DK175809B1

DK175809B1 - Fibronectinbindende protein

Info

Publication number: DK175809B1
Application number: DK198902442A
Authority: DK
Inventors: Magnus Hoeoek; Martin Kjell Lindberg; Lars Christer Signaes; Per-Eric Lindgren
Original assignee: Alfa Laval Agri Internat Aktie
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 2005-03-07
Also published as: JPH0284182A; JP2809428B2; FI892408L; FI892408A0; US6086895A; EP0343137A1; FI103049B; NO179412C; DE68929430D1; US5866541A; EP0343137B1; AU628339B2; DK244289D0; SE8801894D0; DE68929430T2; CA1340910C; AU3498189A; NZ229206A; ATE226634T1; DK244289A

Description

DK 175809 B1 I

Den foreliggende opfindelse angår fibronectinbindende I

proteiner og hybrid-DNA-molekyler, f.eks. plasmider eller fager, som indeholder mindst én nucleotidsekvens, der koder for proteinerne. Opfindelsen angår,endvidere 5 mikroorganismer, der indeholder sådanne molekyler, og deres anvendelse til fremstilling af proteinerne, samt den syntetiske fremstilling af proteinerne.

•Formålet med den foreliggende opfindelse er at opnå mi-10 nimale fibronectinbindende proteiner.

Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at opnå proteinerne ved hjælp af gensplejsningsmetoder under anvendelse af f.eks. et plasmid, som indeholder 15 en nucleotidsekvens, der koder for proteinerne.

Et yderligere formål, med den foreliggende opfindelse er at opnå en mulighed for at fremstille proteinerne ved hjælp af kemisk syntese.

20 I WO-A1-85/05553 omtales bakteriecelleoverfladeproteiner med fibronectin-, fibrinogen-, collagen- og/eller lamininbindende evne. Det vises derved, at forskellige bakterier har evnen til at bindes til fibronectin, fi-25 brinogen, collagen og/eller laminin. Det vises endvidere, at fibronectinbindende protein fra Staphyloc-cocus aureus har en molekylevægt på 165 kD og/eller 87 kD, hvorved det er sandsynligt, at det mindre protein I er en del af det større.

Fibronectin er et stort glycoprotein med en molekyle-vægt på ca 450 kD og med to underenheder, som ligner hinanden, og som kan have varierende molekylestørrelser afhængig af et komplekst splejsningsmønster af forsta-35 die mRNA. Proteinet er til stede i basalmembraner og bindevæv, men også i en opløselig form i forskellige DK 175809 B1

Η I

H legemsvæsker, såsom blodblasma (1). Efter Kuuselas op- I

H rindelige iagttagelse i 1978, at S. aureus bindes til I

H fibronectin (2), er det blevet vist, at visse stammer I

og andre patogene bakterier, såsom streptokokker af I

5 forskellige serologiske typer (3), E. coli (4) og Sal- I

H monella (5) kan bindes til dette protein (6). I

Adhæsion af patogene bakterier til overflader er i dag I

et almindeligt anerkendt koncept ved diskussionen af I

. 10 sårpatogener, som anvender overfladereceptorer til at I

bindes til forskellige proteiner på epitelcelleoverfla- I

der, i bindevævsmatriks og i sårskorper, såsom f.eks I

fibronectin, fibrinogen, collagen og laminin. Proble- I

met er, at disse receptorer er til stede i forholdsvis I

15 små mængder på bakteriecelleoverfladen, og at de er I

vanskelige at frigøre. En mulig måde i tilfælde, hvor I

I receptoren består af proteiner, er at klone generne for I

I de pågældende receptorer for at være i stand til at I

I fremstille dem i mængder, som gør det væsentligt let- I

20 tere at undersøge infektioner og infektionsforløbet så- I

vel som profylaktisk og terapeutisk behandling af in- I

fektioner fremkaldt af sårpatogener. I

Screeningsundersøgelse af forskellige serologiske grup- I

25 per af streptokokker, såsom A, C og G, ifølge Lance- I

field (3) har vist, at de undersøgte stammer kan bindes I

I til forskellige bindevævsproteiner, såsom fibronectin, I

fibrinogen, collagen og laminin samt forskellige immu- I

I noglobuliner (7,8) i en varierende grad og med forskel- I

I 30 lig specificitet. I

I For yderligere at karakterisere fibronectinbindende I

I proteiner fra streptokokker, er specielle gener fra I

I Streptococcus dysgalactiae for sådanne proteiner blevet I

I 35 klonet i E. coli. De fibronectinbindende domæner i I

disse proteiner er også blevet lokaliseret og egenska- I

Γ ‘ I

ber samt funktioner ax proleiueiTii, ser. indeholder dis-

se.domæner, vil blive diskuteret nedenfor. I

\ I

Det har nu overraskende vist sig muligt at opnå hybrid- I

5 DNA-molekyler, som omfatter nucleotidsekvenser for de I

gener, der koder for proteiner eller polypeptider med I

fibronectinbindende egenskaber. Som det fremgår neden- I

for, er følgende nucleotidsekvenser til stede i plasmi- I

derne pSDF102 henholdsvis pSDF203, som koder for prote- I

10 inerne. I

CTA GAT ACC TCA G AA AAC AAA AAA TCT GTA ACT G AA AAA GTA I

IATA ACT AGC GAT GTT AAA TAT AAG ATT AAT GAT AAA GAA GTG I

AAA GGT AAA GAA CTA GAC GAT GTC TCT TTA ACT TAC AGT AAA I

15 GAA ACC GTT CGT AAG CCA CAG GTQ GAA CCA AAT GTT CCT GAT I

ACA CCT CAG GAA AAA CCA TTG ACA CCG CTT GCA CCG TCA GAA I

CCT TCA CAA CCA TCT ATT CCA GAG ACA CCA CTG ATA CCG TCA I

GAA CCT TCA GTT CCA GAG ACA TCA ACA CCA GAA GGT CCA ACA I

GAG GGA GAA AAT AAT CTT GGT GGT CAG AGT GAA GAG ATA ACG I

20 ATT ACA GAA GAT TCT CAA TCA GGG ATG TCT GGT C AA AAT CCT I

GGT TCT GGA AAT GAA ACA GTG GTT

GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT

CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT

25 ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA

GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC

GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT

GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT

30 GAA

GAA GAC TCT AAA CCA AGT -CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC

GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC

GGT ATG TCT GGG

H DK 175809 B1

H GCT GGA CAA GTA GAG AGT CCA ACA ACT ACC GAA GAA ACC CAT

H AAA CCA GAA ATA ATC ATG GGC GGT CAA AGT GAC CCT ATT GAT

ATG GTT GAG GAC ACT CTT CCT GGT ATG TCT GGC TCT AAT GAA

H GCT ACT GTT GTG GAA GAA GAC ACA CGT CCT AAA CTT CAA TTC

H 5 CAT TTT GAT AAT GAA GAG CCC GTT CCT GCA ACG GTT CCA ACC

GTT TCT CAA ACT CCT ATT GCT CAG GTA GAA AGT AAA GTG CCT

CAT GCC AAA GCA GAG AGT GCG TTA CCT CAA ACT GGA GAT ACA

AAT AAA CTA GAA ACG TTC TTT ACC ATT ACA GCA CTA ACT GTT

ATT GGA GCG GCA GGA TTA CTA GGC AAA AAA CGT CGT AAT AAT

10 CAA ACT GAT TAA TCA GCA GAT TTC ATC AAA CGC TAT AAA CAA

GGC TAA CAT TTT AGC CTT GTT TTA TAT TGT TTC ACT GAC CTC

H TAA AAG TTA TGA CTG TTT TAA AGG GGG GGT AGG CCA ATC CTC

AAA AGT AGT TAA GTT GAG AAA CAC CAC ATC ACT TTA GTC TTA

CTG CGC ATA CTA AAA GCA AAA GAT AAT TAG GAG CAG TTG CTA

15 ACT GGA AAA AAT CAA ATG CAA AGC TAG TTG CCA AAG AAC TCT

. AGA

H og/eller

I 20 CTC GAG GAA ACT TTG CCA AAC GAG GAA CAT CAA TCA GGT GAT

I ACC ACA ACT ATT GAA GAT ACT CGC CCG ATT GAT ACC ATG TCA

GGT CTA TCA GGA GAG ACT GGG CAG TCT GGT AAT ACT ACA ATT

I GAG GAA GAT AGT ACG ACT CAC GTT AAA TTC TCA AAA CGT GAT

ATT AAT GGT AAA GAA CTA GCA GGT GCT ATG ATT GAA CTA CGT

I 25 AAT CTA TCA GGT CAA ACT ATT CAA TCA TGG ATA TCA GAC GGC

I ACA GTT AAA GTT TTC TAC TTG ATG CCA GGG ACT TAT CAA TTT

GTG GAG ACG GCA GCG CCA GAA GGT TAT GAA TTG GCA GCT CCA

I ATT ACC TTC ACA ATT GAT GAG AAA GGA CAA ATT TGG GTA GAC

AGT ACA ATT ACT GAG GCG AGT CAA TCT ATT GAT TTC

I 30

GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA

I ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC

I GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC

I 35 5 DK 175809 B1

GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TGT ACA

ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC

GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT

5 GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT

AGC AAG CCT AAA CTC TCT ATC CAC TTT GAT AAC GAG TGG CCT

AAG GAA GAC AAA CCA CAA CTA CCT GCC GTT GAA AAA CCT AAG

10 ACT AAG GAG AGC TTG CCA GCC GCA GGG GAA GCT GAA CAT GTC TTA TCT ACT ATC GTG GGA GCA ATG ATC

hvor de mindre repetitive områder (jfr. fig. 3) i hvert gen ovenfor koder for de peptider, som har fibronectin-15 bindende aktivitet.

Opfindelsen angår endvidere et plasmid eller en fag, der omfatter en nucleotidsekvens, som koder for de fi-bronectinbindende proteiner.

20

Opfindelsen angår endvidere mikroorganismer, som indeholder mindst et hybrid-DNA-molekyle ifølge det ovennævnte. Sådanne mikroorganismer er blevet deponeret hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen under depone-25 ringsnummeret DSM 4614 (pSDF102) og DSM 4613 (pSDF203).

Opfindelsen angår endvidere en' fremgangsmåde til fremstilling af fibronectinbindende proteiner, ved hvilken fremgangsmåde mindst et hybrid-DNA-molekyle ifølge 30 ovennævnte overføres i en mikroorganisme, mikroorganismen dyrket i et dyrkningsmedium, og det således frembragte protein isoleres på i sig selv kendt måde.

Et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse an-35 går en kemisk syntese af de fibronectinbindende proteiner, hvorved aminosyrer bindes sammen til peptider, i

I DK 175809 B1 I

I I

hvilke rækkefølgen af aminosyrerne er baseret på de nu- I

cleotidsekvenser, som koder for proteinerne. Syntesen I

starter fra det C-terminale glycin henholdsvis aspar- I

ginsyre, som trinvis omsættes med den hensigtsmæssige I

5 aminosyre, hvorefter de til sidst omsættes med gluta- I

minsyre henholdsvis glutaminsyre i den N-terminale ende I

til frembringendelse af de fibronectinbindende peptid- I

H områder. I

10 Hensigtsmæssige aminosyrer kan også fusioneres til ami- I

nosyresekvensen, såsom det IgG-bindende område af pro- 'I

tein A. Opfindelsen vil blive beskrevet i større de- I

H taljer i det efterfølgende under henvisning til de giv- I

I ne eksempler, men uden at være begrænset dertil. I

15 I

H Eksempel 1 I

I Konstruktion af en genbank af chromosomal DNA fra I

I Streptococcus dysqalactiae I

I

Chromosomal DNA fra Streptococcus dysgalactiae, stamme I

S2, blev fremstillet i overensstemmelse med perchlorat- I

metoden (9). DNA'et blev delvis spaltet med Sau 3AI, I

blev størrelsesfraktioneret på en 1% agarosegel, og I

I 25 DNA-fragmentet indenfor størrelsesområdet fra 3 til 9 I

kb blev opsamlet, blev elektroelueret og oprénset på en I

I Nensorb-søjle (DuPont). I

I Plasmidvektoren pUC18 blev spaltet med Bam HI og blev I

I 30 fosfatasebehandlet. Det delvis spaltede og fraktione- I

I rede streptococcus-DNA blev ligeret med den spaltede I

I pUCl8-vektor. Frysekompetente E. coli, stamme TGI, I

I blev transformeret med ligeringsblandingen og blev ud- I

spredt på LA-plader, som indeholdt ampicillin (50 ug/ I

I 35 ml) og IPTG (0,1 mM) samt 0,004% X-gal, kaldet axi-pla- I

I der. Hvide kolonier blev overført til LA-plader med I

DK 175809 Β1 I

ampicillin (50 ug/ml).

Screening af en genbank for et fibronectinbindende protein (FNBP) 5

De hvide kolonier fra axi-pladerne blev overført med tandstikkere til LA-plader med ampicillin, 52 kolonier pr. plade. Der blev opsamlet i alt 728 transformanter.

Disse blev screenet med hensyn til fibronectinbindende 10 aktivitet under anvendelse af en filteranalysemetode ifølge det nedenfor anførte.

Transformanter blev overført fra en axi-plade til LA-plader med ampicillin, og pladerne blev inkuberet nat- 115 ten over. Fra disse plader blev kolonierne replikeret over på nye LA-plader, som blev inkuberet ved 37°C natten over. Et nitrocellulosefilter blev anbragt på hver agarplade med udvoksede kolonier. Når filtrene var fuldstændigt fugtige, blev kolonierne fæstnet ved sug-20 ning, og filtrene blev forsigtigt fjernet. Filtrene blev udsat for chloroformdamp i 5 minutter og blev derefter vasket 3 x 10 minutter ved 37"C i en pufferopløsning, som bestod af 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,05%

Tween-40 og 150.mM NaCl. Filtrene fik lov til at tørre 25 ved stuetemperatur i ca 30 minutter. Filtrene blev præinkuberet i 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 og 1,4% fedtfrit mælkepulver i 2 timer ved 37°C eller natten over ved stuetemperatur. Mælkepulverpufferen skal fremstilles frisk. ^^I-mærket fibronectin blev tilsat 30 (ca 30.000 cpm pr. filter), og filtrene blev inkuberet ved stuetemperatur natten over. Filtrene blev vasket 3 x 10 minutter ved 37°C under anvendelse af en opløsning af 0,05% Tween-40 og 150 mM NaCl, hvorefter filtrene blev tørret. En ikke-eksponeret film blev anbragt der-35 på og blev eksponeret i fra 3 til 5 dage. Filmen blev fremkaldt, og de kloner, som var bundet til 125I-fibro-

I DK 175809 B1 I

I I

H nectin blev identificeret og isoleret. I

H Filterscreeningsanalysen viste 3 positive kloner, som I

alle blev analyseret yderligere. Fibronectinbindings- I

H 5 evnen blev yderligere bestemt i en kompetitiv analyse I

(10). Lysat af E. coli-kloner blev fremstillet ved at I

lysere bakterierne med lysozym (1 mg/ml) i en puffer- I

j opløsning, som bestod af 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM I

NaCl og 1 mM EDTA. Den fibronectinbindende aktivitet I

10 blev analyseret ved at bestemme lysaternes evne til at I

konkurrere med S. aureus, stamme Cowan I (alternativt I

stamme 8325-4) henholdsvis S. dysgalactiae, stamme S2, I

med hensyn til deres evne til at bindes til det 29 kD I

125 I

I store, JI-mærkede fragment af fibronectin. Testen I

15 viste, at det var muligt at udkonkurrere fibronectin- I

binding til de to staphylokokstammer såvel som til I

stamme S2 af S. dysgalactiae, når der blev anvendt ly- I

I sater af E. coli-kloner, som indeholdt streptokok-DNA, I

I Omvendt kan bindingen af 29 kD fragmentet fra fibronec- I

I 20 tin til S. dysgalactiae hæmmes ved tilsættelse af et I

lysat fra en E. coli-klon, som indeholder et gen for I

det fibronectinbindende protein fra S. aureus. I

I Restriktionskortlægning og subkloning I

I 25 I

I Plasmid-DNA fra de tre positive subkloner fra filter- I

I analysen, kaldet pSDFlOO, pSDF200 og pSDF300 blev frem- I

I stillet under anvendelse af LiCl-metoden (11) og blev I

I bestemt til at være 4,9 kb, 6,9 kb henholdsvis 6,5 kb I

30 ved hjælp af spaltning under anvendelse af restrik- I

tionsenzymer og analyse på agarosegeler. Alle tre klo- I

ner blev spaltet under anvendelse af ca 20 af de mest 1 I

almindelige restriktionsenzymer, der genkender en se- I

kvens på 6 nucleotider, og på baggrund spaltningsmøn- I

35 stre blev restriktionskort tegnet. To af klonerne, I

PSDF100 og pSDF300, var delvis overlappende med en fæl- I

DK 175809 B1 I

les 3,9 kb lang sekvens, og kun én blev udvalgt til I

i yder ligere undersøgelser. nSDFlOO havde en | større fibronectinbindende aktivitet end pSDF300, blev førstnævnte udvalgt.

pSDFlOO og pSDF200 blev subklonet for nærmere at identificere de områder, som koder for den fibronectinbind-ende aktivitet. pSDFlOO blev spaltet med Bam HI, hvorefter plasmidet blev ligeret. Denne klon, hvor Bam HI-10 Bam Hi-fragmentet var fjernet, blev kaldt pSDFlOl og var positiv. pSDFlOl blev yderligere spaltet med Xbal, hvilket gav tre fragmenter, hvor et hovedsageligt bestod af pUC18-vektoren. De to andre Xbal-Xbal-fragmenter blev oprenset og indsat i pUC18-vektoren. Et af 15 disse fragmenter koder for fibronectinbindende aktivitet. Denne klon blev kaldt pSDF102. På tilsvarende måde blev der konstrueret subkloner udfra pSDF200.

Fjernelse af Clal-SacI-fragmentet fra pSDF200, gav en klon kaldet pSDF201, og eliminering af Bglll-EcoRI-20 fragmentet fra pSDF201 gav pSDF202. Endelig blev Xhol-EcoRI-fragmentet fjernet fra pSDF202. Denne nye klon, der blev opnået, blev kaldt pSDF203. Alle disse nye subkloner var positive, det vil sige de udtrykker fibronectinbindende aktivitet, jfr. fig. la og fig. ab.

Yderligere subkloning ved ExoIIl-fordøjelse

For at lette nucleotidsekventeringen ved dideoxymetoden er mindre subkloner med en baseparlængde fra 150 til 30 200 nødvendig for at opnå overlappende DNA-sekvenser.

Exonuclease ill fordøjer en af DNA-strengene fra 5'-fremspringet eller fra den stumpe ende, men efterlader 3'-fremspringet. Det enkeltstrengede DNA blev derefter fordøjet med Sl-nuclease. Denne metode anvendes i "E-35 rase-a-Base"-systemkittet {Promega, Madison, USA) og gør det mulig at konstruere serier af subkloner, der H DK 175809 B1

Η I

adskiller sig i størrelse med nogle hundrede nucleoti- I

der. I de interessante tilfælde blev fibronectinbind- I

H ende aktivitet undersøgt, jfr. tabel 1 nedenfor. I

5 Tabel 1 I

H Hæmningsanalyse i glas I

H Analyseblanding: 100 μΐ lysat af E. coli-kloner, som I

10 indeholdt streptokok-DNA-kloner (bak- I

terierne blev dyrket på LB + 50 ug I

ampicillin + 1 mM IPTG, blev vasket I

og koncentreret til OD540 = 5,0) I

100 μΐ Cowan I-celler, varmedræbt, I

I 15 OD54Q =5,0 I

I 100 μΐ *^l-mærket fibronectin, 8865 I

cpm I

I 200 μΐ PBS +0,1% BSA I

Inkubering: to timer, stuetemperatur I

I 20 Vask: to gange i PBS + 0,1% BSA + 0,05% I

I Tween I

I Resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel 1 I

Η I

I 25 I

I 30 I

I 35 I

DK 175809 B1 I

Lysat af Fortynding antal % binding i relation I

_..\.i.->= * 1,,0=4- mm t·il kontrol u. lvsat I

Kontrol u. lysat 4430 100 I

5 pSDF102cl0 ufortyndet 550 12,4 I

10'2 3870 87,4 I

pSDF102cl3 ufortyndet 200 4,5 I

10~2 1440 32,5 I

pSDF102c9 ufortyndet 610 13,8 I

10 10"2 3170 71,6 I

pSDF102cll ufortyndet 1400 31,6 I

10“2 3490 78,8 I

pSDF102cl4 ufortyndet 630 14,2 I

10-2 3220 72,7 I

15 pSDF102cl8 ufortyndet 4030 91,0 I

10"2 4300 97,1 I

pSDF203c3 ufortyndet 640 14,4 I

10"2 2780 62,8 I

pSDF203c6 ufortyndet 2710 61,2 20 10'2 4790 108 pSDF203c8 ufortyndet 3180 71,8 10"2 3660 82,6 pSDF203cll ufortyndet 3540 79,9 10-2 3970 89,6 25 pSDF203cl5 ufortyndet 3860 87,1 10"2 4300 97,1 pSDF203c9 ufortyndet 4020 90,7 10"2 4730 107 pSDF102 ufortyndet 200 4,5 30 10'2 1050 23,7 PSDF203 ufortyndet 180 4,1 10"2 950 21,4 TGl ufortyndet 3690 83,3 35 i

I DK 175809 B1 I

il

I 12 I

Nucleotidsekventering I

Subkloner opnået efter en ExoIII-fordøjelse og andre I

subkloner blev sekventeret under anvendelse af dideoxy- I

H 5 metoden ifølge "Gem Seq dsDNA"-sekventeringssystemet I

(Promega Biotech., Madison, USA). I

I Nucleotidsekventering af pSDF102 gav følgende sekvens: I

I 10 CTA GAT ACC TCA GAA AAC AAA AAA TCT GTA ACT GAA AAA GTA I

I ATA ACT AGC GAT GTT AAA TAT AAG ATT AAT GAT AAA GAA GTG I

I AAA GGT AAA GAA CTA GAC GAT GTC TCT TTA ACT TAC AGT AAA I

I GAA ACC GTT CGT AAG CCA CAG GTG GAA CCA AAT GTT CCT GAT I

I ACA CCT CAG GAA AAA CCA TTG ACA CCG CTT GCA CCG TCA GAA I

I 15 CCT TCA CAA CCA TCT ATT CCA GAG ACA CCA CTG ATA CCG TCA I

I GAA CCT TCA GTT CCA GAG ACA TCA ACA CCA GAA GGT CCA ACA I

GAG GGA GAA AAT AAT CTT GGT GGT CAG AGT GAA GAG ATA ACG I

ATT ACA GAA GAT TCT CAA TCA GGG ATG TCT GGT C AA AAT CCT I

I GGT TCT GGA AAT GAA ACA GTG GTT I

20 I

I GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT I

I CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT I

I ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA I

I 25 GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC I

I GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT I

I GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT I

I GAA I

I i

I 30 GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC I

I GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC I

I GGT ATG TCT GGG I

35 I

DK 175809 B1 13

GCT GGA C AA GTA GAG AGT CCA ACA ACT ACC G AA G AA ACC CAT

AAA CCA GAA ATA ATC ATG GGC GGT CAA AGT GAC CCT ATT GAT

ATG GTT GAG GAC ACT CTT CCT GGT ATG TCT GGC TCT AAT GAA

GCT ACT GTT GTG GAA GAA GAC ACA CGT CCT AAA CTT CAA TTC ’

5 CAT TTT GAT AAT GAA GAG CCC GTT CCT GCA ACG. GTT CCA ACC GTT TCT CAA ACT CCT ATT GCT CAG GTA GAA AGT AAA GTG CCT

CAT GCC AAA GCA GAG AGT GCG TTA CCT CAA ACT GGA GAT ACA

AAT AAA CTA GAA ACG TTC TTT ACC ATT ACA GCA CTA ACT GTT

ATT GGA GCG GCA GGA TTA CTA GGC AAA AAA CGT CGT AAT AAT

10 C AA ACT GAT TAA TCA GCA GAT TTC ATC AAA CGC TAT AAA C AA

GGC TAA CAT TTT AGC CTT GTT TTA TAT TGT TTC ACT GAC CTC

TAA AAG TTA TGA CTG TTT TAA AGG GGG GGT AGG CCA ATC CTC

AAA AGT AGT TAA GTT GAG AAA CAC CAC ATC ACT TTA GTC TTA

CTG CGC ATA CTA AAA GCA AAA GAT AAT TAG GAG CAG TTG CTA

15 ACT GGA AAA AAT CAA ATG CAA AGC TAG TTG CCA AAG AAC TCT AGA

hvor de repetitive domæner af sekvensen

20 GAA GAC ACT CAA ACA AGT CAA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC CAA CCG GGT

ATG TCT GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA

GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC

25 GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA

GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC 30 GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG TCT GGG

koder for et peptid med fibronectinbindende aktivitet.

i 35

DK 175809 B1 I

I i

H Nucleotidsekvensen af pSDF203 gav følgende sekvens: I

CTC GAG GAA ACT TTG CCA AAC GAG GAA CAT CAA TCA GGT GAT I

ACC ACA ACT ATT GAA GAT ACT CGC CCG ATT GAT ACC ATG TCA I

5 GGT CTA TCA GGA GAG ACT GGG CAG TCT GGT AAT ACT ACA ATT I

GAG GAA GAT AGT ACG ACT CAC GTT AAA TTC TCA AAA CGT GAT I

ATT AAT GGT AAA GAA CTA GCA GGT GCT ATG ATT GAA CTA CGT I

AAT CTA TCA GGT CAA ACT ATT CAA TCA TGG ATA TCA GAC GGC I

ACA GTT AAA GTT TTC TAC TTG ATG CCA GGG ACT TAT CAA TTT I

I lo GTG GAG ACG GCA GCG CCA GAA GGT TAT GAA TTG GCA GCT CCA I

I ATT ACC TTC ACA ATT GAT GAG AAA GGA CAA ATT TGG GTA GAC I

I AGT ACA ATT ACT GAG GCG AGT CAA TCT ATT GAT TTC I

GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA I

15 ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC I

I GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC I

I GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA I

I ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC I

I 20 GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT I

I GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA . I

I ACT GAA GTA GAA GAT I

25 AGC AAG CCT AAA CTC TCT ATC CAC TTT GAT AAC GAG TGG CCT I

AAG GAA GAC AAA CCA CAA CTA CCT GCC GTT GAA AAA CCT AAG I

ACT AAG GAG AGC TTG CCA GCC GCA GGG GAA GCT GAA CAT GTC I

I TTA TCT ACT ATC GTG GGA GCA ATG ATC I

I 30 hvor de repetitive domæner af sekvensen I

GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA I

I ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC I

I GGT CAG GGA GAG ATT GTT GAT ATC I

I 35 I

15 DK 175809 B1

GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA

ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC

*-« >-»m « -m n/i » ο» λ nmm nwm λ > m > m w< \JV91 osa λ vjr\v? o u. o. un wnx nii

5 GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT

koder for et peptid med fibronectinbindende aktivitet.

10 Southern-blot-hybridisering påviser ingen homologier på DNA-niveau mellem generne for det fibronectinbindende protein i S. aureau og de tilsvarende gener fra S. dys-galactiae. Den kompetitive hæmning mellem proteinerne fra de respektive arter afhænger højst sandsynligt af 15 den kendsgerning, at deres bindingssteder i fibronectin i det NH2-terminale 29 kd store fragment ligger tæt ved hinanden og derved sterisk blokerer bindingen.

Western-blot-analyser af lysat fra de to undersøgte fi-20 bronectinbindende E. coli-kloner med 12^I-mærket fibronectin og autoradiografi viser, at subklon pSDF203 koder for et protein med en molekylevægt på 70 kD, og at subklon pSDF102 koder for et tilsvarende protein med en molekylevægt på 110 kD.

25

De deducerede aminosyresekvenser af de proteiner eller polypeptider, som kodes af de ovenfor anførte nucleo-tidsekvenser, er følgende: 30 Glu Asp Thr Gin Thr Ser Gin Glu Asp Ile Val Leu Gly Gly

Pro Gly Gin Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Ser Gin Pro Gly ' Met Ser Gly Asn Asn Ser His Thr Ile Thr 35

DK 175809 B1 I

! Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gin Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly I

Gly Gin Gly Gin Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gin Ser

Gly Met Ser Gly Asp Asn Ser His Thr Asp Gly Thr Val Leu I

Glu

- I

Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gin Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly I

Gly Gin Gly Gin Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Thr Gin Thr I

Gly Met Ser Gly I

10 henholdsvis I

Glu Glu Thr Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gin Ser Gly Ser Thr I

Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly

Gly Gin Gly Glu Ile Val Asp Ile

Glu Glu Asn Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gin Ser Gly Ser Thr

Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly I

Gly Gin Gly Glu Val Val Asp Ile

20 Glu Glu Ser Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gin Ser Gly Gly Ser H

Thr Thr Glu Val Glu Asp. I

De foreliggende fibronectinbindende. proteiner kan an- H

vendes ved immunisering, hvorved proteiner, fortrinsvis H

25 i kombination med et fusionsprotein for at frembringe H

et større antigen til at reagere på, injiceres i doser, H

som fremkalder en immunologisk reaktion i værtspattedy- H

ret. De fibronectinbindende proteiner kan således an- I

vendes ved vaccination af drøvtyggere overfor mastitis H

30 fremkaldt af streptokokinfektioner. I

De fibronectinbindende proteiner kan endvidere anvendes H

til at blokere en infektion i en åben hudlæsion. Sår

kan behandles med en suspension, som omfatter det fi- H

35 bronectinbindende protein. De fibronectinbindende pro- H

teiner kan således anvendes til at behandle sår, f.eks. H

17 DK 175809 B1 .for at blokere bakteriebindingssteder i fibronectin el- 1 λ v* f ί 1 A mfM a»% N T p* i *3 <-· ^ vs λ ' 1 — ··» »·">«*»·» — «-. *··3 \ » WWW«·««« » »« w fælde frembringer værten specifikke antistoffer, som kan beskytte mod angreb af bakteriestammer, der omf at -5 ter sådanne fibronectinbindende proteiner. Herved blokerer antistofferne vedhæftningen af bakteriestammerne til ødelagt væv.

Eksempler på kolonisering af vævsødelæggelser er: 10 a) kolonisering af sår i hud- og bindevæv, hvilke sår er fremkaldt ved et mekanisk trauma, kemisk ødelæggelse og/eller termisk ødelæggelse, b) kolonisering af sår på slimhindemembraner, såsom i mundhulen, eller i pattedyrkirtler, urinleder eller va- 15 gina, c) kolonisering af bindevævsproteiner, som er blevet udsat for minimal vævsødelæggeIse (mikrolæsioner) i forbindelse med epithel og endothel (mastitis, hjerte-ventilinfektion, hofteudskiftningskirurgi).

20 Når de foreliggende fibronectinbindende proteiner, som er fremstillet ved hjælp af hybrid-DNA-teknik eller som er syntetiseret, anvendes til immunisering (vaccination) i pattedyr, herunder mennesker, dispergeres pro-25 teinerne eller polypeptiderne i en steril, isotonisk saltvandsopløsning, medens der evt. tilsættes et farmaceutisk acceptabelt dispergeringsmiddel. Der kan endvidere anvendes forskellige typer adjuvanser for at forlænge frigørelsen i vævet, og således eksponere 30 kroppens immunforsvarssystem for proteinet i en længere tidsperiode.

En passende dosis til opnåelse af immunisering er fra 0,5 til 5 ug fibronectinbindende protein pr. kg legems-35 vægt og pr. injektion ved immunisering. For at opnå en varig immunisering bør vaccinationer udføres ved på

DK 175809 B1 I

hinanden følgende lejligheder roed et interval på fra 1 H

til 3 uger, fortrinsvis 3 gange. Adjuvanser tilsættes H

normalt ikke, når immuniseringsbehandlingen gentages. H

5 Når de foreliggende fibronectinbindende proteiner eller H

polypeptider anvendes til lokal topisk administrering, H

dispergeres proteinet i en isotonisk saltvandsopløsning I

til en koncentration på fra 25 til 250 ug pr. ml. Sår- I

ene bliver derefter behandlet med en sådan mængde, at I

10 der kun opnås en fuldstændig befugtning af såroverfla- I

den. For et gennemsnitligt sår anvendes således kun I

nogle få ml opløsning på denne måde. Efter behandling H

med proteinopløsningen vaskes sårene hensigtsmæssigt I

med isotonisk saltvandsopløsning eller en anden egnet I

15 sårbehandlingsopløsning. H

Det fibronectinbindende protein eller det syntetiserede H

polypeptid ifølge den foreliggende opfindelse kan end- I

videre anvendes til at diagnostisere bakterieinfektio- I

20 ner fremkaldt af S. dysgalactiae-stammer, hvorved et I

fibronectinbindende protein ifølge den foreliggende op- I

findelse immobiliseres på et fast bæremateriale, såsom I

små latexkugler eller Sepharosekugler, hvorefter sera, I

som indeholder antistoffer, får lov til at passerer i- H

25 gennem søjlen og reagerer med det således immobilisere- I

de fibronectinbindende protein. Agglutineringen måles I

ved hjælp af kendte metoder. H

Det fibronectinbindende protein eller polypeptid kan H

30 endvidere anvendes ved en ELISA-test (Enzyme Linked Im- H

muno Sorbent Assay; E. Engvall, Med. Biol., 55, 193 H

(1977)). Herved belægges brønde i en polystyrenmicro- I

titerplade med det fibronectinbindende protein og inku-

beres natten over ved 4°C. Pladerne blev derefter vas- I

35 ket grundigt med PBS, som indeholder 0,05% Tween 20, og I

blev tørret. Seriefortyndinger af patientserum blev I

19 DK 175809 B1 fremstillet i PBS-Tween, blev tilsat til brøndene og blev inkuberet ved 30°C i 1,5 timer. Efter skylning blev antihuman IgG konjugeret med et enzym eller en pe-berrodperoxidase eller en alkalisk fosfatase tilsat til 5 brøndene, og der blev yderligere inkuberet ved 30°C i 1,5 timer. Under disse inkuberinger er IgG fra patientserum henholdsvis tilsat antihuman IgG-enzymkonjugat blevet bundet dertil. Efter skylning blev et enzymsubstrat tilsat, p-nitrophosphat i tilfælde med en alka-10 lisk fosfatase, eller orthophenylendiaminsubstrat (OPD) i tilfælde, hvor en peroxidase er blevet anvendt.

Brøndene i pladerne blev derefter skyllet med en citratpuffer, som indeholdt en 0,055% OPD og 0,005% H2O2 og blev inkuberet ved 30°C i 10 minutter. Enzymreak-15 tionen blev standset ved tilsætning af en 4N-opløsning af H2SO4 til hver brønd. Farveudviklingen blev målt med et spektrofotometer.

Afhængig af den anvendte type enzymsubstrat kan en 20 fluoroscensmåling også anvendes.

En anden fremgangsmåde til diagnostisering af S. dysga-lactiae-infektioner er ved at anvende DNA-genprobemeto-den baseret på nucleotidsekvensen for det fibronectin-25 bindende protein eller en del deraf. Ved denne metode fastgøres den naturlige eller syntetiske DNA-sekvens til et fast bæremateriale, såsom et nitrocellulosefilter, nylonfilter eller en polystyrenplade som ovenfor nævnt, f.eks. ved at tilsætte mælk i tilfælde med diag-30 nostisering af mastitis, til overfladen. DNA-genpro-ben, evt. enzymatisk mærket eller mærket med en radioaktiv isotop, blev derefter tilsat til pladen med den faste overflade, som omfatter DNA-sekvensen, hvorved DNA-genproben fæster sig til den membranbundne sekvens, 35 hvor den forekommer. Enzymet eller den radioaktive i-sotop kan let påvises ved hjælp af kendte metoder.

DK 175809 B1 I

Ovenfor omfatter udtrykket fibronectinbindende protein H

også en hvilken som helst af polypeptidsekvenserne, som H

I udgør det minimale fibronektinbindingssted i det fuld- H

stændige protein. H

Figurtekster H

Figur 1 Restriktionskort H

10 Figur la. Restriktionskort og subkloner af den 5 kb H

lange indføjelse fra S. dysgalactiae i pUC18-vektoren H

kaldet pSDFlOO. c H

Figur lb. Restriktionskort og subkloner af den 6,9 kb H

lange indføjelse fra S. dysgalactiae i pUCl8-vektoren H

15 kaldet pSDF200. I

A. Restriktionskort af klonen. H

B. Forskellige subkloner konstrueret for at bestemme H

det område i genet, som koder for den fibronectinbind- H

ende aktivitet. Bindingsaktiviteten af de forskellige H

20 genprodukter er blevet indikeret. H

C. Subkloner opnået efter fordøjelse med ExoIII af H

pSDFl02 henholdsvis pSDF203. Skala: 1 cm = 100 bp. Μ I

er den del af DNA-sekvensen, som koder for den membran- H

associerede del af proteinet (=COOH-terminal). Subklon H

25 pl02cl0 indeholder 31-enden af genet (figur la). Aj_, H

A2 og A3 henholdsvis Β^, B2 og B3 betegner repetitive

domæner af sekvenserne (jfr. figur 3). H

Figur 2 Hæmningsanalyse i reagensglas H

-19 c

Binding af I-mærket fibronectin til celler af S.

dysgalactiae S2 henholdsvis S. aureaus Cowan I, ved I

tilsætning af lysater af E. coli-kloner. De angivne I

125 I

procentværdier er relateret til binding af I-mærket

35 fibronectin til celler i fravær af lysat. Som en nega- H

tiv kontrol blev anvendt et lysat af E. coli TGI med I

21 DK 175809 B1 1 O i ) λλ kr»« 1 5 Ι^Ι^λ >«n« Λ Γ * . <r»»ww* w·· «··«·* KJ ; *« » *<l.l»% «4Μ Ψ v»v liV^ en influering på bindingen af cellerne til fibronectin-en. E. coli-klon 015 indeholder et gen fra S. aureus, hvilket gen koder for fibronectinbindende aktivitet.

5

Figur 3 viser repetitive sekvenser af pSDF102 og PSDF203.

Figur 4 viser nucleotidsekvenserne og de deducerede 10 aminosekvenser fra pSDF102.

Figur 5 viser nucleotidsekvenserne og de deducerede aminosekvenser fra pSDF203.

.15

Referencer 1. Hymes, R.O. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1, 67-90.

2. Kuusela, P. (1978) Nature 276, 718-720.

20 3. Switalski, L. et al (1982) Eur. J. Clin. Microbiol.

1, 381-387.

4. Froman, G. et al (1984) J. Biol. Chem. 259, 14899-14905 .

5. Baloda, S.B. et al (1985) FEMS Microbiol. Lett. 28, 25 1-5.

6. Wadstrom, T. et al (1985) I Jackson, G.J. (red.),

Pathogenesis of Infection, Springer Verlag, Berlin,

Heidelberg, New York, Tokyo, pp. 193-207.

7. Lopes, J.D. et al (1985) Science 229, 275-277.

30 8. Langone, I.I. (1982) Adv. Immunol. 32, 157-252.

9. Marmur, J. (1961) J. Mol. Biol. 3, 208-218.

10. Flock, J.-I. et al (1987) The EMBO Journal 6, 2351-2357.

11. Monstein, H.-J. et al (1986) Biochem. Int. 12, 889- 35 896.

i

Claims

1. Plasmid eller fag omfattende en nucleotidsekvens fra S. dysgalactae, hvil- I ken sekvens koder for et protein eller et polypeptid med fibronectinbindende I I 5 egenskaber, og hvilken sekvens er I 0) GAA GAC ACT C AA ACA AGT C AA GAG GAT ATT GTA CTT GGT GGT CCA I I GGT C AA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC C AA CCG GGT ATG TCT I I GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA 1 10 I GAA GAT TCT AAA CCA AGT C AA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT I C AA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG H I TCT GGG GAT AAT AGC CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA I I GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT I I CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG H 15 TCT GGG I og/eller I I 20 I I (2) GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG I I GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG I I GGA GAG ATT GTT GAT ATC I GAG GAG AAC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT I I 25 GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT I I GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT I I GAA GTA GAA GAT I I 30 I DK 175809 B1 . 23

2. Plasmid eller fag ifølae krav 1(1). hvor nucleotidsekvensen er: G AA GAC ACT C AA ACA AGT C AA GAG GAT ATT GTA C TT GGT GGT CCA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT AGC C AA CCG GGT ATG TCT

3. Plasmid eller fag ifølge krav 1(2), hvor nucleotidsekvensen er: GAG GAA ACT TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACG GAG GTT GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAG 20 c GGA GAG ATT GTT GAT ATC GAG GAG AAC TTA CCA ACT 9AA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAG GAT ACT AAA GGC CCA GAA GTC ATT ATC GGC GGT CAA GGA GAG GTT GTT GAT ATT

25 GAG GAG AGC TTA CCA ACT GAA CAA GGC CAA TCT GGC TCT ACA ACT GAA GTA GAA GAT. 30 li DK 175809 B1 I I 24 1

4. Plasmid pSDF102 som det findes i E. coli-stamme TG1 med deponerings- I I nummer DSM 4614. I

5. Plasmid pSDF 203 som det findes i E. coli-stamme TG1 med depone- I I 5 ringsnummer DSM 4613. I I

6. E. coli-stamme, der udtrykker mindst et af de fibronectinbindende proteiner I ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3. I 10

7. Mikroorganisme transformeret med det rekombinante DNA-molekyle ifølge I I et hvilket som helst af kravene 1 til 5. I

5 GGT AAT AAT AGC CAT ACT ATT ACA GAA GAT TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAG GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACT CAA TCT GGT ATG TCT GGG GAT AAT AGO CAT ACA GAT GGG ACA GTG CTT GAA 10 GAA GAC TCT AAA CCA AGT CAA GAG GAT GAG GTG ATA ATC GGC GGT CAA GGT CAA GTG ATT GAC TTT ACA GAA GAT ACC CAA ACC GGT ATG TCT GGG. 15

8. Plasmid eller fag, der omfatter en eller flere nucleotidsekvenser ifølge et I I hvilket som helst af kravene 1 -3. I I 15 I

9. Mikroorganisme, der omfatter mindst et plasmid eller mindst en fag ifølge I I krav 8. I

10. Fremgangsmåde til fremstilling af et fibronectinbindende protein eller po- I I 20 lypeptid, hvori I I (a) mindst et plasmid ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 indføres i I I en mikroorganisme, I I 25 (b) mikroorganismen dyrkes i et vækstfremmende medium, og I I (c) det således dannede protein isoleres på i sig selv kendt måde. H

11. Fibronectinbindende protein eller polypeptid omfattende mindst en af I I 30 aminosyresekvenserne: H I Glu Asp Thr Gin Thr Ser Gin Glu Asp Ile Val Leu Gly Gly I I Pro Gly Gin Val Ile Asp Phe Thr Glu Asp Ser Gin Pro Gly I DK 175809 B1 I Met Ser Giv Asn Asn Ser His Thr Ile Thr I Glu Asp Sex Lys Pro Ser Gin Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly 5 Gin Gly Gin Val Ile Asp phe Thr Glu Asp Thr Gin Ser Gly «et Ser Gly Asp Asn Ser His Thr Asp Gly Thr Val Leu Glu, Glu Asp Ser Lys Pro Ser Gin Glu Asp Glu Val Ile Ile Gly Gly Gin Gly Gin Val Ile Asp phe Thr Glu Asp Thr Gin Thr Gly Met Ser Gly 10

12. Fibronectinbindende protein eller polypeptid omfattende mindst en af aminosyresekvenserne: 15 I Glu Glu Thr Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gin Ser Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gin Gly Glu Ile Val Asp Ile

20 Glu Glu Asn· Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gin Ser Gly Ser Thr Thr Glu val Glu Asp Thr Lys Gly Pro Glu Val Ile Ile Gly Gly Gin Gly Glu Val Val Asp Ile Glu Glu Ser Leu Pro Thr Glu Gin Gly Gin Ser Gly Gly Ser Thr Thr Glu Val Glu Asp.

13. Farmaceutisk præparat til behandling af infektioner fremkaldt af S. dysga-lactiae, hvilket præparat omfatter mindst et fibronectinbindende protein som 30 defineret af nucleotidsekvenserne ifølge krav 1-3, og/eller aminosyresekven-ser ifølge et hvilket som helst af kravene 11 til 12 sammen med et farmaceutisk acceptabelt bæremateriale eller fortyndingsmiddel.