RS67204A - Tripeptidi koji sadrže hidroksiprolin etar supstituisanog hinolina za inhibiranje ns3 (hepatitis c) - Google Patents

Abstract

Prikazana su jedinjenja formule (I), u kojoj R1 jeste hidroksi ili NHSO2R1A grupa, pri čemu R1A jeste (C1-8)-alkil, (C3-7)-cikloalkil ili {(C1-6)-alkil-(C3-7)-cikloalkil} grupa, koje su sve, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, O-(C1-6)-alkil, amido, amino ili fenil grupe, ili R1A jeste C6- ili C10-aril grupa, u datom slučaju, supstituisana sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, (C1-6)-alkil, O-(C1-6)-alkil, amido, amino ili fenil grupe; R2 je (C4-6)-cikloalkil grupa; R3 je t-butil ili (C5-6)-cikloalkil, a R4 je (C4-6)-cikloalkil grupa; ili njihova farmaceutski prihvatljiva so. Jedinjenja su korisna kao inhibitori HCV NS3 proteaze, za lečenje hepatitisa C.

Description

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja, postupke za sintezu, kompozicije i načine lečenja infekcije virusom hepatitisa C (HCV). Posebno, ovaj pronalazak daje nove peptidne analoge, farmaceutske kompozicije koje sadrže takve analoge i načine za upotrebu tih analoga u lečenju HCV infekcije.

Osnovni podaci u vezi sa pronalaskom

Virus hepatitisa C (HCV) je širom sveta glavni etiološki uzročnik non-A non-B hepatitisa, dobijenog posle transfuzije i u društvenoj (životnoj) sredini. Procenjuje se da je preko 200 miliona ljudi širom sveta inficirano tim virusom. Veliki procenat nosioca postaje hronično inficiran a kod mnogih dolazi do hroničnog oboljenja jetre, takozvanog hroničnog hepatitisa C. Ova grupa je, s druge strane, pod velikim rizikom od ozbiljnog oboljenja jetre, kao što je ciroza jetre, hepatoćelijski karcinom i terminalno oboljenje jetre koje dovodi do smrti.

Mehanizam kojim HCV ostvaruje rezistenciju prema virusu i izaziva veliku stopu hroničnog oboljenja jetre nije podrobno razjašnjen. Zna se kako HCV reaguje sa imunskim sistemom domaćina i kako mu izmiče. Pored toga, uloge ćelijskih i humoralnih imunskih odgovora, u zaštiti protiv HCV infekcije i oboljenja još treba da budu objašnjeni. Imunoglobulini su navođeni za profilaksu virusnog hepatitisa povezanog sa transfuzijom, međutim, Centar za sprečavanje bolesti (Center for Disease Control) za tu svrhu danas ne preporučuje tretman imunoglobulinima. Nedostatak efikasnog zaštitnog imunskog odgovora onemogućava razvijanje vakcine ili adekvatnih profilaksnih mera, posle izlaganja takvoj opasnosti, tako da su u bliskoj budućnosti, očekivanja čvrsto usmerena na antirvirusne intervencije.

Različite kliničke studije su izvođene sa ciljem da se identifikuju farmaceutska sredstva koja su efikasna za lečenje HCV infekcije kod pacijenata koji pate od hroničnog hepatitisa C. Ove studije su obuhvatile upotrebu a-interferona, samog ili u kombinaciji sa drugim antivirusnim sredstvima. Takve studije su pokazale da pretežan deo učesnika ne reaguje na ove terapije, a od onih kod kojih je reakcija povoljna, kod velikog broja se bolest vraća posle završetka tretmana.

Do skora, interferon (IFN) je bio jedina postojeća terapija koja se pokazala dobrom, klinički potvrđena za pacijente sa hroničnim hepatitisom C. Ipak, ispoljena brzina odgovora je mala, a tretman interferonom takođe izaziva ozbiljne prateće efekte (ti. retinopatija, tiroiditis, akutni pankreatitis, depresija) što smanjuje kvalitet života lečenih pacijenata. Nedavno, kombinacija interferona sa ribavirinom pokazala je se uspešnom kod pacijenata kod kojih nema odgovora na sam IFN. Međutim, prateći efekti izazvani IFN-om nisu izbegnuti pri TOJ kombinovanoj terapiji. PEG-stabilizovani oblici interferona, kao što PEG-Intron<®>i Pegasvs<®>mogu očigledno delimično da umanje te štetne efekte, ali antivirusni lekovi ipak ostaju najbolji put za oralno lečenje HCV-a.

Zbog toga, postoji potreba da se proizvedu efikasna antivirusna sredstva za lečenje HCV infekcija koja prevazilaze ograničenja postojećih farmaceutskih terapija.

HCV je virus iz familijeFlaviviridae,koji u omotaču sadrži pozitivan lanac RNK. Jedan lanac RNK genoma HCV-a je približno dug 9500 nukleotida i ima jedan "otvoren okvir čitanja" (ORF) koji kodira samo jedan veliki poliprotein od oko 3000 amino kiselina. U inficiranim ćelijama, ovaj poliprotein se čepa na više različitih mesta, ćelijskim i virusnim proteazama, dajući strukturne i ne-strukturne (NS) proteine. U slučaju HCV-a, proizvodnja zrelih ne-strukturnih proteina (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B) ostvaruje se dejsvom dve virusne proteaze. Prva, do sada slabo okarakterisana, čepa polipeptid na mestu veze NS2-NS3 proteina (stoga je označena kao NS2/3 proteaza); druga je serin proteaza koja se nalazi u N-terminalnom regionu NS3 proteina (NS3 proteaza), a posreduje u svim subsekventnim cepanjima nishodno od NS3, kako nacis,NS3-NS4 mestu cepanja, tako i natransmesUma cepanja, preostalih NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B veza. Izgleda da NS4A protein ima nekoliko funkcija: deluje kao kofaktor za NS3 proteazu i verovano pomaže lokalizaciju NS3 proteina i drugih komponenti replikaznog kompleksa virusa u ćelijskoj membrani. Formiranje kompleksa NS3 proteaze sa NS4A proteinom je izgleda neophodno za procese obrade poliproteina, povećavajući proteolitičku efikasnost na svim mestima cepanja. NS3 protein takođe pokazuje nukleozid trifosfataznu i PvNK helikaznu aktivnost. NS5B je RNK-zavisna RNK polimeraza koja je uključena u replikaciju HCV-a.

Opšta strategija za razvijanje antivirusnih sredstava je da se inaktiviraju virusno kodirani enzimi koji su ključni za replikaciju virusa.

Sledeće je lista patentnih prijava publikovanih poslednjih nekoliko godina u kojima se štite peptidni analozi inhibitora HCV NS3 proteaze, koji su strukturno različiti od jedinjenja na osnovu ovog pronalaska: GB 2,337,262; JP10298151; JP 11126861; JP 11292840; JP 2001-103993;

US 6,159,938; US 6,187,905; WO 97/43310; WO 98/17679; WO 98/22496;

WO 98/46597; WO 98/46630; WO 99/38888; WO 99/50230; WO 99/64442;

WO 99/07733; WO 99/07734; WO 00/09543; WO 00/09558; WO 00/20400;

WO 00/59929; WO 00/31129; WO 01/02424; WO 01/07407; WO 01/16357;

WO 01/32691; WO 01/40262; WO 01/58929; WO 01/64678; WO 01/74768;

WO 01/77113; WO 01/81325; WO 02/08187; WO 02/08198; WO 02/08244;

WO 02/08251; WO 02/08256; WO 02/18369; WO 02/60926 i WO 02/79234.

Jedna od prednosti ovog pronalaska je ta što on daje tripeptidna jedinjenja koja su inhibitori NS3 proteaze, enzima koji je bitan za replikaciju (umnožavanje) virusa hepatitisa C. Osim toga, jedinjenja su sposobna da inhibiraju replikaciju RNK HCV-a u modelu ćelijskog replikona.

Dalja prednost jednog od aspekta ovog pronalaska leži u činjenici što ta jedinjenja specifično inhibiraju NS3 proteazu, a ne pokazuju značajnu inhibitorsku aktivnost prema drugim serinskim proteazama, kao što su, humana leukocitna ekstaza (HLE), pankreasna elastaza svinje (PPE), ili pankreasni himotripsin govečeta, ili cisteinske proteaze, kao katepsin (Cat B) humane jetre.

Kratak pregled pronalaska

U predmet pronalaska uključeno je jedinjenje formule (I):

u kojoj R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu R1A jeste (C^-alkil, (C3.7)-cikloalkil ili {(Ci_6)-aM-(C3_7)-cikloalkil} grupa, koje su sve, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, CKC^-alkil, amido, amino ili fenil grupe, ili R<1A>jeste Cg- ili C10-aril grupa, u datom slučaju, supstituisana sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, (C1.6)-alkil, CHC^-alkil, amido, amino ili fenil grupe ; R2 je (C4_6)-cikloalkil grupa; R<3>je t-butil ili (C5.6)-cikloalkil, a R<4>je (C4_g)-cikloalkil grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

U sklopu predmeta ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži, anti-hepatitis C virusno efikasnu količinu jedinjenja formule I, ili njegovu terapeutski prihvatljivu so, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili pomoćnim sredstvom.

Prema jednom od rešenja, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, sadrži još interferon (PEG-stabilizovan ili ne), ili ribavirin, ili jedan ili više drugih anti-HCV sredstava, ili neku od njihovih gornjih kombinacija.

Dalji važan aspekt pronalaska obuhvata postupak za lečenje virusne hepatitis C infekcije kod sisara, davanjem sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, neke njegove terapeutski efikasne soli, ili kompozicije kao što je gore opisana, samog ili u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih sredstava, kao: interferon (PEG-stabilizovan ili ne), ili ribavirin, ili jedno ili više drugih anti-HCV sredstava, koja se daju zajedno ili svako posebno.

Dalji važan aspekt pronalaska obuhvata postupak za prevenciju virusne hepatitis C infekcije kod sisara, davanjem sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, neke njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili kompozicije kao što je gore opisana, samog ili u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih sredstava, kao: interferon (PEG-stabilizovan ili ne), ili ribavirina, ili jedno ili više drugih anti-HCV sredstava, od kojih se sva daju zajedno ili svako posebno.

Takođe, predmet ovog pronalaska je upotreba jedinjenja formule I, kao što je gore opisana, za pripremanje leka za lečenje ili prevenciju virusne hepatitis C infekcije.

U ovom opisu se vrši pozivanje na izvestan broj dokumenata čiji je sadržaj ovde uključen kao referenca.

DETALJAN OPIS REŠENJA KOJA IMAJU PREDNOST

Definicije

Kako je ovde korišćeno upotrebljene su sledeće definicije, ukoliko nije drukčije navedeno: U vezi sa slučajevima kada je( R)ili( S)upotrebljeno za označavanje apsolutne konfiguracije nekog supstituenta ili asimetričnog centra, jedinjenja formule I, oznaka je data u kontekstu celog jedinjenja, a ne u kontekstu samog supstituenta ili asimetričnog centra.

Oznaka "Pl, P2 i P3", kako je ovde korišćeno, odnosi se na položaj ostataka amino kiselina, polazeći od C-terminalnog kraja peptidnih analoga pa produžavajući prema N-terminalnom (tj. Pl se odnosi na poziciju 1 od C-terminalnog, P2: druga pozicija od C-terminalnog, itd.) (vidi Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Societv London series B257.249-264 (1970)).

Kako je ovde korišćeno oznaka "vinil-ACCA" odnosi se na jedinjenje formule:

OH

H2N Ry

O

naime,( 1R, 2S)l-amino-2-etenilciklopropil-karboksilnu kiselinu.

Oznaka "(Ci^-alkil", kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava aciklične, sa pravim ili razgranatim lancem alkil supstituente koji sadrže od 1 do 8 atoma ugljenika, i uključuju, na primer, metil, etil, 2-metilheksil, 1,1-dimetilheksil (ili t-butil) i oktil grupu.

Oznaka "(C3.7)-cikloalkir', kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava cikloalkil supstituent koji sadrži od 3 do 7 atoma ugljenika, a uključuje ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i cikloheptil grupu.

Oznaka "{(C1_6)-alMl-(C3_6)-cikloalkil}", kako je ovde korišćeno, označava cikloalkil radikal koji sadrži od 3 do 6 atoma ugljenika, direktno vezan za alkilen radikal koji sadrži 1 do 6 atoma ugljenika: na primer, ciklopropilmetil, ciklopentiletil, cikloheksilmetil i cikloheksiletil grupu. U slučaju kada jeste {(Ci.6)-alkil-(C3.g)-cikloalkil}, ta grupa je vezana za SO2grupu preko (C^-alkil grupe (tj. alkilen deo).

Oznaka "Cg- ili C10-aril", kako je ovde korišćeno, bilo sama ili kombinaciji sa drugim radikalom, označava ili aromatsku monocikličnu grupu, koja sadrži 6 atoma ugljenika, ili aromatsku bicikličnu grupu, koja sadrži 10 atoma ugljenika. Na primer, aril uključuje fenil, 1-naftil ili 2-naftil grupu.

Oznaka " 0-( Ci. q)-alkil", kako je ovde korišćeno, sama ili u kombinaciji sa drugim supstituentom, označava radikal -0-(Ci^)-alkil, pri čemu je alkil definisan kao gore, a sadrži do šest atoma ugljenika, i uključuje metoksi, etoksi, propoksi, 1-metil-etoksi, butoksi i 1,1-dimetiletoksi grupu. Poslednji radikal je obično poznat kao terc-butoksi.

Oznaka "halogeno", kako je ovde korišćeno, označava halogeni supstituent odabran od bromo, hloro, fluoro ili jodo ostatka.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava so, jedinjenja formule I, koja je na osnovu ispravne medicinske procene, pogodna za upotrebu u kontaktu sa tkivima humanih i manjih životinja, ne izazivajući nepoželjnu toksičnost, iritaciju, alergijski odgovor, i slično, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik, koja obično može da se rastvori ili disperguje u vodi ili ulju, a efikasna je pri njenoj namenskoj upotrebi. Izraz uključuje farmaceutski prihvatljive adicione soli sa kiselinom i farmaceutski prihvatljive adicione soli sa bazom. Spisak pogodnih soli se nalazi, npr. u S.M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977,66, str. 1-19, što je ovim u celini uključeno kao referenca.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva adiciona so sa kiselinom" označava one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih baza i koje biološki, ili na drugi način, nisu nepoželjne, obrazovane sa neorganskim kiselinama, kao što su, hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, jodovodonična kiselina, sumporna kiselina, sulfaminska kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične, i sa organskim kiselinama, kao što su, sirćetna kiselina, trihlorosirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina, adipinska kiselina, alginska kiselina, askorbinska kiselina, asparaginska kiselina, benzensulfonska kiselina, benzoeva kiselina, 2-acetoksibenzoeva kiselina, buterna kiselina, kamforna kiselina, kamforsulfonska kiselina, cimetna kiselina, limunska kiselina, diglukonska kiselina, etansulfonska kiselina, glutaminska kiselina, glikolna kiselina, glicerofosforna kiselina, hemisulfična kiselina, heptanska kiselina, heksanska kiselina, mravlja kiselina, fumaraa kiselina, 2-hidroksietansulfonska kiselina (izetionska kiselina), mlečna kiselina, hidroksimaleinska kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, bademska kiselina, mezitilensulfonska kiselina, metansulfonska kiselina, naftalensulfonska kiselina, nikotinska kiselina, 2-naftalensulfonska kiselina, oksalna kiselina, pamoična kiselina, pektinska kiselina, fenilsirćetna kiselina, 3-fenilpropionska kiselina, pikrinska kiselina, pivalinska kiselina, propionska kiselina, pirogrožđana kiselina, salicilna kiselina, stearinska kiselina, ćilibarna kiselina, sulfanilna kiselina, vinska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, undekanska kiselina i slične.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva adiciona so sa bazom" označava one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva slobodnih kiselina i koje biološki, ili na drugi način, nisu nepoželjne, obrazovane sa neorganskim bazama, kao što su, hidroksid, karbonat ili bikarbonat, amonijuma ili katjona metala, kao što su, natrijum, kalijum, litijum, kalcijum, magnezijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum i slični. Naročito povoljne su soli amonijuma, kalijuma, natrijuma, kalcijum i magnezijuma. Soli dobijene od farmaceutski prihvatljivih, ne-toksičnih organskih baza, uključuju soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, kvaternerna amino jedinjenja, supstituisane amine, uključujući supstituisane amine koji prirodno postoje, ciklične amine i bazne jonoizmenjivačke smole, kao što su, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, etilamin, dietilamin, trietilamin, izo-propilamin, tripropilamin, tributilamin, etanolamin, dietanolamin, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, dicikloheksilamin, lizin, arginin, histidin, kofein, hidrabamin, holin, betain, etilendiamin, glukozamin, metilglukamin, teobromin, purini, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, tetrametil-amonijum jedinjenja, tetraetilamonijum jedinjenja, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dicikloheksilamin, dibenzilamin, N,N-diben-zilfenetilamin, 1-efenamin, N,N'-dibenziletilendiamin, poliaminske smole, i slično. Naročito povoljne ne-toksične organske baze su izo-propilamin, dietilamin, etanolamin, trimetilamin, dicikloheksilamin, holin i kofein.

Naziv "antivirusno sredstvo", kako je ovde korišćen, označava neko sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno u inhibiranju stvaranja i/ili replikacije virusa, kod sisara. Ono uključuje sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju virusa, kod sisara. Antivirusna sredstva uključuju, na primer, ribavirin, amantadin, VX-497 (merimepodib, Vertex Pharmaceuticals), VX-498 (Vertex Pharmaceuticals), Levovirin, Viramidine, Ceplene (maxamine), XTL-001 i XTL-002 (XTL, Biopharmaceuticals).

Naziv "drugo anti-HCV sredstvo", kako je ovde korišćen, označava ona sredstva koja su efikasna u smanjenju ili prevenciji napredovanja simptoma bolesti koji su u vezi sa hepatitisom C. Takva sredstva mogu biti odabrana od: antivirusnih sredstava, imunomodulatorskih sredstava, inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze ili inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a.

Naziv "imunomodulatorsko sredstvo", kako je ovde korišćen, označava sredstva (jedinjenja ili biološke proizvode) koja su efikasna da povećaju ili pojačaju odgovor imunskog sistema, kod sisara. Imunomodulatorska sredstva uključuju, na primer, interferone klase I (kao što su, a-, p- i co-interferoni, i-interferoni, konsenzus interferoni i azialo-interferoni), interferoni klase II (kao y-interferoni) i PEG-interferone.

Naziv "inhibitor HCV NS3 proteaze", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno u inhibiranju funkcije HCV NS3 proteaze, kod sisara. Inhibitori HCV NS3 proteaze uključuju, na primer, ona jedinjenja koja su opisana u WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929 ili WO 02/060926, klinički kandidat, Boehringer Ingelheim-a, označen kao BILN 2061, i pred-razvojni kandidat, Vertex/Eli Lilly-a, označen kao VX-950 ili LY-570310. Naročito, u kombinaciji sa jedinjenjima na osnovu ovog pronalaska, mogu biti upotrebljena jedinjenja # 2, 3, 5, 6, 8,10, 11,18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91,103,104,105,112,113,114,115,116,120,122,123,124,125,126 i 127, obnarodovana u tabeli na stranama 224-226, u WO 02/060926.

Naziv "inhibitor HCV polimeraze" kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili prirodni proizvod) koje je efikasno u inhibiranju funkcije HCV polimeraze, kod sisara. Ono uključuje, na primer, inhibitore HCV NS5B polimeraze. Inhibitori HCV polimeraze uključuju ne-nukleozide, na primer, ona jedinjenja opisana u: US prijavi No. 10/198,680, koja odgovara PCT/CA02/01127, obe podnete 18. jula 2002 (Boehringer Ingelheim),

US prijavi No. 10/198,384, koja odgovara PCT/CA02/01128, obe podnete 18. jula 2002 (Boehringer Ingelheim),

US prijavi No. 10/198,259, koja odgovara PCT/CA02/01129, obe podnete 18. jula 2002 (Boehringer Ingelheim),

WO 02/100846 Al i WO 02/100851A2 (obe Shire),

WO 01/85172 Al i WO 02/098424 Al (obe GSK),

WO 00/06529 i WO 02/06246 Al (obe Merck),

WO 01/47883 i WO 03/000254 (obe Japan Tobacco) i

EP 1 256 628 A2 (Agouron).

Pored toga, drugi inhibitori HCV polimeraze takođe uključuju nukleozidne analoge, na primer, ona jedinjenja opisana u:

WO 01/90121A2 (Idenix),

WO 02/069903 A2 (Biocrvst Pharmaceuticals Inc.) i

WO 02/057287 A2 i WO 02/057425 A2 (oba Merck/Isis).

Specifične primere inhibitora HCV polimeraze sadrže, JTK-002, JTK-003 i JTK-109 (Japan Tobacco).

Naziv "inhibitor drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikaciju HCV-a kod sisara, drukčije nego pri inhibiranju funkcije HCV NS3 proteaze. Ono uključuje sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili HCV virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HCV-a kod sisara. Inhibitori drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a uključuju, na primer, sredstva koja inhibiraju cilj, odabran od helikaze, HCV NS2/3 proteaze i internog mesta ulaska u ribozom (IRES). Specifičan primer inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a uključuje ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals).

Naziv "inhibitor HTV- a", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikaciju HlV-a kod sisara. Ono uključuje sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HlV-a kod sisara. Inhibitori HN- a uključuju, na primer, nukleozidne inhibitore, ne-nukleozidne inhibitore, inhibitore proteaze, fuzione inhibitore i inhibitore integraze.

Naziv "HAV inhibitor", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikacije HAV-a kod sisara. Ono obuvata sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HAV-a kod sisara. HAV inhibitori uključuju Hepatitis A vakcine, na primer, Havrix<®>(GlaxoSmithKline), VAQTA<®>(Merck) i Avaxim<®>(Aventis Pasteur).

Naziv "HBV inhibitor", kako je ovde korišćen, označava sredstvo (jedinjenje ili biološki proizvod) koje je efikasno da inhibira stvaranje i/ili replikacije HBV-a kod sisara. Ono obuvata sredstva koja ometaju, ili domaćinove, ili virusne, mehanizme neophodne za stvaranje i/ili replikaciju HBV-a kod sisara. HBV inhibitori uključuju, na primer, sredstva koja inhibiraju virusnu DNK polimerazu HBV-a, ili HBV vakcine. Specifični primeri HBV inhibitora uključuju, Lamivudine (Epivir-HBV<®>), Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC (Coviracil<®>), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine<®>), AM365 (Amrad), Ldt (Telbivudine), monoval-Ldc (Valtorcitabine), ACH-126,443 (L-Fd4C) (Achillion), MCC478 (Eli Lilly), Racivir (RCV), Fluoro-Li D nukleozide, Robustaflavone, ICN 2001-3 (ICN), Bam 205 (Novelos), XTL-001 (XTL), Imino-Sugars (Nonyl-DNJ)

(Synergy), HepBzvme; i imunomodulatorske proizvode, kao što su: interferon alpha 2b, HE2000 (Hollis-Eden), Theradigm (Epimmune), EHT899 (Enzo Biochem), Thvmosin alpha-1 (Zadaxin<®>), HBV DNK vakcina (PowderJect), HBV DNK vakcina Gefferon Center), HBV antigen (OraGen), BayHep<®>(Bayer), Nabi-HB<®>(Nabi) i Anti-hepatitis B (Cangene); i HBV vakcine, kao što su sledeće: Engerix B, Recombivax HB, GenHevac B, Hepacare, Bio-Hep B, TwinRix, Comvax, Hexavac.

Naziv "interferon klase I", kako je ovde korišćen, označava interferon odabran iz grupe interferona koji se svi vezuju za receptor tipa I, To uključuje i prirodne i sintetički proizvedene interferone klase I. Primeri interferona klase I ujlkučuju, a-, p-, co-,T-interferone, konsenzus interferone, azialo-interferone.

Naziv "interferon klase II", kako je ovde korišćen, označava interferon odabran iz grupe interferona koji se svi vezuju za receptor tipa II. Primeri interferona klase II ujlkučuju, y-interferone.

Farmaceutske kompozicije, na osnovu pronalaska, mogu da sadrže jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava, odabranih, na primer, od antivirusnih sredstava, imunomodulatorskih sredstava, drugih inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze, inhibitora drugog cilja u životnom ckiklusu HCV-a, inhibitora HR/-a, inhibitora HAV-a i inhibitora HBV-a. Primeri takvih sredstava dati su gore u sekciji Definicije.

Specifični primeri nekih od tih sredstava, koja imaju prednost, navedeni su u daljem: • antivirusna sredstva: ribavirin i amantadin; • imunomodulatorska sredstva: interferoni klase I, interferoni klase II i PEG-interferoni; • inhibitor drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a, koji inhibira cilj odabran od: NS3 helikaze, HCV NS2/3 proteaze ili internog mesta ulaska u ribozom (IRES); • HP/ inhibitori: nukleozidni inhibitori, ne-nukleozidni inhibitori, inhibitori proteaze, fuzioni inhibitori i inhibitori integraze; ili • HBV inhibitori: sredstva koja inhibiraju DNK virusne polimeraze HBV-a ili je to HBV vakcina.

Kao što je gore razmatrano, kombinovana terapija se ima u vidu kada se jedinjenje formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, uporedo daje sa bar jednim dopunskim sredstvom odabranim od: antivirusnog sredstva, imunomodulatorskog sredstva, drugog inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze, inhibitora drugog cilja u životnom ciklusu HCV-a, HIV inhibitora, HAV inhibitora i HBV inhibitora. Primeri takvih sredstava dati su gore, u sekciji Definicije. Takva dopunska sredstva mogu da se kombinuju sa jedinjenjima na osnovu ovog pronalaska, da bi se dobio jedinični farmaceutski oblik doziranja. Alternativno, takva dopunska sredstva mogu da se daju pacijentu odvojeno, kao deo višestrukog načina doziranja, na primer, upotrebom odgovarajućeg kompleta sa lekovima. Takva dopunska sredstva mogu da se daju pacijentu pre, jednovremeno sa, ili posle, davanja jedinjenja formule (I), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Kako je ovde korišćen, izraz "tretman" označava davanje nekog jedinjenja ili kompozicije, na osnovu ovog pronalaska, radi ublažavanja ili eliminisanja simptoma oboljenja hepatitis C i/ili smanjenja virusnog opterećenja kod pacijenta.

Kako je ovde korišćen, izraz "prevencija" označava davanje jedinjenja ili kompozicije, na osnovu ovog pronalaska, posle izlaganja osobe virusu, ali pre pojave simptoma bolesti, i/ili pre otkrivanja virusa u krvi.

Rešenja koja imaju prednost

Prednost imaju jedinjenja formule I, kao što je prethodno definisano, u kojoj R<1>jeste hidroksi, NHS02Me, NHSO^ciklopropil ili NHS02Ph grupa. Povoljnije je da R<1>jeste NHSCVciklopropil ili NHSC^Ph grupa. Alternativno, najpovoljnije je da R<1>jeste hidroksi grupa.

Povoljna su, jedinjenja formule I, kao što je prethodno definisano, u kojoj R<2>jeste ciklopentil ili cikloheksil grupa. Najpovoljnije je da R<2>jeste ciklopentil grupa.

Povoljno je da, R<3>jeste t-butil ili cikloheksil grupa. Najpovoljnije je da R<3>jeste t-butil grupa.

Povoljna su, jedinjenja formule I, kao što je prethodno definisano, u kojoj, R<4>je ciklobuti ili

ciklopentil grupa. Najpovoljnije je da R<4>jeste ciklopentil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, kao što je prethodno definisano, u kojoj R<1>jeste hidroksi, svako R<2>i R4 je ciklopentil, a R<3>je t-butil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je ciklobutil, R<3>je t-butil, a R<4>je ciklopentil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je cikloheksil, R<3>je t-butil, a R<4>ciklopentil grupa.

Povoljnije je da, R<1>jeste NHS02Ph, svako R<2>i R<4>jeste ciklopentil, a R<3>jeste t-butil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je ciklopentil, R<3>je t-butil, a R<4>je ciklobutil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je ciklopentil, R<3>je t-butil, a R<4>je cikloheksil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, u kojoj R<1>jeste hidroksi, svako R<2>i R<4>je ciklopenti, a R<3>je cikloheksil grupa.

Povoljnije je, jedinjenje formule I, u kojoj R<1>jeste hidroksi, a svako R<2>, R<3>i R<4>je ciklopentil grupa.

Prema jednom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži neko drugo anti-HCV sredstvo. Primeri anti-HCV sredstava uključuju a- (alfa), p- (beta), 5- (delta),y-(gama) ili co- (omega) interferon, ribavirin i amantadin.

Prema jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži neki drugi inhibitor HCV NS3 proteaze.

Prema jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog

pronalaska, može dodatno da sadrži neki inhibitor HCV polimeraze.

Prema još jednom drugom alternativnom rešenju, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može dodatno da sadrži neki inhibitor drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, uključujući, ali bez ograničavanja na, helikazu, NS2/3 proteazu ili interno mesto ulaska u ribozom (IRES).

Farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može da se daje oralno, parenteralno ili via inplantiranog rezervoara. Prednost ima oralno davanje ili davanje putem injekcije. Farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može da sadrži neke konvencionalane, ne-toksične, farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke ili prenosioce. U nekim slučajevima, pH vrednost formulacije može da se podešava pomoću farmaceutski prihvatljivih kiselina, baza ili pufera, radi povećavanja stabilnosti formulisanog jedinjenja ili oblika u kojem se ono daje. Izraz parenteralan, kako je ovde upotrebljen, obuhvata subkutanu, intrakutanu, intravensku, intamuskularnu, intra-artikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu i intralezijalnu injekcionu ili infuzionu tehniku.

Farmaceutska kompozicija može biti u obliku sterilnog preparata koji može da se injektuje, na primer, kao sterilna vodena ili uljana suspenzija koja se injektuje. Takva suspenzija može da se formuliše prema tehnikama poznatim na osnovu stanja tehnike, upotrebom pogodnih sredstava za dispergovanje ili vlaženje (takvih kao, na primer Tween 80) i suspenzionih sredstava.

Farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, može da se daje oralno u nekom od oralno prihvatljivih oblika doziranja, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, kapsule, tablete i vodene suspenzije i rastvore. Kada se radi o tabletama za oralnu primenu, nosači koji se obično koriste obuhvataju laktozu i kukuruzni škrob. Sredstva za podmazivanje (lubrikanti), kao magnezijum-stearat, takođe se obično dodaju. Za oralno davanje u obliku kapsule, korisni razblaživači uključuju laktozu i osušeni kukuruzni škrob. Kada se vodena suspenzija daje oralno, aktivni sastojak se kombinuje sa sredstvima za emulgovanje i suspendovanje. Ako se želi, mogu se dodati izvesni zaslađivači i/ili aromatizeri i/ili sredstva za bojenje.

Drugi pogodni prenosioci ili nosači, za gore navedene formulacije i kompozicije, mogu se naći u u standardnim farmaceutskim tekstovima, npr. u "Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacv, 19<t0>izdanje, Mack Publishing Companv, Easton, Penn., (1995).

Nivoi doziranja, od između oko 0.01 i oko 100 mg/kg telesne mase, na dan, prvenstveno između oko 0.1 i oko 50 mg/kg telesne mase, na dan, inhibitorskog jedinjenja proteaze, opisanog ovde, korisni su u monoterapiji za prevenciju i tretman oboljenja izazvanog HCV-om. Obično, farmaceutska kompozicija, na osnovu ovog pronalaska, daje se od oko 1 do oko 5 puta, na dan, ili alternativno, kao kontinualna infuzija. Takvo davanje može da se primeni kao hronična ili akutna terapija. Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosećim materijalima, radi pripremanja jediničnog oblika doziranja, zavisiće od domaćina koji se leći i naročito od načina primene. Tipičan preparat sadrži od oko 5% do oko 95% aktivnog jedinjenja (mas./mas.). Prvenstveno, takvi preparati sadrže od oko 20% do oko 80% aktivnog jedinjenja.

Kao što će stručnjak da proceni, niže ili više doze, od onih gore navedenih, mogu biti potrebne. Specifično doziranje i režimi tretmana za nekog pojedinačnog pacijenta zavisiće od mnoštva faktora, uključujući aktivnost upotrebljenog specifičnog jedinjenja, starosti, telesne mase, opšteg zdravstvenog stanja, pola, ishrane, vremena davanja, brzine izlučenja, lekovite kombinacije, ozbiljnosti i toka infekcije, dispozicije pacijenata prema infekciji i procene lekara koji leći. Obično, tretman započinje sa malim dozama, bitno manjim od optimalne doze peptida. Posle toga, doza se po malo povećava sve dok se ne dostigne optimalno dejstvo pod tim okolnostima. Obično, jedinjenje se najradije daje sa nivoom koncentracije koji će obično dati efikasne antivirusne rezultate, ne izazivajući neke štetne ili škodljive prateće efekte.

Ako kompozicija na osnovu ovog pronalaska sadrži, kombinaciju jedinjenja formule I i jednog ili više dodatnih terapeutskih ili profilaktičkih sredstava, oba sastojka, i jedinjenje i dodatno sredstvo, treba da su sa nivoima doziranja od između oko 10 do 100%, a povoljnije je između oko 10 i 80%, doze

koja se obično daje u režimu monoterapije.

Kada su ova jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli formulisani zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, dobijena kompozicija može da sein vivodaje sisarima, kao što je čovek, radi inhibiranja HCV NS3 proteaze ili radi lečenja ili prevencije HCV virusne infekcije. Takav tretman može takođe da se postigne korišćenjem nekog jedinjenja na osnovu ovog pronalaska, u kombinaciji sa sredstvima koja uključuju, ali bez ograničavanja na, a-, p-, 5-, co-,x-ili y-interferon, ribavirin, amantadin; druge inhibitore HCV NS3 proteaze; inhibitore HCV polimeraze; inhibitore drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, koji uključuju, ali bez ograničavanja na, helikazu, NS2/3 proteazu, ili interno mesto ulaska u ribozom (IRES); ili njihove kombinacije. Dodatna sredstva mogu da se kombinuju sa jedinjenjima na osnovu ovog pronalaska, radi dobijanja jediničnog oblika doziranja. Alternativno, ta dodatna sredstva mogu da se sisaru daju odvojeno, kao deo višekratnog oblika doziranja.

Prema tome, jedno drugo rešenje na osnovu ovog pronalaska, jeste postupak inhibiranja aktivnosti HCV NS3 proteaze, kod sisara, putem davanja jedinjenja formule I.

Prema jednom rešenju koje ima prednost, taj postupak je koristan za smanjenje aktivnosti NS3 proteaze kod sisara inficiranog virusom hepatirisa C.

Ako farmaceutska kompozicija, kao aktivnu komponentu, sadrži samo jedinjenje na osnovu ovog pronalaska, takav postupak dodatno može da obuhvata stupanj davanja, pomenutom sisaru, nekog sredstva, odabranog od imunomodulatorskog sredstva, antivirusnog sredstva, inhibitora HCV NS3 proteaze, inhibitora HCV polimeraze ili inhibitora drugih ciljeva u životnom ciklusu HCV-a, kao što su helikaza, NS2/3 proteaza ili IRES. Takvo dodatno sredstvo može sisaru da se daje, pre, jednovremeno sa, ili posle, davanja kompozicije na osnovu ovog pronalaska.

Ovde prikazano jedinjenje formule I može takođe da bude upotrebljeno kao laboratorijski reagens. Jedinjenje na osnovu ovog pronalaska može takođe da bude upotrebljeno za tretman ili prevenciju virusne kontaminacije materijala, pa zbog toga za smanjenje rizika od virusne infekcije, laboratorijskog ili medicinskog osoblja ili pacijenata, koji dolaze u dodir sa takvim materijalima

(npr. krv, tkivo, hirurški instrumenti i odeća, laboratorijski instrumenti i odeća, aparati i materijali za sakupljanje krvi).

Jedinjenje formule I, prikazano ovde, takođe može da bude upotrebljeno kao istraživački reagens. Jedinjenje formule I takođe može da bude upotrebljeno kao pozitivna kontrola valjanosti supstitutnih (surogatnih) ogleda na bazi ćelija, ili u ogledima virusne replikacije,in vitroiliin vivo.

Dalji detalji o pronalasku ilustrovani su u sledećim primerima, koji treba da se shvate kao ne-limitirajući, u odnosu na priložene patentne zahteve.

Metodologija

Obično, jedinjenja formule I, i njihovi intermedijeri, pripremaju se prema poznatim postupcima, pod reakcionim uslovima za koje se zna da su pogodni za reaktante. Neki od tih postupaka obnarodovani su u WO 00/09543, WO 00/09558 i US Pat. No. 6,323,180, koji su ovde uključeni kao reference.

Jedinjenja formule I, u kojoj R<1>jeste NHS02R<1A>, kao što je ovde definisano, pripremaju se kuplovanjem odgovarajuće kiseline, formule I (ti. R<1>je hidroksi grupa), sa pogodnim sulfonamidom, formule R<1A>S02NH2, u prisustvu sredstva za kuplovanje, pod standardnim uslovima. Mada može da se iskoriti nekoliko uobičajeno korišćenih sredstava za kuplovanje, utvrđeno je da su pogodni TBTU i HATU. Sulfonamidi mogu da se nabave komercijalno ili mogu da se pripreme prema poznatim postupcima.

Sledeće sheme ilustruju dva uobičajena procesa, korišćenjem poznatih postupaka za pripremanje jedinjenja formule I, kada R<1>jeste OH.

PRIMERI

Temperature su date u stepenima Celzijusa. Procentni rastvori prikazuju odnos mase prema zapremini, a odnosi u rastvoru prikazuju odnos zapremine prema zapremini, ukoliko nije drukčije rečeno. Spektri nuklearne magnetne rezonance (NMR) snimani su na spektrometru Bruker 400 MHz; hemijska pomeranja (8) su data u delovima na milion (ppm). Fleš hromatografija na koloni izvođena je na silikagelu (SiC^), na osnovu Still-ove fleš hromatografske tehnike (W.C. Still et al., J. Org. Chem., (1978), 43,2923).

Skraćenice korišćene u primerima obuhvataju:

DBU: l,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-en; DCM: dihlormetan; DIAD: diizopropil-azodikarboksilat; DIEA: diizopropiletilamin; DIPEA: diizopropiletilamin; DMF: N,N-dimetilformamid; DMAP: (dimetilamino)piridin; EtOAc: etilacetat; HATU: 0-(7-azabenzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum-heksafluorofosfat; HPLC: tečna hromatografija pod visokim pritiskom; MS: masena spektrometrija (MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionization - Time of Flight, FAB: Fast Atom Bombard-ment); Me: metil; MeOH: metanol; Ph: fenil; R.T.: sobna temperatura (18 - 22 °C); te/r.-butil ili t-butil: 1,1-dimetiletil; Tbg: ferc.-butilglicin: fera-leucin; TBTU: 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametiluronijum-tetrafluoroborat; TFA: trifluorosirćetna kiselina i THF: tetrahidrofuran.

Sinteza jedinjenja formule (I):

Dipeptidni intermedijer 15 (Shema 2) i 2-karbometoksi-4-hidroksi-7-metoksi-hinolin 9 (Shema 1), sintetizovani su prema postupcima opisanim u WO 00/09543.

Sinteza dipeptida 1

Smeša Boc-hidroksiprolina (50.0 g, 216 mmol), vinil-ACCA metil-estra

(42.25 g, 238 mmol, 1.1 ekv.), TBTU (76.36 g 238 mmol, 1.1 ekv.) i DIPEA (113 ml, 649 mmol, 3 ekv.), u DMF (800 ml), mešana je na sobnoj temperaturi, u atmosferi azota. Posle 3.5 h rastvarač je otparen, a ostatak je ekstrahovan sa EtOAc. Ekstrakt je opran sa hlorovodoničnom kiselinom (10%), zasićenim natrijum-bikarbonatom i rastvorom soli. Onda je organska faza osušena preko magnezijum-sulfata, profiltrirana i uparena, dajući ulje. Sušenjem, tokom noći, pod visokim vakuumom, dobijen je dipeptid 1, kao žuta pena (72.0 g, 94%, čistoća > 95% na osnovu HPLC).

Pripremanje dipe<p>tida 3

Dipeptid 1 (72.0 g, 203 mmol)), trifenilfosfin (63.94 g, 243.8 mmol, 1.2 ekv.) i 4-nitrobenzoeva kiselina (41.08 g, 245.8 mmol, 1.2 ekv.) rastvoreni su u suvomTHF (1.4 lit). Rastvor je uz mešanje ohlađen na 0 °C, pod atmosferom azota. Zatim je tokom 45 min dokapavan dietilazodikarboksilat (38.4 ml, 244 mmol, 1.2 ekv.) pa je ostavljeno da se reakciona smeša zagreje do sobne temperature. Posle 4 h, rastvarač je otparen. Ostatak je podeljen na četiri dela. Svaki od njih je prečišćen hromatografisanjem preko finog silikagela (10-40 \ xm meš, prečnik kolone 12 cm, dužina kolone 16 cm), sa gradijentom od 2:1 heksan/EtOAc do 1:1 heksan/EtOAc, pa do čistog EtOAc. Na taj način, dobijen je Boc-dipeptid estar 2, u obliku bele amorfne čvrste supstance, posle otparavanja rastvarača i sušenja pod visokim vakuumom, 1 h na 70 °C. (108.1 g, kvantitativno-105%). U Boc-dipeptid estar 2 (108 g, 243 mmol) dodat je 4M hidrogenhlorid u dioksanu, dajući bezbojan rastvor. Rastvor je mešan 1 h na sobnoj temperaturi. Rastvarač je otparen, pa je ostatak držan 3 h pod visokim vakuumom, dajući hidrohloridnu so jedinjenja 3, kao amorfnu čvrstu supstancu. Čvrsta supstanca je upotrebljena kao takva.

Sinteza karbamata 4

Pripremanje karbamata 4a:

Na 0 °C, u rastvor terc.-buitlglicin metil-estra (590 mg, 3.25 mmol), u THF (8 ml), dodati su vinilhloroformijat (0.55 ml, 6.47 mmol) i trietilamin (1.15 ml, 8.25 mmol). Ostavljeno je da se temperatura popne do sobne temperature. Rastvor je mešan 16 h. Rastvor je koncentrovan pa je ostatak rastvoren u EtOAc. EtOAc-rastvor je opran sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline (2x), zasićenim rastvorom NaHC03(2x) i rastvorom soli, osušen pa koncentrovan, dajući odgovarajući vinilkarbamat (608 mg), kao bezbojno ulje. Ulje je rastvoreno u DCM (4 ml), ohlađeno na 0 °C, pa su dodati dijodometan (0.15 ml, 1.86 mmol) i dietil-cink (95 ul, 0.93 mmol). Prvo je se pojavila bela, čvrsta supstanca, koja je se vremenom rastvorila (~1 h). Suspenzija/rastvor, mešan je 5 h, na sobnoj temperaturi. Dodat je zasićen rastvor amonijum-hlorida pa je rastvor ekstrahovan sa EtOAc (2x). Organski ekstrakt je osušen (MgSO^ i koncentrovan. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni. Eluiranjem sa heksan : EtOAc, 95:5, dobijen je odgova-rajući metil-estar, kao bezbojno ulje (96 mg, prinos 90%).

Rastvor metil-estra (93 mg, 0.41 mmol) u THF (5 ml), MeOH (1 ml) i vodenom rastvoru LiOH (45 mg, 1.81 mmol) u vodi (2 ml), mešan je 4 h. Rastvor je razblažen sa vodom i ekstrahovan sa EtOAc (2x). Vodeni rastvor je zakiseljen dodavanjem IM HC1, pa je kiseli rastvor ekstrahovan sa EtOAc (2x). Sjedinjeni organski ekstrakti su osušeni (MgSO^, profiltrirani i upareni, dajući željeni karbamat 4a, kao belu, čvrstu supstancu (53 mg, prinos 60%).

Pripremanje karbamata 4b

U posudu u kojoj se nalaze, ugljene kiseline ciklopenitl-estar 2,5-diokso-pirolidin-l-il-estar (9.00 g, 39.6 mmol) i terc.-buitlglicin (6.24 g, 47.5 mmol), dodat je tetrahidrofuran (350 ml), uz stvaranje suspenzije. Uz snažno mešanje dodata je destilisana voda (100 ml). Mala količina čvrste supstance ostala je nerastvorena. Zatim je dodat trietilamin (16.6 ml, 119 mmol) pa je dobijen homogeni rastvor koji je mešan na sobnoj temperaturi. Posle 2.5 h, THF je otparen, vodeni ostatak je razblažen sa vodom (100 ml). Reakciona smeša je učinjena baznom dodavanjem IM NaOH (25 ml, finalno pH > 10). Rastvor je opran sa EtOAc (2 x 200 ml) pa je vodena faza zakiseljena sa IM HC1 (ca. 70 ml, finalno pH < 2). Mutan rastvor je ekstrahovan sa EtOAc (200 + 150 ml). Ekstrakt je osušen (MgSO^Pa uparen, dajući karbamat 4b, kao belu, čvrstu supstancu (8.68 g).

Pripremanje drugih karbamata

Prema gore opisanom postupku, a korišćenjem pogodnih kombinacijaferc-butil-glicina, ciklopenitlglicina ili cikloheksilglicina, i karbonske kiseline, ciklobutil-, ciklopentil- ili cikloheksil-estra, 2.5-diokso-pirolidin-l-il-estra, pripremljeni su karbamati sledećih formula: Pripremanje urea 5

Rastvor, hidrohloridne soli ferc-butilglicin benzil-estra (2.55 g, 9.89 mmol) u THF (20 ml) i piridinu (2.0 ml, 24.73 mmol), ohlađen je na 0 °C. U rashlađeni rastvor dokapan je fenilhloroformijat (1.30 ml, 10.19 mmol). Dobijena suspenzija je mešana 5 min na 0 °C, a zatim 1.5 h na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa 10% limunskom kiselinom (2x), vodom (2x), zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušena (MgS04), profiltrirana pa uparena, dajući sirovo jedinjenje, kao skoro bezbojno ulje (3.73 g; > 100%, pretpostavljeno 9.89 mmol). Sirovi proizvod (1.01 g, 2.97 mmol) je rastvoren u DMSO (6.6 ml) pa je dokapan ciklopentilamin. Reakciona smeša je mešana 45 min na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc. Organska faza je oprana sa 10% limunskom kiselinom (2x), vodom (2x), zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušena (MgS04), profiltrirana pa uparena, dajući sirov proizvod, ciklopentil-urea-Tbg-OBn, kao skoro bezbojno ulje. Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom na koloni sa silikagelom, korišćenjem heksan : EtOAc, 9:1, za uklanjanje manje polarnih nečistoća, pa je onda eluiran sa 7:3, dajući prečišćen proizvod kao gusto, bezbojno ulje (936 mg, 95%). Proizvod estarskog benzil-estra (936 mg, 2.82 mmol) je deprotektovan pod balonom napunjenim vodonikom, na sobnoj temperaturi, u rastvoru apsolutnog etanola (15 ml), mešanjem rastvora sa 10% Pd/C (93.6 mg), tokom 5.5 h. Reakciona smeša je profiltrirana kroz filter od 0.45 um, pa uparena do suva, dajući ureu 5, kao belu, čvrstu supstancu (668.9 mg, 98%).

<X>H NMR (400 MHz, DMSO-de): 5 12.39 (s, IH), 6.09 (d, J = 7.4 Hz, IH), 5.93 (d, J = 9.4 Hz, IH), 3.90 (d, J = 9.4 Hz, IH), 3.87-3.77 (m, IH), 1.84-1.72 (m, 2H), 1.63-1.42 (m, 4H), 1.30-1.19 (m, 2H), 0.89 (s, 9H). M.S. (elektrosprej): 241.0 (M - H)-, 243.0 (M + H)<+>. Homogenost (čistoća), na osnovu HPLC, sa reverznom fazom (0.06% TFA; CH3CN: H20): 99%.

Sinteza tripe<p>tida 6

U DMC suspendovani su, karbamat 4b (6.15 g, 22.5 mmol) i TBTU (7.72 g, 24.7 mmol), pa je suspenzija brzo mešana. Pri sobnoj temperaturi, dodat je DIPEA (3.92 ml, 22.5 mmol), i posle 10 min reakciona smeša je bila skoro homogena. Onda je u reakcionu smešu dodat rastvor dipeptida 3 (10.39 g, 23.6 mmol), u anhidrovanom DCM (100 ml) u kojem je bio DIPEA (4.11 ml, 23.62 mmol). Dobijeni žuti rastvor je mešan 14 h. Onda je rastvarač otparen, dajući žuti sirup, koji je ekstrahovan sa EtOAc (300 + 150 ml), pa opran sa 0.05M HC1 (2 x 200 ml), zasićenim Na2C03(300 ml) i rastvorom soli (150 ml). Sjedinjeni ekstrakti su osušeni preko MgS04i upareni, dajući tripeptid 6, kao bledo-žuti penu (15.68 g, kvantitativno).

Sinteza tri<p>eptida 7:

U THF (200 ml) je rastvoren tripeptid 6 (15.68 g) pa je dodata voda (30 ml). Dobijeni rastvor je ohlađen na 0 °C pa je uz snažno mešanje, tokom 3 min, dodat rastvor litijum-hidroksid monohidrata (1.18 g, 28.12 mmol). Posle 3 h, na 0 °C, višak baze je neutralisan sa IM HC1 (finalno pH ca. 6). pa je THF otparen dajući vodenu suspenziju (žuta guma). Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2 x 200 ml) pa oprana sa zasićenim NaHC03(2 x 300 ml). Sjedinjeni ekstrakti su osušeni preko MgS04i upareni, dajući bledo-žutu penu. Fleš hromatografijom pene, preko silikagela, korišćenjem EtOAc kao eluenta, dobijeno je jedinjenje 7 kao bela, amorfna, čvrsta supstanca (9.77 g, 91%).

Pripremanje tiourea 8

Sinteza tiouree 8a:

U rastvor če/r.-butil-izotiocijanata (5.0 ml, 39.4 mmol), u DCM (200 ml), dodat je ciklopentilamin (4.67 ml, 47.3 mmol), a zatim DIEA, pa je reakciona smeša mešana 2 h na sobnoj temperaturi. Smeša je razblažena sa EtOAc, oprana sa 10% vodenim rastvorom limunske kiseline (2x), zasićenim rastvorom NaHC03(2x), H20 (2x) i rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen preko anhidrovanog MgS04, profiltriran i uparen, dajući N-ferc.-butil-N'-ciklopentil-tioureu, kao čvrstu belu supstancu (3.70 g;

prinos 47%). N-fera-butil-N'-ciklopentil-tiourea (3.70 g) je rastvorena u koncentro-vanoj HC1 (46 ml). Tamno žuti rastvor je blago refluksovan. Posle 40 min,

reakciona smeša je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu pa je zatim i rashlađena u ledu i zaalkalisana na pH 9.5, sa čvrstim, pa zasićenim vodenim rastvorom NaHC03. Proizvod je ekstrahovan sa EtOAc (3x). Sjedinjeni EtOAc ekstrakti su oprani sa H20 (2x) i rastvorom soli (lx). Organski sloj je osušen (MgS04), profiltriran pa koncentrovan, dajući bež čvrstu supstancu (2.46 g sirovo).

Pošto je sirovi materijal rastrljan u heksan/EtOAc, 95/5, posle filtriranja je dobijena N-ciklopentiltiourea 8a, kao čvrsta bela supstanca (2.38, prinos 90%).

mNMR (400 MHz, DMSO-d6): 5 7.58 (bs, IH), 7.19 (bs, IH), 6.76 (bs, IH), 4.34 (bs, IH), 1.92-1.79 (m, 2H), 1.66-1.55 (m, 2H), 1.55-1.30 (m, 4H), MS; es<+>: 144.9

(M + H)<+>, es": 142.8 (M - H)".

Pripremanje tiouree 8b

Prema gore opisanom postupku i korišćenjem komercijalnog ciklobutilamina, umesto ciklopenitlamina, dobijena je tiourea 8b:

Pripremanje tiouree 8c

Prema gore opisanom postupku i korišćenjem komercijalnog cikloheksilamina, umesto ciklopenitlamina, dobijena je tiourea 8c:

Pripremanje tiouree 8d

U rastvor KSCN (4.60 g, 47.33 mmol) u acetonu (35 ml), na 0 °C je dokapan benzoilhlorid (5.0 ml, 43.03 mmol). Mlečno beli rastvor je 1.5 h mešan u ledenom

kupatilu pa je dokapan ciklopropilamin (3.2 ml, 46.0 mmol). Reakciona smeša je mešana 1.5 h na 0 °C, zatim je dodato još ciklopropilamina (0.50 ml, 7.22 mmol) pa je reakciona smeša mešana još 30 min, na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je izlivena u led/H20 (300 ml), mešana je 5 min, pa je bledo-žuta čvrsta supstanca odfiltrirana, oprana nekoliko puta sa H20 i osušena, dajući N-benzoiloksi-N'-ciklopropil-tioureu (6.62 g). Ova tiourea je suspendovana u rastvoru 2M NaOH (50 ml), pa je 15 min zagrevano uz refluks. Rastvor je ohlađen na sobnu temperaturu, zasićen sa čvrstim NaCl pa ekstrahovan sa EtOAc (3x). Sjedinjeni EtOAc-ekstrakti su oprani sa H20 (2x) i rastvorom soli (lx), osušeni (MgS04), profiltrirani i upareni, dajući sirov proizvod, kao prljavo-belu čvrstu supstancu. Čvvrsta supstanca je rastrljana u heksan/EtOAc, 5/5, dajući N-ciklopropil-tioureu 8d, kao belu, čvrstu kristalnu supstancu (2.5 g, prinos 50%).

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-de): 5 7.92 (bs, IH), 7.61 (bs, IH), 7.13 (bs, IH), 2.39 (bs, IH), 0.67-0.63 (m, 2H), 0.51-0.44 (m, 2H).

M.S.: es<+>: 116.9 (M + H)<+>, es": 114.8 (M - H)\

Primer 1

Pripremanje jedinjenja 100

Stupanj 1: Sinteza tripeptida 10:

U tripeptid 1 (1.0 g, 2.09 mmol) rastvoren u THF (35 ml), dodati su hidroksihinolin 9 (729 mg, 3.13 mmol) i trifenilfosfin (1.1 g, 4.2 mmol). Žuta suspenzija je ohlađena

u kupatilu sa ledom pa je dokapan DIAD (821 ul, 4.2 mmol). Rastvor je mešan 30 min pri temperaturi kupatila sa ledom, pa 16 h na sobnoj temperaturi. Rastvor je uparen do suva, ostatak je rastvoren u EtOAc, opran sa zasićenim rastvorom natrijum-bikarbonata (2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući žuto ulje koje

je stajanjem prešlo u talog. Sirova čvrsta supstanca suspendovana je u DCM pa je nerastvoran materijal odfiltriran. Rastvor je koncentrovan pa je ostatak prečišćen fleš hromatografijom pri čemu su sa heksan/EtOAc, 5 : 5, uklonjene manje polarne nečistoće, a sa CHCl3/EtOAc, 80 : 20, još je eluiran sav Ph3P=0. Željeno jedinjenje je eluirano sa CHCl3/EtOAc, 65 : 35, kao bela čvrsta supstanca (1 g, prinos 70%). M.S. (elektrosprej): 693.3 (M - H)-, 695.4 (M + H)<+>, 717.4 (M + Na)<+.>Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 99%.

Stu<p>anj 2: Selektivna mono- hidroliza estra 10:

Tripeptid 10 (1 g, 1.44 mmol) je rastvorena u THF (10 ml) i MeOH (5 ml), dodati su, voda (5 ml) i vodeni rastvor IM NaOH (1.5 ml), pa je rastvor mešan 2 h, na sobnoj temperaturi. Smeša je uparena do suva a zatim ponovo uparavana, zajedno sa MeOH : toluenom (1:1, 4x), toluenom (2x) i dietiletrom (2x), dajući proizvod (bezvodni), kao belu, pahuljičastu, čvrstu supstancu (1.04 g, prinos 100%). M.S. (elektrosprej): 679.3 (M - H)", 681.3 (M + H)<+>, 703.3 (M + Na)<+>. Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 95%.

Stupanj 3: Sinteza diazoketona 12

Natrijumova so 11 (pretpostavlja se 1.44 mmol) rastvorena je u THF (16 ml), dodat je trietilamin (301ul,2.16 mmol), pa je rastvor rashlađen na 0 °C. Dokapan je izobutilhloroformijat (280 ul, 2.16 mmol) pa je bela suspenzija mešana 75 min, na 0 °C, a onda je dodat rastvor diazometana (0.67M u dietiletru; 13 ml, 8.64 mmol). Reakciona smeša je mešana 1 h, na 0 °C, 45 min, na sobnoj temperaturi, pa je uparena, dajući gustu suspenziju. Ta suspenzija je rastvorena u EtOAc i vodi. Organski rastvor je opran sa zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući diazoketonski proizvod, kao čvrstu supstancu boje slonovače (sirovi materijal je upotrebljen u sledećem stupnju; pretpostavljeno 1.44 mmol).

M.S. (elektrosprej): 703.3 (M - H)-, 705.3 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA CH3CN : H20): 91%.

Stupanj 4: Sinteza bromoketona 13:

Na 0 °C, u rastvor diazoketona 12 (1.44 mmol) u THF (24 ml), dokapan je rastvor HBr (1.0 ml) pa je smeša mešana 1 h. Rastvor je razblažen sa EtOAc, opran sa zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući željeni bromoketon, kao čvrstu supstancu boje slonovače (1.1 g,pretpostavljeno 1.44mmol).

M.S. (elektrosprej): 757.3 (M), 759.3 (M + 2).

Stupanj 5: Sinteza tiazolil- tripeptida 14:

U izopropanolu (15 ml), rastvoreni su a-bromoketon 13 (0.40 mmol) i N-ciklopentiltiourea (68.5 mg, 0.48 mmol) pa je žuti rastvor zagrevan 75 min, na 70 °C. Ostavljeno je da se rastvor ohladi na sobnu temperaturu, pa je uparen do suva. Ostatak je rastvoren u EtOAc. Rastvor je opran sa zasićenim NaHC03

(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući proizvod, kao oranž-braon penu. Fleš hromatografijom sa heksan : EtOAc, 7:3, uklonjene su manje polarne nečistoće, a sa 6:4 dobijeno je željeno jedinjenje, kao svetlo-žuta pena (218 mg, 69%). M.S. (elektrosprej): 801.4 (M - H)", 803.4 (M + H)<+>, 825 (M + Na)<+>. Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA CH3CN : H20): 99%.

Stupanj 6: Hidroliza estra 14:

Rastvor metilestra 14 (145 mg, 0.181 mmol) u THF (3 ml), MeOH (1.5 ml) i vodeni rastvor LiOH (75.8 mg, 1.81 mmol) u vodi (1.5 ml), mešani su 18 h. Organski rastvor je koncentrovan, dajući prljavo-belu suspenziju, koja je razblažena sa EtOAc i sa rastvorom soli da bi se dobio pravi rastvor. Dodavanjem IM HC1, podešeno je pH na 6, pa je organski sloj dalje ekstraktovan sa EtOAc (2x). Sjedinjeni organski ekstrakti su oprani sa vodom (2x), rastvorom soli (lx), osušeni (MgS04), profiltrirani i upareni, dajući željeno jedinjenje, kao žutu, čvrstu supstancu (138.2 mg, prinos 97%).

Prevođenje u Na so:

Jedinjenje 100 (138.2 mg, 0.175 mmol) rastvoreno je u MeOH (30 ml) pa je dodat 1 ekvivalent 0.01M NaOH (17.5 ml). Bistar svetlo-žut rastvor je koncentrovan radi uklanjanja MeOH, pa je razblažen sa vodom, zamrznut i liofiliziran, da bi se dobio proizvod (Na so), kao žuta, amorfna, čvrsta supstanca (139 mg, teoretski prinos: 142 mg; relativna molekulska masa Na soli: 810.95). M.S. (elektrosprej): 787.2 (M - H)", 789.2 (M + H)<+>, 811.3 (M + Na)<+->Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 98%.

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-de): ca. 5 :1 smeša rotamera; 8 8.14 (bs, IH), 8.02 (d, J = 9.2 Hz, IH), 7.89 (d, J = 6.7 Hz, IH), 7.49-7.36 (m, 2H), 7.27 (bs, IH),

7.06-6.96 (m, 2H), 6.10-5.90 (m, IH), 5.33 (s, IH), 5.01 (d, J = 16.8 Hz, IH), 4.84 (d, J = 10.6 Hz, IH), 4.79-4.65 (m, IH), 4.47-4.40 (m, IH), 4.30 (d, J = 11.5 Hz, IH), 4.15 (d, J = 8.8 Hz, IH), 4.00-3.85 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.37-2.26 (m, IH), 2.15-1.91 (m, 2H), 1.80-1.23 (m, 18H), 0.96 & 0.86 (2x s, 9H).

Primer 2

Pripremanje jedinjenja 101

Primena istog postupka kao što je opisan u primeru 1, a korišćenjem u stupnju 5, N-ciklobutil-tiouree 8b, umesto N-ciklopenitl-tiouree 8a, dala je jedinjenje 101, kao TFA so:

<X>H NMR (400 MHz, DMSO-d&): ca. 90 :10 smeša rotamera, većina izomernog tipa: 8 8.59 (s, IH), 8.45-8.39 (m, IH), 8.25 (bs, IH), 8.20 (d, J = 9.2 Hz, IH), 7.84 (bs, IH), 7.74 (s, IH), 7.32-7.26 (m, IH), 7.01 (d, J = 8.3 Hz, IH), 5.78-5.66 (m, 2H), 5.20 (dd, J = 17.0, 1.6 Hz, IH), 5.09-5.04 (m, IH), 4.53-4.36 (m, 4H), 4.05-3.92 (m, 2H), 3.97 (s, 3H), 2.63-2.55 (m, IH), 2.44-2.29 (m, 3H), 2.07-1.95 (m, 3H), 1.79-1.23 (m, 12H),0.96 (s, 9H).

M.S. (elektrosprej): 773.4 (M - H)-, 775.4 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 98%.

Primer 3

Pripremanje jedinjenja 102

Primena istog postupka kao što je opisan u primeru 1, a korišćenjem u stupnju 5, N-cikloheksil-tiouree 8c, umesto N-ciklopenitl-tiouree 8a, dala je jedinjenje 102, kao TFA so:

<X>H NMR (400 MHz, DMSO-de): ca.90 :10 smeša rotamera, većina izomernog tipa: 5 8.61 (s, IH), 8.26-8.17 (m, 2H), 8.13-8.04 (m, IH), 7.81 (bs, IH), 7.73 (bs, IH), 7.32-7.24 (m, IH), 7.07 (d, J = 8.2 Hz, IH), 5.78-5.65 (m, 2H), 5.23-5.15 (m, IH), 5.09-5.03 (m, IH), 4.51-4.43 (m, 3H), 4.05-3.77 (m, 3H), 3.97 (s, 3H), 2.64-2.55 (m, IH), 2.38-2.27 (m, IH), 2.05-1.95 (m, 3H), 1.79-1.71 (m, 2H), 1.66-1.19 (m, 16H), 0.96 (s, 9H).

M.S. (elektrosprej): 801.4 (M - H)", 803.4 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 99%.

Primer 4

Pripremanje jedinjenja 103

Jedinjenje 100 (30 mg, 0.038 mmol) je pomešano sa HATU (17 mg, 0.045 mmol) pa je to rastvoreno u anhidrovanom DMF (4 ml). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi pre nego što je, u toku ca. 1 min, dokapan DIPEA (26 ul, 0.15 mmol). Smeša je 60 min mešana na sobnoj temperaturi i analizirana pomoću analitičke HPLC da bi se utvrdilo stvaranje aktiviranog estra. Posle toga, u DMF (1 ml) je dodat rastvor, benzensulfonamida (23 mg, 0.15 mmol), DMAP (17 mg, 0.14 mmol) i DBU (22 jal, 0.15 mmol). Reakciona smeša je mešana 24 h na sobnoj temperaturi pre nego što je izlivena u EtOAc (50 ml), i oprana sa zasićenim rastvorom NaHC03i zasićenim rastvorom soli. Organska faza je osušena preko MgS04, profiltrirana i koncentrovana. Ostatak je rastvoren u DMSO i prečišćen preparativnom HPLC. Liofiliziranjem je dobijen finalni proizvod (17 mg, 48%), kao bledo-žuta amorfna, čvrsta supstanca.

mNMR (400 MHz, DMSO-dg), 5 10.89 (s, IH), 8.84 (s, IH), 8.20 (d, J = 8.8 Hz, IH), 8.18-8.08 (m, 2H), 7.89 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.70 (dd, J = 7.6, 7.6 Hz, 2H), 7.58 (dd, J = 7.7, 7.7 Hz, 2H), 7.28 (bs, IH), 7.11 (d, J = 6.6 Hz, IH), 5.75 (bs, IH), 5.37-5.25 (m, IH), 5.12 (d, J = 17 Hz, IH), 4.92 (d, J = 12 Hz, IH), 4.58-4.42 (m, 3H), 4.24 (bs, IH), 4.05 (d, J = 7.8 Hz, IH), 3.97 (s, 3H), 3.93 (d, J = 7.8 Hz, IH), 2.69-2.61 (m, IH), 2.35-2.21 (m, IH), 2.13-1.98 (m, 3H), 1.78-1.68 (m, 4H), 1.68-1.51 (m, 8H), 1.50-1.41 (m, 4H), 1.29-1.22 (m, IH), 0.99 (s, 9H).

M.S. (elektrosprej): 928.5 (M + H)+, 926.5 (M-H)\

HPLC sa reverznom fazom: Rt = 7.3 minuta (homogenost, = 99%).

Na osnovu sinteznog postupka prikazanog na shemi 2 pripremljena su sledeća jedinjenja:

Primer 5

Stupanj 1: Sinteza dipeptida 16:

Dipeptid 15 (4.0 g, 7.02 mmol) je rastvoren u THF (20 ml) i MeOH (10 ml) pa su dodati voda (10 ml) i vodeni rastvor IM NaOH (1.05 ekv., 7.4 ml). Rastvor je 2.75 h mešan na sobnoj temperaturi. Smeša je uparena do suva. Ostatak je razblažen sa vodom, zamrznut pa liofiliziran, dajući natrijumovu so 16, kao belu, amorfnu, čvrstu supstancu (4.28 g). M.S. (elektrosprej): 554.2 (M - H)-, 556.3 (M + H)<+>, 578.2 (M + Na)<+>. Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 96%.

Stupanj 2: Sinteza dipeptidnog diazoketona 17:

Natrijumova so 16 (pretpostavlja se 7.02 mmol) rastvorena je u THF (78 ml); dodat je trietilamin (1.37 ml, 9.83 mmol), pa je rastvor rashlađen na 0 °C.

Dokapan je izobutilhloroformijat (1.28 ml, 9.83 mmol) pa je bela suspenzija mešana 2 h, na 0 °C, a onda je dodat rastvor diazometana (0.67M u dietiletru; 63 ml, 42.13 mmol). Reakciona smeša je mešana 1 h, na 0 °C, 1.25 h, na sobnoj temperaturi, pa je uparena, dajući gustu suspenziju. Ta suspenzija je rastvorena u EtOAc i vodi. Organski rastvor je opran sa zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući diazoketon 17, kao čvrstu supstancu bež boje (sirovi materijal je upotrebljen u sledećem stupnju; pretpostavljeno 7.02 mmol).

M.S. (elektrosprej): 578.2 (M - H)-, 580.3 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN): H20): 90%.

Stu<p>anj 3: Sinteza dipeptidnog bromoketona 18:

Na 0 °C, u rastvor diazoketona (pretpostavlja se 1.44 mmol) u THF (116 ml), dokapan je 48% vodeni rastvor HBr (5.1 ml) pa je smeša mešana 2 h. Rastvor je razblažen sa EtOAc, opran sa zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući željeni bromoketon, kao čvrstu supstancu bež boje (4.25 g, 6.72 mmol).

M.S. (elektrosprej): 632 (M), 634.2 (M + 2).

Stupanj 4: Sinteza dipeptida 19:

U izopropanolu (20 ml), rastvoreni su a-bromoketon 18 (512 mg, 0.81 mmol) i N-ciklopentiltiourea (128.4 mg, 0.89 mmol). Dobijeni žuti rastvor je zagrevan 1.5 h, na 70 °C. Ostavljeno je da se rastvor ohladi na sobnu temperaturu, pa je uparen do suva. Ostatak je razblažen sa EtOAc. EtOAc-rastvor je opran sa zasićenim NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen, dajući proizvod, kao oranž-braon penu. Fleš hromatografijom sa heksan : EtOAc, 7:3, uklonjene su manje polarne nečistoće, a sa 6:4 dobijeno je željeno jedinjenje, kao svetlo-žuta čvrsta supstanca (411.5 mg, 75%).

M.S. (elektrosprej): 676.3 (M-H)", 678.3 (M + H)+.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN) : H20): 99%.

Stupanj 5: Sinteza tripeptida 20:

U 4M HCl/dioksan (3 ml) rastvoren je Boc-dipeptid (32.6 g, 0.048 mmol) pa je mešano na sobnoj temperaturi. Posle 2 h, reakciona smeša je uparena do suva. Tako dobijena HC1 so je prljavo-bela, čvrsta supstanca. HC1 so je 30 min držana pod visokim vakuumom. U rastvor HC1 soli, u DCM (2 ml) i DIEA (33 ul, 0.192 mmol), dodata je urea 5 (13.96 mg, 0.058 mmol) pa zatim sredstvo za kuplovanje HATU (21.90 mg, 0.058 mmol). Reakciona smeša je mešana 3 h, na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa EtOAc, opran sa zasićenim

NaHC03(2x), vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušena (MgS04), profiltriran i uparen, dajući sirov proizvod, kao gusto oranž ulje (pretpostavljeno 0.048 mmol).

M.S. (elektrosprej): 800.4 (M - H)", 802.4 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 95%.

Stupanj 6: Hidroliza tripeptid metil- estra 20:

Rastvor metilestra 20 (77.80 mg, 0.097 mmol) u THF (2 ml), MeOH (1 ml) i vodeni rastvor LiOH (40.7 mg, 0.97 mmol) u vodi (1 ml), mešani su 16 h. Organski rastvor je koncentrovan, dajući prljavo-belu suspenziju. Sirovi materijal je prečišćen pomoću preparativne HPLC ( ?MC Combiscreen ODS-AQ, 50 x 20 mm ID S-5 mikrona, 120A;X= 220 nm) korišćenjem linearnog gradijenta i 0.06% TFA CH3CN/H20. Cviste frakcije su sjedinjene, koncentrovane pa prevedene u natrij umovu so

Prevođenje u Na so:

Koncentrovane frakcije su razblažene sa EtOAc i sa nekoliko mililitara rastvora soli (bazifikovano na pH~13, sa 5M NaOH, a zatim neutralisano na pH 5.5 - 6.0, sa IM HC1). Proizvod je ekstraktovan sa EtOAc (3x), opran vodom (2x) i rastvorom soli (lx), osušen (MgS04), profiltriran i uparen do suva, dajući neutralan proizvod, kao žutu, čvrstu supstancu (52.7 mg, 70%). Neutralni proizvod je (49.4 mg, 0.0627 mmol) je rastvoren u MeOH (10 ml) pa je dodat 1 ekvivalent 0.01M NaOH (6.27 ml). Bistar žut rastvor je koncentrovan radi uklanjanja MeOH, razblažen sa vodom, zamrznut pa liofiliziran, dajući proizvod (Na so), kao žutu amorfnu, čvrstu supstancu (50.8 mg; teoretski prinos: 50.8 mg; relativna molekulska masa Na soli: 809.75).

<*>H NMR (400 MHz, DMSO-dg): ca. 8 :1 smeša rotamera; 5 8.20 (bs, IH), 7.96 (d, J = 8.8 Hz, IH), 7.86 (d, J = 5.7 Hz, IH), 7.51-7.47 (m, 2H), 7.26 (s, IH), 6.97 (d, J = 8.6 Hz, IH), 6.19-6.02 (m, IH), 5.33 (bs, IH), 4.99 (d, J= 16.8 Hz, IH), 4.77 (d, J = 10.0 Hz, IH), 4.52-4.41 (m, 2H), 4.34 (d, J = 11.0 Hz, IH), 4.04-3.96

(m, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.79-3.68 (m, IH), 3.68-3.15 (ispod pika vode, 2H) 2.45-2.36 (m, IH), 2.05-1.92 (m, 2H), 1.82-1.35 (m, 16H), 1.35-1.12 (m, 2H) 0.91 & 0.84 (2x s, 9H).

M.S. (elektrosprej): 786.4 (M - H)-, 788.3 (M + H)<+>, 810 (M + Na)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 99%.

Primer 6

Jedinjenje 104:

Upotrebom istog postupka kao što je opisan u primeru 6, a korišćenjem u stupnju 5, ciklobutil-karbamata te/r.-butilglicina, umesto uree 5, i prečišćavanjem sirove karboksilne kiseline, posle stupnja 6, preparativnom HPLC, dobijeno je jedinjenje navedeno u naslovu, kao TFA so:

<!>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): ca. 7 :1 smeša rotamera; 8 8.20 (bs, IH), 8.02 (d, J = 9.0 Hz, IH), 7.88 (d, J = 6.5 Hz, IH), 7.45 (s, IH), 7.40 (s, IH), 7.28 (d, J = 2.3 Hz, IH), 7.16-7.08 (m, IH), 7.07-7.00 (m, IH), 6.10-5.95 (m, IH), 5.32 (bs, IH), 5.00 (d, J = 17.2 Hz, IH), 4.82 (d, J = 11.4 Hz, IH), 4.64-4.52 (m, IH), 4.48-4.41 (m, IH), 4.29 (d, J = 11.7 Hz, IH), 4.12 (d, J = 8.6 Hz, IH), 3.97-3.85 (m, 2H), 3.91 (s, IH) 2.36-2.27 (m, IH), 2.18-2.04 (m, 2H), 2.03-1.81 (m, 6H), 1.77-1.43 (m, 9H), 1.41-1.34 (m, IH) 0.96 & 0.85 (2xs, 9H).

M.S. (elektrosprej): 773.3 (M - H)-, 775.4 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 99%.

Primer 7

Jedinjenje 105:

Upotrebom istog postupka kao što je opisan u primeru 6, a korišćenjem u stupnju 5, cikloheksil-karbamata te/r.-butilglicina, umesto uree 5, dobijeno je jedinjenje navedeno u naslovu, kao natrijumova so:

<!>H NMR (400 MHz, DMSO-da): ca. 5 :1 smeša rotamera; 8 8.29 (bs, IH), 8.02 (d, J = 9.0 Hz, IH), 7.89 (d, J = 6.5 Hz, IH), 7.45 (s, IH), 7.40 (s, IH), 7.27 (d, J = 2.2 Hz, IH), 7.05 (d, J = 8.6 Hz, IH), 7.00 (dd, J = 2.0, 9.0 Hz, IH), 5.89 (bs, IH), 5.34 (s, IH), 5.08 (d, J = 17.0 Hz, IH), 4.91 (d, J = 9.4 Hz, IH), 4.43 (dd, J = 8.4,16.8 Hz, IH), 4.36-4.24 (m, IH), 4.14 (d, J = 8.6 Hz, IH), 4.00-3.86 (m, 3H), 3.89 (m, 3H), 2.35-2.23 (m, IH), 2.04-1.91 (m, 5H), 1.79-1.41 (m, 10H), 1.39-1.08 (m, 7H) 0.97 & 0.86 (2x s, 9H).

M.S. (elektrosprej): 801.4 (M - H)", 803.4 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN): H20): 98%.

Primer 8

Jedinjenje 106:

Upotrebom istog postupka kao što je opisan u primeru 6, a korišćenjem u stupnju 5, ciklopentil-karbamata cikloheksil-glicina, umesto uree 5, dobijeno je jedinjenje navedeno u naslovu, kao natrijumova so:<*>H NMR (400 MHz, DMSO-da): ca. 1: 4 smeša rotamera; 8 8.22 & 8.04 (2x s, IH), 8.00 (d, J = 9.2 Hz, IH), 7.91 (d, J = 6.5 Hz, IH), 7.46 (s, IH), 7.41 (s, IH), 7.27

(d, J = 2.4 Hz, IH), 7.20 (d, J = 8.4 Hz, IH), 7.01 (dd, J = 2.4, 9.0 Hz, IH), 6.09-5.98 (m, IH), 5.34 (s, IH), 4.98 (dd, J = 1.6,17.4 Hz, IH), 4.80 (d, J = 11.9 Hz, IH), 4.73-4.67 (m, IH), 4.43-4.31 (m, 2H), 4.05-3.95 (m, 2H), 3.95-3.84 (m, IH), 3.90 (s, 3H), 2.38-2.29 (m, IH), 2.03-1.92 (m, 2H), 1.83-1.21 (m, 24H), 1.21-0.83 (m, 5H).

M.S. (elektrosprej): 813.4 (M - H)-, 815.4 (M + H)<+>.

Homogenost, na osnovu HPLC sa reverz. fazom (0.06% TFA; CH3CN : H20): 99%.

Primer 9

Jedinjenje 107:

Upotrebom istog postupka kao što je opisan u primeru 6, a korišćenjem u stupnju 5, ciklopentil-karbamata ciklopentil-glicina, umesto uree 5, dobijeno je jedinjenje navedeno u naslovu, koje je prevedeno u svoju odgovarajuću Na so.

Primer 10

Ogled aktivnosti NS3- NS4A proteaze

Ogled enzimske aktivnosti, korišćen za ocenu jedinjenja na osnovu ovog pronalaska, opisan je u WO 00/09543 i WO 00/59929.

PrimerII

Ogled sa replikaciiom RNK HCV- a u ćelijama

Kultura ćelija

Huh7 ćelije, koje stabilno zadržavaju subgenomski replikon HCV-a, pripremljene su kao što je ranije opisano (Lohman et al., 1999. Science 285:110-113) i označene kao S22.3 ćelijska linija. S22.3 ćelije su gajene u modifikovanom Dulbekovom medijumu (DMEM) u koji je dodavano 10% seruma fetusa govečeta (FBS-a) i 1 mg/ml neomicina (standardni medijum). Tokom ogleda, korišćen je DMEM medijum sa 10% FBS-a, koji je sadržavao i 0.5% DMSO i u kome nije bilo neomicina (medijum za oglede). Na 16 h pre dodavanja jedinjenja, S22.3 ćelije su tripsinizovane i razblažene na 50 000 ćelija/ml u standardnom medijumu. Po 200 ul (10 000 ćelija) je prebačeno u svaki bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta. Ploča je zatim inkubirana na 37 °C sa 5% C02do sledećeg dana.

Pripremanje jedinjenja koje se testira

U 2 ml medijuma za oglede je dodavano 10 ul jedinjenja koje se testira (u 100% DMSO-u), da bi finalna koncentracija DMSO-a bila 0.5%, pa je rastvor sonifikovan 15 minuta i filtriran kroz Millipore filter jedinice od 0.22 um. U red A polipropilenske mikrotitar ploče sa dubokim bunarićima prebacivano je 900 ul ovog rastvora. Redovi od B do H, koji su sadržavali alikvote od po 400 ul medijuma za oglede (sa po 0.5% DMSO-a), korišćeni su za pripremanje serijskih razblaženja (1/2) prebacivanjem po 400 ul rastvora iz reda u red (jedinjenje nije bilo prisutno u redu H).

Primena jedinjenja koje se testira na ćelije

Iz mikrotitar ploče sa 96 mesta, u kojima su bile S22.3 ćelije, usisan je medijum, kulture ćelija. Po 175 ul medijuma za oglede, sa odgovarajućim razblaženjem jedinjenja koje se testira, prebacivano je, iz svakog bunarića mikrotitar ploče za pripremanje razblaženja, u odgovarajući bunarić ploče sa kulturom ćelija (red H je korišćen kao "kontrola bez inhibicije"). Ploča sa kulturom ćelija je inkubirana 72 h na 37 °C sa 5% CO2.

Ekstrakcija totalne ćelijske RNK

Nakon perioda inkubacije od 72 h, totalna ćelijska RNK je ekstrahovana iz S22.3 ćelija sa mikrotitar ploče od 96 mesta, koristeći RNeasv 96 komercijalni paket (Qiagen®, RNeasv priručnik. 1999.). Ukratko, medijum za oglede je kompletno uklonjen sa ćelija, pa je 100 ul RLTpufera (Qiagen®), koji je sadržavao 143 mM p-merkaptoetanola, dodavano u svaki bunarić mikrotitar ploče od 96 mesta, sa kulturom ćelija. Mikrotitar ploča je blago treskana 20 sekundi. Potom je dodavano po 100 ul 70% etanola u svaki bunarić mikrotitar ploče, i rastvor je mešan pipetiranjem. Lizat je sakupljan i prenošen u bunariće RNeasv 96 (Qiagen®) mikrotitar ploče koja je bila postavljena iznad specijalnog Qiagen® četvrtastog bloka za mikrotitar ploče. RNeasv 96 mikrotitar ploča je zatim zalepljena adhezivnom folijom, pa je blok sa RNeasv 96 mikrotitar pločom postavljan u odgovarajući držač i stavljan u korpu rotora centrifuge 4K15C. Uzorak je centrifugiran 4 min na sobnoj temperaturi pri 6000 o/min (oko 5600 x g). Folija je potom uklanjana sa ploče i u svaki bunarić RNeasv 96 ploče je dodavano po 0.8 ml RW1 pufera (Qiagen® RNeasv 96 paket). RNeasv 96 ploča je zalepljena sa novim parčetom folije i centirfugirana 4 min na sobnoj temperaturi pri 6000 o/min. RNeasv 96 ploča je zatim postavljana na drugi, čisti četvrtasti blok za mikroploče, i nakon uklanjanja folije, u svaki bunarić RNeasv 96 mikrotitar ploče je sipano po 0.8 ml RPE pufera (Qiagen® RNeasv 96 paket). RNeasv 96 ploča je opet zalepljena sa novim parčetom folije i centrifugirana 4 min na sobnoj temperaturi pri 6000 o/min. Folija je uklanjana i drugih 0.8 ml RPE pufera (Qiagen® RNeasv 96 paket) je dodavano u svaki bunarić RNeasv 96 mikrotitar ploče. RNeasv 96 mikrotitar ploča je ponovo zalepljena sa novim parčetom folije i centrifugirana 10 min na sobnoj temperaturi sa 6000 o/min. Nakon ukljanjanja folije, RNeasv 96 mikrotitar ploča je postavljana na vrh držača koji sadrži mikrotube za skupljanje uzoraka, zapremine 1.2 ml. RNK je eluirana dodavanjem po 50 jal vode oslobođene od RNaze u svaki bunarić, nakon čega je ploča zalepljena sa novim parčetom adhezivne folije i inkubirana na sobnoj tempe-raturi 1 min. Ploča je centrifugirana 4 minuta na sobnoj temperaturi sa 6000 o/min. Stupanj eluiranja je ponavljan dodavanjem još po jedne zapremine od 50 jal vode oslobođene od RNaze. Mikrotube sa totalnom ćelijskom RNK čuvane su na-70 °C.

Kvantifikovanje totalne ćelijske RNK

RNK je kvantifikovana na STORM® sistemu (Molecular Dvnamics®) korišćenjem RiboGreen® RNK komercijalnog paketa za kvantifikovanje (Molecular Probes®). Ukratko, reagens RiboGreen je razblaživan 200 puta u TE puferu (lOmM Tris-HCl pH 7.5, lmM EDTA). Obično, 50 jal reagensa je razblaživano u 10 ml TE pufera. Ribozomska RNK za standardnu krivu je razblaživana u TE puferu do koncentracije od 2 jag/ml, pa su zatim određene količine (100, 50, 40, 20,10, 5, 2 i 0 jal) rastvora ribozomske RNK prebacivane u novu mikrotitar ploču sa 96 mesta (COSTAR # 3997) i zapremina je dopunjavana sa TE puferom do 100 pl. Obično, kolona 1 mikrotitar ploče sa 96 mesta je korišćena za standardnu krivu, dok su preostali bunarići upotrebljavani za kvantifikovanje RNK u uzorcima. Po 10 pl svakog uzorka čija je RNK kvantifikovana, prebacivano je u odgovarajući bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta, pa je dodavano po 90 ul TE pufera. Potom je u svaki bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta dodavana po jedna zapremina (100 pl) razbaženog RiboGreen reagensa i ploča je inkubirana 2 do 5 minuta na sobnoj temperaturi, zaštićena od svetlosti (10 pl uzorka RNK u krajnjoj zapremini od 200 pl daje razblaženje od 20 x). Intenzitet fluorescencije u svakom bunariću meren je na STORM® sistemu (Molecular Dvnamics®). Standardna kriva je pravljena na osnovu poznatih količina ribozomske RNK i dobijenih intenziteta fluorescencije. Koncentracija RNK u eksperimetnalnim uzorcima je određivana na osnovu standardne krive i korigovana za razblaženje od 20 x.

Reaeensi i materiial:

Real-Time RT-PCR

Real-Time RT-PCR je izvođen na ABI Prism 7700 Sequence detekcionom sistemu korišćenjem TaqMan EZ RT-PCR komercijalnog paketa (Perkin-Elmer Applied Biosvstems®). RT-PCR je podešen za kvantifikovanje 5' IRES-a RNK HCV-a korišćenjem TaqMan tehnologije (Roche Molecular Diagnostics Svstems) slično tehnici koja je ranije opisana (Martell et al., 1999. J. Clin. Microbiol. 37: 327-332). Sistem koristi 5'-3' nukleolitičku aktivnost AmpliTaq DNK polimeraze. Ukratko, metoda koristi duplo obeleženu fluorogenu hibridizacionu probu (PUTR probu) koja se specifično sparuje sa matricom između PCR prajmera (prajmeri 8125 i 7028). 5' kraj probe sadrži fluorescentni molekul "reporter" (6-karboksifluorescein [FAM]), dok 3' kraj sadrži "prigušivač" fluorescencije (6-karboksitetrametilrodamin [TAMRA]). Emisioni spektar FAM reportera je suprimiran prigušivačem fluorescencije na intaktnoj hibridizacionoj probi. Nukleazno razlaganje hibridizacione probe oslobađa reporter, dovodeći do pojačane emisije fluorescencije. ABI Prism 7700 Sequence detektor meri kontinulano porast u emisiji fluorescencije tokom PCR umnožavanja, tako da je proizvod umnožavanja direktno propocionalan signalu. Kriva umnožavanja je analizirana u ranim fazama reakcije, u tački koja predstavlja logaritamsku fazu nagomilavanja proizvoda. Tačka koja predstavlja definisan prag detekcije porasta u fluorescentnom signalu samog aparata, a vezana za eksponencijalni rast produkta PCR-a, definisana je kao prag ciklusa (Ć7).Cy vred-nostisu obrnuto proporcionalne količini početne RNK HCV-a; tako, pri identičnim ulovima PCR-a, veća početna koncentracija RNK HCV-a daje nižuCtvrednost. Standardna kriva je određivana automatski pomoću ABI Prism 7700 detekcionog sistema na osnovu grafičkog prikaza zavisnotiCtvrednosti i svakog standarnog razblaženja poznate koncentracije RNK HCV-a.

Referentni uzorci za standardnu krivu su bili prisutni na svakoj RT-PCR ploči. RNK HCV replikona je sintetizovana (T7 transkripcijom)in vitro,prečišćena i kvantifikovana na OD260- Uzimajući u obzir da je 1 pg te RNK = 2.15 x 10<11>kopija RNK, razblaženja su pravljena tako da se dobije IO8, IO7, IO<6>, IO<5>, IO<4>, IO<3>, ili IO<2>kopija genomske RNK/5 pl rastvora. Totalna ćelijska RNK Huh-7 ćelija je takođe uključena u svako razblaženje (50 ng/5 pl). Po 5 pl svakog referentnog standarda (replikon HCV-a + Huh-7 RNK) je kombinovano sa po 45 pl smeše reagensa, i korišćeno u reakciji Real-Time RT-PCR-a.

Reakcija Real-Time RT-PCR-a je podešavana za eksperimentalne uzorke, prečišćene na RNeasv mikrotitar pločama sa 96 mesta, kombinovanjem po 5 pl svakog uzorka totalne ćelijske RNK sa po 45 pl smeše reagenasa.

Sekvenca uzvodnog prajmera (ID SEKVENCE 1): 5' - ACG CAG AAA GCG TCT AGC

CATGGCGTTAGT-3'

Sekvenca nizvodnog prajmera (ID SEKVENCE BR. 2): 5' - TCC CGG GGC ACT CGC

AAG CAC CCT ATC AGG - 3'

Napomena: Ovi prajmeri umnožavaju 256 nukleotida dug region, prisutan unutar 5' netranslatirajućeg regiona HCV-a

Sekvenca PUTR probe (ID SEKVENCE BR. 3): 6FAM - TGG TCT GCG GAA CCG

GTG AGT ACA CC - TAMRA

Kontrole bez matrice ( NTC) : Na svakoj mikrotitar ploči, 4 bunarića su korišćena kao "NTC". Za ove kontrole, umesto RNK, u bunarić je dodavano po 5 pl vode.

Termalni profil PCR-a:

Nakon završetka RT-PCR reakcije, a da bi se podaci analizirali, neophodno je odrediti prag fluorescentnog signala za PCR ploču, pa je standardna kriva konstruisana crtanjem grafika zavisnosti Ct vrednosti i broja RNK kopija koji je korišćen u svakoj referentnoj reakciji. Ct vrednosti dobijene za uzorke koji su korišćeni u ogledu, upotrebljavane su da se interpolira broj kopija RNK, oslanjajući se na standardnu krivu.

Konačno, broj RNK kopija je normalizovan (na osnovu RiboGreen kvantifikovanja totalne RNK ekstrahovane iz bunarića sa kulturom ćelija) i izražen kao genomski ekvivalenti/pg totalne RNK [g.e./pg].

Broj RNK kopija [g.e./pg] u svakom bunariću ploče sa ćelijskom kulturom bio je merilo količine RNK HCV-a koja se umnožava u prisustvu različitih koncentracija inhibitora. Procenat inhibicije je izračunavan sledećom jednačinom:

Podešavanje ne-linearne krive sa Hill-ovim modelom je korišćeno za podatke koji se odnose na relaciju inhibicija-koncentracija, a efikasna koncentracija od 50%

(EC50) je izračunavana korišćenjem SAS softvera (Statistical Software Svstem; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.).

Kada su jedinjenja, na osnovu ovog pronalaska, procenjivana prethodnim enzimskim ogledima i ogledima na bazi ćelije, nađeno je da su jedinjenja sa velikom aktivnošću.

Tačnije, jedinjenja imaju IC5o-vrednosti ispod 0.1 pM u ogledima aktivnosti NS3-NS4A proteaze, a EC5o-vrednosti ispod 0.5 pM u ogledima sa replikacijom HCV RNK u ćeliji.

Primer 12

Ogledi specifičnosti

Ogledi specifičnosti, korišćeni za određivanje selektivnosti jedinjenja na osnovu ovog pronalaska, opisani su u WO 00/09543.

Kada su jedinjenja procenjivana u specifičnim ogledima, nađeno je da su jedinjenja formule I selektivna u onim gde ona ne pokazuju značajnu inhibiciju u ogledima sa humanom leukocitnom elastazom i katepsinom B.

Primer 13

Farmakokinetičke osobine

Jedinjenja, na osnovu ovog pronalaska, takođe pokazuju dobre farmakokinetičke osobine, kao što su značajni nivoi u plazmi pacova, 1 i 2 h nakon oralne doze od 5 mg/kg.

Tačnije, sledeći ogled, praćenje oralne apsorpcijein vivo,korišćen je da bi se odredili nivoi u plazmi za jedinjenja koja se testiraju, kod pacova, nakon oralnog davanja:

Materijali i postupci:

1. Postupci korišćeni za sakupljanje jedinjenja ("selekcija kasete"): Odabiranje jedinjenja koja su sakupljana u "kasetu" zasniva se na njihovoj strukturnoj sličnosti i fizičko-hemijskim svojstvima. Razvijen je postupak ekstrakcije sa čvrstom fazom, primenljiv na sva odabrana jedinjenja. Zasniva se na početnom testiranju, u kojem je svako jedinjenje ubrizgavano u plazmu pacova i potom analizirano pomoću HPLC ili HPLC/MS, pri koncentraciji od 0.5 pM, a kao osnova za sakupljanje 3-4 jedinjenja u jednu "kasetu" računati su, vreme zadržavanja, jonska masa i mogućnost razdvajanja jedinjenja HPLC ili HPLC/MS postupkom.

2. Oralni prenosilac i pripremanje jedinjenja:

Svaka "kaseta" sadrži 3-4 jedinjenja, sa 5 ili 4 mg/kg od svakog jedinjenja. Kasete su pripremane kao oralna suspenzija u 0.5% vodenom rastvoru metilceluloze i 0.3% polioksietilen (20) solbiton monooleata (Tween-80). Dozirana zapremina je bilo 10 mg/kg, davana oralno.

3. Doziranje i uzorkovanje plazme:

Mužjaci pacova Sprague Dawley, tokom noći su ostavljani bez hrane u pojedinačnim kavezima, uz pristup 10% vodenom rastvoru dekstroze. Po dva pacova su dobijala svaku od "kaseta". Uzorci plazme (~1 ml) uzimani su od 2 pacova, 1 i 2 h posle davanja, i sjedinjavani su za ekstrakciju i analizu.

4. Ekstrakcija jedinjenja i analiza:

Iz svake kasete, uzorci plazme posle 1 i 2 h, plazme bez dodataka, plazme sa dodatkom od 0.5 pM svakog od jedinjenja, ekstrahovani su postupkom ekstrakcije sa čvrstom fazom. Uzorci su radi upoređivanja analizirani pomoću HPLC i HPLC/MS. Koncentracije plazme su određivane na osnovu pojedinačne koncentracije 0.5 pM standarda.

U ogledima prethodnog proveravanja jedinjenja iz primera 1 do 9, na osnovu ovog pronalaska, nađeno je da se ona javljaju u značajnim nivoima u plazmi, u intervalima od 1 h i 2 h posle oralnog davanja, sa prosečnim nivoima u krvnoj plazmi od 1.23 pM, odnosno 1.16 pM. Ova potvrda značajne oralne apsorpcijein vivo,tripeptidnih jedinjenja, na osnovu ovog pronalaska, jeste neočekivana, s obzirom na malu oralnu apsorpciju koja se obično pripisuje toj klasi peptida. Laka (brza) oralna apsorpcija, čini da su takva jedinjenja korisna za lečenje HCV infekcije.

U sledećoj tabeli navedena su reprezentativna jedinjenja na osnovu pronalaska. Dalje, u vezi sa ovim pronalaskom, svako jedinjenje ima IC50ispod 0.1 pM u ogledu aktivnosti NS3-NS4A proteaze, a EC50ispod 0.5 pM u ogledu sa replikacijom HCV RNK u ćelijama.

Claims (32)

1. Jedinjenje formule (I): u kojoj R<1>jeste hidroksi ili NHS02R<1A>grupa, pri čemu Ru jeste (C^-alkil, (C3_7)-cikloalkil ili {(C^-aM-CCs^-cikloalkil) grupa, koje su sve, u datom slučaju, supstituisane sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, O-CC^-alkil, amido, amino ili fenil grupe, ili R^ jeste Cg- ili Cio-aril grupa, koja je u datom slučaju, supstituisana sa 1 do 3 halogeno, cijano, nitro, (C^-alkil, O-CC^-alkil, amido, amino ili fenil grupe ; R<2>je (C^-cikloalkil grupa; R<3>je t-butil ili (C5.6-cikloalkil, a R<4>je (C^-cikloalkil grupa; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, NHS02Me, NHSO-2-ciklopropil ili NHS02Ph grupa.

3. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 2, u kojoj R<1>jeste NHSO^ciklopropil ili NHS02Ph grupa.

4. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 3, u kojoj R<1>jeste hidroksi grupa.

5. Jedinjenje formule I, prema nekom od zahteva 1 do 4, u kojoj R<2>jeste ciklopentil ili cikloheksil grupa.

6. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 5, u kojoj R<2>jeste ciklopentil grupa.

7. Jedinjenje formule I, prema nekom od zahteva 1 do 6, u kojoj R<3>jeste t-butil ili cikloheksil grupa.

8. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 7, u kojoj R<3>jeste t-butil grupa.

9. Jedinjenje formule I, prema nekom od zahteva 1 do 8, u kojoj R<4>jeste ciklobutil ili ciklopentil grupa.

10. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 9, u kojoj R<4>jeste ciklopentil grupa.

11. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, svako R<2>i R<4>je ciklopentil, a R<3>je t-butil grupa.

12. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je ciklobutil, R<3>je t-butil, a R<4>je ciklopentil grupa.

13. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je cikloheksil, R3 je t-butil, a R4 je ciklopentil grupa.

14. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste NHSC^Ph, svako R<2>i R4 je ciklopentil, a R3 je t-butil grupa.

15. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je ciklopentil, R<3>je t-butil, a R4 je ciklobutil grupa.

16. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, R<2>je ciklopentil, R<3>je t-butil a R<4>je cikloheksil grupa.

17. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, svako R<2>i R<4>je ciklopentil, a R<3>je cikloheksil grupa.

18. Jedinjenje formule I, prema zahtevu 1, u kojoj R<1>jeste hidroksi, a svako R<2>, R<3>i R<4>je ciklopentil grupa.

19. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži anti-hepatitis C virusno efikasnu količinu jedinjenja formule I, prema nekom od zahteva 1 do 18, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili pomoćnim sredstvom.

20. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 19, koja sadrži još i terapeutski efikasnu količinu jednog ili više drugih anti-HCV sredstava.

21. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 20, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od: a-interferona ili PEG-a-interferona.

22. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 20 ili 21, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste ribavirin.

23. Farmaceutska kompozicija, prema zahtevu 20,21 ili 22, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od inhibitora: helikaze, NS2/3 proteaze i internog mesta ulaska u ribozom (IRES).

24. Postupak za lečenje ili prevenciju virusne hepatitis C infekcije, kod sisara, putem davanja sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine jedinjenja formule I, prema nekom od zahteva 1 do 18, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

25. Postupak za lečenje ili prevenciju virusne hepatitis C infekcije, kod sisara, putem davanja sisaru anti-hepatitis C virusno efikasne količine kompozicije, prema nekom od zahteva 19 do 23.

26. Postupak za lečenje ili prevenciju virusne hepatitis C infekcije, kod sisara, tako što mu se daje anti-hepatitis C virusno efikasna količina jedinjenja formule I, prema nekom od zahteva 1 do 18, ili njegova terapeutski prihvatljiva so, u kombinaciji sa jednim ili sa više drugih anti-HCV sredstava.

27. Postupak, prema zahtevu 26, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od: a-interferona ili PEG-a-interferona.

28. Postupak, prema zahtevu 26 ili 27, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste ribavirin.

29. Postupak, prema zahtevu 26, 27 ili 28, pri čemu je pomenuto drugo anti-HCV sredstvo odabrano od inhibitora: helikaze, NS2/3 proteaze i internog mesta ulaska u ribozom (IRES).

30. Upotreba jedinjenja formule I, prema nekom od zahteva 1 do 18, za pripremanje leka za lečenje ili prevenciju virusne hepatitis C infekcije.

31. Farmaceutska kompozicija, prema nekom od zahteva 20, 21 ili 22, pri čemu pomenuto drugo anti-HCV sredstvo jeste inhibitor HCV polimeraze.

32. Postupak, prema zahtevu 26, 27 ili 28, pri čemu drugo pomenuto anti-HCV sredstvo jeste inhibitor HCV polimeraze.