JPH0284182A - フィブロネクチン結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野Ｊ 本発明はフィブロネクチン結合タンパク質及び雑種−Ｄ
ＮＡ分子、たと久ば前記タンパク質に対して暗号を変え
る少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むプラスミド
又はファージに関する。さらに本発明は前記の分子を含
む微生物及び前記タンパク質を製造することにそれらを
使用すること並びに前記タンパク質の合成的生産に関す
る。 本発明の目的は最小限度のフィブロネクチン結合タンパ
ク質を得ることにある。 本発明のそれ以上の目的は、たとえば前記タンパク質に
対して暗号に変＾るヌクレオチド配列を含むプラスミド
を用いることによって遺伝子工学により前記タンパク質
を得ることにある。 本発明のそれ以上の目的は、化学合成によって前記タン
パク質を調製することの可能性を取得することにある。 〔発明の背景］ Ｗ　Ｏ−Ａ　Ｉ　−８５１０５５５３はフィブロネクチ
ン、フィブリノケン、コラーゲン及び／又はラミニン結
合能を有する細菌の細胞表面タンパク質を開示している
。それにはいろいろな細菌がフィブロネクチン、フィブ
リノケン、コラーゲン及び／又はラミニンに結合する能
力を持っていることが示されている。さらに５ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓからのフィブロネク
チン結合タンパク質は１６５ＫＤ及び／又は８７ＫＤの
分子量を有し、従って小さいタンパク質は大きいタンパ
ク質の一部であることが示されている。 フィブロネクチンは約４５０ＫＤの分子を有する大きな
グリコプロティンであって２つの類似したサブユニット
を持ち、前駆体ｍＲＮＡの複雑なスプライシングパター
ンに依存して分子の大きさを変えることができる。タン
パク質は基底膜及び結合性の組繊中に存在し、しかもま
たさまざまの体液、たと久ば血漿に溶解可能な形で存在
するｆｌｌｙｍｅｓ、Ｒ，ｏ、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、Ｃ
ｅ１１．上、６７〜９０ｆ１９８５１）　、　１９８７
年のにｕｕｓｅｌａのＳ、　ａｔｌｒｅｕｓはフィブロ
ネクチンに結合するという発見（Ｋｕｕｓｅｌａ、　Ｐ
Ｎａｔｕｒｅ　２７６、７１８〜？２０　（１９７８１
）以後、ほかの病原性のバクテリアのある菌株、たとえ
ばいろいろな血清の型の連鎖球菌（Ｓｗｉｔａｌｓｋｙ
、　Ｌ、ら、　Ｅｕｒ、Ｊ。 Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、上、　　３８１〜３
８７（１９８２）　、　Ｅ、ｃｏｌｉ（Ｆｒｏｍａｎ、
　Ｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ：ｈｅｍ、２５９１４８９９
〜１４９０５（１９８４１）　、及びサルモネラ（Ｂａ
Ｌｏｄａ、Ｓ、　Ｂ、らＦＥＭ　Ｓ　Ｍｉｃｒａｂｉｏ
ｌ、Ｌｅｔｔ、２８　、１〜５　ｆ１９８５１　）はこ
のタンパク質に結合できる（Ｗａｄｓｔｒｏｍ、Ｔ、ら
Ｉｎ　Ｊａｃｋ−ｓｏｎ、Ｇ、Ｊ、　ｆｅｄｌ　＋伝染
病の病原、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ。 Ｂｅｒｌｉｎ、！ｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｖ　Ｙｏ
ｒｋ、Ｔｏｋｙｏ、１９３〜２０７頁（１９８５１）こ
とが示されてきた。 表面に対する病原性のバクテリアの付着には、結合性の
組織マトリックスの、そして傷ついた外皮の、たとえば
フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン及び
ラミニンの上皮細胞表面上のいろいろのタンパク質に対
し結合させるために表面レセプターを用いる傷つける病
原体に間する議論において今日一般に認められている概
念がある０問題はこれらのレセプターはバクテリア細胞
の表面に比較的少量しか存在しなくて、解き放すことが
困難であるということである。タンパク質からなるレセ
プターの場合に実行できる１つの方法は、傷つける病原
体！ごよる伝染病の予防及び治療処置と同様に伝染病及
び伝染病の径路を研究するために著しく容易ならしめる
量にそれらを調製できることである。 連鎖球菌、たと＾ばＬａｎｃｅｆｉｅｌｄによるＡ、Ｃ
及びＧ　ｆｓｗｉｔａｌｓｋｉ、　Ｌ、らＥｕｒ、　Ｊ
、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。 １．３８１〜３８７　ｆ１９８２１）のいろいろな血清
の群の選別研究は、試験した菌株はいろいろな結合性の
組繊タンパク質、たとえばフィブロネクチン、フィブリ
ノーゲン、コラーゲン及びラミニン及びいろいろな免疫
グロブリン（Ｌｏｐｅｓ、　Ｊ、Ｄ、ら５ｃｉｅｎｃｅ
　２２９，２７５〜２７７　（１９８５）、Ｌａｎｇｏ
ｎｅ、　１．１．Ａｄｖ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、３２．１５７〜２５２　（１９８２）
）にいろいろな程度にまたいろいろな特異性をもって結
合できることを示してきた。 さらに連鎖球菌からのフィブロネクチン結合タンパク質
を特徴づけるために、特に前記のタンパク質に対し５ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇｅｌａｃｔｉａｅか
らの遺伝子をＥ、ｃｏｌｉにクローンした。これらのタ
ンパク質のフィブロネクチン結合領域は特定の場所に局
限されてきたがこれらの領域を含むタンパク質の性質及
び機能を以下に議論する。

【本発明の記述】 いまや驚くべきことにフィブロネクチン結合性を有する
タンパク質又はポリペプチドに対して遺伝情報を指定す
る遺伝子のヌクレオチド配列を含む雑種−ＤＮＡ分子を
得ることができることが示された。以下から明らかなよ
うに下記のヌクレオチド配列が前記タンパク質を暗号に
変えるプラスミド、それぞれｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１（１２
及びｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２０３中に存在する。 ｅＴＡ　ＧＡＴ　＾（（ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣ＾＾＾
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　Ａｒｃ　　ＧＴＧ　　ＧＣＡＧ（Ａ　　ＡＴＧ　　Ａ
ＴＣ それによって各遺伝子の小さな繰返しの領域（第３図参
照）はフィブロネクチン結合活性を有するペプチドに対
して上記の遺伝情報を指定する。 本発明は更に前記フィブロネクチン結合タンパク質に遺
伝情報を指定するヌクレオチド配列を含むプラスミド又
はファージを含む。 本発明は更ｌこ上記に従う少なくとも１つの雑種−ＤＮ
Ａ分子を含んでいる微生物を含む、前記の微生物は寄託
番号Ｄ　Ｓ　Ｍ４６１４　（ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１０２）
及びＤ　Ｓ　Ｍ４６１３　（ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　　２０３
）のもとｌこＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ
ａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｎ＋ｅｎへ寄託された
。 本発明は更に上記に従う少なくとも１つの雑種−ＤＮＡ
分子の微生物への転移、前記微生物の培養基質内の培養
及びこのように生成したタンパク質のそれ自体が知られ
ている方法での単離を含むフィブロネクチン結合タンパ
ク質の製造方法に関する。 本発明のそれ以上の面は、それによってアミノ酸が、ア
ミノ酸の順序が前記ヌクレオチド配列が前記タンパク質
を暗号化することに基づいているペプチドに接続するフ
ィブロネクチン結合タンパク質の化学合成を含む０合成
はそれぞれＣ−末端グリシン及びアスパルチン酸から出
発し、それらは適当なアミノ酸と段階的に反応させられ
、それによってそれらはグルタミン酸と、そしてそれぞ
れフィブロネクチン結合ペプチド領域の生成のためにＮ
−末端のグルタミン酸と最終的に反応させられる。 適当なアミノ酸はまた前記アミノ酸配列たとλばタンパ
ク質ＡのＩｇＧ結合領域に融合させることができる。 本発明は以下に示す実施例を参照にして詳細番こ記述す
るが、これに限定されるものではない。 支血旦ユ ５ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄ　ｓ　ａｌａｃｔｉａ
ｅから　　　ＤＮＡの′　　　バンクｂａｎｋの　゛ ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａ
ｅから染色体ＤＮＡ、菌株Ｓ２を過塩素酸塩法（Ｌｌａ
ｒｍｕｒ、Ｊ、Ｊ、Ｍｏｌ。 ｔｌｉｏｌ旦、　　２０８〜２１８　ｆ１９６１１）に
従って調製した。 ５ａｕ３ＡＩを用いて部分的に切り裂かれたＤＮＡを１
％アガロースゲル上で大きさ分割し１寸法範囲３〜Ｑｋ
ｂ内のＤＮＡフラグメントを収集し、電気溶離し、Ｎｅ
ｎ５ｏｒｂ　（デュポン社製）カラムで精製した。 プラスミドベクターｐ　ｕ　ｃ　ｔｇをＢａｎ　ＨＩを
用いて切り裂きホスファターゼ処理した９部分的に切り
裂き分割した連鎖球菌ＤＮＡを切り裂いたｐ　Ｕ　Ｃ１
８ベクターでくくった。＜（った混合物をコンンビテン
トＥ、ｃｏｌｉを凍結するために形質転換し、アクシブ
レート（ａｘ４ｐｌａｔｅＪと称せられるアンピシリン
（５０％ｇ／ｍＪ２）及びＩＰＴＧ（０，１ｍＪ２）並
びに０．００４％Ｘ−ゲルを含有するＬＡ根板上薄く塗
った。白色の群体をアンピシリン（５０μｇ　／　ｍ　
ｆ２　）でＬＡ板に移動させた。 フ　プロネクチン　Ａタンパク　　ＦＮＢＰ　　のため
の　　　バンクｂａｎｋの アクシブレートから白色の群体な５２群体／板にアンピ
シリンとともにＬＡ板につまようじを使用して採取した
。全体で７２８の形質転換体を収集した。これらを以下
に記載する濾過検定法を使用してフィブロネクチン結合
活性に関して選別した。 形質転換体はアクシブレートからＬＡ板へアンピシリン
とともに採取し、板は一夜インキユベートした。これら
の板から群体を新しいＬＡ板上唇こ再生し、それを−夜
３７℃でインキュベートする。 ニトロセルロースのフィルターを成長した群体をもつ各
かんてん板上に置く、フィルターが完全に湿らせられる
とき群体は吸引によってはり付けられ、そしてフィルタ
ーは注意深く取°り除かれる。 フィルターはクロロホルム蒸気に５分間さらされ、次い
でｐＨ７，５のトリス−ＩＣ４２１００ｍ　Ｍ、Ｔｗｅ
ｅｎ−４００，０５％及びＮａ（４２１５０ｍ　ｆ２か
らなる緩（１溶液中で３７℃で１０分間３回洗浄する。 フィルターを室温で約３０分間乾燥させる。フィルター
をＮａ（１２１５０ｍ　ｆ２、ｐＨ７，５のトリス−Ｈ
（［１０ｍ１２及び脱脂乳ｌＲ１，４％中で３７℃で２
時間又は室温で一夜ブリインキュベートする。乳粉の緩
衝液は新しく調製しなければならない　　ｌ！Ｊ標識フ
ィブロネクチンを加え（約３０．　ＯＯＯｃｐｍ／フィ
ルター）、そしてフィルターは室温で一夜インキユベー
トする。フィルターを０．０５％のＴｗｅｅｎ　−４０
と１５１１　ｍ　１２のＮｎＣＱからなる泊ｉ１ｋを用
いて３７Ｔ：で１１１分間づつ３回洗浄し、その後フィ
ルターを乾燥する。未曝露フィルムをその上に置き、３
〜５日間ｌＩｎする。フィルムを現像し　１２８ｉ−フ
ィブロネクチンに結合したクローンを同定して単離する
。 フィルター選別検定は３つの陽性のクローンがあること
を示し、それらを更に分析した。フィブロネクチン結合
能をコンペティションアッセイ（Ｆｌｏｃｋ、　Ｊ、ら
Ｔｈｅ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　ＯＪｏｕｒｎａｌ　　旦、　２３
５１〜２３５７　（１９８７１）で更に測定した。　Ｅ
、ｃｏｌｉクローンの溶菌液はｐＨ７，５のトリス−Ｊ
ＩＣＪ２　１００ｍＭ、ＮａＣ（２１５０ｍ　Ｍ及びＥ
ＤＴＡｌｍＭからなる１１　ｆｌｉ溶液中でリソチーム
（１ｍｇ／ｍ　（２）を使用してバクテリアをリシン化
することによって調製した。 フィブロネクチン結合活性は、フィブロネクチンの””
ＩＦＭ識した２９ＫＤのフラグメントに結合する能力に
関して、それぞれＳ、　ａｕｒｅｕｓ、菌株Ｇｏｗａｎ
Ｉ　（代わりになるべきものとして菌株８３２５−４）
及びＳ、　ｄｙｓｇｓｌａｃｔｉａｅ、菌株Ｓ２と競争
する溶菌液の能力を測定することによって分析した。試
験は連鎖球菌ＤＮＡを含むＥ、ｃｏｌｉクローンの溶菌
液を使用するとき、Ｓ、ｄ　ｓ　ａｌａｃｔｉａｅの菌
株Ｓ２と同様に、２つのブドウ球菌菌株に対するフィブ
ロネクチン結合を追い出すことができることを示した６
逆に、Ｓ、ｄ　ｓ　ａｌａｃｔｉａｅに対するフィブロ
ネクチンの２９ＫＤフラグメントの結合はＳ、　ａｕｒ
ｅｕｓのフィブロネクチン結合タンパク質に対する遺伝
子を含有するＥ、ｃｏｌｉの溶菌液を加λることによっ
て阻害することができる。 マツピング　びサブクローニング ｐＳＤＦｌｏＯ、ｐＳＤＦ２００及びｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　
３００と称せられるフィルター検定からの３つの陽性の
サブクローンのプラスミド−ＤＮＡは、ＬｔＣＪ２法（
Ｍｏｎｓｔｅｉｎ、　Ｈ，Ｊ、　　ら　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｉｎｔ、　１２，８８９〜８９６ｆ１９８６）　）を
使用して調製され、制限酵素を使用する分解及びアガロ
ースゲル上の分析によってそれぞれ４．５ｋｂ、６．９
ｋｂ及び６．５ｋｂであると決定した。これらのクロー
ンはすべて最も普通の制限酵素的２０を使用して引き裂
かれ、それは６つのヌクレオチドの配列を認め、分割パ
ターン制限地図からの出発を下図に書く、クローンの２
つ、ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　ｔｏｏ及びｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　３０
０は同様に３．９ｋｂの配列を有する部分的に重なりを
もち、かくしてただ１つだ番プをそれ以上の研究のため
に選んだ。 ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１００はｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　３００より
高いフィブロネクチン結合活性を有したので前者を選ん
だ。 ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１００及びｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２００は
フィブロネクチン活性を暗号に変える領域をより厳密に
同定するためにサブクローンした。ｐＳＤＦｌｏｏはＢ
ａｍＨＩを用いて切り裂き、その後プラスミドを再びく
くった。削除されたＢａｍ　ＨＩ　−Ｂａｎ　ＨＩフラ
グメントをもつこのクローンはｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１０１
と称せられて陽性であった。ｐＳＤＦｌｏｌは更にＸｂ
ａＩを用いて切り裂かれ、３つのフラグメントを生じ、
１つは主としてｐ　Ｕ　Ｃ１１１！ベクターからなる。 これらのフラグメントの１つはフィブロネクチン結合活
性を暗号に変える。このクローンはｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１
０２と称せられる。相当する方法でサブクローンはｐ　
Ｓ　Ｄ　Ｆ　２００から建造される。ｐＳＤ　Ｆ　２０
０から削除されたＣ１ａｌ　−５ａｃＩフラグメントは
ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２０１と称せられるクローンを生じ、
更にｐＳ　Ｄ　Ｆ　２０１から除去された凪ＩＩ　−Ｅ
ｃｏ　ＲＩフラグメントはｐＳＤＦ２０２を生じる。 最後に、ＸｈｏＩ　−Ｅｃｏ　ＲＩフラグメントはｐＳ
ＤＦ２０２から削除された。それによって得られたこの
新しいクローンはｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２０３と称せられる
。 これらの新しいサブクローンはすべて陽性であり、すな
Ｊ〕ちそれらはフィブロネクチン結合活性を発現する。 第１ａ図及びＩｂ図参照。 Ｅｃｏ　ＩＩＩ　　　によるそれν　のサブクローニン
グ二脱酸素法に従うヌクレオチド配列を容易にするため
に長さが１５０〜２００塩基対異なる小さいサブクロー
ンがオーバーラツプＤＮＡ配列を得るために要求される
。エクソヌークレアスＩＩＩは５′突出部または鈍い端
部からＤＮＡ鎖の１つを消化するが、３′突出部を残す
。単一の鎖でつながるＤＮＡはそのときＳＩ−ムクレア
ーゼを用いて消化される。この技術は’　Ｅｒａｓｅ−
ａ−１１ａｓｅ”システムのキット（米国プロメガ（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ１社）に使用され、そして寸法で数百ヌク
レオチド違うサブクローンのシリーズを組立てることを
可能にする。 関心をそそる場合にフィブロネクチン結合活性が試験さ
れた。以下の表Ｉ参照。 測定混合物：連鎖球菌のＤＮＡクローン（バクテリアは
ＬＢ＋５０μｇのアンピリ ジン＋１ｍＭのＩ　ＰＴＧ上で成長 し、洗浄され、ＯＤ、４゜＝５．０に 濃縮された）を含有するＥ、ｃｏｌｉクローンの１００
μ２の溶菌液 加熱殺菌された、ＯＤ、４゜＝５．０ のＣｏｗａｎ　Ｉ細胞ｌＯ口ｕＩ２ ＋２８Ｈ標識されたフィブロネタチ ン、８８６５ｃｐｍ　　１００με ２００　　μｆｉＰＢｓ＋ｏ、１％ＢＳＡインキュベー
ション二室温、２時間 ン先　　　　　　浄　：ＰＢＳ＋０．１％　Ｂ　　Ｓ　
　Ａ　＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で２回 結果は以下の表Ｉから明白である。 註）　ｕｎｄｉｌは非希釈を意味する。 区り」−交ｌ」」【烈 ｅｘａ　ＩＩＩ消化後得たサブクローン及びほかのサブ
クローンはＧｅｍ　Ｓｅｑ”　ｄｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列シ
ステム（米国Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、社）に
従う二脱酸素法を使用して配列された。 ｐＳＤＦのヌクレオチド配列は以下の配列を与λた： ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＡＣＣＴ（Ａ　Ｇ＾＾＾＾Ｃ＾＾Ａ＾
＾＾　ＴＣＴ　Ｇ工＾＾ＣＴＧ＾＾＾＾＾　ＧＴ＾＾■
＾　ｋｃＴ＾ＧＣＧＡＴ　　ＧＴＴ　　＾＾＾　ＴＡＴ
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ＧＡＡ　ＧＴＧ　　＾＾＾　ＧＧＴ　　ＡＡＡ　　ＧＡ
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ＣＴ　　ＴＡＣＡＧＴ　＾＾ＡＧ＾＾　ＡＣ（ＧＴＴ　
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Ｇ　　ＣＴＴ　ＧＣＡ　　ＣＣＧ　　ＴＣＡ　　ＧＡＡ
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　ＡＴＴ　　ＣＣＡ　　ＧＡＧ　　ＡＣＡ　〔ＣＡＣＴ
Ｇ　ＡＴＡ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　Ｔ（Ａ
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Ａ　ＧＡＡ　ＧＧ＋ＣＣＡ　ＡｅＡ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　
Ｇ＾＾＾＾Ｔ＾＾Ｔ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＣＡＧ
　ＡＧＴ　Ｇ＾＾＾Ｔ＾　＾ＣＧ　ＡＴ＋＾ＣＡＧ＾＾
Ｇ＾■マＣＴＣ＾＾　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＴＣＴ
　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　　ＣＣＴ　ＧＣＴマ（Ｔ　
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Ｇ＾＾ＧＡＣＡＣＴ　Ｃ＾＾＾Ｃ＾＾ＧＴＣ＾＾　ＧＡ
Ｇ　ＧＡＴ　＾■工　ＧＴＡ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ
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ＧＣＧＧＴ　　ＣＡＧＧＴ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　
ＧＡＣＴＴＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡＧＡＴ　ＡＣＴ　ＣＡＡ
ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＧＧＩＧＡＴ　　Ａ
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ＧＧＴ　　ＣＡＡ　ＧＴＧ　　ＡＴＴ　　ＧＡＣＴＴＴ
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＾ＡＴＧ　Ｃ＾＾＾ＧＣＴＡＧ　ＴＴＧ　ＣＣ＾＾＾Ｇ
＾＾ＣＴＣＴ　　ＡｅＡ それによって配列の反復領域 ＡＡＴ　ＡＧＥ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　　ＡＩＴ　ＡＣＡＧ
ＡＴ＾＾Ｔ　ＡＧＣＣＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　
Ｊ、ＣＡ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　Ｇ＾＾暗号に変人る。 ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２０３のヌクレオチド配列は以下の配
列を与えた。 それによって配列の反１夏領域 ＣＴＣＧＡＧ　　ＧＡＡ　ＡＣＴ　　ＴＴＧ　ＣＣＡ　
＾＾ＣＧＡＧ　　ＧＡＡ　　ＣＡＴ　　（ＡＡ　　ＴＣ
Ａ　　ＧＧＴ　　ＧＡＴ　　ＡＣＣＡ（＾＾ＣＴ　　Ａ
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ＧＧＴ　　ＣＴＡ　　ＴＣＡ　　ＧＧ＾Ｇ＾６　＾（Ｔ
　　ＧＧＧ　　ＣＡＧ　　ＴＣＴ　　ＧＧＴ　　ＡＡＴ
　　ＡＣＴ　　ＡＣＡ　ＡＴＴ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　
ＧＡＴ　　ＡＧＴ　＾ＣＧ　　ＡＣＴＣＡＣＧＴＴ　　
＾＾＾　ＴＴ（ＴＣＡ　＾＾＾　ＣＧＴ　　ＧＡＴ　　
ＡＴＴ　ＡＡＴ　　ＧＧＴ　　ＡＡＡ　　ＧＡＡ　　Ｃ
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　　ＧＧＴ　　ＣＡＡ　ＡＣＴ　　ＡＴＴ　　ＣＡＡ　
ＴＣＡ　　ＴＧＧＡＴＡ　　ＴＣＡ　　ＧＡＣＧＧ（Ａ
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Ａ　　ＧＡＧＧＴＴ　　ＧＴＴ　　ＧＡｆ　　ＡＴＴは
フィブロネクチン結合活性を有するペプチドを暗号に変
える。 南のよごれの交雑はＳ、ａｕｒｅｕ、のフィブロネクチ
ン結合タンパク質に対する遺伝子とに−ｃｔｉａｅから
の相当する遺伝子との間のＤＮＡレベルに全く相同を検
出しない、それぞれの種からのタンパク質の間の競争的
阻害は、ＮＨ，末端２９ＫＤフラグメント内のフィブロ
ネクチン結合位置はお互いに接近しており、それによっ
て結合を立体的に妨害するという事実に多分最も依存す
る。 ｌｆｆ１ｌＩｔ！識フイブロネクチン及びオートラジオ
グラフィーを使用して指し示す研究をした２つのフィブ
ロネクチン結合Ｅ、ｃｏｌｉクローンの溶菌液の西のよ
ごれの分析は、サブクローンｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２０３は
分子量７０Ｋ　Ｄ　ａを有するタンパク質を暗号に変＾
、そしてサブクローンｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１０２は分子量
１ｌＯＫＤを有する相当するタンパク質を暗号に変える
ことを示す。 上に与えられた暗号に変えるヌクレオチド配列からのタ
ンパク質又はポリペプチドの推定アミノ酸配列はそれぞ
れ以下の通りである： 及び ＧＬｕ　　Ｇ（ｕ　　Ｔｈｒ　　Ｌ＠１１　　Ｐｒｏ　
　Ｔｈｒ　　ＧＬｕ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　ＧＬｎ　
　Ｓｅｒ　　ＧＬｙ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　
　ＧｔｕＶａｔ　ＧＬｕ　Ａｓｃ＋　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　
Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａ（ＩＬｓ　　Ｉｌｅ　Ｇ
Ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ＧＬｙ　ＧＬｕＧＬｕ　　ＧＬ
ｕ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　ＧＬ
ｕ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　ＧＬｎ　　Ｓ＠ｒ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　ＧｌｕＶａＬ　
　ＧＬｕ　１．協０　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　
　ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　ＶＭＬ　　ＩＬｅ　　ＩＬｅ　
　ＧＬｙ　　Ｇ（ｙ　　ＧＬｎ　　ＧＬｙ　　ＧｌｕＧ
Ｌｕ　ＧＬｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＧＬ
ｕ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　ＧＬｎ　Ｓｅｒ　Ｇｔｙ　Ｇｔｙ
　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒこのフィブロネクチン結合タ
ンパク質は免疫化に使用することができ、それによって
タンパク質は、好ましくは反応するために大きな抗原を
生成するため番こ融合タンパク質と組合せて、宿主補乳
類に免疫反応を創始する量導入される。このようにして
フィブロネクチン結合タンパク質は連鎖球菌伝染病によ
って引き起こされた乳腺炎に対しこぶ胃に関するワクチ
ン注射に使用することができる。 さらに、フィブロネクチン結合タンパク質はむきだしの
皮膚の傷での伝染病を妨害するために使用することがで
きる。傷はフィブロネクチン結合タンパク質を含む懸濁
液を使用することによって治療することができる。この
ようにしてフィブロネクチン結合タンパク質は傷を治療
するために、たとえばフィブロネクチンのバクテリア結
合位置をふさぐために、又は免疫化（ワクチン注射）の
ために使用することができる。後者の場合に宿主は前記
のフィブロネクチン結合タンパク質を含むバクテリアの
菌株による付着に対して保護することができる特殊の抗
体を作る。このようにして抗体は損傷した組織に対する
バクテリアの菌株の密着を妨害する。 組織損傷の群体化の例は、 ａ）傷が機械的外傷、化学的損傷及び／又は熱的損傷に
よって引き起こされた皮膚及び結合性の組繊の群体化、 ｂ）口腔、乳腺、尿道又は腟のような粘膜の傷の詳体化
、 Ｃ）上皮及び内皮に関連した（乳腺炎、心弁の伝染病、
膜交換外科手術）最小の組織損傷（微小損傷）によって
さらされた結合性の組織タンパク質の群体化である。 人間を含む咄乳動物の免疫感作（ワクチン予防接種）の
目的のために、雑種−ＤＮＡ技術によって調製した、又
は合成した本発明のフィブロネクチン結合タンパク質を
使用するとき、タンパク質又はポリペプチドは、任意に
薬学的に受は入れられる分散剤を添加した、殺菌した等
浸透圧の生理食塩水溶液中に分配させられる。さまざま
の型のアジュバントが組織の解放を持続するために更に
使用することができ、かくしてタンパク質を身体の免疫
防御系に長時間さらす。 免疫感作を得るために適切な投与量は体重ｋｇ当り　０
．５〜５μｇのフィブロネクチン結合タンパク質で、免
疫感作の注射も同様の量である。耐久性の免疫感作を得
るためには、ワクチンの予防接種は１〜３週間の間隔で
連続接種、好ましくは３回接種しなければならない。 局部投与のために本発明のフィブロネクチン結合タンパ
ク質又はポリペプチドを使用するときは、タンパク質は
２５〜２５０ｕｇ／ｍβの濃度に等浸透圧の生理的食塩
水溶液に分散される。傷は傷表面に完全に湿潤するだけ
の量によって処置する。かくして平均的な傷に対しては
２個のｍβの溶液がこの方法で使用される。タンパク質
溶液を使用する処置の後で傷は等浸透圧生理食塩水又は
別の適切な傷治療溶液で適切に洗浄する。 さらにフィブロネクチン結合タンパク質、すなわち本発
明の合成ポリペプチドＳ、ｄ　ｓ　ａｌａｃｔｉａｅ菌
株によって引き起こされる細菌の伝染病を診断すること
に使用でき、それによって本発明のフィブロネクチン結
合タンパク質は固体担体、たとえば小さらラテックス又
は５ｅｐｈａｒｏｓｅ”ビーズ上に固定され、それから
抗体を含有する血清が通過させられてフィブロネクチン
結合タンパク質と反応させられかくして固定化させられ
る。凝集はそれから既知の方法によって測定する。 さらにフィブロネクチン結合タンパク質又はポリペプチ
ドＥＬＩＳＡ試験に使用することができる（酵素結合免
疫収着測定；　Ｅ　Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｍｅｄ。 Ｂｉｏｌ、５５．１９３　（１９７７））　、これによ
ってボリスチレンミクロタイタ板の井戸の孔はフィブロ
ネクチン結合タンパク質によって被覆されて４℃で一夜
インキユベートされる。板はそれから０．０５％Ｔｖｅ
ｅｎ２０を含有するＰＢＳを使用して徹底的に洗浄され
、乾燥される。患者の血清の連続的な希釈がＰ　Ｂ　Ｓ
　−Ｔｗｅｅｎ中で行われ、井戸に添加され、３０℃で
１．５時間インキュベートされる。すすぎ後酵素、すな
わちセイヨウワサビパーオキシダーゼ又はアルカリ性ホ
スファターゼと複合した抗大の−ＩｇＧを井戸に添加し
、３０℃で１．５時間さらにインキュベートされた。こ
れらのインキュベーションの間じゅう患者の血清からの
ＩｇＧ及び添加した抗大のＩｇＧ−酵素抱合体はそれぞ
れそれに結合させられた。すすぎ後に酵素基質を添加し
、アルカリ性ホスファターゼの場合にｐ−ニトロホスフ
ァート、またはパーオキシダーゼの場合にはオルソフェ
ニレンジアミン基質（ＯＰＤ）をそれぞれ使用した。板
の井戸は次いで０．０５５％のＯＰＤ及び０、００５％
のＨｌｏ、を含有しているクエン酸塩緩衝液を使用して
すすぎ、３０℃で１０分間インキュベートした。酵素反
応は各井戸に４ＮのＨ＊ＳＯ４溶液を添加することによ
って停止する６色の展開は分光光度計を使用して測定す
る。 使用した酵素基質の型に依存して蛍光測定も使用するこ
とができる。 Ｓ、ｄ　ｓ　ａｌａｃｔｉａｅ伝染病を診断するもう一
つの方法はフィブロネクチン結合タンパク質又はその部
分に対するヌクレオチド配列に基づ＜ＤＮＡ遺伝子プロ
ーブ法を使用することによる。それによって天然又は合
成りＮＡ配列は固体担体、たと＾ばニトロセルロース　
フィルター、ナイロン　フィルター、又は上述のポリス
チレン板に、たとえば乳腺炎を診断する場合には、表面
に乳を添加することによって付着させる。任意に酵素的
に、又は放射性同位元素によって標識されたＤＮＡ遺伝
子プローブはＤＮＡ配列を含む固体の表面板に添加され
、そうすることによってＤＮＡ遺伝子プローブは膜と連
合した配列に付着する。酵素又は放射性同位元素は既知
の方法によって容易に定量することができる。 上述の術語フィブロネクチン結合タンパク質は任意のポ
リペプチド配列もまた含み、それは完全なタンパク質の
最小のフィブロネクチン結合部位を構成する。 ここで図面の一部について説明を行うと、第１ａ及びｌ
ｂ図において、Ａはクローンの制限地図である。 Ｂはフィブロネクチン結合活性に対して遺伝情報を指定
する遺伝子の領域を決定するために構成されたさまざま
なサブクローンである。 ＣはそれぞれｐＳ　Ｄ　Ｆ　１０２及びｌ−１ｓＤＦ２
０３（７）Ｅｘｏ　ＩＩＩによる消化後に得たサブクロ
ーンである。 スケール：　ｌ　ｃｍ＝ｉ００ｂｐ、Ｍはタンパク質（
＝　ＣＯＯ１１−末端）の膜と連合した部分を暗号に変
えるＤＮＡ配列の一部である。サブクローンｐ　１０２
ｃｌｏは遺伝子の３′末端を含む（第１ａ図）、Ａ５、
Ａ２及びＡｓ並びにＢ１、Ｂ、及びＢ３は、それぞれ配
列の反覆領域を示す（第３図参照）。 第２図は試験管内の阻害分析を示し、Ｅ、ｃｏｌｉ−ク
ローンの溶菌液の添加時の、それぞれｍｌａｃｔｉａｅ
及びＳ、ａｕｒｅｕｓ　ＣｏｗａｎＩの細胞に対する”
１１８ｍフィブロネクチンの結合を示している。示され
た％値は溶菌液のない場合の細胞に対する　１″’ＩＦ
Ｉ識フイブロネクチンの結合に関連している。陰性の比
較対照として挿入なしのｐＵｃ１８−ベクターを有する
Ｅ、ｃｏ’ｌｉＴ　Ｇ　Ｉの溶菌液を使用した。それは
フィブロネクチンに対する細胞の結合に全く影響がなか
った。　Ｅ、ｃｏｌｉクローン０１５はフィブロネクチ
ン結合活性を暗号に変＾るＳ、ａｕｒｅｕｓからの遺伝
子を含む。

【図面の簡単な説明】

第１図は制限地図であり、 第１ａ図は制限地図ｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１００と称せられ
るｐ　Ｕ　Ｃ１８−ベクターのＳ、ｄ　ｓ　ａｌａｃｔ
ｉａｅからの５ｋｂ挿入のサブクローンであり、 第１ｂ図はｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　２００と称せられるｐＵＣ
１８−ベクターのＳ、ｄ　ｓ　ａｌａｃｔｉａｅからの
６．９ｋｂ挿入のサブクローンであり、 第４図はｐ　Ｓ　Ｄ　Ｆ　１０２のヌクレオチド及び控
除アミノ酸配列を示し、 第５図はｐＳＤＦ２０３のヌクレオチド及び控除アミノ
酸の配列図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フィブロネクチン結合性を有するポリペプチド又は
   タンパク質を暗号に変える￥Ｓ．ｄｙｓｇａｌａ￥−￥
   ｔｉａｅ￥のヌクレオチド配列を含む雑種−ＤＮＡ分子
   。 ２、フィブロネクチン結合性を有するポリペプチド又は
   タンパク質を暗号に変える￥Ｓ．ｄｙｓｇａｌａ￥−￥
   ｃｔｉａｅ￥のヌクレオチド配列を含むプラスミドエラ
   ー（ｅｌｌｅｒ）ファージ。 ３、寄託番号ＤＳＭ４６１４を有する￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥
   菌株中に含まれるようなプラスミドｐＳＤＦ１０２。 ４、寄託番号ＤＳＭ４６１３を有する￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥
   ＴＧＩ菌株中に含まれるようなプラスミドｐＳＤＦ２０
   ３。 ５、少なくとも１つの前記フィブロネクチン結合タンパ
   ク質を発現する￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥菌株。 ６、請求項１〜４の１項又はそれ以上に従う組換えＤＮ
   Ａ分子によって形質転換された微生物。 ７、下記のヌクレオチド配列 【遺伝子配列があります】 好ましくは 【遺伝子配列があります】 及び／又は 【遺伝子配列があります】 好ましくは 【遺伝子配列があります】 の１つ又はそれ以上を含む請求項１記載の雑種−ＤＮＡ
   分子。 ８、請求項７記載のヌクレオチド配列及び／又はその部
   分の１つ又はそれ以上を含むプラスミド又はファージ。 ９、請求項８記載を少なくとも１つのプラスミド又はフ
   ァージを含む微生物。 １０、ａ）請求項１記載の少なくとも１種の雑種−ＤＮ
   Ａ分子が微生物中に導入され、 ｂ）前記微生物が成長促進媒体中で培養され、 ｃ）このように生成されたタンパク質がそれ自体が知ら
   れている方法で単離されるフィブロネクチン結合タンパ
   ク質の製造方法。 １１、アミノ酸残基がそれぞれＣ−末端グリシン及びア
   スパルチン酸から出発する前記タンパク質又はポリペプ
   チドを暗号に変える前記ヌクレオチド配列に基づいて生
   成され、段階的にそれが適当なアミノ酸と反応させられ
   、最終的にグルタミン酸と、そしてそれぞれフィブロネ
   クチン結合タンパク質又はポリペプチドの生成のために
   Ｎ−末端でグルタミン酸と反応させられる、請求項１記
   載のフィブロネクチン結合タンパク質又はポリペプチド
   を製造するための化学合成方法。 １２、少なくとも１つのアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 及び／又は 【遺伝子配列があります】 を含むフィブロネクチン結合タンパク質又はポリペプチ
   ド。 １３、薬学的に受け入れられる担体又は希釈剤とともに
   請求項１〜１２記載の少なくとも１つのフィブロネクチ
   ン結合タンパク質を含む、￥Ｓ．ｄｙｓｇａｌａ￥−￥
   ｃｔｉａｅ￥によって引き起される伝染病の治療用薬学
   的組成物。 １４、請求項１〜１２記載の少なくとも１つのフィブロ
   ネクチン結合タンパク質の治療的に活性な量を投与する
   ことを特徴とする哺乳類のＳ．ｄｙｓｇａ−ｌａｃｔｉ
   ａｅによって引き起される伝染病の治療方法。