EA001033B1 - Способ определения состояния организма посредством измерения пептидов - Google Patents

Способ определения состояния организма посредством измерения пептидов Download PDF

Info

Publication number
EA001033B1
EA001033B1 EA199900196A EA199900196A EA001033B1 EA 001033 B1 EA001033 B1 EA 001033B1 EA 199900196 A EA199900196 A EA 199900196A EA 199900196 A EA199900196 A EA 199900196A EA 001033 B1 EA001033 B1 EA 001033B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
molecular weight
organism
sample
peptides
weight peptides
Prior art date
Application number
EA199900196A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900196A1 (ru
Inventor
Вольф-Георг Форссманн
Петер Шульц-Кнаппе
Михель Шрадер
Ханс-Георг Опитц
Original Assignee
Биовизион Гмбх Унд Ко.Кг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26028345&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA001033(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE1996132521 external-priority patent/DE19632521A1/de
Application filed by Биовизион Гмбх Унд Ко.Кг filed Critical Биовизион Гмбх Унд Ко.Кг
Publication of EA199900196A1 publication Critical patent/EA199900196A1/ru
Publication of EA001033B1 publication Critical patent/EA001033B1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Предметом настоящего изобретения является способ определения состояния организма посредством измерения пептидов в пробе организма.
Для определения состояния организма применяют различные аналитические методы. Так, например, в диагностике более высоко организованных организмов в случае патологических результатов пытаются найти причину патологических изменений на основе симптоматики, чтобы спланировать каузальную терапию. Затем стараются секвенированием геномов организмов и введением геномов дикого типа разработать эталон среднего, здорового организма, чтобы затем индивидуальные отклонения, которые могут указывать на возможное патогенное развитие, обнаруживать соответствующим генным анализом. Недостатком первой методики является невозможность проведения безгипотезной диагностики, так как при этом устанавливают диагноз, который основывается на предположениях. Недостаток второй методики заключается в отсутствии с точки зрения перспективы, возможности диагностировать важные или даже все заболевания, вызванные генетическими нарушениями. Другой недостаток последней методики может состоять также в том, что мутация на гене не приводит непременно к экспрессии связанных с этим фенотипов.
Следовательно, было бы желательно иметь в распоряжении универсальный способ диагностики, с помощью которого можно избежать описанных недостатков и, в частности, проводить свободную от гипотез диагностику. Кроме того, способ диагностики должен быть универсальным в применении, не ограничиваться высокоорганизованными системами, а чтобы его можно было одновременно применять и для определения состояния низших организмов. К тому же он должен легко реализовываться и осуществляться уже известной техникой.
Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа.
Поставленная техническая задача достигается простым образом при помощи способа с признаками, указанными в п. 1. Зависимые пункты формулы изобретения относятся к предпочтительным вариантам осуществления способа согласно изобретению.
Способ определения состояния организма согласно изобретению исходит из того, что берут пробу исследуемого организма. Проба может быть также полным организмом. Проба должна содержать низкомолекулярные пептиды, при этом не является помехой, если проба наряду с низкомолекулярными пептидами содержит также высокомолекулярные пептиды или протеины. При этом выявляют низкомолекулярные пептиды и непосредственно характеризуют согласно изобретению, и они служат в качестве индикатора состояния организма. При этом можно измерительной техникой непосредственно определить отдельные пептиды, множество пептидов, включая все имеющиеся в пробе и определяемые измерительной техникой низкомолекулярные пептиды. Иначе, чем при обычных аналитических или диагностических методах, таких как гель-электрофорез или двумерный электрофорез, и, например, клинические диагностические методы, здесь исследовали не высокомолекулярные структуры, как например, протеины. В противоположность известным методам диагностики, как например, радиоиммунный анализ или другие конкурирующие анализы измерения пептидных гормонов и им подобных, низкомолекулярные пептиды согласно изобретению измеряют непосредственно, а не косвенно, как в названных методах. Эталоном служит распределение низкомолекулярных пептидов при типичном поперечном срезе определенных контрольных образцов.
В способе согласно изобретению исследуемую пробу тканей или жидкостей можно брать у организма, состояние которого должно быть определено, или это может быть сам организм или его части. В случае исследования низших организмов предпочтительно сам организм служит пробой. В качестве низших организмов принимают во внимание особенно одноклеточные организмы, как прокариотные системы или простые эукариотные системы, как дрожжи или другие микроорганизмы.
Согласно изобретению низкомолекулярные пептиды, которые должны быть привлечены для измерения, предпочтительно имеют молекулярный вес максимально 30.000 Дальтон. Нижний предел не является критическим, однако дипептиды представляют собой нижний предел низкомолекулярных пептидов, которые должны контролироваться согласно изобретению. Особенно предпочтительны молекулярные веса низкомолекулярных пептидов от 1 00 до 10.000 Дальтон.
В случае необходимости, например, если это обусловлено измененным измерительным устройством, может быть предпочтительным удалять из пробы высокомолекулярные пептиды или протеины, а также другие биополимеры, которые могут интерферировать при измерении. Это не требуется, в частности, если посредством применяемого способа измерения согласно изобретению высокомолекулярные пептидные соединения не определяются.
Предпочтительно для определения низкомолекулярных пептидов используют согласно изобретению масс-спектроскопию. При этом особенно пригодным оказался так называемый МАЛДИ-метод (поддерженная матрицей лазерно-десорбционно-ионизационная масс-спектроскопия). Если масс-спектрометрию применяют как метод, рекомендуется использовать данные, определяемые масс-спектроскопией, для характеристики низкомолекулярных пептидов, на3 пример, их молекулярный вес. При определенных обстоятельствах можно также анализировать другие параметры, как, например, заряд пептидов, или характеристическое время удерживания на хроматографических колонках, или фрагментарный образец низкомолекулярных пептидов, или комбинации массы низкомолекулярных пептидов и их зарядов.
В зависимости от постановки вопроса, связанного с определением состояния организма, может быть предпочтительно разделить пробу на несколько фракций, и проанализировать пробы в свете различных вопросов или с помощью различных измерительных устройств, и тем самым определить состояние организма.
В качестве организмов пригодны особенно прокариоты, эукариоты, многоклеточные организмы, клетки тканевых культур, клетки животных и человека. Так, согласно способу по изобретению можно исследовать состояние генетически измененных или трансформированных и/или кондиционированных организмов. Это может быть особенно предпочтительно при повторных контролях трансформированных систем, чтобы знать, в какой мере в трансформированных организмах могут развиваться неожиданные или нежелательные свойства, в которых образуются, например, пептиды, которые указывают на нежелательные или неожиданные свойства, например токсические свойства.
В частности, каждое сознательно или несознательно проведенное манипулирование (кондиционирование) организма может оказывать влияние на его состояние, хотя бы в пределах назначения лекарственных средств, генной терапии, при инфекциях, на рабочем месте в результате контакта с химическими веществами, при опытах с животными, особенно с трансгенными животными и киоск-оиС -мутантами. В особенности при таких способах путем внутрии межиндивидуального сравнения, например, путем хронологического взятия проб из организма перед или в ходе проведения вышеназванного мероприятия или путем сравнения с необработанными контрольными организмами можно проверить, появились ли в самом деле предсказанные, желательные изменения в состоянии и появились ли кроме этого или вместо этого непредсказанные, нежелательные или также желательные изменения, которые определяют свободным от гипотез способом согласно изобретению.
Поэтому способ согласно изобретению пригоден также, например, для сопровождения клинических исследований, токсикологических исследований при опробовании лекарственных средств любого вида, для анализа (определения продуктов расщепления, для идентификации генных продуктов).
В ветеринарии и в медицине человека способ согласно изобретению имеет огромное значение, заключающееся в том, что стал возможным безгипотезный контроль состояния упомянутого организма. Следовательно, анализ уже не осуществляют, руководствуясь предвзятым мнением, а составляют истинную общую картину состояния исследуемого организма. Способ согласно изобретению, который может быть назван дифференциальным индикатором пептидов (Э|ГГсгсп11а1 Рерйбе 0Тр1ау). исходит при этом из того, что в здоровом организме имеется определенный пептидный образец и поэтому он может служить эталонным стандартом. Если определить пептидное состояние индивидуума и сравнить его с эталоном, то можно, с одной стороны, установить отклонения, свидетельствующие уже о первом указании на возможное патогенное состояние. Если теперь отклонения, которые были установлены путем сравнения с подобными патогенными состояниями, определяют из соответствующих проб заболевшего, то уже можно путем сравнения отклонений в образце пептидов пробы индивидуума и в соответствии с отклонениями с тождественной картиной заболевания идентифицировать данное заболевание непосредственно в результате анализа.
При этом согласно изобретению можно осуществлять следующее. Для получения пробы-эталона можно использовать сначала ультрафильтраты жидкостей организма и тканевые экстракты. Осуществляют получение фильтратных пептидов и их разделение на фракции, в результате чего получают фракции низкомолекулярных пептидов. Характеризовать пептидные фракции можно, например, на основании режима удерживания и молекулярного веса, определяемого хроматографией или массспектроскопией. Если используют, например, ультрафильтрат пациентов, которые страдают известным заболеванием, и сравнивают его с установленным ранее спектром здорового испытуемого, можно провести благодаря отклоняющемуся образцу сопоставление специфического заболевания с состоянием соответствующей смеси пептидов. Способ можно использовать также известным традиционным образом, причем, например, сразу запрашивают соответствующий пептидный образец, указывающий на патогенные изменения. В отдельном случае это может быть даже пептид, характерный для соответствующего заболевания. Если анализируют например, пробу пациента, у которого распознают определенную картину заболевания и существует гипотеза причины этого заболевания, можно, например, этот специфический пептид запрашивать также при анализе согласно изобретению и при положительном исходе намечать соответствующее лечение. Так, возможно сначала взять пробу у пациента, с помощью способа по изобретению определить картину состояния, чтобы затем при наличии отклонения, указывающего на патогенное состояние, или провести контрольное измерение известным подтверждающим анализом, с привлечением обычных клинических анализов, или провести контрольное измерение путем специфического скрининга после индикатора патогенного состояния.
При этом пептиды можно получать известными специалисту способами, как например, ультрафильтрация соответствующего исходного материала. При этом применяют фильтры с молекулярным размером отверстий, которые лежат в обсуждаемой согласно изобретению области, а именно между молекулярным весом пептида и максимально 30.000 Дальтон. Подходящим выбором соответствующих мембран можно получать также определенные молекулярно-весовые фракции. Предпочтительно путем фильтрации получают от 0,2 мл до 50 л фильтрата, который, например, сразу после окончания фильтрации подкислением разбавленной соляной кислотой доводят до величины рН от 2 до 4. Названные количества служат, в частности, для того, чтобы исследовать в сборниках пробы 1, во-первых, для обнаружения эталонных проб здоровых испытуемых или для определения специфических относительно заболевания пептидных маркеров для составления банка данных пептидов.
Пептиды, находящиеся в фильтрате после ультрафильтрации, получают путем адсорбции на хроматографических материалах, особенно катионообменных смолах, как например, фрактогель, анионообменный фрактогель (ТМАЕ) и материалы с обращенной фазой (ОФ), с последующим элюированием линейными градиентами или ступенчатыми градиентами. Для дальнейшей очистки можно проводить, в случае необходимости, другие хроматографические разделения, особенно на материале с обращенными фазами.
Определение пептидных фракций осуществляют предпочтительно масс-спектрометрическим анализом, особенно при помощи МАЛДИ - масс-спектрометрами или ЭРИ - массспектрометрами (электрораспылительно-ионизационной масс-спектрометрии). Это методы, которые применяют для анализа пептидов. При этом работают предпочтительно в диалоговом режиме ОФ-разделения с микроотверстиями с масс-спектрометрией (АС-МС-связь). Из полученных данных составляют многомерную таблицу по режимам удержания, молекулярному весу и интенсивности сигналов в качестве предпочтительных главных параметров. Однако можно определять также другие величины, определяемые с помощью названных методов.
Данные о пациентах с известным основным заболеванием, полученные вышеназванными операциями, сравнивают с полученными одновременно данными здоровой эталонной популяции. При этом устанавливают как качественные изменения (например, появление новых пептидов или отсутствие пептидов), так и количественные изменения (увеличенное или уменьшенное появление отдельных пептидов). Мишени, определенные сравнительным анализом, можно, если требуется, очищать и идентифицировать дальше методами, известными специалисту из химии пептидов. Полученную информацию о последовательностях можно затем сравнивать с банками данных протеинов и нуклеиновых кислот и потом с литературными данными. Релевантность представленных пептидов относительно исследованного заболевания проверяют функциональными исследованиями и последовательным скринингом на подходящих группах пациентов.
Пример 1 . Применение жидкостей организма, здесь: фильтрат крови (гемофильтрат, ГФ).
. Получение гемофильтрата.
Гемофильтрат получают путем артериовенозной или также вено-венозной гемофильтрации известными специалисту методами у выбранных пациентов или испытуемых. ГФ получают способом, который, в принципе, применяют обычно для пациентов с хроническим заболеванием почек. Через артериальный отвод и венозный приток (артерио-венозный ГФ) или венозный отвод с венозным притоком (веновенозный ГФ) кровь пациента, при аппаратурной поддержке, направляют через гемофильтрующий прибор (например, гемопроцессор, Сарториус Гёттинген; АК ΙΟ НГМ, Гамбро Гехинген) через гемофильтр (например Гемофлоу Г 60 или Гемофлоу НГ 80 8, Фрезиниус, Бад Гомбург; Гемофлоу ГН 77 Н и Гемофлоу НГ 88 Н, Гамбро), который имеет молекулярный размер пор вплоть до 30 кД. Взятый у пациента объем фильтрата замещают раствором электролита (например 8Н 01, 8Н 05, 8Н 22, 8Н 29, Шива, Кландорф).
Согласно настоящему изобретению проводят диагностическую гемофильтрацию с целью получения от I до 30 л ГФ у пациента в течение гемофильтрации. Гемофильтрат во избежание протеолиза сразу с помощью разбавленной кислоты (например I М НС1) доводят до величины рН между 2 и 4 и охлаждают до 4°С.
2. Получение ГФ-пептидов и разделение на фракции.
2.1 . Экстракция пептидов ступенчатым элюированием. 1 0 л гемофильтрата разбавляют деионизированной водой до проводимости 6 м-с/см и устанавливают с помощью соляной кислоты рН 2,7. Затем наносят ГФ на хроматографическую колонку. После связывания ГФпептидов элюируют связанные пептиды с помощью ступенчатого элюирования с соответствующим значением рН. При этом применяют 7 буферных растворов с возрастающей величиной рН.
Условия хроматографии:
поток при нанесении: 1 00 мл/мин;
поток при элюировании: 30 мл/мин;
детектирование: 214, 280 нм;
колонка: Вантаже (Амикон, Виттен), диаметр 6 см, высота наполнения 7 см;
материал колонки: фрактогель ΤδΚ δΡ 650
М (Мерк, Дармштадт);
установка: БиоСАО 250, Регеерйуе Вю8у81еш8, Висбаден-Норденштадт.
Буферный раствор рН Буферное соединение Моляр- ность
Элюирующий буферный раствор I 3,6 Лимонная кислота 0,1
Элюирующий буферный раствор 2 4,5 Уксусная кислота 0,1
Элюирующий буферный раствор 3 5,0 Яблочная кислота 0,1
Элюирующий буферный раствор 4 5,6 Янтарная кислота 0,1
Элюирующий буферный раствор 5 6,6 Дигидрофосфат натрия 0,1
Элюирующий буферный раствор 6 7,4 Динатрийгидрофосфат 0,1
Элюирующий буферный раствор 7 9,0 Карбонат аммония 0,1
Элюаты 1-7 собирают отдельно.
2.2. Второе хроматографическое разделение.
Элюаты 1 -7 хроматографируют отдельно на колонке с обращенной фазой.
Условия хроматографии:
поток или нанесение: 1 0 мл/мин;
поток при элюировании: 4 мл/мин;
детектирование: 21 4 нм;
колонка: стальная, кислотная для высокоэффективной жидкостной хроматографии (диаметр 1 см, высота заполнения 12,5 материал колонки: источник хроматографии с обращенными фазами 15 мкм (Фармация, Фрайбург),
Установка: БиоСАО, РегеерОуе Вю8У81ет8. Висбаден-Норденштадт.
Элюат собирают фракциями по 4 мл.
3. Составление картотеки пептидных фракций.
3.1. Полученные в 2.2. аликвотные фракции наносят на колонку с обращенными фазами и элюируют в градиенте. Обнаружение проводят ультрафиолетовым детектором в диалоговом режиме с электрораспылительным массспектрометром.
Условия хроматогрфии:
поток при нанесении: 20 мкл/мин;
поток при элюировании: 20 мкл/мин;
детектирование: 220 нм;
колонка: С18 ΑΟδ, 3 мкм, 120 А, диаметр 1 мм, длина 10 см УМС; Шермбек).
Установка: АВ1 140 В система с двойным растворителем.
Буферный раствор А: 0,06% трифторуксусной кислоты в воде.
Буферный раствор В: 80% ацетонитрила в
А.
Градиент: 0% В на 100% В в течение 90 мин.
Диалоговая масс-спектрометрия:
АР1 III с поверхностью раздела электрораспылителя (Перкин-Елмер, Вайтерштадт).
Положительный ион модус.
Диапазон измерения: м/ζ от 300 до 2.390.
Время сканирования: 7 с.
Окно сканирования: 0,25 м/ζ.
Регистрацию данных осуществляют при помощи математического обеспечения Мае8рее или Ми1иУ1е\у (Перкин-Аймер).
3.2. Измерение отдельных фракций путем МАЛДИ - масс-спектрометрией.
Полученные в 2.2. аликвотные фракции измеряют при помощи различных матричных веществ, например, при добавке Ь (-)-фукозы в МАЛДИ - масс-спектрометрии.
Из необработанных данных составляют многомерную таблицу, учитывая номер сканирования, интенсивность сигнала и после расчета массу многозарядных ионов сканирования.
4. Сравнительный анализ.
4.1. Идентификация новых, отсутствующих или определенно различных пептидов.
Путем сравнения полученных в 3.3 блоков данных, которые можно назвать также карточками пептидов, устанавливают качественные и/или количественные различия. При этом, принимая во внимание контроль и пробы, привлекают для сравнения отдельные блоки данных или также группы блоков данных.
4.2. Химическая характеристика пептидов идентифицированных мишеней.
Из полученного сырого материала (например, объем препарационного гемофильтрата) очищают идентифицированные мишени в количествах, которые позволяют проводить идентифицирование. Для этого используют различные, известные специалисту хроматографические методы разделения (обращенные фазы, ионообмен, хроматография исключения, гидрофобная интерактивная хроматография и т.д.), используемые, в общем, для разделения смесей пептидов. После каждого хроматграфического разделения фракции идентифицируют мишени во фракциях путем ЭРИ - масс-спектроскопии, МАЛДИ - масс-спектроскопии или также АСмасс-спектроскопии снова. Этот прием при изменении хроматографических параметров повторяют так часто, пока не образуется чистый продукт искомой спецификации, т. е. время удержания и молекулярный вес. После этого проводят определение частичной или полной аминокислотной последовательности или фрагментарного образца. Затем проводят сравнение банка данных с известными банками данных (Швейцария-Прот и банк данных ЕМВЬпептидов и нуклеиновых кислот) с целью идентифицирования частичной или полной аминокислотной последовательности или фрагмен9 тарного образца. Если данные не внесены в банк данных, поясняют первичную структуру.
Пример 2. Использование жидкостей организма, здесь: асцит.
1. Получение асцита.
Асцит образуется как внесосудистый экссудат при различных заболеваниях (злокачественные опухоли, нарушения печени и т.д.). В рамках настоящего способа получают пункцией от 10 мл до 10 л асцита и после этого во избежание протеолиза с помощью разбавленной кислоты (например I М НС1) сразу устанавливают величину рН между 2,0 и 4,0 и охлаждают до 4°С. После ультрафильтрации через мембрану из триацетатцеллюлозы с размером пор 30 кЭ (Сартокон-Мини-аппаратура, Сарториус) фильтрат используют дальше в качестве источника пептидов.
2. Получение пептидного асцита и разделение на фракции.
2.1. Экстракции пептидов с градиентным элюированием.
л асцитного фильтрата доводят до величины рН 2,0 и разделяют на колонке с обращенными фазами для препаративной хроматографии.
Условия хроматографии: поток при нанесении 40 мл/мин; поток при элюировании: 40 мл/мин; детектирование: 214 нм, 280 нм; колонка: система с фильтрующим элементом \Уа1сг5. диаметр 4,7 см, высота наполнения 30 см;
материал колонки: Уубас КР-С18, 15 - 20 мкм;
установка: БиоСАЭ, РегеерОуе ВюууЖетъ Висбаден-Норденштадт, буферный раствор А: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде;
буферный раствор В: 80% ацетонитрила в А;
градиент: 0% В на 100% В в 3,000 мл.
Элюат собирают во фракции по 50 мл.
Далее определяют характеристики в соответствии с примером 1 .
Пример 3. Использование жидкостей организма, здесь: моча.
. Получение мочи.
Мочу получают катетором или в виде самопроизвольной мочи у пациентов в количествах от 0,5 до 50 л и во избежание протеолиза при помощи разбавленной кислоты (например I М НС1) доводят рН до величины между 2,0 и 4,0 и охлаждают до 4°С. После ультрафильтрации через мембрану из триацетатцеллюлозы с размером пор 30 кЭ (Сартокон-Мини-аппаратура, Сарториус) фильтрат используют далее в качестве источника пептидов.
2. Получение пептидов мочи и разделение на фракции.
2.1. Экстракция пептидов ступенчатым элюированием.
0 л фильтрата мочи разбавляют водой до проводимости 6 м.с/см и при помощи НС1 устанавливают рН, равное 2,7. Затем фильтрат мочи наносят на хроматографическую колонку. После связывания пептидов элюируют связанные пептиды с градиентом хлористого натрия.
Условия хроматографии:
поток при нанесении: 1 00 мл/мин;
поток при элюировании: 30 мл/мин;
детектирование: 21 4 нм, колонка: Вантаже (Амикон, Виттен), диаметр 6 см, высота наполнения 7 см;
материал колонки: Мерк фрактогель Т8К
8Р 650 М, установка: БиоСАЭ 250, Реткерйуе Вю8у81ет8, Висбаден-Норденштадт.
Буферный раствор А: 50 нМ ЫаН2РО4, рН 3,0.
Буферный раствор В: 1,5 М ЫаС1 в А.
Градиент: 0% В на 100% В в 2,000 мл.
Элюат собирают в 1 0 сборников по 200 мл.
2.2. Второе хроматографическое разделение.
Фракции хроматографируют отдельно через колонку с обращенной фазой.
Условия хроматографии:
поток при нанесении: 1 0 мл/мин;
поток при элюировании: 4 мл/мин;
детектирование: 21 4 нм;
колонка: стальная колонка для высокоэффективной жидкостной хроматографии, диаметр 1 см, высота наполнения 12,5 см, материал колонки: источник хроматографии с обращенными фазами ОФХ 15 мкм, Фармация;
установка БиоСаЭ, Реткерйуе ВюууЛетъ Висбаден-Норденштадт;
буферный раствор А: 0,1% трифторуксусной кислоты в воде;
буферный раствор В: 80% ацетонитрила в А;
градиент: 0% В на 1 00% В в 200 мл.
Элюат собирают во фракции по 4 мл.
Далее определяют характеристики в соответствии с примером 1 .

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ определения состояния организма, в соответствии с которым отбирают пробу исследуемого организма и определяют качественный и количественный состав низкомолекулярных пептидов в этой пробе, а о состоянии организма судят по результатам сравнения этого состава с эталоном.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проба представляет собой ткань или жидкость организма, или сам организм, или его комбинации.
  3. 3. Способ по п.1 и/или 2, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды, которые привлекают для измерения, имеют молекулярный вес максимально 30 000 Дальтон.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды, которые привлекают для измерения, имеют, по меньшей мере, молекулярный вес, который соответствует молекулярному весу дипептидов.
  5. 5. Способ по п.3 и/или 4, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды, которые привлекают для измерения, имеют молекулярный вес от 100 до 10 000 Дальтон.
  6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что высокомолекулярные пептиды отделяют перед измерением низкомолекулярных пептидов или не принимают во внимание при измерении или при обработке данных при анализе пробы.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что анализ низкомолекулярных пептидов проводят путем масс-спектрометрии.
  8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что низкомолекулярные пептиды характеризуют путем измерения их молекулярного веса.
  9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что пробу перед измерением низкомолекулярных пептидов разделяют на различные фракции и измеряют при разных условиях.
  10. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что в качестве организма используют прокариоты, эукариоты, многоклеточные организмы, клетки тканевых культур, клетки животных и человека.
  11. 11. Способ по любому из пп. 1 - 1 0, отличающийся тем, что пробу берут из генетически измененных, или трансформированных, и/или кондиционированных организмов.
  12. 12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что контроль состояния организма для безгипотезного исследования и картина состояния всего организма служат для обнаружения возможных отклонений от состояния эталона.
  13. 1 3. Способ по любому из пп. 1 -11, отличающийся тем, что определение состояния трансформированного организма для безгипотезного исследования и картина состояния всего организма служат для обнаружения изменений трансформированного организма, для обнаружения связанного с трансформацией появления пептидов, которые причинно связаны с изменениями обмена веществ.
EA199900196A 1996-08-13 1997-08-13 Способ определения состояния организма посредством измерения пептидов EA001033B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1996132521 DE19632521A1 (de) 1996-08-13 1996-08-13 Verfahren zur Gewinnung von Peptiden aus Köperflüssigkeiten und Geweben sowie Zellüberständen und zur Identifikation von krankheitsrelevanten Peptidmarkern
DE19725362 1997-06-16
PCT/EP1997/004396 WO1998007036A1 (de) 1996-08-13 1997-08-13 Verfahren zur erfassung des status eines organismus durch messung von peptiden

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900196A1 EA199900196A1 (ru) 1999-06-24
EA001033B1 true EA001033B1 (ru) 2000-08-28

Family

ID=26028345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900196A EA001033B1 (ru) 1996-08-13 1997-08-13 Способ определения состояния организма посредством измерения пептидов

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6875616B1 (ru)
EP (1) EP0922226B2 (ru)
JP (1) JP2001508864A (ru)
CN (1) CN1233326A (ru)
AT (1) ATE234469T1 (ru)
AU (1) AU720626B2 (ru)
CA (1) CA2263443C (ru)
CZ (1) CZ294729B6 (ru)
DE (1) DE59709517D1 (ru)
DK (1) DK0922226T3 (ru)
EA (1) EA001033B1 (ru)
ES (1) ES2191175T3 (ru)
IS (1) IS4971A (ru)
PL (1) PL186810B1 (ru)
PT (1) PT922226E (ru)
WO (1) WO1998007036A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9753045B2 (en) 2012-03-30 2017-09-05 Bd Kiestra B.V. Automated selection of microorganisms and identification using MALDI

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936424B1 (en) 1999-11-16 2005-08-30 Matritech, Inc. Materials and methods for detection and treatment of breast cancer
DE10021737C2 (de) 2000-05-04 2002-10-17 Hermann Haller Verfahren und Vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines Protein- und/oder Peptidmusters einer Flüssigkeitsprobe, die dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wird
US6693080B2 (en) 2001-04-30 2004-02-17 Syn X Pharma Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1521 daltons
US20040198950A1 (en) 2001-04-30 2004-10-07 George Jackowski Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1518 daltons
US6677303B2 (en) 2001-04-30 2004-01-13 Syn X Pharma Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1097 daltons
US7049397B2 (en) 2001-04-30 2006-05-23 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1211 daltons
US7314717B2 (en) 2001-04-30 2008-01-01 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1562 daltons
US6602855B2 (en) 2001-04-30 2003-08-05 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1449 daltons
US6620786B2 (en) 2001-04-30 2003-09-16 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having molecular weight of 2937 daltons
US6599877B2 (en) 2001-04-30 2003-07-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1020 daltons
US7294688B2 (en) 2001-04-30 2007-11-13 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1348 daltons
US6703366B2 (en) 2001-04-30 2004-03-09 George Jackowski Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1,896 daltons
US20020160533A1 (en) 2001-04-30 2002-10-31 George Jackowski Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular of weight of 1525 daltons
US7087435B2 (en) 2001-04-30 2006-08-08 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2753 daltons
US6627606B2 (en) 2001-04-30 2003-09-30 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1465 daltons
US7008800B2 (en) 2001-04-30 2006-03-07 Artemis Proteomics, Ltd. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1077 daltons
US6627607B2 (en) 2001-04-30 2003-09-30 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1845 daltons
US6756476B2 (en) 2001-04-30 2004-06-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2021 daltons
US6593298B2 (en) 2001-04-30 2003-07-15 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1690 daltons
US6620787B2 (en) 2001-04-30 2003-09-16 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2267 daltons
US7015004B2 (en) 2001-11-23 2006-03-21 Syn X Pharma, Inc. Inter-alpha trypsin inhibitor biopolymer marker indicative of insulin resistance
US6890763B2 (en) 2001-04-30 2005-05-10 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1350 daltons
US6627608B2 (en) 2001-04-30 2003-09-30 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1206 daltons
US20020160420A1 (en) * 2001-04-30 2002-10-31 George Jackowski Process for diagnosis of physiological conditions by characterization of proteomic materials
US6617308B2 (en) 2001-04-30 2003-09-09 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1865 daltons
DE10123711A1 (de) * 2001-05-15 2003-02-27 Wolfgang Altmeyer Verfahren zur Bestimmung der Herkunft biologischer Materialien
US7132244B2 (en) 2001-11-21 2006-11-07 Syn X Pharma, Inc. Betaine/GABA transport protein biopolymer marker indicative of insulin resistance
US7314762B2 (en) 2001-11-21 2008-01-01 Nanogen, Inc. Apolipoprotein biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7179610B2 (en) 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7122327B2 (en) 2001-11-23 2006-10-17 Nanogen Inc. Biopolymer markers indicative of type II diabetes
US7094549B2 (en) 2001-11-23 2006-08-22 Syn X Pharma, Inc. Fibronectin biopolymer marker indicative of insulin resistance
US7125678B2 (en) 2001-11-23 2006-10-24 Nanogen, Inc. Protein biopolymer markers predictive of type II diabetes
US6890722B2 (en) 2001-11-23 2005-05-10 Syn X Pharma, Inc. HP biopolymer markers predictive of insulin resistance
US20030100014A1 (en) * 2001-11-23 2003-05-29 George Jackowski Apolipoprotein biopolymer markers predictive of type II diabetes
US7026129B2 (en) * 2001-11-23 2006-04-11 Syn X Pharma, Inc. IG lambda biopolymer markers predictive of Alzheimers disease
US7074576B2 (en) 2001-11-23 2006-07-11 Syn X Pharma, Inc. Protein biopolymer markers indicative of alzheimer's disease
JP2005510716A (ja) * 2001-11-23 2005-04-21 シン．クス ファーマ、インコーポレイテッド インスリン耐性を示すグロビンバイオポリマーマーカー
US7179606B2 (en) 2001-11-23 2007-02-20 Syn X Pharma, Inc. IG heavy chain, IG kappa, IG lambda biopolymer markers predictive of Alzheimer's disease
US7179605B2 (en) 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Fibronectin precursor biopolymer markers indicative of alzheimer's disease
US7135297B2 (en) 2001-11-23 2006-11-14 Nanogen Inc. Protein biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7052849B2 (en) 2001-11-23 2006-05-30 Syn X Pharma, Inc. Protein biopolymer markers predictive of insulin resistance
US7097989B2 (en) 2001-11-23 2006-08-29 Syn X Pharma, Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers predictive of type II diabetes
JP2006522340A (ja) 2003-04-02 2006-09-28 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド 質量分析データの分析法
DE10341193A1 (de) * 2003-09-06 2005-03-31 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag Vorrichtung und Verfahren zur quantitativen Auswertung der in einer Körperflüssigkeitsprobe enthaltenden Polypeptide sowie Marker zur Erkennung von pathologischen Zuständen
US20090035797A1 (en) * 2004-10-15 2009-02-05 Hancock William S Detection of Disease Associated Proteolysis
WO2009016431A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Digilab, Inc. Sample preparation method and apparatus
BRPI0920114B1 (pt) * 2008-10-31 2021-08-17 Biomerieux, Inc. Métodos para o isolamento e a identificação de micro-organismos
RU2519650C2 (ru) * 2008-10-31 2014-06-20 Биомерьё, Инк. Способы разделения, характеристики и(или) идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии
KR20110091719A (ko) * 2008-10-31 2011-08-12 바이오메리욱스, 인코포레이티드. 식별제를 사용한 미생물의 분리 및 특성규명 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5537944A (en) * 1978-09-09 1980-03-17 Seiichi Shibata Diagnosis chemical and diagnosis method of kidney disease
EP0651816A4 (en) * 1992-07-15 1995-10-25 Univ South Florida CONTENT OF CCK PEPTIDES IN FLOWER IN RELATION TO THE TREATMENT OF PANIC RIFLES.
US5492834A (en) * 1993-07-09 1996-02-20 Beckman Instruments, Inc. Method of sample preparation for urine protein analysis with capillary electrophoresis
DE4427531A1 (de) * 1994-08-04 1996-02-08 Forssmann Wolf Georg Humanes zirkulierendes beta-Defensin hBD-1
JP3579549B2 (ja) * 1995-10-24 2004-10-20 株式会社トクヤマ 糖尿病または糖尿病合併症用マーカーとしての使用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9753045B2 (en) 2012-03-30 2017-09-05 Bd Kiestra B.V. Automated selection of microorganisms and identification using MALDI
RU2639777C2 (ru) * 2012-03-30 2017-12-22 Бд Кистра Б.В. Автоматизированный отбор микроорганизмов и их идентификация с помощью малди
RU2639777C9 (ru) * 2012-03-30 2018-02-16 Бд Кистра Б.В. Автоматизированный отбор микроорганизмов и их идентификация с помощью малди
US10073105B2 (en) 2012-03-30 2018-09-11 Bd Kiestra B.V. Automated selection of microorganisms and identification using MALDI
US10495655B2 (en) 2012-03-30 2019-12-03 Bd Kiestra B.V. Automated selection of microorganisms and identification using MALDI
US10859588B2 (en) 2012-03-30 2020-12-08 Bd Kiestra B.V. Automated selection of microorganisms and identification using MALDI

Also Published As

Publication number Publication date
DK0922226T3 (da) 2003-07-07
DE59709517D1 (de) 2003-04-17
EA199900196A1 (ru) 1999-06-24
ES2191175T3 (es) 2003-09-01
US6875616B1 (en) 2005-04-05
CZ294729B6 (cs) 2005-03-16
AU720626B2 (en) 2000-06-08
CA2263443C (en) 2004-03-30
WO1998007036A1 (de) 1998-02-19
EP0922226B2 (de) 2008-06-25
AU4298897A (en) 1998-03-06
IS4971A (is) 1999-02-10
CN1233326A (zh) 1999-10-27
EP0922226A1 (de) 1999-06-16
ATE234469T1 (de) 2003-03-15
EP0922226B1 (de) 2003-03-12
JP2001508864A (ja) 2001-07-03
CA2263443A1 (en) 1998-02-19
CZ49199A3 (cs) 2000-04-12
PL331612A1 (en) 1999-08-02
PT922226E (pt) 2003-07-31
PL186810B1 (pl) 2004-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA001033B1 (ru) Способ определения состояния организма посредством измерения пептидов
US8911960B2 (en) Method for identifying idiopathic pneumonia progression by measuring the level of mannose-binding protein C
CN105229164B (zh) 指示癌症疗法的srm测定
US20160252525A1 (en) Cmet protein srm/mrm assay
KR20200028510A (ko) 화학요법 표적에 대한 srm 검정
Hempe et al. Separation of hemoglobin variants with similar charge by capillary isoelectric focusing: value of isoelectric point for identification of common and uncommon hemoglobin variants
WO2012092531A1 (en) Her3 protein srm/mrm assay
O'Riordan et al. Emerging studies of the urinary proteome: the end of the beginning?
JP2013534315A (ja) ｃ−Ｓｒｃ選択反応モニタリングアッセイ
US10718780B2 (en) SRM/MRM assay for the tyrosine-protein kinase receptor UFO(AXL) protein
CN114150057A (zh) 一种诊断阿尔茨海默病的外泌体蛋白及其用途
US10627414B2 (en) Attractin and lumican biomarkers in idiopathic pneumonia syndrome
KR20190080973A (ko) GTPase KRas 단백질(KRas)에 대한 SRM/MRM 검정
KR20160149258A (ko) 안드로겐 수용체(ar) 단백질에 대한 srm/mrm 검정
KR102071122B1 (ko) 섬유아세포 증식 인자 수용체 2(fgfr2) 단백질에 대한 srm/mrm 분석법
Stanley et al. Clinical proteomics and technologies to define and diagnose heart disease
Khwaja et al. Proteomic discovery of biomarkers in the cerebrospinal fluid of brain tumor patients
KR102014694B1 (ko) 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 8(cd30) 단백질에 대한 srm/mrm 검정
US20190285647A1 (en) SRM/MRM Assays For CD56 And CHGA Proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU