendetegnet ved resistensgenet I B ifølge krav 1 eller 2. I

5. Vektor, kendetegnet ved en genstruktur I B ifølge krav 3. I B 15

6. Vektorer indeholdende en eller flere DNA-sekvenser I B valgt blandt: I B I (nucleotid nr. 1-152) I fl I,I (nucleotid nr. 153-312) I B ' B III (nucleotid nr. 313-436) eller I I 20 IV (nucleotid nr. 437-558). I B

7. Værtscelle, kendetegnet ved en vektor I B ifølge krav 4, 5 eller 6. I

8. Plantecelle, kendetegnet ved et gen I B 25 ifølge krav 1, 2 eller 3. I

9. Planter, dele heraf og frø, kendetegnet I B ved et gen ifølge krav 1, 2 eller 3. I

10. Anvendelse af genet ifølge krav l eller 2 eller * I B af genstrukturen ifølge krav 3 til tilvejebringelse af phos- I B 30 phinothricin-resistente planteceller, plantedele, planter I B og frø. I