EA007742B1

EA007742B1 - Трипептиды, несущие простой гидроксипролиновый эфир замещённого хинолина, предназначенные для ингибирования протеазы ns3 (гепатит с)

Info

Publication number: EA007742B1
Application number: EA200400987A
Authority: EA
Inventors: Монсе Ллина-Брюне; Вида Дж. Гори
Original assignee: Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-24
Publication date: 2006-12-29
Also published as: CA2370396A1; DE60312824D1; EP1474441A1; ATE358137T1; ES2285085T3; PE20031012A1; EP1474441B1; CN100430414C; AU2003202347B2; PL371324A1; CN1642974A; IL163130A; NZ534689A; WO2003064456A1; JP2005530688A; UY27636A1; EA200400987A1; TW200400199A; CO5611113A2; NO20043643L

Abstract

В изобретении описаны соединения формулы (I)в которых Rобозначает гидрокси или NHSOR, где Rобозначает С-Салкил, С-Сциклоалкил или С-Салкил-С-Сциклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, ОС-Салкил, амидо, амино или фенил, или Rобозначает С- или Сарил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С-Салкил, OC-Салкил, амидо, амино или фенил; Rобозначает С-Сциклоалкил; Rобозначает трет-бутил или С-Сциклоалкил и Rобозначает С-Сциклоалкил; или его фармацевтически приемлемая соль. Соединения можно применять в качестве ингибиторов NS3-протеазы HCV при лечении гепатита С.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям, способам их синтеза, композициям и способам лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С (НСУ). В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидным аналогам, фармацевтическим композициям, содержащим такие аналоги, и к способам применения этих аналогов для лечения инфекции, вызываемой НСУ.

Предпосылки создания изобретения

Вирус гепатита С (НСУ) является основным возбудителем гепатита, относящегося к не-А, не-В гепатиту, который передается при переливании крови и который поражает людей во всем мире. Установлено, что свыше 200 миллионов людей в мире заражено вирусом. Большой процент носителей становится хронически инфицированным и у многих пациентов это приводит к хроническому заболеванию печени, так называемому хроническому гепатиту С. В свою очередь, эта группа больных имеет высокий риск заболевания такой серьезной болезнью печени, как цирроз печени, печеночно-клеточный рак и последняя стадия болезни печени, приводящая к смерти.

Механизм, с помощью которого происходит сохранение вируса НСУ в организме и обеспечивается высокий коэффициент заболеваемости хронической болезнью печени, пока недостаточно изучен. Неизвестно, как НСУ взаимодействует с иммунной системой хозяина и преодолевает ее действие. Кроме того, также еще не выявлены роли клеточных и гуморальных иммунных ответов в защите от НСУ-инфекции и при заболевании гепатитом. Имеются данные о том, что для профилактики связанного с переливанием крови вирусного гепатита можно применять иммуноглобулины, однако, Центр по контролю заболеваемости в настоящее время не рекомендует для этой цели применять лечение с использованием иммуноглобулинов. Отсутствие эффективного защитного иммунного ответа затрудняет разработку вакцины или адекватных профилактических мер после контакта, поэтому в ближайшее время надежды в основном возлагаются на антивирусные средства.

С целью выявления фармацевтических агентов, обладающих эффективностью в отношении лечения НСУ-инфекции, были проведены различные клинические исследования с участием пациентов, страдающих хроническим гепатитом С. В этих исследованиях применяли интерферон-альфа индивидуально или в сочетании с другими антивирусными агентами. Эти исследования позволили установить, что у основного большинства участников эксперимента не было обнаружено реакции на такие схемы лечения, а из тех участников, которые оказались чувствительными к лечению, у большей части после окончания лечения происходил рецидив.

Таким образом, до последнего времени терапия с использованием интерферона (ΙΡΝ) оставалась единственным доступным методом лечения пациентов, страдающих хроническим гепатитом С, которая обладала доказанной в клинических условиях эффективностью. Однако эффективность такого лечения сохраняется в течение непродолжительного периода времени, и, кроме того, лечение интерфероном вызывает серьезные побочные действия (т. е. ретинопатию, тиреоидит, острый панкреатит, депрессию), что снижает качество жизни пациентов, подвергающихся лечению. В настоящее время интерферон в сочетании с рибавирином предложен для лечения пациентов, нечувствительных к ΙΡΝ при его индивидуальном применении. Однако побочные действия, вызываемые ΙΡΝ, не уменьшаются при такой совместной терапии. Установлено, что пэгилированные формы интерферонов, такие как РЕС-Ιηίτοη® и Редакук®, могут частично снижать указанные вредные побочные действия, однако антивирусные лекарственные препараты все еще остаются основным средством для орального лечения НСУ.

Таким образом, существует необходимость в разработке эффективных антивирусных агентов для лечения НСУ-инфекции, которые были бы лишены недостатков существующих методов лечения, основанных на применении фармацевтических средств.

НСУ представляет собой заключенную в оболочку положительную цепь РНК-ового вируса семейства ИауМпбае. Геном НСУ, представленный одноцепочечной РНК, состоит приблизительно из 9500 нуклеотидов и имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), которая кодирует один большой полипротеин, состоящий примерно из 3000 аминокислот. В зараженных клетках этот полипротеин расщепляется во многих сайтах клеточными и вирусными протеазами с образованием структурных и неструктурных (N8) протеинов. В случае НСУ под действием двух вирусных протеаз образуются зрелые неструктурные протеины (N82, N83, Ν84Α, Ν84Β, Ν85Α и Ν85Β). Первая из указанных протеаз, которая пока еще недостаточно охарактеризована, расщепляет связь Ν82-Ν83 (далее в контексте настоящего описания обозначена как №2/3-протеаза); вторая представляет собой сериновую протеазу, содержащуюся в Νконцевой области Ν83 (далее обозначена как Ж3-протеаза). и она опосредует все последующие расщепления, происходящие по ходу транскрипции Ν83, как в цис-ориентации в сайте расщепления Ν83-Ν84Α, так и в транс-ориентации в остальных сайтах Ν84Α-Ν84Β, Ν84Β-Ν85Α, Ν85Α-Ν85Β. Протеин Ν84Α, вероятно, обладает множественными функциями, действуя в качестве кофактора для Ν83-протеазы и возможно способствуя мембранной локализации Ν83 и других компонентов вирусных репликаз. Образование комплекса протеазы Ν83 с Ν84Α, вероятно, необходимо для процессирования, усиления протеолитической эффективности во всех сайтах. Протеин Ν83 обладает также нуклеозидтрифосфатазной активностью и РНК-геликазной активностью. Ν85Β представляет собой РНК-зависимую РНК-полимеразу, принимающую участие в репликации НСУ.

- 1 007742

Общая стратегия разработки антивирусных агентов предусматривает инактивацию кодируемых вирусом ферментов, которые играют основную роль в репликации вируса.

Ниже приведен перечень заявок на патенты, опубликованных в течение последних нескольких лет, в которых описаны пептидные аналоги, являющиеся ингибиторами \'83-нроз'еазы НСУ, которые по строению отличаются от соединений, предлагаемых в настоящем изобретении: ОБ 2337262; 1Р 10298151; 1Р 11126861; 1Р 11292840; 1Р 2001-103993; ϋδ \\'О \\'О \О \О \\'О 02/18369; \О 02/60926 и \О 02/79234.

Одним из преимуществ настоящего изобретения является

98/22496; \\'О

99/07734; \\'О

01/07407; \\'О

01/77113; \\'О

98/46597; \\'О

00/09543; \\'О

01/16357; \\'О

01/81325; \\'О

98/46630; \\'О

00/09558; \\'О

01/32691; \\'О

02/08187; \\'О

6159938; ϋδ

99/38888; \\'О

00/20400; \\'О

01/40262; \\'О

02/08198; \\'О

6187905; \\'О 97/43310; \\'О

99/50230; \\'О

00/59929; \\'О

01/58929; \\'О

02/08244; \\'О

99/64442; \\'О

00/31129; \\'О

01/64678; \\'О

02/08251; \\'О

98/17679;

99/07733;

01/02424;

01/74768;

02/08256;

то, что в нем заявлены трипептидные производные, которые обладают ингибирующей активностью в отношении N83-протеазы, фермента, который играет важную роль в репликации вируса гепатита С. Кроме того, соединения обладают способностью ингибировать репликацию РНК НСУ, что установлено с использованием клеточной модели реп ликона.

Еще одним преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что эти соединения специфически ингибируют N83-протеазу и не проявляют заметной ингибирующей активности в отношении других сериновых протеаз, таких как эластаза лейкоцитов человека (НЕЕ), эластаза панкреатической железы свиньи (РРЕ) или бычий химотрипсин поджелудочной железы, или в отношении цистеиновых протеаз, таких как катепсин В печени человека (Са! В).

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к соединению формулы (I)

в котором К¹ обозначает гидроксй или NН8О2К^1А, где К^1А обозначает С1-С₈алкил, С₃-С₇циклоалкил или

С1-С6алкил-С3-С7циклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, ОС1-С₆алкил, амидо, амино или фенил, или К^1А обозначает С₆ или С1₀арил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С1-С₆алкил, ОС1-С₆алкил, амидо, амино или фенил;

К² обозначает С₄-С₆циклоалкил;

К³ обозначает трет-бутил или С₅-С₆циклоалкил и

К⁴ обозначает С₄-С₆циклоалкил;

или его фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли в смеси с фармацевтически приемлемой средой носителя или вспомогательным веществом.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, дополнительно содержит интерферон (пэгилированный или непэгилированный) или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, или их любую комбинацию.

Еще одним важным объектом изобретения является способ лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или описанной выше композиции, индивидуально или в сочетании с одним или несколькими следующими компонентами: интерферон (пэгилированный или непэгилированный) или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, которые в каждом случае вводят совместно или раздельно.

Следующим важным объектом изобретения является способ предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) или его терапевтически приемлемой соли, или описанной выше композиции, индивидуально или в сочетании с одним или несколькими следующими компонентами: интерферон (пэгилированный или непэгилированный) или рибавирин,

- 2 007742 или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, которые вводят совместно или раздельно.

Настоящее изобретение относится также к применению описанного выше соединения формулы (I) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.

В настоящем описании сделаны ссылки на многочисленные документы, содержание которых включено в качестве ссылки.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения Определения

Если не указано иное, то в контексте настоящего описания используемые понятия имеют следующие значения.

В тех случаях, когда для обозначения абсолютной конфигурации заместителя или асимметричного центра соединения формулы (I) используют дескрипторы (В) или (8), то обозначение относится ко всему соединению, а не только к заместителю или асимметричному центру.

Обозначение «Р1, Р2 и Р3» в контексте настоящего описания относится к положению аминокислотных остатков, начиная с С-конца пептидных аналогов и простираясь к Ν-концу [т.е. Р1 обозначает положение 1 относительно С-конца, Р2 обозначает положение 2 относительно С-конца и т.д. (см. Вегдег А. и 8с11ес1Иег I., Ттаикасйоик οί 111е Воуа1 8оае1у Ьоийои кепек. В257, 1970, сс. 249-264).

В контексте настоящего описания понятие «винил-АЦКК» относится к соединению формулы

т.е. (1В, 28)-1-амино-2-этенилциклопропилкарбоновой кислоте.

Понятие «С^Сдалкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает ациклические алкильные заместители с прямой или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 8 атомов углерода, и включает, например, метил, этил, 2-метилгексил, 1,1-диметилгексил (или трет-бутил) и октил.

Понятие «С₃-С₇циклоалкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает циклоалкильный заместитель, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, и включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

Понятие «С₁-С₆алкил-С₃-С₆циклоалкил» в контексте настоящего описания обозначает циклоалкильный радикал, содержащий от 3 до 6 атомов углерода, который непосредственно связан с алкиленовым радикалом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода; например, циклопропилметил, циклопентилэтил, циклогексилметил и циклогексилэтил. Например, когда В^1А обозначает С1-С₆алкил-С₃-С₆циклоалкил, то эта группа связана с 8О₂-группой через С1-С₆алкил (т.е. алкиленовый фрагмент).

Понятие «С₆- или С₁₀арил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим радикалом, обозначает либо ароматическую моноциклическую группу, содержащую 6 атомов углерода, либо ароматическую бициклическую группу, содержащую 10 атомов углерода. Например, арил представляет собой фенил, 1-нафтил или 2-нафтил.

Понятие «ОС1-С₆алкил» в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим радикалом, обозначает радикал -ОС1-С₆алкил, в котором алкил, как указано выше, содержит вплоть до 6 атомов углерода. ОС₁-С₆алкил обозначает метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси и 1,1диметилэтокси. Последний радикал обычно обозначают как трет-бутокси.

Понятие «гало» в контексте настоящего описания обозначает галогеновый заместитель, выбранный из брома, хлора, фтора или йода.

Понятие «фармацевтически приемлемая соль» обозначает соль соединения формулы (I), которую с медицинской точки зрения можно использовать в контакте с тканями человека и низших животных без признаков повышенной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. п., которая соответствует приемлемому соотношению польза/риск и, как правило, может растворяться или диспергироваться в воде или масле и обладает эффективностью при целевом использовании. Понятие включает фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли и фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований. Перечень приемлемых солей приведен, например, у 8.М. Виде и др., 1. РНагш. 8ск, 66, 1977, сс. 119, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Понятие «фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль» обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных оснований и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., и с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, адипиновая кислота, альгиновая кислота, аскорбиновая кислота, аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, 2

- 3 007742 ацетоксибензойная кислота, масляная кислота, камфорная кислота, камфорсульфоновая кислота, коричная кислота, лимонная кислота, диглюконовая кислота, этансульфоновая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, глицерофосфорная кислота, полусерная кислота, энантовая кислота, капроновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота (изэтионовая кислота), молочная кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, мезитиленсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота, никотиновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, щавелевая кислота, памовая кислота, пектиновая кислота, фенилуксусная кислота, 3-фенилпропионовая кислота, пикриновая кислота, пивалиновая кислота, пропионовая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, сульфаниловая кислота, винная кислота, паратолуолсульфоновая кислота, ундекановая кислота и т.п.

Понятие «фармацевтически приемлемая соль присоединения основания» обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных кислот и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими основаниями, такими как аммиак или гидроксид, карбонат или бикарбонат аммония, или катионами металла, такого как натрий, калий, литий, кальций, магний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий и т.п. Наиболее предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксических оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, четвертичных аминовых соединений, замещенных аминов, включая встречающиеся в естественных условиях замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, изопропиламин, трипропиламин, трибутиламин, этаноламин, диэтаноламин, 2-диметиламиноэтанол, 2диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, Νэтилпиперидин, производные тетраметиламмония, производные тетраэтиламмония, пиридин, Ν,Νдиметиланилин, Ν-метилпиперидин, Ν-метилморфолин, дициклогексиламин, дибензиламин, Ν,Νдибензилфенэтиламин, 1-эфенамин, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, полиаминовые смолы и т.п. Наиболее предпочтительными органическими нетоксическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметиламин, дициклогексиламин, холин и кофеин.

Понятие «антивирусный агент» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Антивирусные агенты включают, например, рибавирин, амантадин, УХ-497 (меримеподиб, фирма Уейех Рйаттасеийсак), УХ-498 (фирма Уейех РйаттасеийсаИ), левовирин, вирамидин, цеплен (максамин), ХТЬ-001 и ХТЬ-002 (фирма ХТЬ Вюрйаттасеийсак).

Понятие «другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агенты, эффективные в отношении снижения или предупреждения развития связанных с гепатитом С симптомов болезни. Такие агенты выбирают из: антивирусных агентов, иммуномодуляторов, ингибиторов №3-протеазы НСУ, ингибиторов полимеразы НСУ или ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ.

Понятие «иммуномодулятор» в контексте настоящего описания обозначает агенты (химические соединения или биологические агенты), которые обладают эффективностью в отношении повышения или потенциирования реакции иммунной системы у млекопитающего. Иммуномодуляторы включают, например, интерфероны класса I (такие как α-, β- и ω-интерфероны, τ-интерфероны, консенсусные интерфероны и азиало-интерфероны), интерфероны класса II (такие как γ-интерфероны) и пэгилированные интерфероны.

Понятие «ингибитор №3-протеазы НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции №3-протеазы НСУ у млекопитающего. Ингибиторы №3-протеазы НСУ включают, например, соединения, описанные в XVО 99/07733, XVО 99/07734, XVО 00/09558, XVО 00/09543, XVО 00/59929 или XVО 02/060926, перспективное соединение, разработанное фирмой Воейппдет 1пде1йе1т, обозначенное как ΒΙΤΝ 2061, которое изучено в клиническом исследовании, и перспективные соединения, разработанные фирмой Уейех/Ей ЬШу, обозначенные как УХ-950 или ЬУ-570310, которые еще не окончательно исследованы. В частности, соединения №№ 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 и 127, представленные в таблице на сс. 224-226 ^О 02/060926, можно применять в сочетании с соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении.

Понятие «ингибитор полимеразы НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингиби

- 4 007742 рования функции полимеразы НСУ у млекопитающего. Оно относится, например, к ингибиторам Ν85Βполимеразы НСУ. Ингибиторы полимеразы НСУ включают не относящиеся к нуклеозидам соединения, например, описанные в заявке на патент США № 10/198680, которая соответствует РСТ/СА 02/01127, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма ВоеЬппдет [пдеШепп), заявке на патент США № 10/198384, которая соответствует РСТ/СА 02/01128, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма Воейппдет ШдеШет), заявке на патент США № 10/198259, которая соответствует РСТ/СА 02/01129, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма ВоеЬппдет ШдеШет), АО 02/100846 А1 и АО 02/100851 А2 (обе на имя фирмы 8Ыте), АО 01/85172 А1 и АО 02/098424 А1 (обе на имя фирмы О8К), АО 00/06529 и АО 02/06246 А1 (обе на имя фирмы Мегск), АО 01/47883 и АО 03/000254 (обе на имя фирмы 1арап ТоЬассо) и ЕР 1256628 А2 (на имя фирмы Адоигоп).

Кроме того, другие ингибиторы полимеразы НСУ включают также нуклеозидные аналоги, например, соединения, описанные в АО 01/90121 А2 (фирма Иешх), АО 02/069903 А2 (ВюстуЧ РЬаттасеибсак 1пс.) и АО 02/057287 А2 и АО 02/057425 А2 (обе на имя фирмы Метск/кк).

Конкретными примерами ингибиторов полимеразы НСУ являются 1ТК-002, ИК-003 и ИК-109 (фирма 1арап ТоЬассо).

Понятие «ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НСУ у млекопитающего, отличной от ингибирования функции №3-протеазы НСУ. Они включают агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом НСУ механизмы, необходимые для образования и/или репликации НСУ в организме млекопитающего. Ингибиторы другой мишени в жизненном цикле НСУ включают, например, агенты, которые ингибируют мишень, выбранную из ряда, включающего геликазу, N82/3протеазу НСУ и внутренний сайт входа в рибосому (ΙΚΕ8). Конкретным примером ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ является Ι8Ι8-14803 (Ι8Ι8 РйаттасеиНсак).

Понятие «ингибитор ВИЧ» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Ингибиторы ВИЧ включают, например, нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интегразы.

Понятие «ингибитор НАУ (вирус гепатита А)» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НАУ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации НАУ в организме млекопитающего. Ингибиторы НАУ включают вакцины, содержащие вирус гепатита А, например, Наупх® (фирма 61ахо8тИЬК1те), УАЦТА® (фирма Мегск) и Ауах1т® (фирма Ауеп1к РаЧеит).

Понятие «ингибитор НВУ (вирус гепатита В)» в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации НВУ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации НВУ в организме млекопитающего. Ингибиторы НВУ включают, например, агенты, которые ингибируют ДНК-полимеразу вируса НВУ или вакцины на основе НВУ. Конкретными примерами ингибиторов НВУ являются ламивудин (Ер1у1т-НВУ®), адефовирдипивоксил, энтекавир, ЕТС (Соупасб®), ΌΛΡΌ (ΌΧΟ), Ь-ЕМАИ (С1еуибше®), АМ365 (амрад), Ьб! (телбивудин), моновалентный-ЕбС (валторцитабин), АСН-126,443 (Ь-Еб4С) (ахиллион), МСС478 (фирма Е11 ЬШу), рацивир (ЯСУ), фтор-Ь- и -Ό-нуклеозиды, робустафлавон, ΙΟΝ 2001-3 (ΙΟΝ), Ват 205 (№уе1о§), ХТЬ-001 (ХТЬ), иминосахара (ШпуЮЮ) (фирма 8упегду), НерВхуте; иммуномодуляторы, такие как: интерферон альфа 2Ь, НЕ2000 (фирма Но11к-Ебеп), ТЬетаб1дт (эпиммун), ЕНТ899 (фирма Епхо Вюсйет), тимозин альфа-1 (2абахш®), вакцину на основе ДНК НВУ (фирма Ро^беИес!), вакцину на основе ДНК НВУ (фирма 1ейетоп Сеп!ег), антиген НВУ (фирма ОтаОеп), ВауНер В® (фирма Вауег), №1Ы-НВ® (фирма №1Ы) и антитела к вирусу гепатита В (фирма Сапдепе); и вакцины на основе НВУ, такие, например, как Епдепх В, ЯесотЫуах НВ, ОепНеуас В, Нерасаге, Вю-Нер В, ТЖпЯ1х, Сотуах, Нехауас.

Понятие «интерферон класса Ι» в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа Ι. Оно включает как встречающиеся в естественных условиях, таких и полученные синтетическим путем интерфероны класса Ι. Примеры интерферонов класса Ι включают α-, β-, ω-интерфероны, τ-интерфероны, консенсусные интерфероны, азиало-интерфероны.

Понятие «интерферон класса ΙΙ» в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа ΙΙ. Примеры интерферонов

- 5 007742 класса II включают γ-интерфероны.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, могут содержать одно или несколько дополнительных действующих веществ, например, выбранных из антивирусных агентов, иммуномодуляторов, других ингибиторов ЫБЗ-протеазы НСУ, ингибиторов полимеразы НСУ, ингибиторов другой мишени в жизненном цикле НСУ, ингибиторов ВИЧ, ингибиторов НАУ и ингибиторов НВУ. Примеры таких агентов приведены выше в разделе «Определения».

Ниже представлены конкретные предпочтительные примеры некоторых таких агентов антивирусные агенты: рибавирин и амантадин;

иммуномодуляторы: интерфероны класса I, интерфероны класса II и пэгилированные интерфероны; ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ, мишенью такого ингибитора являются N83геликаза, №2/3-протеаза НСУ или внутренний сайт входа в рибосому (ГВЕ8);

ингибиторы ВИЧ: нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интеграз; или ингибиторы НВУ: агенты, которые ингибируют вирусную ДНК-полимеразу НВУ, или вакцина на основе НВУ.

Как указано выше, совместная терапия предусматривает совместное введение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли по меньшей мере с одним дополнительным агентом, выбранным из следующего ряда: антивирусный агент, иммуномодулятор, другой ингибитор №3-протеазы НСУ, ингибитор полимеразы НСУ, ингибитор другой мишени в жизненном цикле НСУ, ингибитор ВИЧ, ингибитор НАУ и ингибитор НВУ. Примеры таких агентов приведены выше в разделе «Определения». Указанные дополнительные агенты можно объединять с соединениями, предлагаемыми в изобретении, получая лекарственное средство, которое содержит однократную фармацевтическую дозу. В другом варианте указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту индивидуально в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства, например, используя набор. Указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту до, одновременно или после введения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

В контексте настоящего описания понятие «лечение» обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, для облегчения или устранения симптомов гепатита С и/или снижения вирусного титра у пациента.

В контексте настоящего описания понятие «предупреждение» обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, после контакта индивидуума с вирусом, но до проявления симптомов болезни и/или до обнаружения вируса в крови.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых В¹обозначает гидрокси, NН802Μе, NН8Ο2-циклопропил или ΝΉ802Ρ1. Более предпочтительно В¹ обозначает NН8Ο2-циклопропил или ΝΉ80₂Ρ1ι. В другом варианте наиболее предпочтительно В¹ обозначает гидрокси.

Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых В²обозначает циклопентил или циклогексил. Наиболее предпочтительно В² обозначает циклопентил.

Предпочтительно В³ обозначает трет-бутил или циклогексил. Наиболее предпочтительно В³ обозначает трет-бутил.

Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых В⁴обозначает циклобутил или циклопентил. Наиболее предпочтительно В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), как оно определено выше, в котором В¹обозначает гидрокси, В² и В⁴ каждый обозначает циклопентил и В³ обозначает трет-бутил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В²обозначает циклобутил, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В²обозначает циклогексил, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклопентил.

Более предпочтительно В¹ обозначает ΝΉ80₂Ρ1, В² и В⁴ каждый обозначает циклопентил и В³ обозначает трет-бутил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В²обозначает циклопентил, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклобутил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В²обозначает циклопентил, В³ обозначает трет-бутил и В⁴ обозначает циклогексил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В² и В⁴ каждый обозначает циклопентил и В³ обозначает циклогексил.

Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором В¹ обозначает гидрокси, В², В³ и В⁴ каждый обозначает циклопентил.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой агент, обладающий активностью

- 6 007742 в отношении НСУ. Примеры других агентов, обладающих активностью в отношении НСУ, включают α(альфа), β- (бета), δ- (дельта), γ- (гамма) или ω- (омега) интерферон, рибавирин и амантадин.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой ингибитор Ы83-протеазы НСУ.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор полимеразы НСУ.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор других мишеней жизненного цикла НСУ, включая (но не ограничиваясь ими) геликазу, Ы82/3-протеазу или внутренний сайт входа в рибосому (ΙΚΕ8).

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально, парентерально или с помощью устройства для имплантации. Предпочтительным является оральное введение или введение с помощью инъекции. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать любые общепринятые нетоксические фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или наполнители. В некоторых случаях значение рН композиции можно регулировать с помощью фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов с целью повышения стабильности соединения, включенного в композицию или в форму для его введения. В контексте настоящего описания понятие «парентеральный» включает подкожный, внутрикожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставной, интрасиновиальный, интрастернальный, интратекальный путь введения, введение с помощью инъекции или инфузии, а также введение в область повреждения.

Фармацевтическая композиция может иметь форму стерильного препарата для инъекции, например стерильной инъецируемой водной или жирорастворимой суспензии. Эту суспензию можно получать с помощью хорошо известных методов с использованием диспергирующих или смачивающих агентов (таких, например, как Твин 80) и суспендирующих агентов. Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально в виде любой приемлемой формы лекарственного средства, предназначенной для орального введения, включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки и водные суспензии и растворы. В случае таблеток для орального введения обычно применяемые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсул приемлемые разбавители представляют собой лактозу и безводный кукурузный крахмал. Когда оральным путем вводят водные суспензии, действующее вещество объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять определенные подслащивающие вещества, и/или корригенты, и/или красители.

Другие пригодные наполнители или носители для указанных выше препаративных форм и композиций приведены в обычных фармацевтических справочниках, например, в «К.етшд1оп'8 Р11агтасеиОса1 8с1еисе5», Тйе 8с1епсе и Ргасйсе о£ Рйагтасу, 19-е изд. Маск РиЬШЫпд Сотрапу, ЕаЫоп. Репп., (1995).

Для монотерапии с целью предупреждения и лечения опосредованной НСУ болезни можно применять дозы в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг веса тела в день предлагаемого соединения, которое является ингибитором протеазы. Как правило, фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить от примерно 1 до примерно 5 раз в день или в другом варианте путем непрерывной инфузии. Такое введение можно применять как для длительного, так и для экстренного лечения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителями для получения однократной дозы лекарственного средства, должно варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Обычная композиция может содержать от примерно 5 до примерно 95% действующего вещества (мас.%). Предпочтительно такие композиции содержат от примерно 20 до примерно 80% действующего вещества.

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, можно применять и более низкие или более высокие дозы по сравнению с указанными выше. Конкретные дозы и схемы лечения любого конкретного пациента могут зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время введения, скорость выведения, сочетание лекарственных средств, серьезность и особенности развития болезни, предрасположенность пациента к инфекции, и их определяет лечащий врач. Как правило, лечение начинают с небольших доз, существенно более низких, чем оптимальная доза пептида. Затем дозу повышают небольшими порциями до достижения оптимального действия в конкретных условиях. Как правило, наиболее предпочтительно вводить соединение в таком диапазоне концентраций, которые, в целом, обеспечивают антивирусную активность, но не обладают какими-либо вредными или опасными побочными действиями.

Когда композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, включают в комбинацию, содержащую соединение формулы (Ι) и один или несколько дополнительных терапевтических или профилактических агентов, то соединение и дополнительный агент должны присутствовать в дозе, составляющей примерно от 10 до 100% и более предпочтительно примерно от 10 до 80% от дозы, обычно применяемой

- 7 007742 в режиме монотерапии.

Когда эти соединения или их фармацевтически приемлемые соли объединяют в препаративной форме с фармацевтически приемлемым носителем, то полученную композицию можно вводить ίη νίνο млекопитающему, такому как человек, для ингибирования Ы§3-протеазы НСУ или для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом НСУ. Такое лечение можно осуществлять также при использовании соединения, предлагаемого в изобретении, в сочетании с агентами, включающими (но не ограничиваясь ими): α-, β-, δ-, ω-, τ- или γ-интерферон, рибавирин, амантадин; другие ингибиторы N83протеазы НСУ; ингибиторы полимеразы НСУ; ингибиторы других мишеней жизненного цикла НСУ, которые включают (но не ограничиваясь ими) геликазу, №2/3-протеазу или внутренний сайт входа в рибосому (ГЯЕ8); или их комбинации. С соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении, можно объединять другие агенты, получая однократную дозу лекарственного средства.

В другом варианте эти дополнительные агенты можно вводить млекопитающему по отдельности в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ ингибирования N83протеазной активности НСУ у млекопитающего, заключающийся во введении соединения формулы (I).

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения этот способ предназначен для снижения №3-протеазной активности у зараженного вирусом гепатита С млекопитающего.

Если фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества только соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, то такой способ может дополнительно предусматривать введение указанному млекопитающему агента, выбранного из ряда, включающего иммуномодулятор, антивирусный агент, ингибитор №3-протеазы НСУ, ингибитор полимеразы НСУ или ингибитор других мишеней жизненного цикла НСУ, таких как геликаза, №2/3-протеаза или ШЕ8. Такой дополнительный агент можно вводить млекопитающему до, одновременно или после введения композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве лабораторного реагента. Соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также для устранения или предупреждения вирусного загрязнения материалов, снижая тем самым риск заражения вирусом персонала лабораторий или медицинских учреждений или пациентов, которые имеют контакт с такими материалами (например, кровью, тканями, хирургическими инструментами и предметами одежды, лабораторными инструментами и предметами одежды, приборами и материалами для сбора крови).

Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве реагента для исследований. Соединение формулы (I) можно использовать в качестве позитивного контроля для обоснования модельных анализов на клетках или анализов ίη νίίτο или ίη νίνο репликации вирусов.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем, заявляемый в приведенной ниже формуле изобретения.

Методология

В целом, соединения формулы (I) и их промежуточные продукты получают известными методами, используя реакционные условия, которые, как известно, являются приемлемыми для реактантов. Некоторые такие методы описаны в АО 00/09543, АО 00/09558 и И8 6323180, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Соединения формулы (I), в которых Я¹ обозначает ИН8О2Я^1А, как они определены выше, получают путем сочетания соответствующей кислоты формулы (I) (т.е. Я¹ обозначает гидрокси) с соответствующим сульфонамидом формулы Я^1А 8ОХН2 в присутствии связывающего агента в стандартных условиях. Хотя можно применять несколько общепринятых связующих агентов, предпочтительными для практики являются ТБТУ и ГАТУ. Сульфонамиды поступают в продажу или их можно получать известными методами.

На приведенных ниже схемах проиллюстрировано два основанных на известных методах приемлемых процесса получения соединений формулы (I), в которых Я¹ обозначает ОН.

- 8 007742

Схема 1

Схема 2

θ К’ ^Κ'⁴Χ'^Ν^χ14|Γ^0ΗН О

Х = О, ΝΗ или 5

Соединения формулы I, где К обозначает ОН

Примеры

Температуры даны в градусах Цельсия. Проценты для растворов представляют собой % (мас./об.), а соотношения в растворах представляют собой соотношения объемов, если не указано иное. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали с помощью спектрометра фирмы Вгискег при частоте 400 МГц, химические сдвиги (δ) выражены в ч./млн. Экспресс-хроматографию проводили на силикагеле (8ίΟ₂) согласно методу экспресс-хроматографии Стилла (А.С. 8Й11 и др., 1. Огд. Сйеш., 43, 1978, с. 2923).

В примерах использовали следующие сокращения: ДБУ: 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен; ДХМ: дихлорметан; ДИАД: диизопропилазодикарбоксилат; ДИЭА: диизопропилэтиламин; ДИПЭА: диизопропилэтиламин; ДМФ: Ν,Ν-диметилформамид; ДМАП: 4-(диметиламино)пиридин; ЕЮАс: этилацетат; ГАТУ: гексафторфосфат О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония; ЖХВР: жидкостная хроматография высокого разрешения; МС: масс-спектрометрия; ΜΑΓΏΙ-ТОГ: Ма!пх Азз18!еб Газет ϋίδΟΓρίίοπ 1ош7айоп-Т1ше о£ ГйдЫ, ГАВ: бомбардировка быстрыми атомами; Ме: метил; МеОН: метанол; Рй: фенил; К.Т.: комнатная температура (18-22°); трет-бутил или т-бутил: 1,1-диметилэтил; ТЬд: трет-бутил

- 9 007742 глицин: трет-лейцин; ТБТУ: тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония; ТФК: трифторуксуная кислота; и ТГФ: тетрагидрофуран.

Синтез соединений формулы (I).

Представляющий собой дипептид промежуточный продукт 15 (схема 2) и 2-карбометокси-4гидрокси-7-метоксихинолин 9 (схема 1) синтезировали с помощью методов, описанных в АО 00/09543.

Синтез дипептида 1.

Смесь, содержащую Вос-гидроксипролин (50,0 г, 216 ммоль), метиловый эфир винил-АЦКК (42,25 г, 238 ммоль, 1,1 экв.), ТБТУ (76,36 г, 238 ммоль, 1,1 экв.) и ДИПЭА (113 мл, 649 ммоль, 3 экв.) в ДМФ (800 мл), перемешивали при К.Т. в атмосфере азота. Через 3,5 ч растворитель выпаривали и остаток экстрагировали ЕЮАс. Экстракт промывали соляной кислотой (10%), насыщенным раствором бикарбоната натрия и соляным раствором. Затем органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и упаривали, получая масло. После сушки масла в течение ночи в глубоком вакууме получали дипептид 1 в виде пены желтого цвета (72,0 г, 94%, чистота >95% по данным ЖХВР).

Получение дипептида 3.

Дипептид 1 (72,0 г, 203 ммоль), трифенилфосфин (63,94 г, 243,8 ммоль, 1,2 экв.) и 4нитробензойную кислоту (41,08 г, 245,8 ммоль, 1,2 экв.) растворяли в безводном ТГФ (1,4 л). Раствор при перемешивании охлаждали до 0° в атмосфере азота. Затем по каплям в течение 45 мин добавляли диэтилазодикарбоксилат (38,4 мл, 244 ммоль, 1,2 экв.) и реакционной смеси давали нагреться до К.Т. Через 4 ч растворитель выпаривали. Остаток разделяли на 4 порции. Каждую из них хроматографировали на тонкоизмельченном силикагеле (зернистость 10-40 мкм, диаметр колонки 12 см, длина колонки 16 см), используя градиент от 2:1 гексан/ЕЮАс до 1:1 гексан/ЕЮАс и до чистого (100%) ЕЮАс. После выпаривания растворителей и сушки в глубоком вакууме при 70° в течение 1 ч получали сложный эфир защищенного с помощью Вос дипептида (Вос-дипептид) 2 в виде аморфного твердого вещества белого цвета (108,1 г, количественный выход-105%). К сложному эфиру Вос-дипептида 2 (108 г, 243 ммоль) добавляли раствор 4н. хлористого водорода в диоксане, получая бесцветный раствор. Раствор перемешивали при К. Т. в течение 1 ч. Растворитель выпаривали и остаток помещали в глубокий вакуум на 3 ч, получая гидрохлорид соединения 3 в виде аморфного твердого вещества. Твердое вещество применяли без дополнительной очистки.

Синтез карбаматов 4.

Получение карбамата 4а.

о но но но

4а

При 0°С к раствору метилового эфира трет-бутилглицина (590 мг, 3,25 ммоль) в ТГФ (8 мл) добавляли винилхлорформиат (0,55 мл, 6,47 ммоль) и триэтиламин (1,15 мл, 8,25 ммоль). Температуре давали подняться до К. Т. Раствор перемешивали в течение 16 ч. Раствор концентрировали и остаток растворяли в ЕЮАс. ЕЮАс-раствор промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты (2х), насыщенным водным раствором №НСО₃ (2х) и соляным раствором, сушили и концентрировали, получая соответствующий винилкарбамат (608 мг) в виде бесцветного масла. Масло растворяли в ДХМ (4 мл), охлаждали до 0°С и добавляли дийодметан (0,15 мл, 1,86 ммоль) и диэтилцинк (95 мкл, 0,93 ммоль). Сначала появлялось твердое вещество белого цвета, но оно со временем (~1 ч) растворялось. Суспензию/раствор перемешивали при К.Т. в течение 5 ч. Добавляли насыщенный раствор хлорида аммония и раствор экстрагировали ЕЮАс (2х). Органический экстракт сушили (Мд8О₄) и концентрировали. Остаток очищали колоночной экспресс-хроматографией. Поле элюирования гексаном:ЕЮАс (95:5) получали соответствующий сложный метиловый эфир в виде бесцветного масла (96 мг, выход 90%).

Раствор сложного метилового эфира (93 мг, 0,41 ммоль) в ТГФ (5 мл), МеОН (1 мл) и водный раствор Б1ОИ (45 мг, 1,81 ммоль) в воде (2 мл) перемешивали в течение 4 ч. Раствор разбавляли водой и

- 10 007742 экстрагировали ЕЮАс (2х). Водный раствор подкисляли, добавляя 1н. НС1, и кислый раствор экстрагировали ЕЮАс (2х). Объединенные органические экстракты сушили (Мд80₄), фильтровали и упаривали, получая требуемый карбамат 4а в виде твердого вещества белого цвета (53 мг; выход 60%).

Получение карбамата 4Ь.

о о но

4Ь

ТГФ (350 мл) добавляли в колбу, содержащую 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир циклопентилового эфира угольной кислоты (9,00 г, 39,6 ммоль) и трет-лейцин (6,24 г, 47,5 ммоль), получая суспензию. При интенсивном перемешивании добавляли дистиллированную воду (100 мл). Небольшое количество твердого вещества оставалось нерастворенным. Затем добавляли триэтиламин (16,6 мл, 119 ммоль), получая гомогенный раствор, который перемешивали при К.Т. Через 2,5 ч ТГФ выпаривали и водный остаток разбавляли водой (100 мл). Реакционную смесь подщелачивали, добавляя 1н. №0И (25 мл - конечное значение рН>10). Раствор промывали ЕЮАс (2x200 мл) и затем водную фазу подкисляли с помощью 1н. НС1 (примерно 70 мл - конечное значение рН<2). Мутный раствор экстрагировали ЕЮАс (200+150 мл). Экстракт сушили (Мд80₄) и упаривали, получая карбамат 4Ь в виде твердого вещества белого цвета (8,68 г).

Получение других карбаматов.

С помощью описанного выше процесса и используя соответствующие комбинации третбутилглицина, циклопентилглицина или циклогексилглицина и 2,5-диоксопирролидинового эфира циклобутилового, циклопентилового или циклогексилового эфира угольной кислоты, получали карбаматы, представленные следующими формулами:

Получение мочевин 5.

Раствор, содержащий гидрохлорид бензилового эфира трет-бутилглицина (2,55 г, 9,89 ммоль) в ТГФ (20 мл) и пиридин (2,0 мл, 24,73 ммоль), охлаждали до 0°С. К охлажденному раствору по каплям добавляли хлорформиат (1,30 мл, 10,19 ммоль). Образовавшуюся суспензию перемешивали в течение 5 мин при 0°С, затем в течение 1,5 ч при К.Т. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс, промывали 10%-ной лимонной кислотой (2х), водой (2х), насыщенным раствором №НС0₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд80₄), фильтровали и упаривали, получая неочищенное соединение в виде практически бесцветного масла (3,73 г; >100%; примерно 9,89 ммоль). Неочищенный продукт (1,01 г, 2,97 ммоль) растворяли в ДМСО (6,5 мл) и по каплям добавляли циклопентиламин. Реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 45 мин. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс. Органическую фазу промывали 10%-ной лимонной кислотой (2х), водой (2х), насыщенным раствором №НСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд80₄), фильтровали и упаривали, получая неочищенный продукт, представляющий собой циклопентилмочевину-ТЬд-0Ьп, в виде практически бесцветного масла. Неочищенный продукт очищали колоночной экспресс-хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента смесь гексан:ЕЮАс в соотношении 9:1 для удаления менее полярных примесей и в соотношении 7:3 для элюирования очищенного продукта в виде густого бесцветного масла (936 мг, 95%). У продукта, представляющего собой сложный эфир бензилового эфира (936 мг, 2,82 ммоль), удаляли защитную группу в атмосфере поступающего из баллона водорода, при К.Т., в абсолютном этаноле (15 мл) путем перемешивания раствора с 10% Рй/С (93,6 мг) в течение 5,5 ч. Реакционную смесь фильтровали через фильтр с размером отверстий 0,45 мкм и упаривали досуха, получая мочевину 5 в виде твердого вещества белого цвета (668,8 мг, 98%).

- 11 007742 ¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-Дб): δ 12,39 (§, 1Н), 6,09 (Д, 1=7,4 Гц, 1Н), 5,93 (Д, 1=9,4 Гц, 1Н), 3,90 (Д, 1=9,4 Гц, 1Н), 3,87-3,77 (т, 1Н), 1,84-1,72 (т, 2Н), 1,63-1,42 (т, 4Н), 1,30-1,19 (т, 2Н), 0,89 (§, 9Н).

МС (электроспрей): 241,0 (М-Н)- 243,0 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН3СХ:Н₂О): 99%.

Синтез трипептида 6.

Карбамат 4Ъ (6,15 г, 22,5 ммоль) и ТБТУ (7,72 г, 24,7 ммоль) суспендировали в ДХМ и суспензию быстро перемешивали. Добавляли ДИПЭА (3,92 мл, 22,5 ммоль) при К.Т. и через 10 мин реакционная смесь становилась практически гомогенной. Затем в реакционную смесь сливали раствор дипептида 3 (10,39 г, 23,6 ммоль) в безводном ДХМ (100 мл), содержащем ДИПЭА (4,11 мл, 23,62 ммоль). Образовавшемуся раствору желтого цвета давали перемешиваться в течение 14 ч. Затем растворитель выпаривали, получая сироп желтого цвета, который экстрагировали ЕЮАс (300+150 мл) и промывали 0,05н. НС1 (2x200 мл), насыщенным раствором Ха₂СО₃ (300 мл) и соляным раствором (150 мл). Объединенные экстракты сушили над М§8О₄ и упаривали, получая трипептид 6 в виде пены светло-желтого цвета (15,68 г, количественный выход).

Синтез трипептида 7.

Трипептид 6 (15,68 г) растворяли в ТГФ (200 мл) и добавляли воду (30 мл). Образовавшийся раствор охлаждали до 0°С и в течение 3 мин при интенсивном перемешивании добавляли раствор моногидрата гидроксида лития (1,18 г, 28,12 ммоль). После выдерживания в течение 3 ч при 0°С избыток основания нейтрализовали с помощью 1н. НС1 (конечное значение рН примерно 6) и ТГФ выпаривали, получая водную суспензию (смола желтого цвета). Смесь экстрагировали ЕЮАс (2x200 мл) и промывали насы щенным раствором \а11СО₃ (2x300 мл). Обьединенные экстракты сушили над М§8О₄ и упаривали, получая пену светло-желтого цвета. С помощью экспресс-хроматографии пены на силикагеле с использованием ЕЮАс в качестве элюента получали соединение 7 в виде аморфного твердого вещества белого цвета (9,77 г, 91%).

Получение тиомочевин 8.

Синтез тиомочевины 8а.

8а

К раствору трет-бутиизотиоцианата (5,0 мл, 39,4 ммоль) в ДХМ (200 мл) добавляли циклопентиламин (4,67 мл, 47,3 ммоль), а затем ДИЭА и реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 2 ч. Смесь разбавляли ЕЮАс, промывали 10%-ным водным раствором лимонной кислоты (2х), насыщенным раствором \а11СО₃ (2х), Н₂О (2х) и соляным раствором (1х). Органический слой сушили над безводным МцЗО.|, фильтровали и упаривали, получая Х-трет-бутил-Х'-циклопентилтиомочевину в виде твердого вещества белого цвета (3,70 г, выход 47%). Х-трет-Бутил-Х'-циклопентилтиомочевину (3,70 г) растворяли в концентрированной НС1 (46 мл). Раствор темно-желтого цвета осторожно кипятили с обратным холодильником. Через 40 мин реакционной смеси давали охладиться до К.Т. и затем охлаждали на льду и подщелачивали до рН 9,5 с помощью твердого и насыщенного водного раствора ХаНСО3. Продукт экстрагировали ЕЮАс (3х). Объединенные ЕЮАс-экстракты промывали Н₂О (2х) и соляным раствором (1х). Органический слой сушили (М§8О₄), фильтровали и концентрировали, получая твердое вещество бежевого цвета (2,46 г неочищенного продукта). Растирали неочищенный продукт в смеси гексан/ЕЮАс (95/5) и после фильтрации получали Х-циклопентилтиомочевину 8а в виде твердого вещества белого цвета (2,38 г; выход 90%).

¹Н -ЯМР (400 МГц, ДМСО-Д6): δ 7,58 (Ъ§, 1Н), 7,19 (Ъ§, 1Н), 6,76 (Ъ§, 1Н), 4,34 (Ъ§, 1Н), 1,92-1,79 (т, 2Н), 1,66-1,55 (т, 2Н), 1,55-1,30 (т, 4Н). МС; е§⁺ 144,9 (М+Н)⁺; е§^-: 142,8 (М-Н)^-.

Получение тиомочевины 8Ъ.

- 12 007742

С помощью описанного выше процесса и используя поступающий в продажу циклобутиламин вместо циклопентиламина, получали тиомочевину 8Ь.

•Ν—=О

Η₂Ν'

Получение тиомочевины 8с.

С помощью описанного выше процесса и используя поступающий в продажу циклогексиламин вместо циклопентиламина, получали тиомочевину 8с.

Получение тиомочевины 86.

в η₂ν ν'

8с

Η,Ν Ν' ² Н

К раствору Κ8ΟΝ (4,60 г, 47,33 ммоль) в ацетоне (35 мл) при 0°С добавляли по каплям бензоилхлорид (5,0 мл, 43,03 ммоль). Раствор молочного цвета перемешивали в ледяной бане в течение 1,5 ч, затем по каплям добавляли циклопропиламин (3,2 мл, 46,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч при 0°С, затем добавляли новую порцию циклопропиламина (0,50 мл, 7,22 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение еще 30 мин. Реакционную смесь сливали на смесь лед/Н₂О (300 мл), перемешивали в течение 5 мин и твердое вещество светло-желтого цвета фильтровали, промывали несколько раз Н₂О и сушили, получая ^бензилокси-№-циклопропилтиомочевину (6,62 г). Указанную тиомочевину суспендировали в растворе 2н. ΝαΟΗ (50 мл) и выдерживали при температуре дефлегмации в течение 15 мин. Раствор охлаждали до К.Т., насыщали твердым ХаС1 и экстрагировали ЕЮАс (3х). Объединенные ЕЮАс-экстракты промывали Н₂О (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Μ§8Ο₄), фильтровали и упаривали, получая неочищенный продукт в виде беловатого твердого вещества. Твердый продукт растирали в смеси гексан/ЕЮАе (5/5), получая Ν-циклопропилтиомочевину 86 в виде кристаллического твердого вещества белого цвета (2,5 г, выход 50%).

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆): δ 7,92 (ь§, 1Η), 7,61 (Ь§, 1Η), 7,13 (Ь§, 1Η), 2,39 (Ь§, 1Н), 0,67-0,63 (т, 2Н), 0,51-0,44 (т, 2Н). МС е§⁺ 116,9 (М+Н)⁺; е§^-: 114,8 (М-Н)^-.

Пример 1. Получение соединения 100.

Стадия 1. Синтез трипептида 10.

К трипептиду 1 (1,0 г, 2,09 ммоль), растворенному в ТГФ (35 мл), добавляли гидроксихинолин 9 (729 мг, 3,13 ммоль) и трифенилфосфин (1,1 г, 4,2 ммоль). Суспензию желтого цвета охлаждали в ледяной бане и по каплям добавляли ДИАД (821 мкл, 4,2 ммоль). Раствор перемешивали при температуре ледяной бани в течение 30 мин и при К.Т. в течение 16 ч. Раствор упаривали досуха и остаток растворяли в ЕЮАс, промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Μ§8Ο₄), фильтровали и упаривали, получая масло желтого цвета, которое осаждалось при выстаивании. Неочищенное твердое вещество суспендировали в ДХМ и нерастворившийся продукт отфильтровывали. Раствор концентрировали и остаток очищали экспресс-хроматографией с использованием смеси гексан:ЕЮАс (5:5) для удаления всех менее полярных примесей и смеси СНС1₃:ЕЮАс (80:20) для элюирования всего РН₃Р=О. Требуемое соединение элюировали с помощью смеси СНС1₃:ЕЮАс (65:35), получая твердое вещество белого цвета (1 г, выход 70%).

МС (электроспрей): 693,3 (М-Н)- 695,4 (М+Н)+ 717,4 (Μ+Να)+.

Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; С^С^^О): 99%.

Стадия 2. Избирательный моногидролиз сложного эфира 10.

- 13 007742

Трипептид 10 (1 г, 1,44 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и добавляли МеОН (5 мл), воду (5 мл) и 1н. водный раствор ИаОН (1,5 мл) и раствор перемешивали при К.Т. в течение 2 ч. Смесь упаривали досуха и затем совместно упаривали со смесью МеОН:толуол (1:1; 4х), толуолом (2х) и диэтиловым эфиром (2х), получая продукт (безводный) в виде хлопьевидного твердого вещества белого цвета (1,04 г, выход 100%). МС (электроспрей): 679,3 (М-Н)- 681,3 (М+Н)+ 703,3 (Μ+Να)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СИ:Н₂О): 95%.

Натриевую соль 11 (примерно 1,44 ммоль) растворяли в ТГФ (16 мл), добавляли триэтиламин (301 мкл, 2,16 ммоль) и раствор охлаждали до 0°С. Добавляли по каплям изобутилхлорформиат (280 мкл, 2,16 ммоль) и суспензию белого цвета перемешивали при 0°С в течение 75 мин, а затем добавляли раствор диазометана (0,67М в диэтиловом эфире; 13 мл, 8,64 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 0°С, 45 мин при К.Т. и упаривали, получая густую суспензию. Эту суспензию растворяли в Е1ОЛе и воде. Органический раствор промывали насыщенным ИаНСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд8О₄), фильтровали и упаривали, получая диазокетон в виде твердого вещества цвета слоновой кости (неочищенный продукт использовали на следующей стадии; примерно 1,44 ммоль).

МС (электроспрей): 703,3 (М-Н)- 705,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СИ:Н₂О): 91%.

При 0°С к раствору диазокетона 12 (1,44 ммоль) в ТГФ (24 мл) добавляли по каплям раствор НВг (1,0 мл) и смесь перемешивали в течение 1 ч. Раствор разбавляли Е1ОЛе, промывали насыщенным раствором ИаНСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд8О₄), фильтровали и упаривали, получая требуемый бромкетон в виде твердого вещества цвета слоновой кости с бежевым оттенком (1,1 г, примерно 1,44 ммоль). МС (электроспрей): 757,3 (М) 759,3 (М+2).

Стадия 5. Синтез тиазолилтрипептида 14.

Бромкетон 13 (0,40 ммоль) и Ν-циклопентилтиомочевину (68,5 мг, 0,48 ммоль) растворяли в изопро- 14 007742 паноле (15 мл) и раствор желтого цвета выдерживали при 70°С в течение 75 мин. Раствору давали охладиться до К.Т. и упаривали досуха. Остаток растворяли в ЕЮАс. Раствор промывали насыщенным КаНСО₃(2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (М§80₄), фильтровали и концентрировали, получая продукт в виде пены оранжево-коричневого цвета. С помощью колоночной экспресс-хроматографии с использованием указанной смеси гексан:ЕЮАс (7:3) удаляли менее полярные примеси, а с использованием смеси в соотношении 6:4 получали требуемое соединение в виде пены светло-желтого цвета (218 мг, 69%).

МС (электроспрей): 801,4 (М-Н)- 803,4 (М+Н)+ 825 (М+№)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СХН₂0): 99%.

Стадия 6. Гидролиз сложного эфира 14.

Раствор сложного метилового эфира 14 (145 мг, 0,181 ммоль) в ТГФ (3 мл), МеОН (1,5 мл) и водный раствор ЬЮН (75,8 мг, 1,81 ммоль) в воде (1,5 мл) перемешивали в течение 18 ч. Органический раствор концентрировали, получая беловатую суспензию, которую разбавляли ЕЮАс и соляным раствором до полного растворения. Значение рН доводили до 6, добавляя 1н. НС1 и органический слой экстрагировали дополнительно ЕЮАс (2х). Объединенные органические экстракты промывали водой (2х), соляным раствором (1х), сушили (М§80₄), фильтровали и упаривали, получая требуемое соединение в виде твердого вещества желтого цвета (138,2 мг, выход 97%).

Превращение в Να-соль.

Соединение 100 (138,2 мг, 0,175 ммоля) растворяли в МеОН (30 мл) и добавляли 1 экв. 0,01н. ΝαΟΗ (17,5 мл). Прозрачный раствор желтого цвета концентрировали, удаляя МеОН, и разбавляли водой, замораживали и лиофилизировали, получая продукт (Να-соль) в виде аморфного твердого вещества желтого цвета (139 мг; теоретический выход: 142 мг; ММ Να-соли: 810,95).

МС (электроспрей): 787,2 (М-Н)- 789,3 (М+Н)+ 811,3 (Μ+Να)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№:Н₂0): 98%.

'Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-4₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 5:1; δ 8,14 (Ьз, 1Н), 8,02 (4, 1=9,2 Гц, 1Н), 7,89 (4, 1=6,7 Гц, 1Н), 7,49-7,36 (т, 2Н), 7,27 (Ьз, 1Н), 7,06-6,96 (т, 2н), 6,10-5,90 (т, 1Н), 5,33 (з, 1Н), 5,01 (4, 1=16,8 Гц, 1Н), 4,84 (4, 1=10,6 Гц, 1Н), 4,79-4,65 (т, 1Н), 4,47-4,40 (т, 1Н), 4,30 (4, 1=11,5 Гц, 1Н), 4,15 (4, 1=8,8 Гц, 1Н), 4,00-3,85 (т, 2н), 3,90 (з, 3Н), 2,37-2,26 (т, 1Н), 2,15-1,91 (т, 2Н), 1,80-1,23 (т, 18Н), 0,96 и 0,86 (2 х з, 9н).

Пример 2. Получение соединения 101.

С помощью процесса, описанного в примере 1, используя на стадии 5 Ν-циклобутилтиомочевину 8Ь вместо Ν-циклопентилтиомочевины 8а, получали соединение 101 в виде соли ТФК.

Соединение 101 'Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-4б): смесь ротамеров, соотношение примерно 90:10, характеристики основного изомера; δ 8,59 (з, 1Н), 8,45-8,39 (т, 1Н), 8,25 (Ьз, 1Н), 8,20 (4, 1=9,2 Гц, 1Н), 7,84 (Ьз, 1Н), 7,74 (з, 1Н), 7,32-7,26 (т, 1Н), 7,01 (4,1=8,3 Гц, 1Н), 5,78-5,66 (т, 2Н), 5,20 (44,1=17,0, 1,6 Гц, 1Н), 5,09-5,04 (т, 1Н), 4,53-4,36 (т, 4Н), 4,05-3,92 (т, 2Н), 3,97 (з, 3Н), 2,63-2,55 (т, 1Н), 2,44-2,29 (т, 3Н), 2,07-1,95 (т, 3Н), 1,79-1,23 (т, 12Н), 0,96 (з, 9Н).

МС (электроспрей): 773,4 (М-Н)- 775,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; С’Н;С’\:Н-0): 98%.

Пример 3. Получение соединения 102.

С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя на стадии 5 Ν-циклогексилтиомочевину 8с вместо Ν-циклопентилтиомочевины 8а, получали соединение 102 в виде соли ТФК.

- 15 007742

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-бб): смесь ротамеров, соотношение примерно 90:1, характеристика основного изомера; δ 8,61 (§, 1Н), 8,26-8,17 (т, 2Н), 8,13-8,04 (т, 1Н), 7,81 (Ь§, 1Н), 7,73 (Ь§, 1Н), 7,32-7,24 (т, 1Н), 7,07 (й, 1=8,2 Гц, 1Н), 5,78-5,65 (т, 2Н), 5,23-5,15 (т, 1Н), 5,09-5,03 (т, 1Н), 4,51-4,43 (т, 3Н), 4,05-3,77 (т, 3Н), 3,97 (§, 3Н), 2,64-2,55 (т, 1Н), 2,38-2,27 (т, 1Н), 2,05-1,95 (т, 3Н), 1,79-1,71 (т, 2Н), 1,66-1,19 (т, 16Н), 0,96 (§, 9Н).

МС (электроспрей): 801,4 (М-Н)- 803,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СНэСК:Н₂0): 99%.

Пример 4. Получение соединения 103.

Соединение 100

Соединение 103

Соединение 100 (30 мг, 0,038 ммоль) объединяли с ГАТУ (17 мг, 0,045 ммоль) и растворяли в безводном ДМФ (4 мл). Раствор перемешивали при К.Т., а затем по каплям в течение примерно 1 мин добавляли ДИПЭА (26 мкл, 0,15 ммоль). Смесь перемешивали в течение 60 мин при К.Т. и анализировали с помощью аналитической ЖХВР в отношении образования активированного сложного эфира. Затем добавляли раствор, содержащий бензолсулфонамид (23 мг, 0,15 ммоль), ДМАП (17 мг, 0,14 ммоль) и ДБУ (22 мкл, 0,15 ммоль) в ДМФ (1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч при К.Т., затем сливали на ЕЮАс (50 мл) и промывали насыщенным раствором \аНСО₃ и насыщенным соляным раствором. Органическую фазу сушили над Мд80₄, фильтровали и концентрировали. Остаток восстанавливали в ДМСО и очищали с помощью препаративной ЖХВР. После лиофилизации получали конечный продукт (17 мг, 48%) в виде аморфного твердого вещества светло-желтого цвета.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-й₆): δ 10,89 (§, 1Н), 8,84 (§, 1Н), 8,20 (й, 1=8,8 Гц, 1Н), 8,18-8,08 (т, 2Н), 7,89 (й, 1=7,6 Гц, 2Н), 7,70 (йй, 1=7,6, 7,6 Гц, 2Н), 7,58 (йй, 1=7,7, 7,7 Гц, 2Н), 7,28 (Ь§, 1Н), 7,11 (й, 1=6,6 Гц, 1Н), 5,75 (Ь§, 1Н), 5,37-5,25 (т, 1Н), 5,12 (й, 1=17 Гц, 1Н), 4,92 (й, 1=12 Гц, 1Н), 4,58-4,42 (т, 3Н), 4,24 (Ь§, 1Н), 4,05 (й, 1=7,8 Гц, 1Н), 3,97 (§, 3Н), 3,93 (й, 1=7,8 Гц, 1Н), 2,69-2,61 (т, 1Н), 2,35-2,21 (т, 1Н), 2,131,98 (т, 3Н), 1,78-1,68 (т, 4Н), 1,68-1,51 (т, 8Н), 1,50-1,41 (т, 4Н), 1,29-1,22 (т, 1Н), 0,99 (§, 9Н).

МС (электроспрей): 928,5 (М+Н)+ и 926,5 (М-Н)-. ОФ-ЖХВР: К₄=7,3 мин (гомогенность=99%). Приведенные ниже соединения получали с помощью процесса синтеза, представленного на схеме 2. Пример 5.

Стадия 1. Синтез дипептида 16.

ОМе

МеО.

О

.ОМе

ОМе

и 1н. водный раствор \а011 (1,05 экв., 7,4 мл). Раствор перемешивали при К.Т. в течение 2,75 ч. Смесь упаривали досуха. Остаток разбавляли водой, замораживали и лиофилизировали, получая натриевую соль 16 в виде аморфного твердого вещества (4,28 г).

МС (электроспрей): 554,2 (М-Н)- 556,3 (М+Н)+ 578,2 (М+№)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; С11₃С\:1 ЕО): 96%.

Стадия 2. Синтез дипептиддиазокетона 17.

- 16 007742

	О		О
МеСТ	.Ν___,Ыа	МеО.

	о		о

17

Натриевую соль 16 (приблизительно 7,02 ммоль) растворяли в ТГФ (78 мл); добавляли триэтиламин (1,37 мл, 9,83 ммоль) и раствор охлаждали до 0°С. По каплям добавляли изобутилхлорформиат (1,28 мл, 9,83 ммоль) и белую суспензию перемешивали при 0°С в течение 2 ч, затем добавляли раствор диазометана (0,67М в диэтиловом эфире; 63 мл, 42,13 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 0°С, 1,25 ч при К.Т. и упаривали, получая густую суспензию. Указанную суспензию растворяли в ЕЮАс и воде. Органический раствор промывали насыщенным КаНСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд§О₄), фильтровали и упаривали, получая диазокетон 17 в виде твердого вещества бежевого цвета (неочищенный продукт использовали на следующей стадии; примерно 7,02 ммоль).

МС (электроспрей): 578,2 (М-Н)- 580,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СЫ:Н₂О): 90%.

Стадия 3. Синтез дипептидбромкетона 18.

При 0°С к раствору диазокетона (приблизительно 1,44 ммоль) в ТГФ (116 мл) добавляли по каплям 48%-ный водный раствор НВг (5,1 мл) и смесь перемешивали в течение 2 ч. Раствор разбавляли ЕЮАс. промывали насыщенным раствором №1НСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд§О₄), фильтровали и упаривали, получая требуемый бромкетон в виде твердого вещества бежевого цвета (4,25 г, 6,72 ммоль).

МС (электроспрей): 632 (М) 634,2 (М+2).

Стадия 4. Синтез дипептида 19.

α-Бромкетон 18 (512 мг, 0,81 ммоль) и Ν-циклопентилтиомочевину (128,4 мг, 0,89 ммоль) растворяли в изопропаноле (20 мл). Образовавшийся раствор желтого цвета выдерживали при 70°С в течение 1,5 ч. Раствору давали охладиться до К.Т. и упаривали досуха. Остаток разбавляли ЕЮАс. ЕЮАсраствор промывали насыщенным КаНСО₃ (2х), водой (2х) и соляным раствором (1), сушили (Мд§О₄), фильтровали и концентрировали, получая продукт в виде пены оранжево-коричневого цвета. С помощью колоночной экспресс-хроматографии с использованием смеси гексан:ЕЮАс (7:3) удаляли менее полярные примеси, а с использованием смеси 6:4 получали требуемое соединение в виде твердого вещества светло-желтого цвета (411,5 мг, 75%).

МС (электроспрей): 676,3 (М-Н)- 678,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃СК:Н₂О): 99%.

Стадия 5. Синтез трипептида 20.

- 17 007742

Защищенный с помощью Вос дипептид (32,6 г, 0,048 ммоль) растворяли в смеси 4н. НС1/диоксан (3 мл) и перемешивали при К.Т. Через 2 ч реакционную смесь обрабатывали, упаривая досуха. Получали гидрохлорид в виде беловатого твердого вещества. Гидрохлорид помещали в глубокий вакуум на 30 мин. К раствору гидрохлорида в ДХМ (2 мл) и ДИЭА (33 мкл, 0,192 ммоль) добавляли мочевину 5 (13,96 мг, 0,058 ммоль), а затем связывающий агент ГАТУ (21,90 мг, 0,058 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при К.Т. в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс, промывали насыщенным NаНСОз (2х), водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд8О₄), фильтровали и упаривали, получая неочищенный продукт в виде густого масла желтого цвета (приблизительно 0,048 ммоль).

МС (электроспрей): 800,4 (М-Н)- 802,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№Н₂о): 95%.

Стадия 6. Гидролиз сложного метилового эфира трипептида 20.

Раствор сложного метилового эфира 20 (77,80 мг, 0,097 ммоль) в ТГФ (2 мл) и МеОН (1 мл) и водный раствор Б1ОН (40,7 мг, 0,97 ммоль) в воде (1 мл) перемешивали в течение 16 ч. Органический раствор концентрировали, получая беловатую суспензию. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ЖХВР (УМС СотЫксгееп ΟΌ8-ΑΡ, 50x20 мм, Ю 8-5 мкм,120 Α; λ=220 нм), используя линейный градиент и 0,06% ТФК СИзСА/ЩО. Чистые фракции объединяли, концентрировали и превращали в натриевую соль.

Превращение в \а-со.п,.

Концентрированные фракции разбавляли ЕЮАс и несколько мл соляного раствора (который подщелачивали до рН~13 с помощью 5н. №ОН, затем нейтрализовали до рН 5,5-6,0 с помощью 1н. НС1). Продукт экстрагировали ЕЮАс (3х), промывали водой (2х) и соляным раствором (1х), сушили (Мд8О₄), фильтровали и упаривали досуха, получая нейтральный продукт в виде твердого вещества желтого цвета (52,7 мг, 70%). Нейтральный продукт (49,4 мг, 0,0627 ммоль) растворяли в МеОН (10 мл) и добавляли 1 экв. 0,01н. №ОН (6,27 мл). Прозрачный раствор желтого цвета концентрировали для удаления МеОН и разбавляли водой, замораживали и лиофилизировали, получая продукт (Аа-соль) в виде аморфного твердого вещества желтого цвета (50,8 мг; теоретический выход: 50,8 мг; ММ №-соли: 809,75).

'Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-6₆): смесь ротамеров, соотношение примерно 8:1; δ 8,20 (Ьк, 1Н), 7,96 (6, 1=8,8 Гц, 1Н), 7,86 (6, 1=5,7 Гц, 1Н), 7,51-7,47 (т, 2Н), 7,26 (к, 1Н), 6,97 (6, 1=8,6 Гц, 1Н), 6,19-6,02 (т, 1Н), 5,33 (Ьк, 1Н), 4,99 (6, 1=16,8 Гц, 1Н), 4,77 (6, 1=10,0 Гц, 1Н), 4,52-4,41 (т, 2Н), 4,34 (6, 1=11,0 Гц, 1Н), 4,04-3,96 (т, 2Н), 3,89 (к, 3Н), 3,79-3,68 (т, 1Н), 3,68-3,15 (под пиком, соответствующим воде, 2Н), 2,452,36 (т, 1Н), 2,05-1,92 (т, 2Н), 1,82-1,35 (т, 16Н), 1,35-1,12 (т, 2Н), 0,91 и 0,84 (2 х к, 9Н).

МС (электроспрей): 786,4 (М-Н)- 788,3 (М+Н)+ 810 (М+№)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С\:Н₂О): 99%.

Пример 6. Соединение 104.

С помощью процесса, описанного в примере 5, используя на стадии 5 циклобутилкарбамат третбутилглицина вместо мочевины 5 и осуществляя очистку неочищенной карбоновой кислоты после стадии 6 с помощью препаративной ЖХВР, получали указанное в заголовке соединение в виде соли ТФК.

- 18 007742

Соединение 104 ¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-дб): смесь ротамеров, соотношение примерно 7:1; δ 8,09 (Ьз, 1Н), 8,02 (ά, 1=9,0 Гц, 1Н), 7,88 (ά, 1=6,5 Гц, 1Н), 7,45 (з, 1Н), 7,40 (з, 1Н), 7,28 (ά, 1=2,3 Гц, 1Н), 7,16-7,08 (т, 1Н), 7,07-7,00 (т, 1Н), 6,10-5,95 (т, 1Н), 5,32 (Ьз, 1Н), 5,00 (ά, 1=17,2 Гц, 1Н), 4,82 (ά, 1=11,4 Гц, 1Н), 4,64-4,52 (т, 1Н), 4,48-4,41 (т, 1Н), 4,29 (ά, 1=11,7 Гц, 1Н), 4,12 (ά, 1=8,6 Гц, 1Н), 3,97-3,85 (т, 2Н), 3,91 (з, 3Н), 2,362,27 (т, 1Н), 2,18-2,04 (т, 2Н), 2,03-1,81 (т, 6Н), 1,77-1,43 (т, 9Н), 1,41-1,34 (т, 1Н), 0,96 и 0,85 (2 х з, 9Н).

МС (электроспрей): 773,3 (М-Н)- 775.4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН,С\:Н-О): 99%.

Пример 7. Соединение 105.

С помощью процесса, описанного в примере 5, используя на стадии 5 циклогексилкарбамат трет-

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-άγ смесь ротамеров, соотношение примерно 5:1; δ 8,29 (Ьз, 1Н), 8,02 (ά, 1=9,0 Гц, 1Н), 7,89 (ά, 1=6,5 Гц, 1Н), 7,45 (з, 1Н), 7,40 (з, 1Н), 7,27 (ά, 1=2,2 Гц, 1Н), 7,05 (ά, 1=8,6 Гц, 1Н), 7,00 (άά, 1=2,0, 9,0 Гц, 1Н), 5,89 (Ьз, 1Н), 5,34 (з, 1Н), 5,08 (ά, 1=17,0 Гц, 1Н), 4,91 (ά, 1=9,4 Гц, 1Н), 4,43 (άά, 1=8,4, 16,8 Гц, 1Н), 4,36-4,24 (т, 1Н), 4,14 (ά, 1=8,6 Гц, 1Н), 4,00-3,86 (т, 3Н), 3,89 (з, 3Н), 2,35-2,23 (т, 1Н), 2,04-1,91 (т, 5Н), 1,79-1,41 (т, 10Н), 1,39-1,08 (т, 7Н), 0,97 и 0,86 (2 х з, 9Н).

МС (электроспрей): 801,4 (М-Н)- 803,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№Н₂о): 98%.

Пример 8. Соединение 106.

С помощью процесса, описанного в примере 5, и используя на стадии 5 циклопентилкарбамат циклогексилглицина вместо мочевины 5, получали указанное в заголовке соединение в виде натриевой соли.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-άγ смесь ротамеров, соотношение примерно 1:4; δ 8,22 и 8,04 (2 х з, 1Н), 8,00 (ά, 1=9,2 Гц, 1н), 7,91 (ά, 1=6,5 Гц, 1Н), 7,46 (з, 1Н), 7,41 (з, 1Н), 7,27 (ά, 1=2,4 Гц, 1Н), 7,20 (ά, 1=8,4 Гц, 1Н), 7,01 (άά, 1=2,4, 9,0 Гц, 1Н), 6,09-5,98 (т, 1Н), 5,34 (з, 1Н), 4,98 (άά, 1=1,6, 17,4 Гц, 1Н), 4,80 (ά, 1=11,9 Гц, 1Н), 4,73-4,67 (т, 1Н), 4,43-4,31 (т, 2Н), 4,05-3,95 (т, 2Н), 3,95-3,84 (т, 1Н), 3,90 (з, 3Н), 2,38-2,29 (т, 1Н), 2,03-1,92 (т, 2Н), 1,83-1,21 (т, 24Н), 1,21-0,83 (т, 5Н).

МС (электроспрей): 813,4 (М-Н)- 815,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; СН₃С№Н₂О): 99%.

Пример 9. Соединение 107.

С помощью процесса, описанного в примере 5, и используя на стадии 5 циклопентилкарбамат циклопентилглицина вместо мочевины 5, получали указанное в заголовке соединение, которое превращали в соответствующую Να-соль.

Пример 10. Анализ №3-№4А-протеазы.

Ферментативный анализ, который применяли для оценки соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, описан в \\'О 00/09543 и \\'О 00/59929.

- 19 007742

Пример 11. Анализ репликации РНК НСУ на культуре клеток.

Культура клеток.

Клетки линии НцЕ7, стабильно поддерживающие субгеномный репликон НСУ, создавали согласно описанному ранее методу (1,о1ипап и др., 8с1епсе 285, 1999, сс. 110-113) и обозначали их как клеточная линия 822.3. Клетки линии 822.3 поддерживали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (ΏΜΕΜ), дополненной 10% ФБС и 1 мг/мл неомицина (стандартная среда). В процессе анализа использовали среду ΏΜΕΜ, дополненную 10% ФБС, содержащую 0,5% ДМСО и не содержащую неомицин (среда для анализа). За 16 ч до внесения соединения клетки линии 822.3 обрабатывали трипсином и разбавляли до 50000 клеток/мл стандартной средой. По 200 мкл (10000 клеток) вносили в каждую лунку 96луночного планшета. Затем планшет инкубировали при 37° в атмосфере с 5% СО₂ до следующего дня.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
ϋΜΕΜ	АУ1зеп11пс.	10013СУ	4°С
ДМСО	81дта	ϋ-2650	К.Т.
Модифицированный по методу Дульбекко ЗФР	СНЬсо-ВЯЬ	14190-136	К.Т.
Фетальная телячья сыворотка (ФТС) (сыворотка плода коровы)	Вю-АУЫИакег	14-901Р	-20°С/4°С
Неомицин (0418)	СНЬсо-ВЯЬ	10131-027	-20°С/4°С
Трипсин-ЭДТК	СНЪсо-ВЯЬ	25300-054	-20°С/4°С
96-луночные планшеты	Соз1аг	3997	К.Т.
Фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ), 0,22 мкм	МПНроге	8ЬОУ025Ь8	К.Т.
Титрационный планшет из полипропилена с глубокими лунками	Весктап	267007	К.Т.

Подготовка тестируемого соединения к анализу.

мкл тестируемого соединения (в 100% ДМСО) добавляли к 2 мл среды для анализа до конечной концентрации ДМСО 0,5% и раствор обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин и фильтровали через фильтр типа \11111роге с размером отверстий 0,22 мкм. 900 мкл вносили в ряд А титрационного планшета из полипропилена с глубокими лунками. Ряды Б-3 содержали аликвоты по 400 мкм среды для анализа (содержащей 0,5% ДМСО) и их применяли для приготовления серийных разведений (1/2) путем переноса по 400 мкл из ряда в ряд (в ряд 3 не вносили никакого соединения).

Внесение тестируемого соединения в культуру клеток.

Среду для культуры клеток аспирировали из 96-луночного планшета, содержащего клетки линии 822.3. По 175 мкл среды для анализа с соответствующим образом разбавленным тестируемым соединением переносили из каждой лунки планшета, содержащего соединения, в соответствующую лунку планшета, содержащего культуру клеток (ряд 3 применяли в качестве «контроля без ингибитора»). Планшет с культурой клеток инкубировали при 37° в атмосфере с 5% СО₂ в течение 72 ч.

Экстракция общей клеточной РНК.

После 72-часового периода инкубации экстрагировали общую клеточную РНК из клеток линии 822.3, находящихся в 96-луночном планшете, используя набор типа ЯХеазу 96 ((Даден'® ЯХеазу НапбЬоок, 1999). В целом, метод состоит в следующем: среду для анализа полностью удаляли из клеток и в каждую лунку 96-луночного планшета с культурой клеток добавляли по 100 мкл ЯЕТ-буфера (Р1адеп®), содержащего 143 мМ β-меркаптоэтанол. Микропланшет осторожно встряхивали в течение 20 с. Затем в каждую лунку микропланшета добавляли по 100 мкл 70%-ного этанола и перемешивали пипетированием. Лизат удаляли и вносили в лунки планшета, содержащего ЯХеазу 96 ((Даден ®), который помещали в верхнюю часть блока с квадратными лунками ((Даден® 8циаге-Ае11 В1оск). Планшет с ЯХеазу 96 запечатывали скотчем и устройство 8циаге-Ае11 В1оск с содержащим ЯХеазу 96 планшетом помещали в держатель и вносили в роторный резервуар центрифуги 4К15С. Образец центрифугировали при 6000 об./мин (~5600 х д) в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли с планшета и в каждую лунку планшета с ЯХеазу 96 вносили по 0,8 мл ЯА1-буфера ((Даден® набор ЯХеазу 96). Содержащий ЯХеазу 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Содержащий ЯХеазу 96 планшет помещали в верхнюю часть другого чистого блока с квадратными лунками (типа 8циаге-Ае11 В1оск), скотч удаляли и в каждую лунку содержащего ЯХеазу 96 планшета вносили по 0,8 мл ЯРЕ-буфера ((Даден® набор ЯХеазу 96). Содержащий ЯХеазу 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли и в каждую лунку содержащего ЯХеазу 96 планшета

- 20 007742 вносили еще по 0,8 мл КРЕ-буфера ((Дацеп® набор К№азу). Содержащий К№азу 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли, содержащий КЫеазу 96 планшет помещали в верхнюю часть адаптора, содержащего предназначенные для сбора образцов микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл. РНК элюировали, добавляя в каждую лунку по 50 мкл свободной от РНКазы воды, запечатывая планшет новым куском скотча и инкубируя в течение 1 мин при комнатной температуре. Планшет затем центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Стадию элюирования повторяли, используя второй объем, равный 50 мкл свободной от РНКазы воды. Микроцентрифужные пробирки с общей клеточной РНК хранили при -70°.

Количественная оценка общей клеточной РНК.

РНК оценивали количественно с помощью системы 8ТОКМ® (Мо1еси1аг Эупатюз®), используя набор для количественной оценки РНК типа КЛоОгееп® (Мо1еси1аг РгоЬез®). В целом, метод состоит в следующем: реагент КЛоОгееп разбавляли в 200 раз ТЭ (10 мМ Трис-НС1 рН=7,5, 1 мМ ЭДТК). Как правило, 50 мкл реагента разбавляли 10 мл ТЭ. Образцы рибосомной РНК для построения стандартной кривой разбавляли в ТЭ до 2 мкл/мл и затем предварительно определенные количества (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 и 0 мкл) раствора рибосомной РНК переносили в новый 96-луночный планшет (СО8ТАК № 3997) и объем доводили до 100 мкл с помощью ТЭ. Как правило, колонку 1 96-луночного планшета использовали для построения стандартной кривой, а другие лунки использовали для количественной оценки образцов РНК. По 10 мкл каждого образца РНК, подлежащего количественной оценке, переносили в соответствующую лунку 96-луночного планшета и добавляли по 90 мкл ТЭ. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили по одному объему (100 мкл) разбавленного реагента КгЬоОгееп и инкубировали в течение 2-5 мин при комнатной температуре, защищая от света (10 мкл образца РНК в 200 мкл конечного объема, т.е. 20-кратное разбавление). Интенсивность флуоросценции каждой лунки оценивали с помощью системы 8ТОКМ® (Мо1еси1аг Охпаиисз®). Стандартные кривые получали на основе известных количеств рибосомной РНК и соответствующей им интенсивности флуоресценции. Концентрацию РНК в экспериментальных образцах определяли, исходя из стандартной кривой, и корректировали с учетом 20кратного разбавления.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	У словияхранения
ϋΕΡΟ	81§та	ϋ5758	4°С
ЭДТК	81§та	Е5134	К.Т.
Основание Тпгта	81§та	Т8524	К.Т.
Тпгта-НС!	81§та	Т7149	К.Т.
Адаптеры с пробирками для сбора	(Дадеп	19562	К.Т.
Набор для количественной оценки РНК типа К1Ьо§гееп	Мо1еси1аг РгоЬе	К11490	-20°С
Набор типа КИеазу 96	(Дадеп	74183	К.Т.
Блоки с квадратными лунками	(Дадеп	19573	К.Т.

ОТ-ПЦР, проводимая в реальном времени.

ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью системы для анализа последовательности АВ1 Рпзт 7700 с использованием набора ТацМап Е2 К.Т.-РСК (фирма Регкт-Е1тег Арркей Вюзузйетз®). ОТ-ПЦР оптимизировали для количественной оценка 5'-1КЕ8 РНК НСУ с помощью технологии Тацтап (фирма Коске Мо1еси1аг ОшапозИсз 8у81етз), которая аналогична методу, описанному ранее у Маг1е11 и др. й. Скп. М1сгоЬю1. 37, 1999, сс. 327-332. Система основана на 5'^3' нуклеолитической активности ДНК-полимеразы АтркТац. В целом, метод состоит в следующем: для его осуществления использовали фторогенный гибридизующийся зонд с двойной меткой (РиТК-зонд), который специфично ренатурирует матрицу между ПЦР-праймерами (праймеры 8125 и 7028). 5'-конец зонда содержит флуоресцентный репортер (6-карбоксифлуоресцин [ГАМ]), а 3'-конец содержит гаситель флуоресценции (6карбокситетраметилродамин [ТАМКА]). Спектр испускания репортера ГАМ подавляли гасителем на неповрежденном гибридизующемся зонде. Расщепление гибридизующегося зонда высвобождало репортер, что приводило к повышению испускания флуоресценции. С помощью анализатора последовательности типа АВ1 Рпзт 7700 непрерывно осуществляли определение повышения испускания флуоресценции в процессе ПЦР-амплификации, при этом количество амплифицированного продукта прямо пропорционально сигналу. Зависимость амплификации от времени анализировали на ранней стадии реакции, в момент времени, соответствующий логарифмической фазе накопления продукта. Точку, представляющую собой определенный порог обнаружения повышения сигнала флуоресценции, связанного с экспоненциальным увеличением количества ПЦР-продукта для анализатора последовательности, обозначали как порог цикла (Ст). Значения С_Т обратно пропорциональны количеству введенной РНК НСУ; т.е. при оди

- 21 007742 наковых условиях ПЦР чем больше исходная концентрация РНК НСУ, тем ниже значение С_Т. Стандартную кривую строили автоматически с помощью системы обнаружения АВI Рикш 7700 путем построения графика зависимости С_Т от каждого стандартного разведения с известной концентрацией РНК НСУ.

В каждый планшет для осуществления ОТ-ПЦР вносили эталонные образцы для стандартной кривой. РНК репликона НСУ синтезировали (посредством транскрипции Т7) ΐη νΐίΐΌ, очищали и количественно оценивали по величине ОП₂₆₀. С учетом того, что в 1 мкг этой РНК содержится 2,15х10^п копий РНК, осуществляли такие разведения, чтобы получать 10⁸,10⁷,10⁶,10⁵,10⁴,10³ или 10² копий геномной РНК/5 мкл. В каждое разведение включали также общую клеточную РНК линии Ник-7 (50 нг/5 мкл). 5 мкл каждого эталонного образца (РНК репликона + РНК Ник-7) объединяли с 45 мкл реагента Μΐχ и применяли в проводимой в реальном времени ОТ-ПЦР.

Проводимую в реальном времени ОТ-ПЦР осуществляли также с использованием экспериментальных образцов, которые очищали в содержащих В№аку 96 лунках планшета, объединяя 5 мкл каждого образца общей клеточной РНК с 45 мкл реагента Μΐχ.

Реагенты и материалы.

Продукт	Компания	Каталожный №	Условия хранения
Набор ТацМап ΕΖ К.Т.РСК	РЕ Αρρίΐβά В1О8у81ет8	N808-0236	-20°С
Оптические колпачки типа М1СгоАтр	РЕ Αρρίίβά В1О8у81етз	N801-0935	К.Т.
Оптический 96луночный реакционный планшет типа МтсгоАшр	РЕ АррИе<1 В1О5у81ет5	N801-0560	К.Т.

Состав для приготовления реагента Μΐχ.

Компонент	Объем для 1 образца (мкл)	Объем для одного планшета (мкл) (объем для 91 образца + «мертвый» объем)	Конечная концентрация
Свободная от РНКазы вода	16,5	1617
5 х буфер ТаяМап ΕΖ	10	980	1х
Мп(ОАс)₂ (25мМ)	6	588	ЗмМ
дАТФ (ЮмМ)	1,5	147	ЗООмкМ
дЦТФ (ЮмМ)	1,5	147	ЗООмкМ
дГТФ (ЮмМ)	1,5	147	ЗООмкМ
дУТФ (20мМ)	1,5	147	бООмкМ
«Прямой» праймер (ЮмкМ)	1	98	200нМ
«Обратный» праймер (ЮмкМ)	1	98	200нМ
РиТК-зонд (5мкМ)	2 .	196	200нМ
ДНК-полимераза гТ1к (2,5 ед./мкл)	2	196	0,1 ед./мкл
АтрЕгазе υΝΟ (1 ед./мкл)	0,5	49	0,01 ед./мкл
Общий объем	45	4410

Последовательность «прямого» праймера (8БР ГО. 1):

5'-АСО САО ААА ОСО ТСТ АОС САТ ООС ОТТ АОТ-3'.

Последовательность «обратного» праймера (8БР ГО ΝΟ. 2):

5'-ТСС СОО ООС АСТ СОС ААО САС ССТ АТС АОО-3'.

Примечание: эти праймеры обеспечивают амплификацию области, состоящей из 256 нуклеотидов, которая присутствует в 5'-нетранслируемой области НСУ.

Последовательность РИТВ-зонда (8БР ГО ΝΟ. 3):

16ГАМ Р ТОО ТСТ ОСО ОАА ССО ОТО АОТ АСА СС - |ТАМКА|

Несодержащие матрицы контроли (НМК): На каждом планшете по 4 лунки использовали в качестве «НМК». Для получения таких контролей в каждую лунку вместо РНК вносили 5 мкл воды.

Условия проведения реакции в термоячейке:

- 22 007742

50°С	2 мин
60°С	30 мин
95°С	5 мин
95°С	^15с 1 η
	г 2 цикла
60°С	1 мин
90°С	15 с Ί
	к 40 циклов
60°С	1 мин

После завершения ОТ-ПЦР для анализа данных необходимо определять порог обнаружения сигнала флуоресценции для ПЦР-планшета, и для этого получали стандартную кривую путем построения графика зависимости значения С от количества копий РНК, применяемых в каждой эталонной реакции. Значения С_£, полученные для анализируемых образцов, использовали для определения путем интерполяции количества копий РНК на основе стандартной кривой.

И, наконец, количество копий РНК стандартизовали (на основе количественной оценки РНК, экстрагируемой из лунки с клеточной культурой, с помощью набора КЛоОгееп ΡΝΑ) и выражали в виде геномных эквивалентов/мкг общей РНК [г.э./мкг].

Количество копий РНК [г.э./мкг] для каждой лунки планшета с культурой клеток принимали за меру количества реплицирующейся РНК НСУ в присутствии различных концентраций ингибитора. Ингибирование в % рассчитывали с помощью следующего уравнения:

100-[(г.э./мкг инг.)/(г.э./мкг контр.)х100]

Для обработки данных зависимости ингибирования от концентрации применяли основанную на модели Хилла аппроксимацию нелинейной кривой, и значения концентрации, обеспечивающей 50%-ную эффективность (50%-ное ингибирование) (ЕС₅₀) рассчитывали с помощью программного обеспечения 8А8 (81а11811еа1 8оЙАаге 8уз1еш; 8А8 ЫзйШе, >0. Кэри, шт.Северная Каролина). При оценке соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, с помощью описанных выше ферментативных анализов и анализов клеточных культур, выявлена их высокая активность. Более конкретно, установлено, что значения КА, соединений составляли менее 0,1 мкМ при анализе ^3-№4А-протеазы, и значения ЕС₅₀ составляли менее 0,5 мкМ при анализе репликации РНК НСУ на культуре клеток.

Пример 12. Анализы специфичности.

Анализы специфичности, применяемые для оценки избирательности действия указанного соединения, соответствуют описанным в Υ0 00/09543.

Когда соединения оценивали в опытах по определению специфичности, то было установлено, что соединения формулы (I) обладали селективностью, т.е. они не вызывали существенного ингибирования эластазы лейкоцитов человека и катепсина В.

Пример 13. Фармакокинетические свойства.

Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают также удовлетворительными фармакокинетическими свойствами, такими как значительные уровни в плазме крыс через 1 и 2 ч после орального введения дозы 5 мг/кг.

Более конкретно, для оценки уровней в плазме крыс тестируемых соединений после орального введения применяли следующий анализ, основанный на оценке ΐη у1уо абсорбции после орального введения: Материалы и методы.

1. Метод, применяемый для группировки соединений (отбор с помощью «кассет»).

Отбор соединений, предназначенных для объединения в «кассету», был основан на их структурном сходстве и физикохимических свойствах. Был разработан метод твердофазной экстракции, применимый для всех отобранных соединений. Данные начального тестирования, при котором каждое соединение вводили в плазму крыс и с помощью ЖХВР или ЖХВР-МС анализировали каждое соединение, взятое в концентрации 0,5 мкМ, с определением времени удерживания, ионной массы и возможности разделения соединений с помощью ЖХВР и/или ЖХВР/МС, использовали для объединения 3-4 соединений в одну «кассету».

2. Подготовка носителя и соединения для орального введения.

Каждая «кассета» содержала 3-4 соединения, каждое в концентрации 5 или 4 мг/кг. Кассету приготавливали в виде суспензии для орального введения, содержащей 0,5% водной метилцеллюлозы и 0,3% полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеата (Твин-80). Объем вводимой дозы составлял 10 мл/кг и ее вводили через оральный желудочный зонд.

3. Применяемые дозы и отбор образцов плазмы.

Самцов крыс 8ргадие 1)а\\'1еу содержали в индивидуальных клетках в течение ночи, и животные имели доступ к водной 10%-ной декстрозе.Каждую «кассету» вводили 2 крысам. Образцы плазмы (~1 мл) получали через 1 и 2 ч после обработки у каждой из двух крыс и объединяли для экстракции и анализа.

4. Экстракция и анализ соединений.

Для каждой «кассеты» образцы плазмы, полученные через 1 и 2 ч, образцы контрольной плазмы, образцы контрольной плазмы, в которую вводили все соединения, каждое в концентрации 0,5 мкМ, экстрагировали с помощью метода твердофазной экстракции. Для сравнения образцы анализировали с помощью ЖХВР и ЖХВР/

- 23 007742

МС. Концентрации в плазме определяли на основе одной концентрации стандарта, составляющей 0,5 мкМ.

При оценке предлагаемых в настоящем изобретении соединений, описанных в примерах 1-9, с помощью указанного выше метода отбора выявлены их высокие уровни в плазме через 1 и 2 ч после орального введения, при этом усредненные уровни в плазме крови составляли 1,23 и 1,16 мкМ соответственно. Эти результаты демонстрируют, что предлагаемые в настоящем изобретении соединения обладали выраженным уровнем абсорбции т νίνη после орального введения в сравнении с низким уровнем абсорбции после орального введения, характерным в целом для этого класса пептидов. Способность к абсорбции после орального введения делает указанные соединения перспективными для лечения инфекции, вызываемой НСУ.

Ниже в таблице представлены репрезентативные предлагаемые в изобретении соединения. В дополнении к указанному ранее в описании следует отметить, что для всех соединений значения 1С₅₀ составляли менее 0,1 мкМ при анализе Ν83-Ν84 А-протеазы, и значения ЕС₅₀ составляли менее 0,5 мкМ при анализе репликации РНК НСУ на культуре клеток.

Таблица 1

Соед. №		я²		к⁴	т/ζ (МН)⁺
100	ОН	ъ	третбутил	а	789,3
101	он		третбутил	а	775,4
102	он	ъ	третбутил	а	803,4
103	о	ъ	третбутил	а	928,5
104	ОН	ъ	третбутил	Су	775,4
105	ОН	ъ	третбутил	а	803,4
106	ОН	ъ	Р	а	815,4
107	он	ъ	9	а	801,4 ‘

- 24 007742

Перечень последовательностей <110> Бёрингер Ингельхайм Интернациональ ГмбХ <120> Трипептиды, несущие простой гидроксипролиновый эфир замещенног хинолина, предназначенные для ингибирования протеазы N83 (гепатит С) <130> 13/106 <150> 2,370,396 <151> 2002-08-01 <160> 3 <170> ГазбЗЕО для версии УЛпбонз 4.0 <210> 1 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> прямой праймер <400> 1 асдсадааад сдбсбадсса бддсдббадб 30 <210> 2 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> обратный праймер <400> 2 бсссддддса сбсдсаадса сссбабсадд 30 <210> 3 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> ΡϋΤΚ-зонд <400> 3 бддбскдсдд аассддбдад басасс 26

- 25 007742

Claims

1. Соединение формулы (I) в котором К¹ обозначает гидрокси или \118О2Р11; К² обозначает С4-С₆циклоалкил; К³ обозначает третбутил или С5-С6циклоалкил и К⁴ обозначает С4-С₆циклоалкил; или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает Ν 18О₂Р11.

3. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси.

4. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-3, в котором К² обозначает циклопентил или цикло гексил.

5. Соединение формулы (I) по п.4, в котором К² обозначает циклопентил.

6. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-5, в котором К³ обозначает трет-бутил или циклогек сил.

7. Соединение формулы (I) по п.6, в котором К³ обозначает трет-бутил.

8. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-7, в котором К⁴ обозначает циклобутил или цикло пентил.

9. Соединение формулы (I) по п.8, в котором К⁴ обозначает циклопентил.

10. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² и К⁴ каждый обозначает циклопентил и К³ обозначает трет-бутил.

11. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает циклобутил, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклопентил.

12. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает циклогексил, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклопентил.

13. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает \118О₂Р11, К² и К⁴ каждый обозначает циклопентил и К³ обозначает трет-бутил.

14. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает циклопентил, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклобутил.

15. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² обозначает циклопентил, К³ обозначает трет-бутил и К⁴ обозначает циклогексил.

16. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К² и К⁴ каждый обозначает циклопентил и К³ обозначает циклогексил.

17. Соединение формулы (I) по п.1, в котором К¹ обозначает гидрокси, К², К³ и К⁴ каждый обозна чает циклопентил.

18. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) по одному из пп.1-17 или его фармацевтически приемлемой соли.

19. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) по одному из пп.1-17 или его фармацевтически приемлемой соли в смеси с фармацевтически приемлемой средой носителя или вспомогательным веществом.

20. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы (I) по одному из пп.1-17 или его терапевтически приемлемой соли в сочетании с одним или несколькими другими агентами, обладающими активностью в отношении НСУ.

21. Способ по п.20, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, выбирают из α-интерферона или пэгилированного α-интерферона.

22. Способ по п.20 или п.21, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, представляет собой рибавирин.

23. Способ по одному из пп.20-22, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, выбирают из ингибиторов геликазы, \82/3-протеазы и внутреннего сайта входа в рибосому (ПК'%).

- 26 007742

24. Способ по одному из пп.20-22, заключающийся в том, что другой агент, обладающий активностью в отношении НСУ, представляет собой ингибитор НСУ-полимеразы.

25. Применение соединения формулы I по одному из пп.1-17 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.