DK2490986T3 - Fremgangsmåder og systemer til oprensning af ikke-kompleksbundet botulinum-neurotoksin - Google Patents

Claims (25)

1. Fremgangsmåde til oprensning af et ikke-kompleksbundet botulinum toksin type A (botulinum toksin A), hvilken fremgangsmåde omfatter: (i) tilvejebringelse af en blanding, der omfatter en rå, ikke-kompleksbundet botulinum toksin A, hvor den rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A dissocieres fra native, ikke-toksiske proteiner; (ii) fyldning af det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A på en anionbyttersøjle for således at muliggøre opfangning af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A ved hjælp af anionbyttersøjlen; (iii) eluering af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A fra anionbyttersøjlen for at opnå en eluent, der omfatter det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A; (iv) fyldning af en kationbyttersøjle with eluenten fra anionbyttersøjlen for således at muliggøre opfangning af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A ved hjælp af kationbyttersøjlen; og (v) eluering af oprenset ikke-kompleksbundet botulinum toksin A fra kationbyttersøjlen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A opnås ved at opnå en prøve, der omfatter botulinum toksin A-kompleks; fyldning af en hydrofob interaktionssøjle med prøven for således at muliggøre opfangning af botulinum toksin A-komplekset med den hydrofobe interaktionssøjle; eluering af botulinum toksin A-komplekset fra den hydrofobe interaktionskromatografisøjle; og dissociering af botulinum toksin A-komplekset for at opnå en blanding, der omfatter det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor: (a) prøven er en ovenstående cellevæske eller et filtrat, der omfatter botulinum toksin A-komplekset; eller (b) prøven, der omfatter et botulinum toksin A-kompleks, udsættes for en nukleasedigestion før fyldning på den hydrofobe interaktionssøjle, og eventuelt hvor nukleasen afledes af en proces fri for animalsk produkt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor prøven, der omfatter et botulinum toksin A-kompleks opnås ved: at udsætte en fermenteringskultur, der omfatter botulinum toksin A, for syreudfældning for at opnå en syreudfældning; og udførelse af tangentiel strømningsfiltrering på præcipitatet for at opkoncentrere udfældningen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor prøven, der omfatter et botulinum toksin A-kompleks, opnås ved at udsætte en uopløselig fraktion af en fermenteringskultur for tangentiel strømningsfiltrering.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor: (a) fremgangsmåden i alt væsentligt er fri for animalsk produkt, eller (b) fremgangsmåden giver et udbytte på mindst ca. 2 mg/L fermenteringskultur.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor: (a) det oprensede, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A er mindst 95 % rent; eller (b) det oprensede, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A har en aktivitet på mindst 200 LDso enheder/ng.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den anioniske søjle er valgt fra gruppen bestående af en Q Sepharose FIP-, Q Sepharose Fast Flow- og Q XL Sepharose-søjle, og hvor den kationiske søjle er valgt fra gruppen bestående af en SP Sepharose-, SP Sepharose FIP-, SP Sepharose Fast Flow-, Mono S-, Source-S-, Source-30S- og Source-15S-søjle.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor en buffer til fyldning af det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A på den anioniske søjle er valgt fra gruppen bestående af Tris, bis-Tris, triethanolamin og N-methyldiethanolamin, og eventuelt hvor bufferen anvendes ved et pH fra 7,4 til 8,2.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1 hvor en buffer for fyldning af det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A på den kationiske søjle er valgt fra gruppen bestående af natriumphosphat, MES, og HEPES, og eventuelt hvor bufferen anvendes ved et pH fra 6,0 til 7,0

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den anioniske søjles pH er fra 7,4 til 8,2.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor den kationiske søjles pH er fra 6,0 til 7,0.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor en gradient til eluering af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A fra anionbyttersøjlen er valgt fra gruppen bestående af en stigende koncentrationsgradient af natriumchlorid og en stigende koncentrationsgradient af kaliumchlorid, og eventuelt hvor anionbyttersøjlen elueres ved et pH fra 7,4 til 8,4.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor en gradient til eluering af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A fra kationbyttersøjlen er valgt fra gruppen bestående af en stigende koncentrationsgradient af natriumchlorid og en stigende koncentrationsgradient af kaliumchlorid, og eventuelt hvor kationbyttersøjlen elueres ved et pH fra 6,0 til 7,0.

15. Fremgangsmåde til oprensning af et ikke-kompleksbundet botulinum toksin type A (botulinum toksin A), hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) tilvejebringelse af en blanding, der omfatter en rå, ikke-kompleksbundet botulinum toksin A, hvori den rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A dissocieres fra native ikke-toksinproteiner; hvor blandingen opnås ved: (i) udsættelse af en fermenteringskultur, der omfatter botulinum toksin A, for syreudfældning for at producere en uopløselig syreudfældning; (ii) opkoncentrering af syreudfældningen fra trin (i) for at producere en opkoncentreret prøve; (iii) udsættelse af prøven for nukleasedigestion under forhold, der reducerer værtscelle-nukleinsyreindhold og som bevarer et kompleks af botulinum toksin A og ikke-toksinproteiner; (iv) fjernelse af nedbrudt cellemateriale fra prøven fra trin (iii) for at frembringe en klaret prøve; (v) fyldning afen hydrofob interaktionssøjle med den klarede prøve fra trin (iv) under forhold, der muliggør opfangning af botulinum toksin A-komplekset ved hjælp af den hydrofobe interaktionssøjle og urenheders strømning gennem søjlen; (vi) eluering af botulinum toksin A-komplekset fra den hydrofobe interaktionssøjle fra trin (iv); og (vii) dissociering af botulinum toksin A-komplekset opnået fra trin (vi) underforhold, der bryder komplekset og producerer en blanding, der omfatter råt, ikke-kompleksbundet botulinum toksin A dissocieret fra de native ikke-toksinproteiner; (b) fyldning af blandingen, der indeholder det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A dissocieret fra native ikke-toksinproteiner fra trin (a) på en an ion byttersøj le under forhold, der muliggør opfangning af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A ved hjælp af anionbyttersøjlen; (c) eluering af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A fra anionbyttersøjlen fra trin (b) for at opnå en eluent, der omfatter det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A; (d) fyldning af en kationbyttersøjle med eluenten fra anionbyttersøjlen fra trin (c) under forhold, der muliggør opfangning af det ikke-kompleksbundne botulinum toksin A ved hjælp af kationbyttersøjlen; og (e) eluering af oprenset, ikke-kompleksbundet botulinum toksin A fra kationbyttersøjlen fra trin (d).

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor, i trin (i), fermenteringskulturen, der omfatter botulinum toksin A, syreudfældes med ca. 3M svovlsyre.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor den opkoncentrerede prøve fra trin (ii) opnås ved udførelse af tangentiel strømningsfiltrering på syreudfældningen for at opkoncentrere præcipitatet.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor prøven fra trin (iii) udsættes for nukleasedigestion ved et pH på 5 til 7.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, hvor nukleasen afledes af en ikke-animalsk kilde.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor, i trin (iv), det nedbrudte cellemateriale fjernes ved centrifugering og/eller filtrering for at frembringe den klarede prøve.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, hvor den klarede prøve fra trin (iv) kombineres med en buffer, der omfatter ammoniumsulfat, før fyldning af den hydrofobe interaktionssøjle i trin (v).

22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, hvor den klarede prøve fra trin (iv) kombineres med en 0,5 M ammoniumsulfatopløsning ved pH 6 og 50 mM phosphat før fyldning af den hydrofobe interaktionssøjle i trin (v).

23. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor, i trin (vii), botulinum toksin A-komplekset dissocieres i en buffer med et pH på 7,0 til 8,4 for at opnå blandingen, der omfatter det rå, ikke-kompleksbundne botulinum toksin A dissocieret fra de native non-toksinproteiner.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, hvor botulinum toksin A-komplekset dissocieres i Tris buffer ved pH 7,8.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, hvor fremgangsmåden i alt væsentligt er fri for animalsk produkt.