DK175961B1 - Anvendelse af biokompatible mikrokapsler og sammensætning indeholdende biokompatible mikrokapsler til potensering af et immunrespons - Google Patents
Anvendelse af biokompatible mikrokapsler og sammensætning indeholdende biokompatible mikrokapsler til potensering af et immunrespons Download PDFInfo
- Publication number
- DK175961B1 DK175961B1 DK200500082A DKPA200500082A DK175961B1 DK 175961 B1 DK175961 B1 DK 175961B1 DK 200500082 A DK200500082 A DK 200500082A DK PA200500082 A DKPA200500082 A DK PA200500082A DK 175961 B1 DK175961 B1 DK 175961B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- microcapsules
- antigen
- biocompatible
- excipient
- poly
- Prior art date
Links
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 title claims description 194
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 52
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 41
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 title claims description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 118
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 118
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 118
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 78
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 37
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 31
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 17
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 9
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 8
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 8
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 claims description 7
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 claims description 7
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 7
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims description 7
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 229920001244 Poly(D,L-lactide) Polymers 0.000 claims description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 6
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 4
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920001432 poly(L-lactide) Polymers 0.000 claims description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- -1 poly (ester amide Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 claims description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 2
- 229920001306 poly(lactide-co-caprolactone) Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 claims description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 claims 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 claims 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 45
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 36
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 35
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 33
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 24
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 17
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 13
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 13
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 10
- 101150063569 slgA gene Proteins 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 9
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 7
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 7
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 7
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 6
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 4
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 3
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- VBVAVBCYMYWNOU-UHFFFAOYSA-N coumarin 6 Chemical compound C1=CC=C2SC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 VBVAVBCYMYWNOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 3
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000002962 plaque-reduction assay Methods 0.000 description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N (+)-Pilocarpine Chemical compound C1OC(=O)[C@@H](CC)[C@H]1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010003011 Appendicitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229940124868 Japanese encephalitis virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- QCHFTSOMWOSFHM-UHFFFAOYSA-N SJ000285536 Natural products C1OC(=O)C(CC)C1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- HEUMNKZPHGRBKR-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cr] Chemical compound [Na].[Cr] HEUMNKZPHGRBKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- GAMPNQJDUFQVQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid;phthalic acid Chemical compound CC(O)=O.OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O GAMPNQJDUFQVQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000229 biodegradable polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000004622 biodegradable polyester Substances 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031071 cholera toxoid Proteins 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 1
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- HQMNCQVAMBCHCO-DJRRULDNSA-N etretinate Chemical compound CCOC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)C=C(OC)C(C)=C1C HQMNCQVAMBCHCO-DJRRULDNSA-N 0.000 description 1
- 229960002199 etretinate Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 229940047135 glycate Drugs 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000985 iga plasma cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100001223 noncarcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002399 phagocytotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001416 pilocarpine Drugs 0.000 description 1
- 229920001279 poly(ester amides) Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000007425 progressive decline Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012487 rinsing solution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940031572 toxoid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
DK 175961 B1
Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af biokompatible mikrokapsler, som omfatter et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens, samt en sammensætning til stimulering af immun respons hos et menneske eller et dyr.
5 Det er velkendt at anvende mikroindkapsling til beskyttelse af følsomme bioaktive stoffer mod nedbrydning. Typisk indkapsles et bioaktivt stof inde i et vilkårligt ' antal beskyttende vægmaterialer, sædvanligvis af polymer art. Stoffet, der skal indkapsles, kan overtrækkes med en enkelt væg af polymert materiale (mikrokapsler) eller kan dispergeres homogent i en polymer matrix (mikrosfærer). (I 10 det følgende henviser udtrykket "mikrokapsler" til både mikrokapsler og mikrosfærer). Stofmængden inde i mikrokapslen kan varieres efter ønske og spænder fra en lille mængde til så meget som 95 % eller derover af mikrokapslens sammensætning. Mikrokapslens diameter kan også varieres efter ønske.
15 De Peyerske plaques er aggregater af lymfoide småknuder, som er beliggende i tyndtarmens, tyktarmens og blindtarmens vægge, hvor de udgør en vigtig del af kroppens forsvar mod adhærering og penetration af infektiøse stoffer og andre for kroppen fremmede stoffer. Antigener er stoffer, der inducerer kroppens antistofdannende og/eller cellemedierede immunsystemer, og kan omfatte fremmed 20 protein eller væv. Det ved interaktion mellem et antigen og immunsystemet inducerede immunologiske respons kan være enten positivt eller negativt, hvad angår kroppens evne til ved en senere udsættelse for antigenet at iværksætte et antistof- eller cellemedieret immunrespons over for dette. Et cellemedieret immunrespons omfatter for eksempel drab af fremmede celler eller væv, "cel-25 lemedieret cytotoxicitet", og hypersensitivitetsreaktioner af den forsinkede type. Antistoffer tilhører en klasse proteiner kaldet immunglobuliner (Ig), der dannes som respons på et antigen, og som specifikt forbinder sig med antigenet. Når et antistof forbindes med et antigen, danner de et kompleks. Dette kompleks kan hjælpe til at udrense antigenet fra kroppen, hjælpe til at dræbe levende antige-30 ner, såsom infektiøse stoffer og fremmede væv eller cancerarter, og neutralisere toxiners eller enzymers aktivitet. Når det drejer sig om kroppens slimhinde-overflader, er den i størst mængde forekommende antistofklasse, som findes i sekreterne, der bader disse steder, sekretorisk immunglobulin A (slgA). Sekre- i 2 DK 175961 B1 toriske IgA antistoffer forhindrer, at infektiøse stoffer og andre antigener adhæ-rerertil og penetrerer gennem kroppens slimhindevæv.
Selv om adskillige antigener kommer ind i kroppen gennem slimhindevævene, 5 inducerer almindeligt anvendte immuniseringsmetoder, såsom intramuskulær eller subcutan injektion af antigener eller vacciner, sjældent forekomst af slgA antistoffer i slimhindesekreter. Sekretoriske IgA antistoffer induceres mest effektivt gennem direkte immunisering af de slimhindeassocierede lymfoide væv, hvoraf den største masse i kroppen udgøres af de Peyerske plaques i mave-10 tarmkanalen.
I de Peyerske plaques er der IgA prækursor B-celler, som kan tage plads i ma-vetarmkanalens og de øvre luftvejes lamina propria områder og differentiere til modne IgA-syntetiserende plasmaceller. Det er disse plasmaceller, som rent 15 faktisk secernerer antistofmolekylerne. Undersøgelser foretaget af Heremans og Bazin til måling af udvikling af IgA-responser i mus, der var peroralt immuniseret med antigen, viste, at der forekom en sekvéntiel optræden af antigen-specifikke IgA-plasmaceller, først i lymfeknuder i mesenteriet, senere i milten og til slut i mavetarmkanalens lamina propria [Bazin, H., Levi, G. og Doria, G., 20 "Predominant contribution of IgA antibody-forming cells to an immune response detected in extraintestinal lymphoid tissues of germ free mice exposed to antigen via the oral route", J. Immunol. 105:1049, (1970), og Crabbe, P.A., Nash, D.R., Bazin, H., Eyssen, H. og Heremans, J.F., "Antibodies of the IgA type in intestinal plasma cells of germ-free mice after oral or parenteral immunization 25 with ferritin", J. Exp. Med. 130:723, (1969)]. Senere undersøgelser har vist, at peroral administrering af antigener fører til dannelse af slgA-antistoffer i tarmen og også i slimhindesekretioner, der forekommer længere væk fra tarmen, f.eks. i bronchialskylninger, colostrum, mælk, spyt og tårer [Mestecky, J., McGhee, J.R., Arnold, R.R., Michalek, S.M., Prince, S.J. og Babb, J.L., "Selective induc-30 tion of an immune response in human external secretions by ingestion of bacterial antigen", J. Clin. Invest. 61:731, (1978); Montgomery, P.C., Rosner, B.R. og Cohen, J., The secretory antibody response. Anti-DNP antibodies induced by dinitrophenylated Type III pneumococcus", Immunol. Commun. 3:143, (1974), og Hanson, L.A., Ahistedt, S., Carlsson, B., Kaijser, B., Larsson, P., Mattsby 3 DK 175961 B1
Baltzer, A., Sohi Akerlund, A., Svanborg Eden, C. og Dvennerholm, A.M., "Secretory IgA antibodies to enterobacterial virulence antigens: their induction and possible relevance", Adv. Exp. Med. Biol. 1007:165, (1978)]. Det er derfor tydeligt, at de Peyerske plaques er en beriget kilde til prækursor IgA-celler, som 5 efter antigen-sensibilisering cirkulerer og er årsag til, at IgA udtrykkes i såvel området for den oprindelige udsættelse for antigen som på slimhindeoverflader langt derfra. Dette cirkulerende mønster giver et slimhinde-immunrespons ved kontinuerligt at transportere sensibiliserede B celler til slimhinder, hvor der sker respons på i tarmen mødte antigener fra omgivelserne eller potentielle patoge-10 ner.
WO 87/03197 anviser en farmaceutisk sammensætning, som omfatter natrium-kromglycat til behandling af astma hypersensitivitet. Denne sammensætning er således beregnet til at reducere immunresponset i modsætning til at forstærke 15 et immunrespons. Der findes andre sammensætninger inden for området, som omfatter et lægemiddel eller medikament der bevirker at et immunrespons undgås frem for at forstærke det. Dette ses blandt andet i EP-A-257.915, som beskriver en sammensætning til behandling af astma, og i US-A-4.542.025, som angår en fremgangsmåde til fremstilling af en komposition, som omfatter mikro-20 partikler indeholdende et antiinflammatorisk middel; mikropartikleme har fortrinsvist en størrelse på op til 200 pm. En artikel i "Biomedical Applications of Microencapsulation”, Ed. F. Lim, kapitel 3, side 53 - 72, angår ligeledes mikro-sfærer indeholdende lægemiddel, som kan administreres parenteralt. En anden artikel af T.M.S. Chang offentliggjort i Journal of Bioengineering, Vol. 1, pp. 25 25 32,1976, anviser anvendelsen af semipermeable mikrokapsler til indkapsling af biologisk aktive midler, som er blevet injiceret til frigivelse af midlet i blodstrømmen. Artursson et al. , Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 73, Nr. 11, pp.
1507 - 1513, har studeret anvendelsen af polyacryl stivelses mikropartikler, . som et lægemiddelbærende system, som anvendes ved injektion af af læge- 30 midler. Den sammensætning som anvises i alle disse dokumenter forventes ikke at inducere et immunrespons, hvilket er formålet med den foreliggende opfindelse.
4 DK 175961 B1
Endvidere var det kendt inden for området at fremstille sammensætninger til oral administrering eller administration ved injektion. I EP-A-266.119 anvises for eksempel en fremgangsmåde og en formulering til at bringe en bioaktiv ingrediens til Peyers plaques i den gastro-intestinale tragt. WO 88/01213 angår leve-5 ringssystemer til farmakologiske midler, som administreres i proteinoide mikro-sfærer, som leverer midlet enten i den neutrale blodstrøm eller den gastro-intestinale tragt. WO 84/00294 er rettet mod en krystallinsk carbohydratmatrix til forsinket frigivelse af af et middel, der hvor depot matricen er injiceret.
10 Cox & Taubman, Int. Archs. Allergy appl. Immun. 75:126-131 (1984) omtaler oral antigen induceret sekretorisk antigen respons, og Cox & Muench, Int. Archs. Allergy appl. Immun. 74:249-255 (1984) omtaler effekten ved at introducere et antigen ved gastrisk intubering, dvs via den orale vej. Schroder & Stahl, Journal of Immunological Methods, 70 (1984) 127 - 132, anviser en frem-15 gangsmåde til fremstilling af en matrix med indespærrede antigen, som skal administreres ved injektion. EP-A-292.710 er et dokument som angår en proces til fremstilling af sammensætninger indeholdende mikrokapsler, som er produceret ved en speciel proces, hvor mikrokapsleme fortrinsvist har en størrelse på mellem 30 - 120 μιτι og bliver administreret ved injektion. D.O’Hagen (1987) 20 CRC Critical Reviews, Therapeutic Drug Carrier Systems, 4, 197 -220, understreger den oral administration og den intestinale absorbtion af partikulært materiale. En artikel af Kreuter & Liehl, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 70, Nr. 4, pp 367 - 371 (1981) angår brug af nanopartikler og nanokapsler til injektion af antigener. Hvorom alting er, ingen af disse formuleringer angår 25 MALT.
Yderligere blev det tidligere anset for nødvendigt at have et antigen på overfladen for at gøre denne kendt for immunforsvaret og få et immunrespons. Dette blev for eksempel understreget i FR-A-2.304.326, af Artursson og al., i J.
30 Pharm. Exp. Therap. 234, 255- 260 (1985), af Cox & Taubvmand og af Cox & Muench (krediteret ovenfor) og af kreuter & Liehl. Derimod har opfinderne af den foreliggende opfindelse fundet at et antigen kan inducere et immunrespons hvis det er indkapslet under betingelse af at parametrene i krav 1 er opfyldt.
5 DK 175961 B1
Af særlig vigtighed for den foreliggende opfindelse er evnen til ved oral immunisering at inducere beskyttende antistoffer. Det er kendt, at dyrs indtagelse af antigener fører til forekomsten af antigen-specifikke slgA antistoffer i bronchial-5 og næseskylninger. For eksempel viser undersøgelser foretaget med frivillige mennesker, at oral administrering af influenzavaccine er effektiv til inducering af sekretoriske anti-influenza antistoffer i næsesekreter.
Der er derfor et behov for en fremgangsmåde til immunisering gennem andre 10 slimhindevæv end den gastro-intestinale tragt, som kan overvinde problemet med nedbrydning af antigenet og målretter leveringen af antigenet til det slimhindeassocierede lymfoide væv. Endvidere er der et behov for beskyttelse mod nedbrydning af på slimhinden påførte immunogiserende midler, forbedring og/eller målretning af deres indtrængen i kroppen gennem de slimhindeassocie-15 rede lymfoide væv og frigivelse af det immunogiserende middel, når det først er kommet ind i kroppen.
Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af biokompatible mikrokapsler, hvilke biokompatible mikrokapsler omfatter et immunogen indkapslet i en bio-20 kompatibel excipiens og som har en størrelse mindre en ca. 10 pm til fremstilling af et middel til indgivelse nasalt, rektalt, oftalmisk, intratrachealt eller ved oral inhalering af immunogenet til slimhindeassocierede lymforetikulære væv i mennesker eller dyr. Foretrukne udførelsesformer er angivet i krav 2-15.
25 Den foreliggende opfindelse angår også en sammensætning til stimulering af immun respons hos et menneske eller et dyr, som omfatter en blanding af en første mængde biokompatible mikrokapsler, der har en størrelse på mindre end cirka 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en første biokompatibel excipiens, og en anden mængde biokompatible mikrokapsler, der har en 30 størrelse på mere end 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en anden biokompatibel excipiens, hvor den første mængde af mikrokapsler forårsager et primært immunologisk respons og den anden mængde af mikrokapsler 6 DK 175961 B1 frigiver det aktive stof, som er indeholdt i den anden mængde mikrokapsler, pulserende til potensering af et efterfølgende immunologisk respons.
Foretrukne udførelsesformer er blandt andet angivet i krav 17-19.
5
Endnu et formål med opfindelsen er at anvise en anvendelse af en sammensætning, som omfatter en blanding af en første mængde biokompatible mikrokapsler, der har en størrelse på mindre end ca. 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens, og en anden mængde bio-10 kompatible mikrokapsler, der har en størrelse på mere end 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens, hvor den første mængde af mikrokapsler forårsager et primært immunologisk respons og den anden mængde af mikrokapsler frigiver det aktive stof, som er indeholdt i den anden mængde mikrokapsler, pulserende til potensering af et efterfølgende 15 immunologisk respons i et menneske eller dyr.
Et yderligere formål med opfindelsen er anvendelsen til fremstilling af en kombineret sammensætning, som omfatter en første mængde biokompatible mikrokapsler, som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens 20 og som har en størrelse på mellem 1pm og 10 pm, der indgives til et menneske eller et dyr på en første måde, samt en anden mængde biokompatible mikrokapsler, som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens og som har en størrelse på mellem 1pm og 10 pm, der indgives til et menneske eller et dyr på en anden måde end den første måde til potensering af et efter-25 følgende immunologisk respons hos et menneske eller dyr.
Den foreliggende opfindelse angår blandt andet en formulering til målretning mod og efterfølgende frigivelse af et immunogenisk middel i kroppen på et dyr ved slimhinde applikering, og specielt ved intratracheal administrering. Midlet er 30 mikroindkapslet i en biokompatibel polymer eller copolymer, fortrinsvist en bionedbrydelig polymer eller copolymer, som kan eksistere på en slimhindeoverflade uden at nedbrydes eller kun nedbrydes minimalt, således at midlet når til 7 DK 175961 B1 og overgår til det slimhindeassocierede lymfoide væv (MALT) uforandret og i en effektiv mængde. Udtrykket biokompatibel er defineret som et polymert materiale, som ikke er toksisk for kroppen, ikke er carcinogent og som ikke vil inducere inflammation i kropsvævet. Det foretrækkes at mikrokapslemes polymere exci-5 piens er bionedbrydeligt i den forstand at den bliver nedbrudt ved processer i | kroppen til produkter som kroppen kan skille sig af med og som ikke akkumule res i kroppen. Mikrokapslerne er også af en størrelse og fysisk-kemisk sammensætning, som betyder at de effektivt og selektivt kan optages af det slimhindeassocierede lymfoide væv. Dermed er problemerne med at midlet når an-10 dre slimhindeassocierede væv og optages der, løst.
Det er yderligere et formål med den foreliggende opfindelse at anvise en fremgangsmåde til administrering af et antigen til et dyr, hvilket resulterer i at antigenet når frem til og optages af de slimhindeassocierede lymfoide væv, og derved 15 stimulerer slimhindeimmunsystemet, uden at tabe effektivitet som et resultat af nedbrydning på slimhindeoverfladen.
Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at anvise en fremgangsmåde til administrering af et antigen til et dyr, hvilket resulterer i at antigenet 20 optages af de slimhindeassocierede lymfoide væv, og derved stimulerer slimhindeimmunsystemet, uden at tabe effektivitet som et resultat af nedbrydning på slimhindeoverfladen.
Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at anvise en fremgangs-25 måde til administrering af et immunogenisk middel til et dyr, hvilket resulterer i at midlet når frem til og optages af de slimhindeassocierede lymfoide væv, og derved forårsager en forøget lokal eller systemisk koncentration af midlet.
Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at anvise en formulering 30 bestående af en kerne indeholdende immunogenisk ingrediens og en indkapslende polymer eller copolymer excipiens, som er biokompatibel og fortrinsvist også bionedbrydelig, som kan anvendes ved den slimhinde-administrations fremgangsmåde, der er nævnt ovenfor.
8 DK 175961 B1
Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at anvise et forbedret vaccineleveringssystem, som forebygger behovet for immunpotentiatorer.
Endnu et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at anvise et for-5 bedret vaccineleveringssytem til inducering af immunitet gennem pulserende frigivelse af antigen udfra en administrering af mikroindkapslet antigen.
Endnu et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at anvise et forbedret vaccineleveringssytem som både forebygger behovet for immunpotentia-10 torer og som inducerer immunitet gennem pulserende frigivelse af antigen udfra en enkelt administrering af mikroindkapslet antigen.
Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at anvise en sammensætning, som er i stand til at realisere de ovennævnte mål.
15
KORT BESKRIVELSE AF FIGUREN
Figuren viser plasma IgA-respons i mus bestemt ved titrering til endepunkt.
20 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN
Beskrivelser af fremgangsmåder til udførelsesformer for opfindelsen følger nedenfor. Disse beskrivelser viser målrettetheden mod de slimhinde-associerede-lymfoide-væv og den programmerede indføring af antigenerne (trinitrophenyl-: 25 keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH) og en toxoidvaccine af Staphylococcus enterotoxin B) og et lægemiddel (etretinat) indkapslet i 50:50 poly(DL-lactid-co-glycolid) til mus.
Det skal imidlertid bemærkes, at der kan anvendes andre polymere foruden 30 poly(DL-lactid-co-glycoHd). Eksempler på sådanne polymerer omfatter, men er ikke begrænset til, poly(glycolid), poly(DL-lactid-co-g!ycolid), copolyoxalater, polycaprolacton, poly(lactid-co-caprolacton), poly(esteramider), polyorthoestere og poly(8-hydroxysmørsyre) og polyanhydrider.
9 DK 175961 B1
Der kan også bruges andre bioaktive bestanddele. Eksempler på sådanne omfatter, men er ikke begrænset til, antigener til vaccinering mod sygdomme forårsaget af vira, bakterier, protozoer eller svampe, såsom influenza, respiratorisk syncytial, parainfluenza-vira, Hemophilus influenza, Bordetella pertussis, Neis-5 seria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae og Plasmodium falciparum eller andre sygdomme forårsaget af patogene mikroorganismer, eller antigener til vaccinering mod sygdomme forårsaget af makroorganismer, såsom hel-minthiske patogener, eller antigener til vaccinering mod allergier. Andre anvendelige bioaktive stoffer omfatter, men er ikke begrænset til, immunomodulatorer, 10 næringsstoffer, lægemidler, peptider, lymfokinerog cytokiner.
I. MIKROINDKAPSLING
15 A. Fremstilling af farveholdige mikrokapsler
Kumarin, et ikke-vandopløseligt fluorescerende farvestof, blev mikroindkapslet i polystyren, en ikke-bionedbrydelig polymer, hvorved opnåedes fluorescerende mikrokapsler, der kunne bruges til at følge mikrokapslers penetration ind i de 20 Peyerske plaques. Mikrokapsleme blev fremstillet ved følgende fremgangsmåde:
Man fremstillede først en polymeropløsning ved at opløse 4,95 g polystyren (type 685D, Dow Chemical Company, Midland, Mi) i 29,5 g methylenchlorid (Syn-25 tesekvalitet, Eastman Kodak, Rochester, NY). Derefter blev ca. 0,05 g kumarin (Polysciences, Inc., Warrington, PA) sat til polymeropløsningen og opløst ved omrøring af blandingen med en magnetomrører.
I en separat beholder blev 10 vægt-% vandig polyvinylalkohol (PVA) opløsning, 30 reaktionsmediet, fremstillet ved at opløse 40 g PVA (Vinol 2050, Air Products and Chemicals, Allentown, PA) i 360 g ionbyttet vand. Efter fremstilling af PVA-opløsningen mættes opløsningen ved tilsætning af 6 g methylenchlorid. Dernæst sættes PVA-opløsningen til en 1 liters beholder (Ace Glass, Inc., Vineland, e 10 DK 175961 B1 NJ) udstyret med en gennemgående omrøringsaksel og en 6,35 cm teflonomrø-rer og omrøres ved ca. 380 rpm med en Fisher motor med konstant hastighed.
i
Polystyren/kumarin-blandingen sættes derpå til beholderen indeholdende PVA-5 reaktionsmediet. Dette udføres ved at hælde polystyren/kumarin-blandingen gennem en langstilket 7 mm tragt, som leder blandingen ind i beholderen. Der fremkommer en stabil olie-i-vand emulsion, som dernæst omrøres i ca. 30 minutter ved omgivelsernes tryk til opnåelse af mikrodråber af olie med en passende størrelse. Beholderen lukkes derpå, og trykket i beholderen reduceres 10 gradvist til 520 mmHg ved hjælp af en vandstrålepumpe forbundet til et manometer og en udluftningsventil. Beholderens indhold omrøres ved reduceret tryk i ca. 24 timer, således at alt methylenchloridet afdamper. Derefter opsamles de størknede mikrokapsler ved centrifugering, og de tørres i 72 timer i et vakuumkammer, som holdes ved stuetemperatur.
15 B. Fremstilling af antigen-holdige mikrokapsler I TNP-KLH, et vandopløseligt antigen, blev indkapslet i poly(DL-lactid-co- ' glycolid), en biokompatibel, bionedbrydelig polyester. Mikrokapsleme blev frem- 20 stillet ved følgende fremgangsmåde:
Man fremstillede først en polymeropløsning ved at opløse 0,5 g 50:50 poly(DL-lactid-co-glycolid) i 4,0 g methylenchlorid. Derefter blev 300 pi af en vandig opløsning af TNP-KLH (46 mg TNP-LKH/ml, efter dialyse) sat til og homogent dis-25 pergeret i poly(DL-lactid-co-glycolid)-opløsningen ved hvirvelstrømsblanding på en Vortex-Genie 2 (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY).
I en separat beholder blev en 8 vægt-% vandig PVA-opløsning fremstillet ved opløsning af 4,8 g PVA i 55,2 g ionbyttet vand. Efter opløsning af PVAen, sæt-30 tes PVA-opløsningen til en 100 ml beholder (Kontes Glass, Inc., Inc., Vineland, NJ) udstyret med en gennemgående omrører og en 3,8 cm teflon turbineomrø-rer. Polymeropløsningen blev derpå tilsat PVA-reaktionsmediet ved udhæld-ning gennem en langstilket tragt. Under tilsætningen blev PVA-opløsningen omrørt ved ca. 650 rpm. Efter ca. 10 minutters omrøring af den herved fremkomne 11 DK 175961 B1 oiie-i-vand-emulsion i beholderen, blev beholderens indhold overført til 3,5 I ionbyttet vand indeholdt i et 4 I bægerglas og omrørt ved ca. 800 rpm med en 5 cm omrører af rustfrit stål. De herved fremkomne mikrokapsler blev omrørt i det ionbyttede vand i ca. 30 minutter, opsamlet ved centrifugering, vasket to gange 5 med ionbyttet vand til fjernelse af resterende PVA og derpå opsamlet ved frysetørring. Mikrokapselproduktet bestod af sfæriske partikler med en diameter på 1-10 pm. Andre mikrokapsler, som f.eks mikrokapsler med Staphylococcus en-terotoxin B, kan fremstilles på lignende måde.
10 TNP-KLH-indholdet af de antigenholdige mikrokapsler, d.v.s. kærneindholdet af mikrokapslerne, blev bestemt ved udvejning af 10 mg antigenholdige mikrokapsler i et 12 ml centrifugeglas. Der tilsættes 3,0 ml methylenchlorid til glasset, som hvirvelstrømsblandes til opløsning af poly(DL-lactid-co-glycolid). Dernæst sættes 3,0 ml ionbyttet vand til glasset, og der hvirvelstrømsblandes kraftigt i 1 15 minut. Indholdet af centrifugeglasset centrifugeres til adskillelse af de organiske og vandige lag. Det vandige lag overføres til en 10 ml målekolbe. Ekstraktionen gentages, idet de vandige lag kombineres i målekolben. Kolben fyldes op til mærket med ionbyttet vand. Mængden af TNP-KLH i kolben, og således mængden af TNP-KLH i mikrokapslerne, bestemmes derefter ved brug af et 20 protein assay. Mikrokapslerne indeholdt 0,2 vægt-% TNP-KLH. Indholdet af Staphylococcus enterotoxin B i Staphylococcus enterotoxin B mikrokapsler kan kvantificeres pålignende måde.
II. PENETRATION AF FARVESTOFHOLDIGE MIKROKAPSLER IND I DE 25 PEYERSKE PLAQUES EFTER ORAL ADMINISTRERING
De Peyerske plaques er langt den største vævsmasse, der har evne til at fungere som et induktivt sted for sekretoriske IgA-nesponser. Disse isolerede små knuder af lymforetikulært væv er beliggende langs hele tyndtarmens og blind-30 tarmens længde. Den målrettede indføring af intakt antigen direkte ind i dette væv til opnåelse af høj lokal koncentration antages på nuværende tidspunkt at være den mest effektive måde at inducere et udbredt IgA-respons i slimhinden. Bionedbrydelige mikrokapsler udgør et ideelt vehikel til opnåelse af denne målrettede vaccinering.
12 DK 175961 B1 | EKSEMPEL 1 - Optagelse af mikrokapsler af polystyren I Optagelsen af mikrokapsler ind i de tarmassocierede lymforetikulære væv og i ! 5 størrelsesrestriktionen af denne penetration blev undersøgt ved oral administre ring af polystyrenmikrokapsler indholdende det fluorescerende farvestof kumarin.
Ikke bedøvede, fastede BALB/c mus fik ved hjælp af en fødekanyle i maven 10 indgivet 0,5 ml af en 100 mg/ml suspension af fluorescerende mikrokapsler af forskellig størrelse (under 5 pm eller 8-50 pm i diameter) i ledningsvand. Til forskellige tidspunkter efter indgivelsen (0,5, 1 og 2 timer) blev musene slået ihjel og tyndtarmen udtaget. Tarmstykker på 1 cm indholdende en isoleret Peyersk plaque blev isoleret, lumenindholdet skyllet af, krænget ud og lynfrosset. Der 15 blev lavet frysesnit, som undersøgtes under fluorescensmikroskop med henblik på at observere antal, beliggenhed og størrelse af de mikrokapsler, som fra tarmlumen var optaget i den Peyerske plaque.
Skønt der var sket nogen indfangning af mikrokapsleme mellem villi, som havde 20 forhindret fjernelsen af disse ved skylningen, sås der ingen penetration ind i vævene påandre steder end i den Peyerske plaque. Der blev observeret mikrokapsler i den Peyerske plaque af den proximale, men ikke den distale del af tyndtarmen 0,5 time efter indgivelsen. Efterhånden blev mikrokapsleme transporteret af de peristaltiske bevægelser, således at de efter 2 timers forløb sås 25 gennem hele mavetarmkanalen og kunne ses i de Peyerske plaques i ileum. De endocyterede mikrokapsler var i overvejende grad beliggende perifert, væk fra apex af den Peyerske plaque-kuppel, hvilket giver indtryk af, at fysisk indfangning mellem kuplen og tilstødende villi under peristaltisk bevægelse har hjulpet til deres optagelse. Sammenligning af optagelseseffektiviteten af præparatet på 30 <5 pm versus præparatet på 8-50 pm viste, at mikrokapsler >10 pm i diameter ikke blev absorberet ind i de Peyerske plaques, medens mikrokapsler på 1-10 pm i diameter blev hurtigt og selektivt optaget. Dette antydede, at mikrokapsler bestående af bionedbrydelige vægmaterialer ville udgøre et effektivt middel for 13 DK 175961 B1 den målrettede indføring af antigener til de lymforetikulære væv til induktion af immunitet på slimhindeoverflader.
EKSEMPEL 2 - Mikrokapsler af 85.15 poly(DL-lactid-co-glycolid) 5 1. Optagelse af biokompatible og bionedbrydelige mikrokapsler i de Peyerske plaques
Grupper af mus blev via en gastrisk slange indgivet bionedbrydelige mikro-10 kapsler indeholdende det fluorescerende farvestof kumarin-6 i form af en suspension i ledningsvand. Det til disse undersøgelser valgte mikrokapsel-vægmateriale bestod af 85:15 poly(DL-lactid-co-glycolid) på grund af dets evne til at modstå signifikant bioerosion i et tidsrum på seks uger. Til forskellige tidspunkter fra 1 til 35 dage efter indgivelsen blev tre repræsentative Peyerske pla-15 ques, de vigtigste mesenteriske lymfeknuder og milten fra individuelle mus fjernet, bearbejdet og serielle frysesnit fremstillet.
Ved betragtning under et fluorescensmikroskop med anvendelse af passende excitations- og barrierefiltre udviste kumarin en dyb grøn fluorescens, som tillod 20 visuel detektering af mikrokapsler, som var væsentligt mindre end 1 μιτι i diameter. Man så på alle snittene, således at det totale antal mikrokapsler i hvert væv eller organ kunne bestemmes. Størrelsen af hver af de optagne mikrokapsler blev bestemt ved anvendelse af et kalibreret okularmikrometer og beliggenheden inden for vævet eller organet noteret.
25
Optagede mikrokapsler af forskellig størrelse blev observeret i de Peyerske plaques 24 timer efter oral administrering og til alle de undersøgte tidspunkter op til 35 dage som vist i tabel 1. På intet tidspunkt sås mikrokapsler af nogen størrelse at penetrere ind i tarmvævet på andre steder end de Peyerske pla-30 ques. Det totale antal mikrokapsler inde i de Peyerske plaques forøgedes til dag 4 og aftog derefter over de efterfølgende 31 dage til ca. 15 % af det højeste antal.
14 DK 175961 B1
Dette stemmer overens med den iagttagelse, at frie mikrokapsler kunne ses på overfladen af tarmvilli til tidspunkterne 1, 2 og 4 dage. Det er interessant, at ca.
10 timer efter oral administerering af mikrokapselsuspensionen, kunne de ku-marinholdige mikrokapsler rent faktisk ses i de passerede fæces. Denne ud-5 tømning blev fulgt ved hjælp af en ultraviolet lyskilde, og til tiden 24 timer var størstedelen af de indtagede mikrokapsler passeret. Den fortsatte optagelse af mikrokapsler i de Peyerske plaques, som sås på 2. og 4. dagen må således skyldes den lille del af den indgivne dosis, som blev indfanget i slim mellem tarmvilli. Endvidere må optagelseseffektiviteten for de fangede mikrokapsler 10 være flere gange større end for de mikrokapsler, der er tilstede i tarmlumen, men over slimlaget. Disse iagttagelser er vigtige, når man ekstrapolerer disse data til mennesket. Den uhyre meget større masse af Peyersk plaque-væv og den meget længere tid, det tager for materiale at passere gennem den humane tyndtarm i forhold til musen, tyder på, at effektiviteten af mikrokapslemes opta-15 gelse ind i de humane Peyerske plaques vil være meget større.
Der observeredes mikrokapsler af forskellig størrelse inde i de Peyerske plaques til alle de testede tidspunkter, se tabel 1. Til tidspunkterne 1, 2 og 4 dage forblev andelen af mikrokapsler på <2 pm (45-47 %), 2-5 pm (31-35 %) og >5 20 pm (18-23 %) relativt konstant. Det var tydeligt efter 7 dage og endog mere tydeligt til senere tidspunkter, at der var et skift i størrelsesfordelingen, således at de små (<2 pm) og mellemstore (2-5 pm) mikrokapsler ikke længere dominerede, og de store (>5 pm) mikrokapsler blev den talmæssigt stærkest repræsenterede art. Dette skift var sideløbende med nedgangen i det totale antal mikro-25 kapsler i de Peyerske plaques, som sås på og efter dag 7. Disse resultater stemmer overens med den foretrukne bevægelse af de små og mellemstore størrelser mikrokapsler fra de Peyerske plaques, medens de store (>5 pm) mikrokapsler foretrukkent bibeholdes.
30 Overensstemmende med den foretrukne bevægelse af de småog mellemstore mikrokapsler ud af de Peyerske plaques er data angående beliggenheden af mikrokapsleme inde i strukturen af de Peyerske plaques. Når en mikrokapsel sås inde i den Peyerske plaque, sås den enten at være forholdsvis nær kuppe-lepithelet, hvor den trådte ind den Peyerske plaque (inden for 200 pm) eller dy- 15 DK 175961 B1 bere inde i det lymfoide væv (>200 mp fra det nærmeste identificerbare kuppe-lepithel) (tabel 1). Mikrokapsler observeret dybt inde i det Peyerske plaque-væv var næsten alle af lille eller mellemstor diameter. På 1. dagen efter indgivelsen var 92 % af mikrokapsleme beliggende nær ved kuppelepithelet. Andelen af 5 dybt beliggende mikrokapsler steg gennem dag 4 til 24 % af det totale og faldt derefter med tiden til ca. 2 % på dag 14 og senere. De små og mellemstore mikrokapsler bevæger sig således gennem og ud af de Peyerske plaques, medens de store (>5 pm) mikrokapsler forbliver inden for kuppelområdet i et forlænget tidsrum.
10 2. Bevægelse af mikrokapsler til de mesenteriske lymfeknuder og milten
Der observeredes et lille antal mikrokapsler i de mesenteriske lymfeknuder på dag 1 efter indgivelsen, og antallet steg progressivt til og med dag 7, se tabel 2.
15 Efter dag 7 gik antallet ned, men var stadig påviseligt på dag 35. Størrelsesfordelingen viste klart, at mikrokapsler på >5 pm i diameter ikke kom ind i dette væv, og den større andel af små (<2 pm) i forhold til mellemstore (2-5 pm) mikrokapsler på de tidligere tidspunkter indikerede, at mikrokapsleme med den mindre diameter bevæger sig til dette væv med størst effektivitet. Dertil kom-20 mer, at påde tidligere tidspunkter var størstedelen af mikrokapsleme beliggende lige under kapslen i den subkapsulære sinus. Senere tidspunkter viste et skift i fordelingen til dybt inde i lymfeknudestrukturen, og ved dag 14 var 90 % af mikrokapsleme beliggende inde i cortex og de medullære områder. Den iagttagelse, at mikrokapsleme først kan påvises i eller nær den subkapsulære sinus 25 stemmer overens med, at de ledes ind i dette væv via lymfekarrene, som tømmer de Peyerske plaques. En progressiv stigning i andelen af mikrokapsler beliggende dybt i dette væv, let skelnelig på 4. dagen, efterfulgt af et progressivt fald i det totale antal på dag 14 og senere, tyder på, at mikrokapsleme fortsætter gennem dette væv og siver ud gennem den efferente lymfedrænage. (*) 30
Lignende undersøgelse af milten viste, at mikrokapsler ikke var påviselige før dag 4 efter indgivelsen. Det højeste antal mikrokapsler sås først på dag 14.
Som det var tilfældet for de mesenteriske lymfeknuder, sås ingen mikrokapsler med en diameter på >5 pm. Til alle tidspunkter sås mikrokapsleme dybt inde i 16 DK 175961 B1 cortex af dette organ. Det skal bemærkes, at det største antal mikrokapsler sås i milten på et tidspunkt, hvor de fleste af mikrokapsleme i de mesenteriske lymfeknuder lå dybt inde, og deres samlede antal var i aftagende. Disse data stemmer overens med det kendte mønster for lymfedrænage fra de Peyerske 5 plaques til de mesenteriske lymfeknuder og fra de mesenteriske lymfeknuder til blodbanen via ductus thoracius. Det lader således til, at de mikrokapsler, der ses i milten, er gået igennem de Peyerske plaques og de mesenteriske lymfeknuder og er kommet ind i milten via blodstrømmen.
10 Ved yderligere forsøg blev vævssnit fra de Peyerske plaques, mesenteriske lymfeknuder og milten, som indeholdt absorberede 85:15 DL-PLG-mikrokapsler undersøgt ved histokemiske og immunohistokemiske teknikker. Blandt andet viste disse undersøgelser klart, at de mikrokapsler, som blev absorberet ind i de Peyerske plaques, fandtes inde i makrofaglignende celler farvet med periodsyre 15 Schiffs reagens (PAS) for intracellulær carbonhydrat, formentlig glycogen, og for major histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II antigen. Endvidere fandt man, at mikrokapsleme observeret i de mesenteriske lymfeknuder generelt var ført dertil inde i disse PAS- og MHC klasse Il-positive celler. De antigenholdige mikrokapsler er således blevet optaget i de Peyerske plaques ved antigen-20 præsenterende accessoriske celler (APC), og disse APC har udbredt antigen-mikrokapslerne til andre lymfoide væv.
Disse data tyder på, at kvaliteten af immunresponset induceret ved oral indgivelse af en mikroindkapslet vaccine kan kontrolleres ved størrelsen af partiklen.
25 Mikrokapsler <5 pm i diameter siver ud fra de Peyerske plaques inde i APC og frigiver antigenet i lymfoide væv, der er induktive steder for systemiske immunresponser. Derimod forbliver mikrokapsler på 5-10 pm i diameter i de Peyerske plaques, ligeledes inden i APC, i et længere tidsrum og frigiver antigenet ind i dette slgA-induktive sted.
30 EKSEMPEL 3 - Sammenligning af optagelse i de Peyerske plaques af mikrokapsler af 10 forskellige sammensætninger 17 DK 175961 B1
Der blev udført forsøg for at identificere de mikrokapsel-polymerexcipienser, som ville være nyttige ved et praktisk indføringssystem med kontrolleret frigivelse, og som ville besidde de fysisk-kemiske egenskaber, der ville tillade målrettet absorption af mikrokapsler i de slimhindeassocierede lymforetikulære 5 væv. Hvad angår sidstnævnte hensyn, har forskning vist, at hydrofobe partikler lettere fagocyteres af cellerne i det retikuloendotheliale system. Derfor undersøgte man absorptionen i de Peyerske plaques af mikrokapsler med en diameter på 1-10 pm fremstillet af 10 forskellige polymere spændende over en vis rækkevidde, hvad angår hydrofobicitet. De valgte vægmaterialer til disse under-10 søgelser bestod af polymerer, der varierede med hensyn til vandoptagelse, bio-nedbrydelighed og hydrofobicitet. Disse polymerer omfattede polystyren, poly(L-lactid), poly(DL-lactid), 50:50 poly(DL-lactid-co-glycolid), 85:15 poly(DL-lactid-co-glycolid), poly(hydroxysmørsyre), poly(methylmethacrylat), ethylcellulose, celluloseacetat-hydrogenphthalat og cellulosetriacetat. Mikrokapsler fremstillet 15 af 7 ud af de 10 excipienser blev absorberet og sås overvejende i kuppel-området af de Peyerske plaques 48 timer efter oral indgivelse af en suspension indeholdende 20 mg mikrokapsler, se tabel 3. Der sås ikke penetration af mikro-sfærer ind i andre væv end de Peyerske plaques. Med én undtagelse, ethylcellulose, fandtes absorptionseffektiviteten at korrelere med den relative hydrofobi-20 citet af excipienset. Der observeredes op til 1.500 mikrokapsler i de tre repræsentative Peyerske plaques fra de mus, der blev indgivet den mest hydrofobe gruppe af forbindelser [poly(styren), poly(methylmethacrylat), po-ly(hydroxybutyrat)], medens 200 til 1.000 mikrokapsler blev observeret med de relativt mindre hydrofobe polyestere [poly(L-lactid), poly(DL-lactid), 85:15 po-25 ly(DL-lactid-co-glycolid) og 50:50 poly(DL-lactid-co-glycolid)]. Klassen af celluloseforbindelser blev ikke absorberet.
Man har fundet, at mikrokapslemes fysisk-kemiske egenskaber regulerer mål-rettetheden af mikrokapslerne gennem effektiviteten af deres absorption fra 30 tamrilumen af de Peyerske plaques, og at dette er et overfladefænomen. Derfor kan ændringer i mikrokapslemes overfladeegenskaber i form af kemiske modifikationer af polymeren eller i form af overtræk bruges til at regulere den effektivitet, hvormed mikrokapslerne målretter overførslen af bioaktive stoffer til slimhindeassocierede lymfoide væv og til APC. Eksempler på overtræksmaterialer 18 DK 175961 B1 er kemiske stoffer, polymere, antistoffer, bioadhæsiver, proteiner, peptider, car-bonhydrater, lectiner og lignende af såvel naturlig som kunstig oprindelse.
Opsamling af biologiske væsker 5 1. Plasma. Blod blev efter punktering af det retro-orbitale plexus opsamlet i kalibrerede kapillærpipetter. Efter størkning blev serum opsamlet, centrifugeret til fjernelse af røde blodceller og blodplader, varmeinaktiveret og opbevaret ved -70 0C indtil udførelse af assay.
10 2. Tarmsekreter. Mus blev indgivet fire doser (0,5 ml) udskylningsopløsning [25 mM NaCI, 40 mM Na2S04, 10 mM KCI, 20 mM NaHCOa og 48,5 mM po-ly(ethylenglycol) med en osmolaritet på 530 mosMJ med intervaller på 15 minutter [Elson, C.O., Ealding, W. og Lefkowitz, J., "A lavage technique allowing repeated measurement of IgA antibody on mouse intestinal secretions", J. Immu-15 nol. Meth. 67:101 (1984)]. Femten minutter efter den sidste udskylning blev musene bedøvet, og efter yderligere 15 minutter blev de indgivet 0,1 mg pilocarpin ved intraperitoneal injektion. Over de næste 10-20 minutter stimulerede man udtømning af tarmindholdet. Dette blev opsamlet i en petriskål indeholdende 3 ml af en opløsning af 0,1 mg/ml sojabønne-trypsininhibitor (Sigma, St. Louis, 20 MO) i 50 mM EDTA, kraftigt hvirvelstrømsblandet og centrifugeret til fjernelse af suspenderet stof. Supernatanten blev overført til et polycarbonat-centrifugerør med rund bund, og der tilsattes 30 μΙ 20 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma) før klaring ved centrifugering med høj hastighed (27.000 x g, 20 minutter, 4 0C). Efter klaring blev tilsat 20 μΙ hver PMSF og 1 % natriumazid, og 25 opløsningen gjort 10 % i FCS til opnåelse af et alternativt substrat for eventuelt tilbageværende proteaser.
3. Spyt. Samtidig med tarmudtømningen secerneres et stort volumen spyt, og 0,25 ml deraf blev ved hårrørsvirkning opsamlet i en pasteurpipette. Tyve μΙ hver trypsininhibitor, PMSF, natriumazid og FCS blev tilsat før klaring.
30 4. Bronchial-alveolære-skyllevæsker. Der opnåedes bronchial-alveolære- skyllevæsker ved at skylle lungerne med 1,0 ml PBS. En foderkanyle til dyr blev indført intratrachealt og fikseret ved binding med sutur. PBS blev indført og trukket ud 5 gange for at opnå vaskevæsker, hvortil var sat 20 μΙ hver trypsininhibitor, PMSF, natriumazid og FCS før klaring ved centrifugering.
19 DK 175961 B1 5. Immunokemiske reagenser. Fastfase-absorberede og affinitetsoprensede I polyklonale gede IgG antistoffer, specifikke for muse IgM, IgG og IgA, blev ind- ! købt kommercielt (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL). Speci ficiteten deraf i radioimmunassays blev testet ved deres evne til at binde mo- 5 noklonale antistoffer og myeloma proteiner af passende oprensning.
6. Fastfase radioimmunassays. Oprensede antistoffer blev mærket med bærerfrit Na 125l (Amersham) ved brug af chloramin T-metoden [Hunter, W.M., "Radioimmunoassay" i Handbook of Experimental Immunology, M. Weir (ed.). Blackwell Scientific Publishing, Oxford, p. 14.1, (1978)]. "Immulon Removaweir 10 assay-strimler (Dynatech) blev overtrukket med TNP-konjugeret bovin serumalbumin (BSA) eller Staphylococcus enterotoxin B i en mængde på 1 pg/ml i BBS natten over ved 4 0C. Kontrolstrimler blev ikke overtrukket, men alle strimlerne blev blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med 1 % BSA i BBS, der blev brugt som fortyndingsmiddel til alle prøver og 125l-mærkede reagenser. Prøver af bio-15 logiske væsker blev fortyndet på passende vis, sat til skyllede 3 gange vaskede replicerede brønde og inkuberet 6 timer ved stuetemperatur. Efter skylning blev 100.000 cpm 125l-mærket isotypespecifik anti-immunglobulin sat til hver brønd og inkuberet natten over ved 4 0C. Efter fjernelse af ikke-bundne 125l-antistoffer ved skylning blev brøndene talt i et Gamma 5500 spektrometer (Beckman In-20 struments, Inc., San Ramon, CA). Hvor det drejede sig om assays for TNP-specifikke antistoffer, blev der foretaget kalibreringer ved anvendelse af dobbelte fortyndingsrækker af et standardserum (Miles Scientific, Naperville, IL) indeholdende kendte mængder immunglobuliner på brønde overtrukket med 1 pg/brønd isotypespecifikke antistoffer. Kalibreringskurver og interpolation af 25 ukendte blev opnået på computer, idet man anvendte "Logit-log" eller "Four Parameter Logistic" BASIC Technology Center (Vanderbilt Medical Center, Nashville, TN). Hvor det drejede sig om antistoffer specifikke for Staphylococcus enterotoxin B, angives resultaterne som den reciprokke serumfortynding, der frembringer et signal, der er >3 gange så stort som i standardblodprøver ved 30 samme fortynding ved samme fortynding (titrering til endepunkt).
Forskning i vores laboratorier har vist at mikroindkapsling resulterer i et væsentligt kraftigere immunrespons på indlejret antigen eller vaccine i adskillige ekspe-rimentielle systemer. Et eksempel er givet ved den direkte sammenligning af 20 DK 175961 B1 niveauet og isotop fordelingen af det cirkulerende antigenrespons på Staphyloc enterotoxin B, som er årsagen til Staphyloccoc madforgiftning, som efterfølger immunisering med enten opløselig eller mikroindkapslet enterotoxid.
5 2. Mekanismen af den adjuvante virkning bibragt ved mikroindkapsling EKSEMPEL 1 - Den adjuvante virkning bibragt ved mikroindkapsling er ikke et resultat af en i polymeren intrinsisk adjuvant virkning.
i 10 Ved overvejelse af den mekanisme, hvorved DL-PLG mikrosfærer på 1-10 pm formidler et potenseret humoralt immunrespons på det indkapslede antigen, må tre mekanismer overvejes som muligheder. For det første kan den kroniske frigivelse over et langt tidsrum (depot) sammenlignet med en bolusdosis af ikke-indkapslet antigen spille en rolle ved immunforstærkning. For det andet har for-15 søg udført af ansøgerne vist, at mikrosfærer af denne størrelsesorden let fago-cyteres af antigenbearbejdende og -præsenterende celler. Derfor må målrettet indføring af en forholdsvis stor dosis af ikke-nedbrudt antigen direkte i de celler, der er ansvarlige for initieringen af immunresponser på T celle-afhængige antigener også overvejes. For det tredie kan mikrokapslerne have intrinsisk im-20 munpotenserende virkning gennem deres evne til at aktivere celler i immun-systmet på en måde, der er analog til adjuvanser, såsom bakterie-lipopoly-saccharid eller muramyl-di-peptid. Immunpotensering ved sidstnævnte mekanisme er karakteristisk ved, at den udtrykkes, når adjuvanset indgives sammen med antigenet.
25
For at undersøge, om mikrosfærer er i besiddelse af en iboende adjuvant virkning, som overføres gennem disse partiklers evne til på uspecifik vis at aktivere immunsystemet, sammenlignede man antistofresponset på 100 pg mikroindkapslet enterotoxoid med det antistofrespons, der induceredes efter indgivelse 30 af en lige så stor dosis enterotoxoid blandet med placebo-mikrosfærer, der ikke indeholdt antigen. De forskellige antigenformer blev indgivet ved IP injektioner til grupper på 10 BALB/c mus, og de enterotoxinspecifikke IgM- og IgG-antistofresponser i plasma bestemt ved endepunkt-titrerings-RIA, se tabel 4.
21 DK 175961 B1
Plasma-antistofresponset på en bolusinjektion af den optimale dosis af opløseligt enterotoxoid (25 pg) var generelt dårligt og bestod i en maksimal IgM-titer på 800 på dag 10 og en maksimal IgG-titer på 800 på dag 20. Indgivelse af en lige så stor dosis mikroindkapslet enterotoxoid inducerede et stærkt respons i 5 både IgM- og IgG-isotyperne, som stadig var i stigning på 30. dagen efter immunisering. Samtidig indgivelse af opløseligt enterotoxoid og en dosis placebo-mikrosfærer af samme vægt, størrelse og sammensætning som dem, der blev anvendt til indgivelse af indkapslet antigen, inducerede ikke et antitoxinrespons i plasma, som var signifikant højere end det, der induceredes af opløseligt anti-10 gen alene. Dette resultat ændreres ikke ved indgivelse af det opløselige antigen 1 dag før eller 1, 2 eller 5 dage efter placebo-mikrosfæreme. Således indikerer disse data, at den immunpotensering, der udtrykkes ved indgivelse af antigen i 1-10 pm DL-PLG mikrosfærer, ikke er en funktion af mikrosfæremes evne til intrinsisk at aktivere immunsystemet. Materialet stemmer snarere overens med j 15 forekomsten af en depotvirkning, målrettet indføring af antigenet i antigenpræsenterende accessoriske celler eller en kombination af disse to mekanismer.
EKSEMPEL 2 - Forsinkelse af hastigheden af antigenfrigivelse fra 1-10 pm mi-20 krokapsler forøger størrelsen af antistofresponset og forsinker tidspunktet for det maksimale respons.
Fire enterotoxoidholdige mikrokapselpræparater med forskellige hastigheder for antigenfrigivelse blev sammenlignet for deres evne til at inducere et antitoxin-25 respons i plasma efter IP injektion. Hastigheden af antigenfrigivelsen af mikro-kapsleme anvendt i denne undersøgelse er en funktion af to mekanismer diffusion gennem porerne i vægmatrix og hydrolyse (bioerosion) af vægmatrix. Portionerne nr. 605-026-1 og nr. 514-140-1 har forskellig begyndelseshastighed for frigivelse gennem porerne efterfulgt af et andet frigivelsestrin, som er en funk-30 tion af deres nedbrydning ved hydrolyse. I modsætning dertil er portionerne nr.
697-143-2 og nr. 928-060-00 fremstillet med en tæt ensartet matrix af vægmateriale, der kun har lille frigivelse gennem porerne, og deres frigivelse er i det væsentlige en funktion af den hastighed, hvormed vægmaterialerne hydrolyseres. Dog er disse to sidstnævnte portioner forskellige, hvad angår forholdet 22 DK 175961 B1 mellem lactid og glycolid, som mikrokapsleme består af, og den større modstand over for hydrolyse, som ses for 85:15 DL-PLG medfører en lavere hastighed for frigivelse af enterotoxoid.
5 Immunresponset induceret af portion nr. 605-026-1 (60 % frigivelse efter 48 timer) nåede en maksimal IgG-titer på6.400 på dag 20 (tabel 5). Portion nr. 514-140-1 (30 % frigivelse efter 48 timer) stimulerede I gG-a nti stoffer, der også nåede et maksimum på dag 20, men som forefandtes i en højere koncentration både på dagene 20 og 30.
10
Immunisering med portion nr. 697-143-2 (10 % frigivelse efter 48 timer) førte til maksimale niveauer af IgG-antistof på dagene 30 og 45, som var betydeligt højere (102.400) end dem, der induceres af begge portioner med tidlig frigivelse. Yderligere forsinkelse af hastigheden af antigenfrigivelse ved at anvende et for-15 hold på 85:15 mellem lactid og glycolid, portion nr. 928-060-00 (0 % frigivelse efter 48 timer) forsinkede de maksimale antistofniveauer indtil dagene 45 og 60, men der sås ingen yderligere forøgelse af immunpotensering.
Disse resultater stemmer overens med en forsinket og vedvarende frigivelse af 20 antigen til stimulering af et større antistofrespons. Imidlertid tyder visse aspekter af responsmønsteret induceret af disse forskellige mikrosfærer på, at en depotvirkning ikke er den eneste immunpotenseringsmekanisme. Jo hurtigere den første frigivelse er, jo lavere er den maksimale antistoftiter. Disse resultater stemmer overens med en model, hvor antigen frigivet inden for de første 48 25 timer via diffusion gennem porerne, ikke er mere effektivt end indgivelse af opløseligt antigen. Signifikant forsinkelse ved starten af frigivelse for at tillade tid til fagocytose af mikrosfærerne af makrofager tillader effektiv bearbejdning og præsentering af antigenet, og størrelsen af det resulterende respons styres af den mængde antigen, der føres ind i de præsenterende celler. Imidlertid fører 30 forsinkelse af antigenfrigivelse ud over det punkt, hvor alt antigenet er ført ind i de præsenterende celler, ikke til yderligere potensering af responset, det forsinker kun tidspunktet for det maksimale niveau.
23 DK 175961 B1 2. Pulserende frigivelse af vacciner fra mikrokapsler til programmeret forstærkning efter en enkelt injektion Når man ved injektion modtager en vaccine, er to, tre eller flere indgivelser af 5 vaccinen nødvendige for at fremkalde et godt imunrespons. Typisk gives den første injektion til opnåelse af et primært respons, den anden injektion gives til opnåelse af et sekundært respons, og en tredie injektion gives til opnåelse af et ! tertiært respons. Multiple injektioner er nødvendige, fordi der kræves gentagen reaktion mellem antigenet og immunsystemets celler til stimulering af et stærkt 10 immunologisk respons. En patient må derfor efter modtagelse af den første vaccineinjektion igen hen til lægen flere gange for at modtage den anden, tredie og efterfølgende injektioner til opnåelse af beskyttelse. Ofte returnerer patienter aldrig til lægen for at få de efterfølgende injektioner.
15 Vaccinepræparatet, som injiceres i en patient, kan beståaf et antigen i forbin delse med et adjuvans. Et antigen kan for eksempel være bundet til alun. Ved den første injektion er brugen af antigen/adjuvans-kombinationen vigtig, derved at adjuvanset hjælper til at stimulere et immunrespons. Ved den anden og tredie injektion forbedrer Indgivelsen af antigenet kroppens immunrespons på anti-20 genet. Den anden og tredie indgivelse eller efterfølgende indgivelser kræver imidlertid ikke nødvendigvis et adjuvans.
Alza Corporation har beskrevet metoder til kontinuerlig frigivelse af et antigen og et immunforstærkende middel (adjuvans) til stimulering af et immunrespons (US 25 patentskrift nr. 4 455 142). Den foreliggende opfindelse adskiller sig på mindst to vigtige måder fra Alzas patent. For det første kræves der ikke et immunforstærkende middel til at forøge immunresponset, og for det andet frigives antigenet ikke kontinuerligt fra indføringssystemet.
30 Den foreliggende opfindelse angår fomnulerering af en vaccine (antigen) indeholdt i mikrokapsler (eller mikrosfærer), hvorved antigenet indkapsles i bionedbrydelige polymerer, såsom poly(DL-lactid-co-glycolid). Mere specifikt fremstiller man forskellige vaccinemikrokapsler, som derpå blandes, således at en enkelt injektion af blandingen af vaccinekapsler forøger det primære immunrespons og i 24 DK 175961 B1 derefter på senere tidspunkter indfører antigen på en pulserende måde til opnåelse af sekundære, tertiære og efterfølgende responser.
Blandingen af mikrokapsler består af små og store mikrokapsler. De små mi-5 krokapsler, der er mindre end 10 pm, foretrukket mindre end 5 pm, eller mere foretrukket 1-5 pm, potenserer det primære respons (uden at et adjuvans er nødvendigt), fordi de små mikrokapsler på effektiv vis genkendes og optages af makrofager. Mikrokapsleme inde i makrofagerne frigiver derpå antigenet, som dernæst bearbejdes og præsenteres på overfladen af makrofagen til opnåelse 10 af det primære respons. De større mikrokapsler, der er større end 5 pm, foretrukket større end 10 pm, men ikke så store, at de ikke kan indgives ved for eksempel injektion, foretrukket mindre end 250 pm, er fremstillet af forskellige polymere, således at de bionedbrydes med forskellig hastighed, de frigiver antigen på en pulserende måde.
15
Ifølge den foreliggende opfindelse er sammensætningen af antigenmikro-kapslerne til det primære respons dybest set den samme som sammensætningen af antigenmikrokapsleme anvendt til det sekundære, tertiære og efterfølgende responser. Det vil sige, antigenet er indkapslet i den samme klasse af 20 bionedbrydelige polymere. Antigen mikrokapslemes størrelse og egenskaberne til pulserende frigivelse maksimerer immunresponset på antigenet.
De foretrukne bionedbrydelige polymerer er sådanne, hvis bionedbrydningshastigheder kan varieres ved blot at ændre forholdet mellem deres mo-25 nomere, for eksempel poly(DL-lactid-co-glycolid), således at antigenmikro-kapsler anvendt til det sekundære respons bionedbrydes hurtigere end anti-genmikrokapsler anvendt til efterfølgende responser, hvorved fås pulserende frigivelse af antigenet.
30 Sammenfattende kan siges, at ved at kontrollere størrelsen af mikrokapsler af stort set samme sammensætning kan man maksimere immunresponset på et antigen. Det er også af vigtighed at have små mikrokapsler (mikrokapsler med en størrelse mindre end 10 pm, foretrukket mindre end 5 pm, mest foretrukket 1-5 pm) i blandingen af antigenmikrokapsler med henblik på at maksimere det 25 DK 175961 B1 primære respons. Anvendelsen af et immunforstærkende indføringssystem, såsom små mikrokapsler, bliver endog mere vigtigt, når man forsøger at fremkalde et immunrespons på mindre immunogene forbindelser, såsom dræbte vacciner, subunit-vacciner, lav-molekylvægt vacciner, såsom peptider, og lig-5 nende.
EKSEMPEL 1 - Samtidig indgivelse af fri og mikroind kapslet vaccine
Man undersøgte en japansk Encephalitis virus vaccine (Biken). Den anvendte 10 virus er et produkt fremstillet af Research Foundation for Microbial Disease of Osaka University, Suita, Osaka, Japan. Fabrikanten anbefaler en immuniseringsserie med tre doser bestående af to vaccinedoser indgivet med 1 -2 ugers mellemrum efterfulgt af indgivlse af en tredie vaccinedosis indgivet 1 måned efter den indledende immuniseringsserie. Ansøgerne har sammenlignet det an-15 tivirale immunrespons i mus immuniseret med et standardprogram på 3 doser JE-vaccine med det antivirale respons i mus immuniseret med en enkelt indgivelse af JE-vaccine bestående af 1 del uindkapslet vaccine og 2 dele indkapslet vaccine. JE-mikrokapsleme var >10 pm. Resultatet af immunisering af mus med JE-vaccine ved disse to metoder blev sammenlignet ved at måle antistofti-20 terne i serum over for JE-vaccine påvist ved et ELISA-assay. ELISA-assay måler tilstedeværelsen af serum-antistoffer med specificitet for JE-vaccine-komponenter, men det måler imidlertid ikke mængden af tilstedeværende virusneutraliserende antistof i serum. Den virusneutraliserende antistofaktivitet blev derfor målt ved virus cytopatisk effekt (CPE) inhibitionsassay og virus plaque 25 reduktionsassay. Resultaterne af disse assays gives i det følgende.
Der blev undersøgt fire forsøgsgrupper bestående af (1) ubehandlede kontrolmus, der ikke immuniseres, 30 (2) mus, der får 3,0 mg JE-vaccine (uindkapslet) på dag 0, (3) mus, der får 3,0 g JE-vaccine (uindkapslet) på dagene 0, 14 og 42 (standardskema), og (4) mus, der får 3,0 mg JE-vaccine (uindkapslet) og 3,0 mg JE-vaccine (indkapslet) på dag 0.
26 DK 175961 B1 i i | De ubehandlede kontroller giver baggrundstitere for virusneutralisering, imod hvilke immuniserede dyr kan sammenlignes. Dyrene, der modtager en enkelt 3,0 mg dosis JE-vaccine på dag 0, giver baggrundstitere for neutralisering, imod ' 5 hvilke dyr, der modtager uindkapslet vaccine sammen med indkapslet vaccine, kan sammenlignes. Denne sammenligning giver bevis for, at indgivelsen af indkapslet vaccine forøger immuniseringspotentialet af en enkelt 3,0 mg dosis uindkapslet vaccine. Dyrene, der får 3 doser uindkapslet vaccine, er kontroller, imod hvilke den indkapslede vaccinegruppe kan sammenlignes med henblik på 10 at dokumentere evnen af en enkelt injektion bestående af både ikke-indkapslet og indkapslet vaccine til at danne antiviral aktivitet, der er sammenlignelig med et standardimmuniseringsskema med 3 doser.
Serumprøver indsamlet på dagene 21, 49 og 77 fra 10 dyr i hver forsøgsgruppe 15 blev testet for deres evne til at inhibere de cytopatiske virkninger induceret ved en standard challenge (100 TCID5o) med JE-virus. Resultaterne af CPE-inhibitionsassays, udtrykt som den højeste serumfortynding, der er i stand til at inhibere 50 % af viral CPE, er vist i tabel 6. Som det ses, havde de ubehandlede kontroldyr (gruppe 1) på ingen af de undersøgte tidspunkter nogen signifi-20 kant virusneutraliserende aktivitet i serum. Af de 10 dyr, der fik en enkelt 3,0 mg dosis JE-vaccine på dag 0 (gruppe 2), udviklede et af dem ikke noget påviseligt virusneutraliserende antistof. Blandt de resterende 9 mus var den højeste titer 254, som sås på dag 49. Den geometriske antivirale middeltiter for denne forsøgsgruppe toppede på dag 49. Ud af de 10 dyr, der fik et standardprogram 25 bestående af tre vaccinedoser (gruppe 3), havde 8 en nedgang i antistofaktivitet fra dag 49 til dag 77. Den geometriske middeltiter for denne gruppe gik ned med over 50 % fra dag 40 til dag 77. Alle 10 dyr, der fik indkapslet JE-vaccine (gruppe 4), udviklede antiviral aktivitet i serum. Den geometriske middeltiter for denne gruppe steg fra dag 21 til dag 77. Den gennemsnitlige titer på dag 49 i 30 denne gruppe var signifikant lavere end for gruppen, der fik 3 vaccinedoser (gruppe 3) (p = 0,006); imidlertid fortsatte titeren med at stige fra dag 49 til dag 77, hvilket var i modsætning til gruppe 3. Der var ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige titer for disse to grupper i prøverne fra dag 77 (p = 0,75), hvilket tyder på, at gruppen, der fik den indkapslede vaccine, opnåede sammen- , DK 175961 B1 i 27 lignelige antivirale titere i serum på dag 77. Ulig de dyr, der havde fået 3 vaccinedoser (gruppe 3), fortsatte de dyr, der havde modtaget indkapslet vaccine (gruppe 4), med at udvise stigninger i virusneutraliserende aktivitet i serum hen igennem de undersøgte tidspunkter. I modsætning til den standard vaccine-5 behandlede gruppe havde mus, der fik indkapslet JE-vaccine, en 2-fold stigning i den gennemsnitlige neutraliserende titer i serum fra dag 49 til dag 77. Den gennemsnitlige antivirale titer fra mus, der fik mikroindkapslet vaccine, var ikke j signifikant forskellig fra gennemsnitstiteren på dag 21 for mus, der fik en enkelt i dosis JE-vaccine på dag 0 (p = 0,12); imidlertid var gennemsnitstiteme på dag 10 49 og dag 77 signifikant forskellige for de to grupper (henholdsvis p = 0,03 og p = 0,03). Disse data tyder på, at virusneutraliserende titere i serum, der ligner dem dannet ved standard vaccineindgivelse, kan opnås ved indgivelse af en enkelt dosis indkapslet JE-vaccine. Skønt de antivirale titere opnået med den ved denne undersøgelse anvendte excipiensformulering ikke steg så hurtigt 15 som dem opnået ved standard vaccinen, så nåede den neutraliserende antistof-aktitivitet i serum op på titere, som er sammenlignelige med dem opnået med standard 3-dosis vaccineprogrammet.
For yderligere at bekræfte disse resultater fremstillede man for hver forsøgs-20 gruppe pulje-prøver ved at blande lige store volumener af hver serumprøve.
Disse prøver blev overgivet til et uafhængigt laboratorium til bestemmelse af antiviral aktivitet. Prøverne blev testet ved plaque-reduktionsassay imod en standard JE-virus "challenge". Resultaterne af disse assays (se tabel 7) underbygger de oven for beskrevne resultater. Selvom dyrene, der fik indkapslet vac-25 cine, ikke nåede op påmaksimale titere lige så hurtigt, som det var tilfældet for standard vaccinegruppen, så inducerede den indkapslede vaccine sammenlignelig virusneutraliserende antistofaktivitet. Endvidere opretholdt den indkapslede vaccine en højere antiviral titer over et længere tidsrum end tilfældet var for standardvaccinen. Disse resultater underbygger yderligere den konklusion, at 30 en enkelt indgivelse af mikroindkapslet vaccine kan frembringe resultater, der er sammenlignelige med dem opnået med et 3-dosis standardvaccineprogram.
EKSEMPEL 2 - Samtidig indgivelse af vaccinemikrokapsler med en størrelse på <10 pm og >10 pm 28 DK 175961 B1
En fordel ved indføringssystemet med copolymer-mikrokapsler er evnen til at kontrollere den tid og/eller hastighed, hvormed det inkorporerede materiale frigives. Med vacciner muliggør dette planlægning af frigivelse af antigen for mak-5 simering af antistofresponset efter en enkelt indgivelse. Blandt de mulige måder til frigivelse, som ville forventes at forbedre antistofresponset på en vaccine, er pulserende frigivelse (analog til konventionelle forstærkende immuniseringer).
Muligheden for at bruge pulserende frigivelse blev undersøgt ved til grupper af 10 mus subcutant at indgive 100 pg enterotoxoid, enten i 1-10 pm (50:50 DL-PLG, 1,51 vægt-% enterotoxoid), 20-125 pm (50:50 DL-PLG, 0,64 vægt-% enterotoxoid) eller i en blanding af 1-10 pm og 20-125 pm mikrokapsler, i hvilke lige dele af enterotoxoidet var indeholdt i hvert størrelsesområde. Grupperne af mus fik udtaget blodprøver med intervaller på 10 dage, og plasma IgG responserne 15 blev bestemt ved titrering til endepunkt i isotype-specifikke radioimmunassays under anvendelse af fastfase-absorberet enterotoxin (figur 1). Efter indgivelse af de 1-10 pm enterotoxoidmikrokapsler, kunne plasma IgG-responset spores på dag 10, det steg til en maksimal titer på 102.400 på dagene 30 og 40 og faldt til dag 60 til 25.600.1 modsætning dertil forsinkedes responset på toxoidet indgivet 20 i 20-125 pm mikrokapsler indtil dag 30 og steg derefter til en titer på 51.200 på-dagene 50 og 60. Den samtidige indgivelse af lige dele af toxoidet i 1-10 pm og 20-125 pm mikrokapsler frembragte et IgG-respons, som i de første 30 dage i det væsentlige var det samme som det, der stimuleredes ved 1-10 pm mikro-kapslerne indgivet alene. Imidlertid steg det målte respons fra dag 40 i musene, 25 der modtog samtidig indgivelse af 1-10 pm plus 20-125 pm mikrokapsler, konstant til en titer på 819.200 på dag 60, et niveau, der lå meget højere, end de additive mængder af responserne induceret af de to størrelser indgivet hver for sig.
30 Det ved samtidig indgivelse af 1-10 pm og 20-125 pm enterotoxoidholdige mikrokapsler opnåede antistofrespons svarer til en 2-faset (pulserende) frigivelse af antigen. Den første puls hidrører fra vævshistiocyternes hurtige optagelse og fremskyndede nedbrydning af 1-10 pm partiklerne, hvilket skyldes disse accessoriske cellers effektive opfyldning med høje koncentrationer af antigenet, der 29 DK 175961 B1 fører til et potenseret primært immunrespons, samt sandsynligvis deres aktivering. Den anden fase af antigenfrigivelsen skyldes bionedbrydningen af 20-125 pm mikrokapsler, som er for store til at blive optaget af fagocytotiske celler. Denne anden puls af antigen frigives i en forbehandlet vært og stimulerer et 5 anamnetisk immunrespons. Ved at anvende 50:50 DL-PLG-copolymeren, kan der således konstrueres et system til indføring af vaccine bestående af en enkelt injektion, som potenserer antistofresponser (1-10 pm mikrokapsler), og som kan indføre en tidstilpasset og langvarig sekundær forstærkende immunisering (20-125 pm mikrokapsler). Dertil kommer, at det ved ændring af forholdet mel-10 lem de copolymere er muligt at fremstille præparater, som har endog senere frigivelse, med henblik på at tilvejebringe tertiære eller endog kvatemære forstærkende frigivelser, uden nødvendigheden af yderligere injektioner.
Der eksisterer derfor flere mulige fremgangsmåder til vaccinering med de inji-15 cerbare mikrokapsler ifølge den foreliggende opfindelse. Blandt disse er multiple injektioner af små mikrokapsler, fortrinsvis 1-5 pm, som vil blive opslugt af makrofager og fjerne behovet for immun potenserende midler, såvel som blandinger af frit antigen til et primært respons kombineret med mikroindkapslet antigen i form af mikrokapsler med en diameter på 10 pm eller derover, som frigi-20 ver antigenet pulserende til potensering af sekundære og tertiære responser og tilvejebringer immunisering med en enkelt indgivelse. Der kan også anvendes en kombination af småmikrokapsler til et primært respons og større mikrokapsler til sekundære og senere responser, hvorved fjernes behovet for både immunpotenserende midler og multiple injektioner.
25 C. Vaccinemikrokapsler indgivet intratrachealt EKSEMPEL 1 - Intratrachealt indgivne mikrokapsler indeholdende SEB toxoid inducerer samtidigt cirkulerende og slimhinde antitoxin-antistoffer.
30
Follikulære lymfatiske aggregater i lighed med de Peyerske plaques i mavetarmkanalen findes i de slimhindeassocierede lymfoide væv, der ses beliggende andre anatomiske steder, såsom luftvejene. Deres funktion har lighed med funktionen af de Peyerske plaques, idet de absorberer materiale fra lumen af 30 DK 175961 B1 lungerne og er induktive steder for antistofresponser, der er karakteriseret ved en stor andel af slgA. Det blev undersøgt om der var mulighed for at immunisere gennem de bronchialassocierede lymfoide væv. Grupper af mus fik direkte ind i trachea indgivet 50 μΙ PBS indeholdende 50 pg SEB toxoid i enten mi-5 kroindkapslet eller ikke-indkapslet form. På dagene 10, 20, 30 og 40 efter immuniseringen blev der opsamlet prøver af plasma, spyt, tarmskylninger og bronchial-alveolære skylninger.
! Assay af plasmaprøveme for antitoxinspecifikke antistoffer viste, at indgivelse af 10 frit SEB toxoid ikke førte til induktion af et påviseligt antistofrespons i nogen af isotypeme (tabel 8). I modsætning hertil udløste intratracheal inddrypning af en lige så stor dosis mikroindkapslet SEB vaccine toxinspecifikke antistoffer af alle isotyper. Dette respons nåede maksimale niveauer på dag 30 og blev opretholdt til dag 40 med IgM-, IgG- og IgA-titere på henholdsvis 400, 51.300 og 400.
15 I lighed med de i plasma observerede responser induceredes der toxinspecifik- ke antistoffer i bronchial-alveole-skylningerne af det mikroindkapslede toxoid, men ikke af den ikke-indkapslede vaccine (tabel 9). Kinetikken af fremkomsten af antitoxin-antistoffeme i de bronchiale sekreter var noget forsinket i forhold til 20 plasmaresponset derved, at responset på dag 20 kun påvistes i IgG-isotypen og var lavt i sammenligning med de senere opnåede plateau-mængder. Der opnåedes imidlertid maksimale titere af IgG- og IgA-antitoxin-antistoffer (henholdsvis 1.280 og 320) på dag 30, som opretholdtes til dag 40. Der påvistes ingen antistoffer af klassen IgM i bronchial-alveole-skylningeme ved brug af denne immu-25 niseringsmetode, et resultat der stemmer overens med fraværet af IgM-secernerende plasmaceller i lungerne og den manglende evne af dette store antistofmolekyle til at transudere fra serum gennem molvægtsafskæringen på 200.000, som udgøres af den kapillær-alveolære membran.
30 Disse date viser, at mikroindkapsling frembragte immunrespons over for SEB-toxoid-antigenet efter indgivelse i luftvejene, mens det ikke-indkapslede antigen var virkningsløst. Dette respons sås både i cirkulationen og i de sekreter, der bader luftvejene. Det skal bemærkes, at denne immuniseringsmetode var effektiv til inducering af antistoffer af klassen IgA. Dette antistof er formentlig produk 31 DK 175961 B1 tet af lokal syntese i de øvre luftveje, et område, der ikke er beskyttet af antistoffer af klassen IgG, som ledes ind i den nedre del af lungerne fra blodcirkulationen. Således vil intratracheal immunisering med mikroindkapslede antigener gennem inhalering af aerosoler være en effektiv måde til at inducere antistoffer, 5 som beskytter de øvre luftveje.
D. Vaccinemikrokapsler indgivet ved blandede immuniseringsveje I både mennesker og dyr er det vist, at systemisk immunisering koblet med 10 slimhindepræsentering af antigen er mere effektiv end nogen anden kombination til at fremme slimhindeimmunresponser (Pierce, N.F. og Gowans, J.L. "Cellular kinetics of the intestinal immune response to cholera toxoid i rotter", J. Exp.
Med. 142:1550, (1975)). Tre grupper af mus blev forbehandlet ved IP immunisering med 100 pg mikroindkapslet SEB-toxoid og 30 dage senere udsat for 15 100 pg mikroindkapslet SEB-toxoid ved enten IP, oral eller IT indgivelse. Dette blev gjort for direkte at bestemme, om et blandet immuniseringsprogram, der anvender mikroindkapslet antigen, var fordelagtigt, hvad angår mængderne af induceret slgA.
20 Tyve dage efter de mikroindkapslede forstærkende immuniseringer udtog man prøver af plasma, tarmskylninger og bronchial-alveolære skylninger og bestemte mængderne og isotypefordelingen af anti-SEB-toxin antistoffer ved ende-punkttitrerings-radioimmunassays (tabel 10). Den IP forstærkning af IP forbehandlede mus førte til fremkomsten af højt indhold af IgG antitoxin-antistoffer i 25 plasma- og sekretprøveme, men var helt uden virkning til induktion af påviselige IgA-antistoffer i nogen af de testede væsker. I modsætning hertil forøgede sekundær immunisering med mikroindkapslet SEB-toxoid ved enten oral eller IT indgivelse effektivt indholdet af specifikke IgG-antistoffer i plasma (præsekundær immuniseringstiter i hver gruppe var 51.200) og inducerede og-30 såfremkomsten af signifikante mængder af slgA-antistoffer i tarm- og bronchial-alveolære skylninger. Oral forstærkning af IP forbehandlede mus inducerede anti-SEB-toxin slgA-antistoffer, som secerneres ind i tarmsekreteme i mængder sammenlignelige med dem, der kræver 3 orale immuniseringer indgivet med mellemrum (tabel 10 sammenlignet med tabel 11). Intratracheal forstærkning af 32 DK 175961 B1 tidligere IP immuniserede mus var især effektiv til inducering af et udbredt slimhinderespons og udløste forekomsten af høje samtidige mængder af IgG og slgA i både bronchial-alveolære prøver og tarmsekretprøver.
5 Disse resultater er især vigtige, hvad angår immunisering mod talrige infektiøse stoffer, som udøver deres patofysiologiske virkninger gennem akutte infektioner i respirationsvejene. Antistoffer i luftvejene stammer fra to forskellige kilder. Se-kretorisk IgA er almindeligt forekommende i den slim, der bader næse-svælg og bronchieme [Soutar, C.A., "Distribution of plasma cells and other cells contai-10 ning immunoglobulin in the respiratory tract of normal man and class of immunoglobulin contained therein", Thorax 31:58 (1976) og Kaltreider, H.B. og Chan, M.K.L., "The class-specified immunoglobulin composition of fluids obtained from various levels of canine respiratory tract", J. immunol. 11:423 (1976)], og er produktet af lokale plasmaceller i lamina propria i de øvre luftveje. I modsætning 15 til næse-svælg og bronchieme indeholder bronchiolerne og alveolerne overve jende lg&, som passivt opnås fra blodcirkulationen via transudation (Reynolds, H.Y. og Newball, H.H., "Analysis of proteins and respiratory cells obtained from human lungs by bronchial lavage", J. Lab. Clin. Med. 84:559, (1974)]. Effektiv beskyttelse af lungerne kræver således både cirkulerende IgG-antistoffer og 20 slimhinde-slgA-antistoffer.
Disse data tyder på, at immuniseringsprogrammer, der benytter blandet indgivelsesvej med mikroindkapslede antigener, vil vise sig at være de mest effektive til induktion af samtidige cirkulerende antistof- og slimhindeantistofresponser.
25 Skønt de her rapporterede forsøg undersøger afgrænsede forbehandlings- og forstærkningstrin, som hver krævede en indgivelse af mikroindkapslet antigen, vil det være muligt at bruge fleksibiliteten i kontrolleret pulserende frigivelse tilvejebragt ved mikrokapsel-indføringssystemet til at udforme et system med en enkelt indgivelse, som vil stimulere maksimal samtidig systemisk og sekretorisk 30 immunitet. For eksempel kunne mikroindkapslet antigen indgives både ved injektion og ingestion under et enkelt lægebesøg. Ved at variere forholdet mellem lactid og glycolid i de to doser kunne den systemisk indgivne dosis frigives inden for få dage til forbehandling af immunsystemet, og den anden (orale) dosis 33 DK 175961 B1 kunne frigives i de Peyerske plaques på et senere tidspunkt til stimulering af et forstærket slimhinderespons.
Tabel 1:
Penetration af 85:15 DL-PLG mikrosfærer indeholdende kumarin-6 ind i og gennem de Peyerske plaques efter oral administrering_
Tid Antal Procentdel med diameter Procentdel med beliggenhed (dage) observeret < 2 Mm 2 -5 pm > 5 pm Kuppel Dybt 1 ~ 296 47 35__18__92__8 2 __325 45 32 23__83__17 4__352 46 31__23__76__24 7__196 21__29__41__88__11 14__148 16 29__55__98__2 21__91__7__27__66__98__2 28__63__5__24__71__100__0 35 I 52 I 6 I 19 I 79 I 97 I 3 5 Tabel 2:_
Bevægelse af 85:15 DL-PLG mikrosfærer indeholdende kumarin-6 ind i og gennem de mesenteriske lymfeknuder efter oral administrering_
Tid Antal Procentdel med diameter__Procentdel med beliggenhed (dage) observeret < 2 pm 2 -5 pm > 5 gm__Kuppel__Dybt_ 1 8 so 50__o__loo__o_ 2 83__76 24__0__95__5_ 4 97__73 27__0__73__27 7 120 67 32__g__64__36 14 54 83 17__0__9__91 21 20 75 25__g__5__95 28 15 67 32__0__0__95 35 9 | 44 56 0 0 100 ~
Tabel 3:_ Målrettet absorption i de Peyerske plaques i de tarmassocierede lymfoide væv efter oral administrering af 1-10 pm mikrosfærer med forskellige excipienser_
Excipiens Bionedbrydelig Absorption Peyerske pla- ___g ues_
Poly(styren)__Nej__Meget god_
Poly(methylmethacrylat)__Nej__Meget god_
Poly(hydroxybutyrat)__Ja__Meget god_
Poly(DL-lactid)__Ja__God_
Poly(L-lactid)__Ja__God_ 85:15Poly(DL-lactid-co- glycolid)__Ja__God_ 50:50 Poly(DL-lactid-co-1 Ja God 34 DK 175961 B1 glycolid)____
Celluloseacetat· hydrogenphthalat__Nej___Ingen_
Cellulosetriacetat__Nej___Ingen_
Ethylcellulose Nej Ingen
Tabel 4: _
Mikrosfærer besidder ikke intrinsisk adjuvansvirkning_
Toxoid dosis Anti-toxin titer i plasma (pg) pr. im- Form Dag 10__Peg 20__Dag 30
; munisering IgM | IgG IgM IgG IgM I IgG
25 Antigen i mikrosfærer 6.400 6.400 400 12.800 800 25.600 25 Opløseligt antigen 800 <50 200__800 100 <50 25 Antigen plus placebo- 800 <50 200 <50 200 50 _ mikrosfærer _______
Tabel 5:_
Systemisk antitoxin respons induceret ved parenteral immunisering med pm mikrosfærer, der udtømmer antigen med forskellig hastighed_
Toxoid lactid/ Antigen ud- IgG anti-toxin titer i plasma på dag: dosis glycolid tømning efter ~ ~ ~ ~ (Mg)___forhold 48 timer 10 15 20 30 45 60 100 Opløselig -__-__<50 <50 <50 <50__<50__<50 100 Mikrosfærer ~50:50 60% 400 - 6.400 3.200 __- 100 Mikrosfærer 50:50 30% 400 - 12.800 6.400 __- 100 Mikrosfærer 50:50__10%__ 6.400 - 102.400 102,400 51.200 100 Mikrosfærer 85:15__0%__ 3.200 - 51.200 102.400 102.400
Tabel 6:___
Resultater af CPE-inhibitions-assays af serumprøver fra immuniserings- undersøgelseme af JE-vaccine _
Dyr Serumfortynding i stand til at reducere virus induceret CPE
__med 50 % på dag __ _21 | 49 I 77
Gruppe 1 = ubehandlede kontroller __ G MT <10 I 11 | 11
Gennemsnit__fio__11__11_
Maksimum__<10__ 16__<20_
Minimum__<10___fio__<10_
Gruppe 2 = 3,0 mg uindkapslet JE-vaccine IP på dag 10 _ GMT I 44 I 73 I 50
Gennemsnit__55___95__71_
Maksimum__127_ 254__160_
Minimum__<io__13__<io_
Gruppe 3 = 3,0 mg uindkapslet JE-vaccine IP på dag 0,14 og 42_ 35 DK 175961 B1
GMT 507 3680 1.576 I
Gennemsnit__934__5.363__2.951_
Maksimum__4,064__>10-240__>10.240
Minimum__160_ 806 254
Gruppe 4 = 3,0 mg uindkapslet JE-vaccine + 3,0 mg indkapslet JE-vaccine IP på dag 0 _ ___ GMT 77 I 718 I 1.341
Gennemsnit__803__1.233__2.468_
Maksimum__320__5.120__10.240
Minimum__13__160__254_ BGMT = geometriske middeltitere.
Tabel 7:_
Resultater af plaque-reduktions-assays af forenede serumprøver fra immu- niseringsundersøgelseme af JE-vaccine_
Gruppe Behandling Dag Serum fortynding til opnåelse af: ___50% 80% 1a__Kontroller__0__<10__<10_ 1__Kontroller__14__<10_ <10 1__Kontroller__21__<10__<10_ 1__Kontroller__42__<10__<10_ 1__Kontroller__49 <10__<10_ 1 __Kontroller__84__<10__<10 2D Uindkapslet JE__0__<10_ <10 2 __Uindkapslet JE__14__160__20_ 2__Uindkapslet JE__21__ND^__NDO_ 2__Uindkapslet JE__42__320__80_ 2__Uindkapslet JE__49__320__40_ 2 __Uindkapslet JE__84__640__160__ 3° ~ Uindkapslet JE__0__<10__<10_ 3 __Uindkapslet JE__14 160__40_ 3__Uindkapslet JE__21__2.560__640_ 3__Uindkapslet JE__42__1,280__640_ 3__Uindkapslet JE__49__5.120__2,560_ 3 __Uindkapslet JE__84__2,560__1,280_ 4e__Mikroindkapslet JE__0__<10__<10_ 4 __Mikroindkapslet JE__14__160__20_ 4__Mikroindkapslet JE 21__320__80_ 4__Mikroindkapslet JE__42 5.120__640 4__Mikroindkapslet JE__49__5.120__640_ 4__Mikroindkapslet JE 84__10,000__2,560_
Ubehandlede kontroller.
5 b Dyrene fik 3,0 mg uindkapslet JE vaccine IP på dag 0.
36 DK 175961 B1 c ND = Ikke bestemt (utilstrækkelig prøvemængde).
d Dyrene fik 3,0 mg uindkapslet JE vaccine IP på dagene 0,14 og 42.
e Dyrene fik 3,0 mg uindkapslet og 3,0 mg mikroindkapslet JE-vaccine IP på dag 0.
DK 175961 B1 © "c 05 o o
~ I < I o| o| I < I o 101 JS I ra V N S
M IgS Λ „I.
m T3 ---Ό 05 _* .. O O 0 o Φ .E © O) * O S 0 E ^ O § o ε © .55____ 7: 05 J-? t- 8 m σ> Oi cn ^ .» £ , o 0 o Φ cd mv P co cd c H (5 'f § 2 ! s u o -c1-1 E 3 o i? o £ o CL 05 S © 0 S CD S ΙΟ ΙΟ Ε I (D__H___ 0 c 0)^¾ M c 05 V V c5 i _.
τ-ι’ίκ v C ‘i- hr, ^ 2 in in in ? δ—i p e s v v v Ε ·| l g %$V ÉL 1--“- c E o —~ E O —~Z -i 05 $ § S g s ! 5 85? I i 588* >
.2 ω Q _o © Q __1_ Jg 5 ί O § 2 S
1 ? Sgo |s® Σ ίο w ig “ E - ° ® S
1 5 v .Eos °>vv § -—-- — c <8 S »S c < m m ^
N- w x -2>° v >mx ®vv ;£ -o--=-IH
Λ .c 2 o 0 φ c -2 o 05— q3 0 © CM (i) § o Is § S N W n .n o 9 = < o o o 2 ® g> og ^ o o © O) 05 § V .2§c V V v i tx c S — cn 3 *; c S — jaT-3 2 _© Q----ro 2 cp Q---lu CD o----
Sgo .E © -i 2 w w 05 LU -V © o o o — SE 05 ° y »- C E 05 V V ΞΞ (S) E rr\ 2 © °
Ό JS ro____© <u ra ~___ ©*-5μ m ® SI
© ° < o o 05 λ, < —~-- > CD — J? £ ·§□“ S “i? V g« P C r->---*5. O /—.--->2 m
© X 2 (0 O O Sc O ° O m m — ^ O O O
^ ° 05 05 ν’ V ©g 05 -2> v v © "c O) S § S
ΕΦ Sgo ® & 2 » IO S i i 1 5 " 85 - v v E'É^sf
—---I----« ^ é g I 'S
W o ~ jl2 ~ £© — (/)c3°o° — o © co © © Otf>cl,;Ewooo ' L_ o <f> _ — Q. </)„ QT» c ΐ! — 05 T— © O O, O -O m O. 05 « ^ II) — U c tf i n §i i il iiiir |f “ ΪΪ ii 1 &8 I! 8____
s -Sε 5 SI? I
00 2___O) Jr___C > » C Ql 2 H
•-0» . c ® . _ v σ σι o — o “ c Q O U 05 (D -T-. T5 U. 05 £ C © ^ m ffl O CL C CO © ·— Q. .C Q ό ©
C 9 Λ u. 1 E 05 c/D
C =5 o 05 © i 05 o 05 © oCOSw ______ ee O c § o..© O O fli ^ = 2 3« O O ? IU'= C i»— S·— p ’— C LO IT) © © p — c in If) m C 3 © if I If i if ® ff I i = ! I 1 a= 5= a= 38 DK 175961 B1
Tabel 11:______
Sammenlignend tabe! 11 Toxin-specifik IgA antigener i spyt og mavevæsker i mus på dag 10 og 20 efter tertiær oral immunisering med opløselig mikroind-kapslet enterotoxid _ . ' ΤΊ IgA anti-enterotoxin titer efterfølgende tertiær oral
Enterotoxoid _ immuniserinq dosis (pg)pr. Fom, -oiilo- Dag 20- immunisering ---f---—------ ,.. - ___Spyt Maveudvask Spyt Maveudvask 100__Mikroisfærer 1.280__1.024__640__256 ™ I "SSST I 40 I <8 I 10 I <8
Claims (22)
1. Anvendelse af biokompatible mikrokapsler, som omfatter et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens og som har en størrelse mindre en ca. 10 5 μηη til fremstilling af et middel til indgivelse nasalt, rektalt, oftalmisk, intratrachealt eller ved oral inhalering af immunogenet til slimhindeassocierede lymforetikulære væv i mennesker eller dyr.
2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor midlet indgives nasalt, intratrachealt eller ved 10 oral inhalering.
3. Anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2, hvor mikrokapsleme har en størrelse mellem ca. 1 pm og ca. 10 pm.
4. Anvendelse ifølge krav 1 til 3 til indgivelse af immunogenet til folliculi lymphati aggregati i luftrøret, i køns- og urinrør og andre slimhinde væv i kroppen bortset fra mavetarmkanalen.
5. Anvendelse ifølge et af kravene 1-4 ved absorption og passage gennem det 20 slimhinde associerede lymforetikulære væv, hvor mikrokapsleme har en størrelse fra 1 pm til mindre end 5 pm.
6. Anvendelse ifølge et af kravene 1-4 ved absorption og tilbageholdelse i det slimhinde associerede lymforetikulære væv, hvor mikrokapsleme har en størrelse 25 fra 5 pm til mindre end 10 pm.
7. Anvendelse ifølge et af kravene 1-6 til stimulering af immun systemet hos et menneske eller et dyr.
8. Anvendelse ifølge krav 1-7, hvor immunogenet er en immunomodulator, lym- fokin, monokin, cytokin, antigen eller allergen. DK 175961 B1
9. Anvendelse ifølge krav 8, hvor immunogenet er et influenza antigen, Staphylococcus antigen, respiratorisk syncytial, parainfluenza-vira, Hemophilus influenza, Bordetella pertussis. Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae, Plasr modium falciparum, helminthiske patogener, antigener til vacciner mod syg- 5 domme forårsaget af vira, bakterier, protozoer eller svampe eller antigen til vaccine mod allergi.
10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor immunogenet omfatter et influenza virus eller. staphylococcal enterotoxin B. 10
11. Anvendelse ifølge et af kravene 1-10, hvor excipiensen har en størrelse, samt fysisk-kemiske egenskaber, således at mikrokapslerne effektivt nås og optages af det slimhinde associerede lymforetikulære væv.
12. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 1-11, hvor excipiensen omfatter en polymer eller en copolymer.
13. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 1-12, hvor excipiensen omfatter en bionedbrydelig polymer eller en copolymer. 20
14. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 1-13, hvor excipiensen er en hydrofob . polymer.
15. Anvendelse ifølge krav 10-14, hvor excipiensen omfatter en poly(DL-lactid-co-25 glycolid), en poly(L-lactid), en poly(DL-lactid) en poly(glycolid), en copolyoxalat, en polycaprolactone, en poly(lactid-co-caprolacton), en poly(esteramid), en poly-ortester, en poly(P-hydroxy butansyre) eller en polyanhydrid eller en blanding deraf.
16. En sammensætning til stimulering af immun respons hos et menneske eller et dyr, som omfatter en blanding af en første mængde biokompatible mikrokapsler, der har en størrelse på mindre end cirka 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en første biokompatibel excipiens, og en anden mængde biokompati- DK 175961 B1 ble mikrokapsler, der har en størrelse på mere end 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en anden biokompatibel excipiens, hvor den første mængde af mikrokapsler forårsager et primært immunologisk respons og den anden mængde af mikrokapsler frigiver det aktive stof, som er indeholdt i den ! 5 anden mængde mikrokapsler, pulserende til potensering af et efterfølgende im munologisk respons.
17. En sammensætning ifølge krav 16, hvor den første mængde mikrokapsler har en størrelse på mellem 1 pm og 10 pm. 10
18. En sammensætning ifølge krav 16-17, som omfatter en tredje og eventuelt flere mængder biokompatible mikrokapsler, som indeholder et aktivt immunogen, hvor den tredje og de eventuelt flere mængder mikrokapsler frigiver det aktive stof indeholdt deri, på en pulserende måde efter at den anden mængde mikro- 15 kapsler frigiver det aktive stof indeholdt deri.
19. En sammensætning ifølge et af kravene 16-18, hvor to forskellige bionedbrydelige polymere er anvendt som første og anden excipiens og hvor bionedbrydningshastigheden af den første polymere excipiens adskiller sig fra bioned- 20 brydningshastigheden af den anden polymere excipiens.
20. Anvendelse af en sammensætning, som omfatter en blanding af en første mængde biokompatible mikrokapsler, der har en størrelse på mindre end ca. 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens, og 25 en anden mængde biokompatible mikrokapsler, der har en størrelse på mere end 10 pm og som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens, hvor den første mængde af . mikrokapsler forårsager et primært immunologisk respons og den anden mængde af mikrokapsler frigiver det aktive stof, som er indeholdt i den anden mængde mikrokapsler, pulserende til potensering af et efter-30 følgende immunologisk respons i et menneske eller dyr.
21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor den første og anden og eventuelt yderligere mængder mikrokapsler administreres i ét middel. DK 175961 B1
22. Anvendelse til fremstilling af en kombineret sammensætning, som omfatter en første mængde biokompatible mikrokapsler, som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens og som har en størrelse på mellem 1pm og 5 10 pm, der indgives til et menneske eller et dyr på en første måde, samt en an den mængde biokompatible mikrokapsler, som indeholder et immunogen indkapslet i en biokompatibel excipiens og som har en størrelse på mellem ipm og 10 pm, der indgives til et menneske eller et dyr på en anden måde end den første måde til potensering af et efterfølgende immunologisk respons hos et menneske 10 eller dyr.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16997388 | 1988-03-18 | ||
| US07/169,973 US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1988-03-18 | Method of potentiating an immune response |
| DK199002224A DK175851B1 (da) | 1988-03-18 | 1990-09-17 | Anvendelse af og fremgangsmåde til fremstilling af komposition indeholdende mikrokapsler til inducering af immunrespons |
| DK222490 | 1990-09-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK200500082A DK200500082A (da) | 2005-01-17 |
| DK175961B1 true DK175961B1 (da) | 2005-09-05 |
Family
ID=35058105
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK200500082A DK175961B1 (da) | 1988-03-18 | 2005-01-17 | Anvendelse af biokompatible mikrokapsler og sammensætning indeholdende biokompatible mikrokapsler til potensering af et immunrespons |
| DK200500083A DK175960B1 (da) | 1988-03-18 | 2005-01-17 | Anvendelse af biokapatible mikrokapsler, sammensætning indeholdende biokapatible mikrokapsler samt fremgangsmåde til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til potensering af et immunrespons |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK200500083A DK175960B1 (da) | 1988-03-18 | 2005-01-17 | Anvendelse af biokapatible mikrokapsler, sammensætning indeholdende biokapatible mikrokapsler samt fremgangsmåde til fremstilling af en farmaceutisk sammensætning til potensering af et immunrespons |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (2) | DK175961B1 (da) |
-
2005
- 2005-01-17 DK DK200500082A patent/DK175961B1/da not_active IP Right Cessation
- 2005-01-17 DK DK200500083A patent/DK175960B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK175960B1 (da) | 2005-09-05 |
| DK200500083A (da) | 2005-01-17 |
| DK200500082A (da) | 2005-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK175851B1 (da) | Anvendelse af og fremgangsmåde til fremstilling af komposition indeholdende mikrokapsler til inducering af immunrespons | |
| US5814344A (en) | Method for delivering bioactive agents into and through the mucosally associated lymphoid tissues and controlling their release | |
| Challacombe et al. | Enhanced secretory IgA and systemic IgG antibody responses after oral immunization with biodegradable microparticles containing antigen | |
| IE19960647A1 (en) | Method of potentiating an immune response and compositions therefor | |
| AU607439B2 (en) | Method and formulation for orally administering bioactive agents to and through the peyer's patch | |
| Eldridge et al. | Biodegradable microspheres: vaccine delivery system for oral immunization | |
| Saraf et al. | Lipid microparticles for mucosal immunization against hepatitis B | |
| JP2003261661A (ja) | 生分解性及び生体適合性を有するポリマーの製法 | |
| US6117449A (en) | Method for inducing a systemic immune response to a hepatitis antigen | |
| Mestecky et al. | Biodegradable microspheres for the delivery of oral vaccines | |
| DK175961B1 (da) | Anvendelse af biokompatible mikrokapsler og sammensætning indeholdende biokompatible mikrokapsler til potensering af et immunrespons | |
| US20230285529A1 (en) | Immunostimulatory compositions comprising soluble parasite extracts and uses thereof | |
| NZ241320A (en) | Delivery of bioactive agent to the mucosally associated lymphoreticular tissues of non-human animals | |
| Rehal | Poly-(ϵcaprolactone) nano-and microparticles as vaccine delivery systems | |
| GILLEY et al. | JACQUELINE D. DUNCAN |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |