JPS63273479A - 植物において活性であるフォスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用 - Google Patents
植物において活性であるフォスフィノトリシン耐性遺伝子及びその使用Info
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- JPS63273479A JPS63273479A JP63011851A JP1185188A JPS63273479A JP S63273479 A JPS63273479 A JP S63273479A JP 63011851 A JP63011851 A JP 63011851A JP 1185188 A JP1185188 A JP 1185188A JP S63273479 A JPS63273479 A JP S63273479A
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- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
公開前のドイツ国特許出願（Ｐ ３Ｂ ２８ ７４７．
４）（「主出願」）は、ストレプトミセス争ピリドクロ
モゲネス（゛） ＤＳＭ４０７３Ｂ （一般寄託株）又はＤＳＭ４１１２
（ブダペスト条約に基づく寄託株）の全ＤＮＡから得ら
れるフォスフイノトリシン（ＰＣＴ）耐性遺伝子、すな
わち、フォスフイツトリシル−アラニル−アラニン（Ｐ
ＴＴ）耐性による選択、ＢａｍＨＩによる切断、４．Ｏ
ｋｂの大きさのフラグメントのクローニング及びＰＴＴ
耐性による選択を経て得られる遺伝子、を提示している
。さらに、該特許出願は、該ＰＣＴ耐性遺伝子を細菌に
おけるＰＴＴ耐性マーカー及び植物細胞におけるＰＴＣ
耐性マーカーとしてＰＴＣ耐性植物の生産に利用するこ
とも提示している。耐性遺伝子が位置している４ｋｂ大
の該ＢａｍＨＩフラグメントは、制限酵素地図（該特許
出願第１図）によって詳細に定義されている。耐性遺伝
子コード領域の位置は、この４ｋｂフラグメントの部分
領域をクローニングすることによって、より正確に決定
された。その結果、耐性遺伝子は１．６ｋｂの大きさの
５ｓｔｎ−ＳｓｔＩフラグメント（主出願第１図の０．
５５から２．１５の位置）に位置していることが明らか
になった。また、ＢｇｌＩＩによる消化によって得られ
る０、８ｋｂ大のフラグメントは、プラスミドに導入し
てストレプトミセス・リビダンス＜ ” ＞を
形質転換させた際のＰ Ｔ Ｔ耐性に開存する。この耐
性は、ＰＴＣのＮ−アセチル化に依存している。すなわ
ち、耐性遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼをコー
ドしている。
４）（「主出願」）は、ストレプトミセス争ピリドクロ
モゲネス（゛） ＤＳＭ４０７３Ｂ （一般寄託株）又はＤＳＭ４１１２
（ブダペスト条約に基づく寄託株）の全ＤＮＡから得ら
れるフォスフイノトリシン（ＰＣＴ）耐性遺伝子、すな
わち、フォスフイツトリシル−アラニル−アラニン（Ｐ
ＴＴ）耐性による選択、ＢａｍＨＩによる切断、４．Ｏ
ｋｂの大きさのフラグメントのクローニング及びＰＴＴ
耐性による選択を経て得られる遺伝子、を提示している
。さらに、該特許出願は、該ＰＣＴ耐性遺伝子を細菌に
おけるＰＴＴ耐性マーカー及び植物細胞におけるＰＴＣ
耐性マーカーとしてＰＴＣ耐性植物の生産に利用するこ
とも提示している。耐性遺伝子が位置している４ｋｂ大
の該ＢａｍＨＩフラグメントは、制限酵素地図（該特許
出願第１図）によって詳細に定義されている。耐性遺伝
子コード領域の位置は、この４ｋｂフラグメントの部分
領域をクローニングすることによって、より正確に決定
された。その結果、耐性遺伝子は１．６ｋｂの大きさの
５ｓｔｎ−ＳｓｔＩフラグメント（主出願第１図の０．
５５から２．１５の位置）に位置していることが明らか
になった。また、ＢｇｌＩＩによる消化によって得られ
る０、８ｋｂ大のフラグメントは、プラスミドに導入し
てストレプトミセス・リビダンス＜ ” ＞を
形質転換させた際のＰ Ｔ Ｔ耐性に開存する。この耐
性は、ＰＴＣのＮ−アセチル化に依存している。すなわ
ち、耐性遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼをコー
ドしている。
−上記の０．８ｋｂ大フラグメントのＤＮＡ塩基配列は
、ドイツ国特許追加出願Ｐ ３６４２８２９．９に再現
されている。このＤＮＡ配列から、遺伝子配列の開始コ
ードン及び転写解読枠（オーブン・リーディング・フレ
イム）を決定することが可能である。
、ドイツ国特許追加出願Ｐ ３６４２８２９．９に再現
されている。このＤＮＡ配列から、遺伝子配列の開始コ
ードン及び転写解読枠（オーブン・リーディング・フレ
イム）を決定することが可能である。
最後部のヌクレオチドは、終止コードンのＴＧＡ部分で
ある。
ある。
ストレプトミセス菌類由来の遺伝子は、Ｃ＋Ｃ比が非常
に高い。すなわち、アデニン（Ａ）十チミン（Ｔ）ニゲ
アニン（Ｇ）＋シトシン（Ｃ）は、約３０： ７０であ
る。植物遺伝子のＧｃ比はこれよりはるかに低く、約５
０％である。このため、発明のさらなる発展として、耐
性遺伝子のＤＮＡ塩基配列を新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合
成によって最適条件にして、植物のＲＮＡポリメラーゼ
■にょって利用できる好ましいコードンにすることが行
われてきた。
に高い。すなわち、アデニン（Ａ）十チミン（Ｔ）ニゲ
アニン（Ｇ）＋シトシン（Ｃ）は、約３０： ７０であ
る。植物遺伝子のＧｃ比はこれよりはるかに低く、約５
０％である。このため、発明のさらなる発展として、耐
性遺伝子のＤＮＡ塩基配列を新規（ｄｅ ｎｏｖｏ）合
成によって最適条件にして、植物のＲＮＡポリメラーゼ
■にょって利用できる好ましいコードンにすることが行
われてきた。
本発明は、ドイツ国特許出願Ｐ ３６２８７４７．４及
びその追加出願Ｐ ３６４２８２９．９に提示された耐
性遺伝子の修飾、すなわち植物において有用なコードン
への改変に関する。対応アミノ酸配列は、添付図面に示
す通りである。本発明のより具体的な態様は、特許請求
の範囲に定義され、また、以下に説明する通りである。
びその追加出願Ｐ ３６４２８２９．９に提示された耐
性遺伝子の修飾、すなわち植物において有用なコードン
への改変に関する。対応アミノ酸配列は、添付図面に示
す通りである。本発明のより具体的な態様は、特許請求
の範囲に定義され、また、以下に説明する通りである。
知られているように、遺伝暗号は縮重する。すなわち、
単一のトリブレットでコードされるアミノ酸は２種類し
かなく、残りの１８のアミノ酸はそれぞれ２ないし６種
類のトリブレットのいずれかによってコードされている
。したがって、゛理論的には、遺伝子合成に際しては、
多様のコードンの組合せが選択され得る。上記した、全
ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドの構成比が影響すること
から、この比を、塩基配列の最適条件を決める基準のひ
とつに用いた。
単一のトリブレットでコードされるアミノ酸は２種類し
かなく、残りの１８のアミノ酸はそれぞれ２ないし６種
類のトリブレットのいずれかによってコードされている
。したがって、゛理論的には、遺伝子合成に際しては、
多様のコードンの組合せが選択され得る。上記した、全
ＤＮＡ配列中の各ヌクレオチドの構成比が影響すること
から、この比を、塩基配列の最適条件を決める基準のひ
とつに用いた。
′次のような修飾を、このように配列させた遺伝子に対
して行った。
して行った。
（１）ストレプトミセス菌類由来の遺伝子の開始コード
ンＧＴＣ； （追加出願塩基配列図中２５８−２６０）
を植物ＲＮＡポリメラーゼ■によって用いられる開始コ
ードンＡＴＧで置き換えた。
ンＧＴＣ； （追加出願塩基配列図中２５８−２６０）
を植物ＲＮＡポリメラーゼ■によって用いられる開始コ
ードンＡＴＧで置き換えた。
（２）遺伝子内部において、ストレプトミセス由来の遺
伝子コードンを植物遺伝子のコードンとして適するよう
に改変した＜ＧｌＣ比の改変）。
伝子コードンを植物遺伝子のコードンとして適するよう
に改変した＜ＧｌＣ比の改変）。
（３）翻訳プロセスを終結させるための終止コードンＴ
ＧＡを配列末端に位置させた。
ＧＡを配列末端に位置させた。
（４）遺伝子配列の先端及び末端部は、制限酵素部位の
突出末端として、遺伝子を伸長したり、該遺伝子配列を
植物調節配列の間に連結（ライゲーション）したりでき
るようにした。
突出末端として、遺伝子を伸長したり、該遺伝子配列を
植物調節配列の間に連結（ライゲーション）したりでき
るようにした。
（５）パリンドローム（回文対構造）配列は最少限に減
らした。
らした。
本発明に係るＤＮＡ配列■（対応アミノ酸配列を併記）
を添付図面第１図に示す。
を添付図面第１図に示す。
遺伝子内部において、３種類の制限酵素に対するそれぞ
れ単一の切断部位（Ｘｂａｌ：塩基番号１５２、Ｂａｍ
ＨＩ：同３１２、ＸｍａＩ：同４３６）が存在するので
、ｐＵｃ１８やｐＵｃ１９等よく研究されたクローニン
グベクターに組み込みが可能な部分配列のサブクローニ
ングが可能である。ざらに、他の多くの制限酵素に対す
るそれぞれ単一の切断部位を有する塩基配列を遺伝子内
に組み込んだ。これによって、一方では、アセチルトラ
ンスフェラーゼの部分配列へのアクセスが提供され、他
方では、必要な修飾が可能になる。制限酵素名及び切断
部位を次表に示す。
れ単一の切断部位（Ｘｂａｌ：塩基番号１５２、Ｂａｍ
ＨＩ：同３１２、ＸｍａＩ：同４３６）が存在するので
、ｐＵｃ１８やｐＵｃ１９等よく研究されたクローニン
グベクターに組み込みが可能な部分配列のサブクローニ
ングが可能である。ざらに、他の多くの制限酵素に対す
るそれぞれ単一の切断部位を有する塩基配列を遺伝子内
に組み込んだ。これによって、一方では、アセチルトラ
ンスフェラーゼの部分配列へのアクセスが提供され、他
方では、必要な修飾が可能になる。制限酵素名及び切断
部位を次表に示す。
制限酵素名 切断部位前の塩基番号ＢｓｐＭｎ
１１ ＳａｃＩＩ ６４ＥｃｏＲＶ
７４ Ｈｐａｌ ８０ ＡａｔＩＩ ９９ＢｓｔＸＩ
１３９ Ａｐａｌ ２３２ ＳｃａＩ ２７２ ＡｖｒＩＩ ３０８Ａｆ ｌ
ｎ ３３６Ｓｔｕ！
３８５ＢｓｓＨＩＩ
４４９ＦｏｋＩ ４８７Ｂ
ｇｌ Ｉ ５３６Ｂｇ ｌ
ＩＩ ５５０化学合成及び酵素
的連結（ライゲーション）反応による部分配列の構築は
、既知の方法（欧州特許出願０，１３３，２８２．０，
１３６，４７２．０，１５５，５９０゜０．１６１，５
０４．０，１６３，２４９．０．１７１，０２４．０．
１７３．１４９又は０．１７７．８２７号明細書）によ
って行う。制限酵素による分析、ＤＮＡフラグメントの
連結及び大腸菌（Ｌ−立１ユ）におけるプラスミドの形
質転換等の詳細は、Ｍａｎｉａｔｉｓによる底置に記載
されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ｍａｎｉａｔｉｓら： Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ、１９８２）。
１１ ＳａｃＩＩ ６４ＥｃｏＲＶ
７４ Ｈｐａｌ ８０ ＡａｔＩＩ ９９ＢｓｔＸＩ
１３９ Ａｐａｌ ２３２ ＳｃａＩ ２７２ ＡｖｒＩＩ ３０８Ａｆ ｌ
ｎ ３３６Ｓｔｕ！
３８５ＢｓｓＨＩＩ
４４９ＦｏｋＩ ４８７Ｂ
ｇｌ Ｉ ５３６Ｂｇ ｌ
ＩＩ ５５０化学合成及び酵素
的連結（ライゲーション）反応による部分配列の構築は
、既知の方法（欧州特許出願０，１３３，２８２．０，
１３６，４７２．０，１５５，５９０゜０．１６１，５
０４．０，１６３，２４９．０．１７１，０２４．０．
１７３．１４９又は０．１７７．８２７号明細書）によ
って行う。制限酵素による分析、ＤＮＡフラグメントの
連結及び大腸菌（Ｌ−立１ユ）におけるプラスミドの形
質転換等の詳細は、Ｍａｎｉａｔｉｓによる底置に記載
されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ｍａｎｉａｔｉｓら： Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ、１９８２）。
このようにして、クローニングされた遺伝子配列は、植
物に導入されて植物の調節遺伝子シグナルの支配下にお
かれ、発現が誘導される。欧州特許出願０，１２２，７
９１号明細書に既知の方法が解説されている。このよう
にして、ＰＴＣ耐性を示す（形質転換細胞を選択する性
質を有する）植物細胞、植物体又は植物体部分及び種子
が得られる。
物に導入されて植物の調節遺伝子シグナルの支配下にお
かれ、発現が誘導される。欧州特許出願０，１２２，７
９１号明細書に既知の方法が解説されている。このよう
にして、ＰＴＣ耐性を示す（形質転換細胞を選択する性
質を有する）植物細胞、植物体又は植物体部分及び種子
が得られる。
本発明の実施態様のいくつかは、次の諸例によって詳細
に説明された通りである。特に記載がない限り、パーセ
ント表示は重量パーセントである。
に説明された通りである。特に記載がない限り、パーセ
ント表示は重量パーセントである。
例
下記の諸例においては、次の培地を用いた。
ａ）細菌用：
ＹＴ培地＝０．５％酵母エキス、０．８％バクトドリブ
トン、０．５％食塩 ＬＢ培地：０．５％酵母エキス、１％バクトドリブトン
、１％食塩 固形培地：上記それぞれの培地に１．５％の寒天を添加 ｂ）植物用： Ｍ＋Ｓ培地： Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ ：
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５
（１９６２） ４７３を参照されたい。
トン、０．５％食塩 ＬＢ培地：０．５％酵母エキス、１％バクトドリブトン
、１％食塩 固形培地：上記それぞれの培地に１．５％の寒天を添加 ｂ）植物用： Ｍ＋Ｓ培地： Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ ：
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５
（１９６２） ４７３を参照されたい。
２ＭＳ培地：２％シュークロースを含むＭ＋Ｓ培地
ＭＳＣＩＯ培地＝２％シュークロース、５００＋ｎｇ／
ｌセフォタクシム、 ０．１ｍｇ／ｌナフチル酢酸 （ＮＡＡ）、１ｍｇ／Ｉベンジルア ミノプリン（ＢＡＰ）、 １００＋ｎｇ／Ｉカナマイシンを含む Ｍ＋Ｓ培地 ＭＳＣ１５培地：２％シュークロース、５００ｍｇ／ｌ
セフォタキシム、 １００ｍｇ／ｌカナマイシンを含む Ｓ＋Ｍ培地 ４個の部分フラグメントＩ−ＩＶの−っであるフラグメ
ント■の合成は、末端オリゴヌクレオチド■ｃ （ＤＮ
Ａ配列Ｉのコード鎖中のヌクレオチド番号２１９−３１
２）から開始した。固相合成のために、オリゴヌクレオ
シド（この場合はヌクレオチド番号３１２のグアノシン
）の３′末端をその３′水酸基を介して支持体に共有結
合させる。
ｌセフォタクシム、 ０．１ｍｇ／ｌナフチル酢酸 （ＮＡＡ）、１ｍｇ／Ｉベンジルア ミノプリン（ＢＡＰ）、 １００＋ｎｇ／Ｉカナマイシンを含む Ｍ＋Ｓ培地 ＭＳＣ１５培地：２％シュークロース、５００ｍｇ／ｌ
セフォタキシム、 １００ｍｇ／ｌカナマイシンを含む Ｓ＋Ｍ培地 ４個の部分フラグメントＩ−ＩＶの−っであるフラグメ
ント■の合成は、末端オリゴヌクレオチド■ｃ （ＤＮ
Ａ配列Ｉのコード鎖中のヌクレオチド番号２１９−３１
２）から開始した。固相合成のために、オリゴヌクレオ
シド（この場合はヌクレオチド番号３１２のグアノシン
）の３′末端をその３′水酸基を介して支持体に共有結
合させる。
このとき、支持体は、長鎖アミノアルキル基を官能基と
して有するＣＰＧ （調整孔ガラス）を用いる。その他
に間しては、合成は、前出の欧州特許出願に記載の既知
の方法に準じて行った。
して有するＣＰＧ （調整孔ガラス）を用いる。その他
に間しては、合成は、前出の欧州特許出願に記載の既知
の方法に準じて行った。
合成の設計は、ＤＮＡ配列■（添付図面第２図）に示し
た通りである。これは、他の点においてはＤＮＡ配列■
（第１図）に対応している。
た通りである。これは、他の点においてはＤＮＡ配列■
（第１図）に対応している。
オリゴヌクレオチドの５′末端を燐酸化するために、オ
リゴヌクレオチドｎｂ及びＩＩｃの各ｌ ｎｍｏｌを、
それぞれ５ｎｍｏｌのアデノシン三燐酸及び４ユニツト
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと２０μｌの緩衝液（
５０ｍＭ）リス−塩酸（１）Ｈ７，６）、１０ｍＭ塩化
マグネシウム及び１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ
）を含む）中で３７℃で３０分間反応させた。その後、
９５℃で５分間加熱して酵素を失活させた。ＤＮＡフラ
グメント■で「突出」配列を形成するオリゴヌクレオチ
ドＩＩａ及びＩｌｄは燐酸化しない。これによって、次
の連結プロセス中においてＤＮＡフラグメント■に相当
するよりも大きいサブフラグメントの形成が妨げられる
。
リゴヌクレオチドｎｂ及びＩＩｃの各ｌ ｎｍｏｌを、
それぞれ５ｎｍｏｌのアデノシン三燐酸及び４ユニツト
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと２０μｌの緩衝液（
５０ｍＭ）リス−塩酸（１）Ｈ７，６）、１０ｍＭ塩化
マグネシウム及び１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ
）を含む）中で３７℃で３０分間反応させた。その後、
９５℃で５分間加熱して酵素を失活させた。ＤＮＡフラ
グメント■で「突出」配列を形成するオリゴヌクレオチ
ドＩＩａ及びＩｌｄは燐酸化しない。これによって、次
の連結プロセス中においてＤＮＡフラグメント■に相当
するよりも大きいサブフラグメントの形成が妨げられる
。
オリゴヌクレオチドＴｌ（ａ−ｄ）を次のようにして連
結して、サブフラグメントＩＩを構成する。
結して、サブフラグメントＩＩを構成する。
まず、オリゴヌクレオチドＩｌａ及び■ｄ、５”末端を
燐酸化したオリゴヌクレオチドｎｂ及びＩｌｃの各１ｎ
ｍｏｌを一緒に４５７１１の緩衝液（５０ｍＭ）リス−
塩１ｉｔ（ｐＨ７，６）、２０ｍＭ塩化マグネシウム、
２５ｍＭ塩化カリウム及び１０ｍＭＤＴＴを含む）に溶
解する。ＤＮＡフラグメント■に対応するオリゴヌクレ
オチドをアニーリングさせるため、オリゴヌクレオチド
溶液を９５℃で２分間加熱の後、緩やかに（２−３時間
かけて）２０℃まで冷却する。次いで、酵素的結合を行
うために、２μｍの０、ＩＭＤＴＴ、８ノ１１の２．５
ｍＭアデノシン三燐酸（ｐＨ７）及び５μｍのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（２０００ユニツト）を加え、この混合溶液
を２２℃で１６時間反応させる。
燐酸化したオリゴヌクレオチドｎｂ及びＩｌｃの各１ｎ
ｍｏｌを一緒に４５７１１の緩衝液（５０ｍＭ）リス−
塩１ｉｔ（ｐＨ７，６）、２０ｍＭ塩化マグネシウム、
２５ｍＭ塩化カリウム及び１０ｍＭＤＴＴを含む）に溶
解する。ＤＮＡフラグメント■に対応するオリゴヌクレ
オチドをアニーリングさせるため、オリゴヌクレオチド
溶液を９５℃で２分間加熱の後、緩やかに（２−３時間
かけて）２０℃まで冷却する。次いで、酵素的結合を行
うために、２μｍの０、ＩＭＤＴＴ、８ノ１１の２．５
ｍＭアデノシン三燐酸（ｐＨ７）及び５μｍのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（２０００ユニツト）を加え、この混合溶液
を２２℃で１６時間反応させる。
遺伝子フラグメント■を、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動くアクリルミド濃度１０％、尿素無添加、ゲルサイ
ズ２０Ｘ４０（？１１、厚さｌｌｌ１ｌｌＩ）によって
精製する。用いるマーカー物質は、Ｈｉ ｎ ｆ Ｉで
切断したφＸ １７４ＤＮＡ （ＢＲＬ社製）又はＨａ
ｅｍで切断したｐＢＲ３２２である。
泳動くアクリルミド濃度１０％、尿素無添加、ゲルサイ
ズ２０Ｘ４０（？１１、厚さｌｌｌ１ｌｌＩ）によって
精製する。用いるマーカー物質は、Ｈｉ ｎ ｆ Ｉで
切断したφＸ １７４ＤＮＡ （ＢＲＬ社製）又はＨａ
ｅｍで切断したｐＢＲ３２２である。
遺伝子フラグメントＪ、■及び■を同様の方法にて調製
するが、連結ステップが不要であるので、「突出」配列
はアニーリングの前に５′燐酸に転換する。
するが、連結ステップが不要であるので、「突出」配列
はアニーリングの前に５′燐酸に転換する。
ａ）ｐＵｃｌＢへの遺伝子フラグメントＩの組み込み
市販のプラスミドｐＵｃ１８を、制限酵素５ａｉｌ及び
Ｘｂａ Ｉを製造者の指示通りに用いて、既知の方法で
開環する。制限酵素反応混合液を１％アガロースゲル電
気泳動にかけて既知の方法で分画し、フラグメントをエ
チジウムブロマイドで染色して可視化する。プラスミド
バンド（約２．６ ｋ ｂ ）を７ガロースゲルから切
り出して、そのアガロースからＤＮＡを電気溶出させる
。
Ｘｂａ Ｉを製造者の指示通りに用いて、既知の方法で
開環する。制限酵素反応混合液を１％アガロースゲル電
気泳動にかけて既知の方法で分画し、フラグメントをエ
チジウムブロマイドで染色して可視化する。プラスミド
バンド（約２．６ ｋ ｂ ）を７ガロースゲルから切
り出して、そのアガロースからＤＮＡを電気溶出させる
。
最後に、Ｘｂａｌ及び５ａｌＩで開環した１８ｇのプラ
スミドと１０ｎ３のＤＮＡフラグメント■とを１６℃で
一晩反応させて連結する。
スミドと１０ｎ３のＤＮＡフラグメント■とを１６℃で
一晩反応させて連結する。
ｂ）ｐＵｃｌＢへの遺伝子フラグメントＩＩの組み込み
ａ）と同様の方法にて、Ｘｂａｌ及び
ＢａｍＨｔを用いて開環したｐＵｃｌＢと遺伝子フラグ
メント■とを連結する。その際、フラグメント■は、例
２で述べたように突出末端を予め燐酸化しておく。
メント■とを連結する。その際、フラグメント■は、例
２で述べたように突出末端を予め燐酸化しておく。
ｃ）ｐＵｃｌＢへの遺伝子フラグメント■の組み込み
ａ）と同様の方法にて、ｐＵｃｌＢを
ＢａｍＨｌ及びＸ ｔｎ ａ ｍを用いて開環して、遺
伝子フラグメント■と連結する。
伝子フラグメント■と連結する。
ｄ）ｐＵｃｌＢへの遺伝子フラグメントＩＶの組み込み
ａ）と同様の方法にて、ｐＵｃｌＢをＸ ｍ ａ Ｉ［
Ｉ及び５ａｌＩを用いて開環して、遺伝子フラグメント
■と連結する。
Ｉ及び５ａｌＩを用いて開環して、遺伝子フラグメント
■と連結する。
ａ）形質転換及び遺伝子フラグメントＩ−ＩＶの複製
このようにして得たハイブリッドプラスミドを用いて大
腸菌を形質転換した。このために、大腸菌に１２株を７
０ｍＭの塩化カルシウム溶液で処理してコンピテント（
ＤＮＡを導入できる状態）にし、ハイブリッドプラスミ
ドの懸濁液（７０ｍＭカルシウムを含む１０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））を加える。常法に従って
、プラスミドの示す抗生物質耐性又は感受性を利用して
形質転換体を選択し、ハイブリッドベクターを複製する
。
腸菌を形質転換した。このために、大腸菌に１２株を７
０ｍＭの塩化カルシウム溶液で処理してコンピテント（
ＤＮＡを導入できる状態）にし、ハイブリッドプラスミ
ドの懸濁液（７０ｍＭカルシウムを含む１０ｍＭ）リス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））を加える。常法に従って
、プラスミドの示す抗生物質耐性又は感受性を利用して
形質転換体を選択し、ハイブリッドベクターを複製する
。
細胞を死滅させた後、ハイブリッドプラスミドを分離し
、最初に用いたものと同じ制限酵素で開環し、遺伝子フ
ラグメントＩ、■、■及び■をゲル電気泳動にて分離す
る。
、最初に用いたものと同じ制限酵素で開環し、遺伝子フ
ラグメントＩ、■、■及び■をゲル電気泳動にて分離す
る。
ｂ）遺伝子フラグメントＩ、■、■及びＩＶの連結によ
る全遺伝子の構築 複製によって得られたサブフラグメント■と■とを次の
ようにして連結する。
る全遺伝子の構築 複製によって得られたサブフラグメント■と■とを次の
ようにして連結する。
分離したフラグメント■及び■の各１１００ｎを１０μ
ｌの緩衝液（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）、２
０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０ｍＭＤＴＴを含む）に
溶解し、この溶液を５７℃で５分間加熱処理する。溶液
を室温にまで戻した後、１μｍの１０ｍＭアデノシン三
燐酸（ｐ Ｈ７）及び１μｍのＴ４リガーゼく４００ユ
ニツト）を加え、室温で１６時間反応させる。制限酵素
５ａｌＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断後、所望の３１２
塩基対フラグメント（ヌクレオチド番号１−３１２、Ｓ
ａｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメント）を８％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にて分離精製する。
ｌの緩衝液（５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，６）、２
０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０ｍＭＤＴＴを含む）に
溶解し、この溶液を５７℃で５分間加熱処理する。溶液
を室温にまで戻した後、１μｍの１０ｍＭアデノシン三
燐酸（ｐ Ｈ７）及び１μｍのＴ４リガーゼく４００ユ
ニツト）を加え、室温で１６時間反応させる。制限酵素
５ａｌＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断後、所望の３１２
塩基対フラグメント（ヌクレオチド番号１−３１２、Ｓ
ａｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメント）を８％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にて分離精製する。
ゲル電気泳動に用いるマーカー物質は、制限酵素Ｈａｅ
ｍにて切断したφＸ １７４ＲＦＤＮＡ（ＢＲＬ社製）
である。
ｍにて切断したφＸ １７４ＲＦＤＮＡ（ＢＲＬ社製）
である。
遺伝子フラグメントＩＩＩと■とを同様の方法にて連結
し、精製をして２４６塩基対のフラグメント（ヌクレオ
チド番号３１３−５５８、ＢａｍＨＩ−５ａ ｌ ｌフ
ラグメント）を得ろ、ゲル電気泳動に用いるマーカーは
、制限酵素ＭｓｐＩで切断したｐＢＲ３２２である。
し、精製をして２４６塩基対のフラグメント（ヌクレオ
チド番号３１３−５５８、ＢａｍＨＩ−５ａ ｌ ｌフ
ラグメント）を得ろ、ゲル電気泳動に用いるマーカーは
、制限酵素ＭｓｐＩで切断したｐＢＲ３２２である。
全遺伝子（ＤＮＡ配列配列相構築するために、１５ｎｇ
の３１２塩基対フラグメント及び１２ｎ８の２４６塩基
対フラグメントを、前記のようにして１Ｔｇの市販のプ
ラスミドｐＵｃ１８と連結させる。
の３１２塩基対フラグメント及び１２ｎ８の２４６塩基
対フラグメントを、前記のようにして１Ｔｇの市販のプ
ラスミドｐＵｃ１８と連結させる。
その際、ｐＵｃｌＢは、制限酵５ａｌＩにて予め開環し
、末端を酵素的に脱燐酸しておく。例４ａ）と同様の方
法にて形質転換及び複製を行った後、ＤＮＡ配列配列相
当する５５８塩基対フラグメントを有する目的のクロー
ンを５ａｌＩ消化によって確認する。
、末端を酵素的に脱燐酸しておく。例４ａ）と同様の方
法にて形質転換及び複製を行った後、ＤＮＡ配列配列相
当する５５８塩基対フラグメントを有する目的のクロー
ンを５ａｌＩ消化によって確認する。
１ ハ １１１隻 ′ −々 −ヅコンビ
テントにした大腸菌をＤＮＡ配列配列相むハイブリッド
プラスミド０．１−１Ｔｇにて形質転換し、アンピシリ
ンを含む寒天平板に塗布する。
テントにした大腸菌をＤＮＡ配列配列相むハイブリッド
プラスミド０．１−１Ｔｇにて形質転換し、アンピシリ
ンを含む寒天平板に塗布する。
このようにして、プラスミドに正しく組み込まれた塩基
配列を有するクローンを、迅速ＤＮＡ分析法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ：前出）を用いて確認することができる。
配列を有するクローンを、迅速ＤＮＡ分析法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ ：前出）を用いて確認することができる。
末端に５ａｌｌ切断部位を設けておいた最適条件にした
耐性遺伝子とプラスミドｐ−ＤＨ５１（Ｐｉｅｔｒｚａ
ｋら： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１４ （１９８６）５８５７）のポリリンカー配列とを
、５ａｌＩ切断部位で連結した。このプラスミドは、植
物の転写機構によって認識される、カリフラワーモザイ
クウィルス由来の３５５転写のプロモーター及びターミ
ネータ−を含んでいる。この連結によって、耐性遺伝子
を、３５５転写のプロモーターの下流であってターミネ
ータ−の上流である位置に挿入した。この遺伝子の正確
な位置を制限酵素分析によって確認した。
耐性遺伝子とプラスミドｐ−ＤＨ５１（Ｐｉｅｔｒｚａ
ｋら： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１４ （１９８６）５８５７）のポリリンカー配列とを
、５ａｌＩ切断部位で連結した。このプラスミドは、植
物の転写機構によって認識される、カリフラワーモザイ
クウィルス由来の３５５転写のプロモーター及びターミ
ネータ−を含んでいる。この連結によって、耐性遺伝子
を、３５５転写のプロモーターの下流であってターミネ
ータ−の上流である位置に挿入した。この遺伝子の正確
な位置を制限酵素分析によって確認した。
同様の方法にて、ソラナム・ツベロサム（）からの５Ｔ
−ＬＳ Ｉ遺伝子 のプロモーター（Ｅｃｋｅｓら： Ｍｏ１． Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ。
−ＬＳ Ｉ遺伝子 のプロモーター（Ｅｃｋｅｓら： Ｍｏ１． Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｔ。
２０５ （１９８６） １４）を、最適条件にしたアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子の植物における発現に用
いた。
チルトランスフェラーゼ遺伝子の植物における発現に用
いた。
ａ）同時取り込み法
プロモーター、最適条件にした耐性遺伝子及びターミネ
ータ−を含む全転写ユニット（例６）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し、中間大腸菌ベクター ｐＭＰ Ｋ １１
０ （Ｐｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ： １３４士論文、ＬＪ
ｎｉｖ、 Ｃｏｌｏｇｎｅ （１９８５）、ｐ９１以降
参照）のＥｃｏＲ［切断部位に連結した。この中間ベク
ターは、耐性遺伝子をその調節配列とともにアグロバク
テリウム・ツメファシェンスのＴｉ（ティー・アイ）プ
ラスミドに移動させるのに必要であった。この、いわゆ
る接合は、Ｖａｎ Ｈａｕｔｅらの記載している方法に
て行った（ＥＭＢＯＪ、 ２ （１９８３） ４１１）
。
ータ−を含む全転写ユニット（例６）を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し、中間大腸菌ベクター ｐＭＰ Ｋ １１
０ （Ｐｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ： １３４士論文、ＬＪ
ｎｉｖ、 Ｃｏｌｏｇｎｅ （１９８５）、ｐ９１以降
参照）のＥｃｏＲ［切断部位に連結した。この中間ベク
ターは、耐性遺伝子をその調節配列とともにアグロバク
テリウム・ツメファシェンスのＴｉ（ティー・アイ）プ
ラスミドに移動させるのに必要であった。この、いわゆ
る接合は、Ｖａｎ Ｈａｕｔｅらの記載している方法に
て行った（ＥＭＢＯＪ、 ２ （１９８３） ４１１）
。
これによって、遺伝子を、ｐＭＰＫ１１０ベクター及び
ＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０ｋａｎＲ（Ｊｏｎｅｓら
： ＥＭＢＯＪ、 ４ （＋９８５） ２４１＋）に存
在する標準ベクターｐＢＲ３２２の塩基配列を介しての
相同組換えによって、調節シグナルとともにＴｉプラス
ミドに組み込んだ。
ＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０ｋａｎＲ（Ｊｏｎｅｓら
： ＥＭＢＯＪ、 ４ （＋９８５） ２４１＋）に存
在する標準ベクターｐＢＲ３２２の塩基配列を介しての
相同組換えによって、調節シグナルとともにＴｉプラス
ミドに組み込んだ。
この目的のため、大腸菌ＤＨＩ（ｐＭＰＫ１１０誘導体
の宿主株）及びＧＪ２３（Ｖａｎｌｌａｕｔｅら：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４ （１
９８６） ５８５７）の新鮮培養液各５０μｍを、乾燥
させたＹＴ−寒天平板上で混合し、３７℃で１時間培養
した。得られた′Ｓ菌を３ｍｌの１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウムに再懸濁させて、抗生物質を含む寒天平板（スベク
チノマイシン５０ μｇ／ｍｌ ： ｐＭＰ Ｋ １１
０を選択、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＭＲ６４ｄｒ
ｄ １１を選択、カナマイシン５０μ３／ｍｌ： Ｉ）
ＧＪ ２８を選択）に塗布する。選択寒天平板で増殖す
る細菌は３種類のプラスミドを有するものであって、ア
グロバクテリウム・ツメファシェンスと接合させるため
にＹＴ液体培地中で３７℃で増殖させた。アグロバクテ
リウムをＬＢ培地中で２８℃で培養した。細菌懸濁液各
５０μｍを乾燥させたＹＴ−寒天平板上で混合し、２８
℃で１２−１６時間培養した。得られた細菌を３ｍｌの
１０ｍＭ硫酸マグネシウムに再懸濁させて、抗生物質を
含む寒天平板（エリスロマイシン０．０５ｇ／Ｉ、クロ
ラムフェニコール０．０２５３／Ｉ：アグロバクテリウ
ム菌株選択、ストレプトマイシン０．０３３／Ｉ及びス
ペクチノマイシン０．１ｇ／Ｍ ｐＭＰＫ １１０のＴ
ｉプラスミドへの組人の選択〉に塗布した。相同接合に
よって細菌Ｔｉプラスミドにｌ）ＭＰ Ｉ（１１０を組
み込んだアゲロバクチリアのみが、これらの選択平板培
地で増殖できる。
の宿主株）及びＧＪ２３（Ｖａｎｌｌａｕｔｅら：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４ （１
９８６） ５８５７）の新鮮培養液各５０μｍを、乾燥
させたＹＴ−寒天平板上で混合し、３７℃で１時間培養
した。得られた′Ｓ菌を３ｍｌの１０ｍＭ硫酸マグネシ
ウムに再懸濁させて、抗生物質を含む寒天平板（スベク
チノマイシン５０ μｇ／ｍｌ ： ｐＭＰ Ｋ １１
０を選択、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＭＲ６４ｄｒ
ｄ １１を選択、カナマイシン５０μ３／ｍｌ： Ｉ）
ＧＪ ２８を選択）に塗布する。選択寒天平板で増殖す
る細菌は３種類のプラスミドを有するものであって、ア
グロバクテリウム・ツメファシェンスと接合させるため
にＹＴ液体培地中で３７℃で増殖させた。アグロバクテ
リウムをＬＢ培地中で２８℃で培養した。細菌懸濁液各
５０μｍを乾燥させたＹＴ−寒天平板上で混合し、２８
℃で１２−１６時間培養した。得られた細菌を３ｍｌの
１０ｍＭ硫酸マグネシウムに再懸濁させて、抗生物質を
含む寒天平板（エリスロマイシン０．０５ｇ／Ｉ、クロ
ラムフェニコール０．０２５３／Ｉ：アグロバクテリウ
ム菌株選択、ストレプトマイシン０．０３３／Ｉ及びス
ペクチノマイシン０．１ｇ／Ｍ ｐＭＰＫ １１０のＴ
ｉプラスミドへの組人の選択〉に塗布した。相同接合に
よって細菌Ｔｉプラスミドにｌ）ＭＰ Ｉ（１１０を組
み込んだアゲロバクチリアのみが、これらの選択平板培
地で増殖できる。
ここにおいて、植物において活性であり、最初から存在
していた抗生物質カナマイシンに対する耐性遺伝子の他
に、ＰＴＣ耐性遺伝子がＴｉプラスミドｐ Ｇ Ｖ ３
８６０ ｋ ａ ｎ Ｒ上に組み込まれた。
していた抗生物質カナマイシンに対する耐性遺伝子の他
に、ＰＴＣ耐性遺伝子がＴｉプラスミドｐ Ｇ Ｖ ３
８６０ ｋ ａ ｎ Ｒ上に組み込まれた。
これらのアグロバクテリウムのクローンを形質転換に用
いる前に、所望の組み込みが行われたかどうかをサザー
ンプロット法で確認した。
いる前に、所望の組み込みが行われたかどうかをサザー
ンプロット法で確認した。
ｂ）バイナリ−ベクター法
Ｋｏｎｃｚら （Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
２０４ （１９８６） ３８３）の記載しているバイナ
リ−ベクターシステムを用いた。Ｋｏｎｃｚらの記載し
ているベクターｐＰＣＶ７０１ （ＰＮＡＳ ８４ （
１９８７） ！３１）を次のように改変した。とくにＴ
ＲＩ及びＴＲ２プロモーターを含むフラグメントをベク
ターから取り除くために、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄｍを用いた。得られたプラスミドを再び環状にし
た。このベクターのＥｃｏＲＩ切断部位に、ベクターｐ
ＤＨ５１からのフラグメントを挿入した。このｐＤＨ５
１ベクターは、約８００塩基対の長さで、カリフラワー
モザイクウィルス由来の３５Ｓ転写のプロモーター及び
ターミネータ−を含んでいる（ ｐｉｅｔｒｚａｋら：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４
（１９８６）５８５８）。得られたプラスミドｐＰｃＶ
８０１は、３５Ｓプロモーターとターミネータ−との間
に唯１個の５ａｌｌ切断部位を有する。最適条件にした
ＰＴＣ耐性遺伝子をこの切断部位に挿入した。
２０４ （１９８６） ３８３）の記載しているバイナ
リ−ベクターシステムを用いた。Ｋｏｎｃｚらの記載し
ているベクターｐＰＣＶ７０１ （ＰＮＡＳ ８４ （
１９８７） ！３１）を次のように改変した。とくにＴ
ＲＩ及びＴＲ２プロモーターを含むフラグメントをベク
ターから取り除くために、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉ
ｎｄｍを用いた。得られたプラスミドを再び環状にし
た。このベクターのＥｃｏＲＩ切断部位に、ベクターｐ
ＤＨ５１からのフラグメントを挿入した。このｐＤＨ５
１ベクターは、約８００塩基対の長さで、カリフラワー
モザイクウィルス由来の３５Ｓ転写のプロモーター及び
ターミネータ−を含んでいる（ ｐｉｅｔｒｚａｋら：
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４
（１９８６）５８５８）。得られたプラスミドｐＰｃＶ
８０１は、３５Ｓプロモーターとターミネータ−との間
に唯１個の５ａｌｌ切断部位を有する。最適条件にした
ＰＴＣ耐性遺伝子をこの切断部位に挿入した。
ここにおいて、遺伝子の発現は３５Ｓ転写調節配列の制
徘下に置かれた。
徘下に置かれた。
このプラスミド（１） Ｐ ＣＶ ８０１ Ａ ｃ ）
で大腸ａ Ｓ Ｍ １０ （Ｓｉｍｏｎら： Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌ （１９８３）７８４）
を形質転換させた。プラスミドｐＰＣＶ８０１Ａｃをア
グロバクテリウム・ツメファシェンスに移入するために
、各５０μ！の５Ｍｌ０培養液及びＣ５８アグロバクテ
リウム培養液（Ｃ；Ｖ３１０１、〜’ａｎ Ｌａｒｅｂ
ｅｋｅら： Ｎａｔｕｒｅ ２５２（１９７４） １
６９）をヘルパープラスミドとしてのＴ１プラスミドｐ
Ｍ Ｐ ９０ ＲＫ （Ｋｏｎｃｚら： Ｍｏ１．
Ｇｅｎ。
で大腸ａ Ｓ Ｍ １０ （Ｓｉｍｏｎら： Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌ （１９８３）７８４）
を形質転換させた。プラスミドｐＰＣＶ８０１Ａｃをア
グロバクテリウム・ツメファシェンスに移入するために
、各５０μ！の５Ｍｌ０培養液及びＣ５８アグロバクテ
リウム培養液（Ｃ；Ｖ３１０１、〜’ａｎ Ｌａｒｅｂ
ｅｋｅら： Ｎａｔｕｒｅ ２５２（１９７４） １
６９）をヘルパープラスミドとしてのＴ１プラスミドｐ
Ｍ Ｐ ９０ ＲＫ （Ｋｏｎｃｚら： Ｍｏ１．
Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、 ２０４ （＋９８６） ３８３）ととも
に、乾燥させたＹＴ寒天平板上で混合し、２８°Ｃで約
１６時間培養した。得られた細菌を３ｍｌの１ｍＭ硫酸
マグネシウムに再懸濁させ、これを抗生物質寒天子Ｆｉ
、（リファンピシン０．１ｇ／ｌ：Ｃ；Ｖ３１０１を選
択、カナマイシン０．０２５ｇ／Ｉ： ｐＭＰ９０ＲＫ
を選択、カルベニシリン０．１ｇ／Ｍ ｐＰｃＶ８０１
Ａｃを選択）上に塗布した。両プラスミド（１） Ｍ
Ｐ９０ＲＫ及びｐ Ｐ ＣＶ ８０１ Ａ ｃ ）を含
むアゲロバクチリアのみがこの平板上で増殖することが
できる。これらのアゲロバクチリアを植物の形質転換に
用いる前に、プラスミドｐ Ｐ ＣＶ ８０１ Ａ ｃ
が間違いなくアゲロバクチリア内に存在しているかどう
かを、サザーンプロット法によって確認した。
に、乾燥させたＹＴ寒天平板上で混合し、２８°Ｃで約
１６時間培養した。得られた細菌を３ｍｌの１ｍＭ硫酸
マグネシウムに再懸濁させ、これを抗生物質寒天子Ｆｉ
、（リファンピシン０．１ｇ／ｌ：Ｃ；Ｖ３１０１を選
択、カナマイシン０．０２５ｇ／Ｉ： ｐＭＰ９０ＲＫ
を選択、カルベニシリン０．１ｇ／Ｍ ｐＰｃＶ８０１
Ａｃを選択）上に塗布した。両プラスミド（１） Ｍ
Ｐ９０ＲＫ及びｐ Ｐ ＣＶ ８０１ Ａ ｃ ）を含
むアゲロバクチリアのみがこの平板上で増殖することが
できる。これらのアゲロバクチリアを植物の形質転換に
用いる前に、プラスミドｐ Ｐ ＣＶ ８０１ Ａ ｃ
が間違いなくアゲロバクチリア内に存在しているかどう
かを、サザーンプロット法によって確認した。
最適条件にした耐性遺伝子を、いわゆる、リーフディス
ク形質転換法によってタバコ植物に移入した。
ク形質転換法によってタバコ植物に移入した。
アゲロバクチリアを適当な抗生物質を含むＬＢ培地３０
ｍ１中で約２８℃で継続振とうしながら培養したく約５
日間）。得られた細菌をクリスト遠心分離器による７０
００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって沈澱させ、２
０ｍ１の１０ｍＭ硫酸マグネシウムで１回洗浄した。さ
らに遠心分離した後、得られた！Ｉ苗を２０ｍ１の１０
ｍＭ硫酸マグネシウムに懸濁させてペトリ皿に移した。
ｍ１中で約２８℃で継続振とうしながら培養したく約５
日間）。得られた細菌をクリスト遠心分離器による７０
００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって沈澱させ、２
０ｍ１の１０ｍＭ硫酸マグネシウムで１回洗浄した。さ
らに遠心分離した後、得られた！Ｉ苗を２０ｍ１の１０
ｍＭ硫酸マグネシウムに懸濁させてペトリ皿に移した。
２ＭＳ培地で無菌培養したライスコンシン３８タバコ植
物の葉をリーフディスク感染に用いた。全ての無菌培養
は、２５−２７℃で、１６時間明培養／８時間暗培養の
サイクルで、明培養は白色光の下で行った。
物の葉をリーフディスク感染に用いた。全ての無菌培養
は、２５−２７℃で、１６時間明培養／８時間暗培養の
サイクルで、明培養は白色光の下で行った。
タバコ葉を切り取り、葉の表面をサンドペーパーにて傷
つけ、これを小片に切り刻んで細菌培養）？ｋに浸した
。次いで、葉小片をＭ＋Ｓ培地に移し、通常の培養条件
で２日間維持した。２日間の細菌感染の後、葉小片をＭ
＋Ｓ液体培地で洗浄し、ＭＳＣＩＯ寒天平板に移した。
つけ、これを小片に切り刻んで細菌培養）？ｋに浸した
。次いで、葉小片をＭ＋Ｓ培地に移し、通常の培養条件
で２日間維持した。２日間の細菌感染の後、葉小片をＭ
＋Ｓ液体培地で洗浄し、ＭＳＣＩＯ寒天平板に移した。
形質転換した芽を、共に移入されたカナマイシン耐性を
マーカーとして選択した。３−６週間の後、最初の芽が
肉眼で見えるようになった。個々の芽を、ざらにガラス
容器中でＭＳＣ１５培地で培養した。数週間の後、切断
をしておいたいくつかの芽の切断部位から根が生じた。
マーカーとして選択した。３−６週間の後、最初の芽が
肉眼で見えるようになった。個々の芽を、ざらにガラス
容器中でＭＳＣ１５培地で培養した。数週間の後、切断
をしておいたいくつかの芽の切断部位から根が生じた。
形質転換植物は、ＰＴＣを含む植物培地から直接に選択
することも可能であった。ＰＴＣ耐性遺伝子の存在とそ
の発現を、形質転換植物のＤＮＡ分析（サザーンプロッ
ト法）及びＲＮＡ分析（ノーザンブロット法）によって
確認した。
することも可能であった。ＰＴＣ耐性遺伝子の存在とそ
の発現を、形質転換植物のＤＮＡ分析（サザーンプロッ
ト法）及びＲＮＡ分析（ノーザンブロット法）によって
確認した。
１ 乏′ 吉 、−「
形質転換植物の耐性遺伝子の機能を調べるため、形質転
換植物及び非形質転換植物からの葉片を０．１ｍＭＬ−
ＰＴＣを含むＭ＋Ｓ栄養培地に入れた。
換植物及び非形質転換植物からの葉片を０．１ｍＭＬ−
ＰＴＣを含むＭ＋Ｓ栄養培地に入れた。
非転換植物からの葉片は死滅したが、形質転換植物から
の葉片は発芽した。形質転換植物からの葉からは根が生
じ、１ｍＭＬ−ＰＴＣを含むＭ＋Ｓ栄養培地上で容易に
生長した。形質転換した植物を無菌状態から土壌に移植
し、そこで２ ｋ３／ｈａ及び −５ｋｇ／ｈａＯＰＴ
Ｃ噴霧を行った。非転換植物は、この除草剤処理では生
存できなかったが、形質転換植物ではこの除草剤による
影響が認められなかった。噴霧処理した形質転換植物の
生長状態は、噴霧処理をしない対照植物にも劣らなかっ
た。
の葉片は発芽した。形質転換植物からの葉からは根が生
じ、１ｍＭＬ−ＰＴＣを含むＭ＋Ｓ栄養培地上で容易に
生長した。形質転換した植物を無菌状態から土壌に移植
し、そこで２ ｋ３／ｈａ及び −５ｋｇ／ｈａＯＰＴ
Ｃ噴霧を行った。非転換植物は、この除草剤処理では生
存できなかったが、形質転換植物ではこの除草剤による
影響が認められなかった。噴霧処理した形質転換植物の
生長状態は、噴霧処理をしない対照植物にも劣らなかっ
た。
形質変換させたＰＣＴ耐性タバコ植物又は非転換タバコ
植物から採った葉組織約１００ｍｇを緩衝液（５０ｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、２ｍＭＥ Ｄ Ｔ Ａ、
０ 、１ ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０ 、３ ｍ
ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．３ｍ３／ｍｌ ＤＴ
Ｔ、０ 、１５ ｍｇ／ｍｌフェニールメチルスルフォ
ニル・フルオライド（ＰＭＳＦ））中で均質化した。
植物から採った葉組織約１００ｍｇを緩衝液（５０ｍＭ
）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、２ｍＭＥ Ｄ Ｔ Ａ、
０ 、１ ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０ 、３ ｍ
ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．３ｍ３／ｍｌ ＤＴ
Ｔ、０ 、１５ ｍｇ／ｍｌフェニールメチルスルフォ
ニル・フルオライド（ＰＭＳＦ））中で均質化した。
遠心分離の後、得られた上澄液の２０μｍを１μｌの放
射線ラベルした１ ０ｍＭ Ｄ、Ｌ−ＰＴＣ及び１μｌ
の１０Ｏｎ＋ＭアセチルーＣｏＡとともに３７℃で２０
分間反応させた。その後、２５μｍの１２％トリクロル
酢酸を反応液に加え、遠心分離した。得られた上澄液の
７１１１を薄層クロマトグラフィープレートに移し、ピ
リジン／ｎ−ブタノール／酢酸／水の混液（容量比で５
０： ７５：１５：６０）中で２同上ｒ１．展開を行ツ
タ。ＰＴＣとアセチルＰＴＣとをこのようにして単離し
て、オートラジオグラフィーで確認した。非形質変換植
物においてはＰＴＣのアセチルＰＴＣへの転化は見られ
なかったが、形質変換させた耐性植物においてはこの転
化が可能であった。
射線ラベルした１ ０ｍＭ Ｄ、Ｌ−ＰＴＣ及び１μｌ
の１０Ｏｎ＋ＭアセチルーＣｏＡとともに３７℃で２０
分間反応させた。その後、２５μｍの１２％トリクロル
酢酸を反応液に加え、遠心分離した。得られた上澄液の
７１１１を薄層クロマトグラフィープレートに移し、ピ
リジン／ｎ−ブタノール／酢酸／水の混液（容量比で５
０： ７５：１５：６０）中で２同上ｒ１．展開を行ツ
タ。ＰＴＣとアセチルＰＴＣとをこのようにして単離し
て、オートラジオグラフィーで確認した。非形質変換植
物においてはＰＴＣのアセチルＰＴＣへの転化は見られ
なかったが、形質変換させた耐性植物においてはこの転
化が可能であった。
第１図は、本発明の遺伝子のＤＮＡ配列及びそれに対応
するアミノ酸配列を示す、アミノ酸及びＤＮＡ配列Ｉ、
の説明図である。 第２図は、第１図の本発明の遺伝子のＤＮＡ配列及びそ
れに対応するアミノ酸配列を示し、かつ、該ＤＮＡ配列
の構築の設計をサブフラグメント名を表示して説明する
、アミノ酸及びＤＮＡ配列■、の説明図である。 出皿人代理人 佐芸−Ｇ１ 図面の浄書（内容に変 泌０ 図 Ｏ０ １６事件の表示 昭和６３年特許願第１１８５１号 ２、発明の名称 植物において活性であるフォスフイノトリシン耐性遺伝
子及びその使用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 へＡ又ト、アクチェンゲゼルシャフト ４、代 理 人（郵便番号１００） 昭和６３年３月３１日 （発送日 昭和６３年４月２６日） ６、補正の対象
するアミノ酸配列を示す、アミノ酸及びＤＮＡ配列Ｉ、
の説明図である。 第２図は、第１図の本発明の遺伝子のＤＮＡ配列及びそ
れに対応するアミノ酸配列を示し、かつ、該ＤＮＡ配列
の構築の設計をサブフラグメント名を表示して説明する
、アミノ酸及びＤＮＡ配列■、の説明図である。 出皿人代理人 佐芸−Ｇ１ 図面の浄書（内容に変 泌０ 図 Ｏ０ １６事件の表示 昭和６３年特許願第１１８５１号 ２、発明の名称 植物において活性であるフォスフイノトリシン耐性遺伝
子及びその使用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 へＡ又ト、アクチェンゲゼルシャフト ４、代 理 人（郵便番号１００） 昭和６３年３月３１日 （発送日 昭和６３年４月２６日） ６、補正の対象
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、第１図に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコ
ードし、コードンを植物において活性であるコードンに
改変した、耐性遺伝子。 ２、第１図に示すＤＮＡ塩基配列 I （ヌクレオチド番
号９−５５４）を含む、請求項１に記載の耐性遺伝子。 ３、植物において活性である調節及び発現シグナルと連
結させた、第１図に示すＤＮＡ塩基配列を有する遺伝子
構造。 ４、請求項１又は２に記載の耐性遺伝子を含むベクター
。 ５、請求項３に記載の遺伝子構造を含むベクター。 ６、第２図に示す遺伝子フラグメント I からIVの１個
以上を含むベクター。 ７、請求項４、５又は６に記載のベクターを含む宿主細
胞。 ８、請求項１、２又は３に記載の遺伝子を含む植物細胞
。 ９、請求項１、２又は３に記載の遺伝子を含む、植物体
、植物体部分又は種子。 １０、フォスフィノトリシン耐性の植物細胞、植物体部
分、植物体及び種子を産生させるための、請求項１又は
２に記載の遺伝子又は請求項３に記載の遺伝子構造の使
用。
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