EA018010B1 - Способы и нуклеиновые кислоты для анализов нарушений клеточной пролиферации - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способам, нуклеиновым кислотам и наборам для обнаружения нарушений клеточной пролиферации. Изобретение раскрывает геномные последовательности, профили метилирования которых применимы для улучшенного обнаружения указанного нарушения, посредством чего обеспечивается более эффективная диагностика и лечение пациентов.

Description

Настоящее изобретение относится к последовательностям геномной ДНК, которые имеют измененные параметры экспрессии при патологических состояниях по сравнению с нормой. Конкретные варианты осуществления относятся к способам, нуклеиновым кислотам, нуклеиновым кислотам-чипам и наборам, которые могут использоваться для обнаружения или диагностики нарушений клеточной пролиферации.

Уровень техники

Метилирование островков СрС.

Было показано, что помимо мутаций к транскрипционному молчанию некоторых генов, что ранее связывали с патогенезом различных нарушений клеточной пролиферации, включая злокачественные опухоли, приводит патологическое метилирование островков СрС. Островки СрС являются короткими последовательностями, которые богаты динуклеотидами СрС. и обычно обнаруживаются в 5'-области примерно у 50% всех генов человека. Метилирование цитозинов этих островков приводит к прекращению генной экспрессии и, как сообщалось, к инактивации Х-хромосомы и геномному импринтингу.

Разработка медицинских тестов.

Двумя ключевыми показателями любого медицинского скрининга или диагностического теста являются чувствительность и специфичность, которые определяют, каким образом с помощью теста можно точно обнаружить всех пораженных индивидов без исключения и без ложного включения индивидов, у которых отсутствует интересуемое заболевание (прогностическая ценность). Исторически, большое число диагностических тестов вызывало критику из-за низкой чувствительности и специфичности.

Истинноположительным результатом (ТР) является результат, при котором тест является положительным, и заболевание присутствует. Ложноположительный результат (РР) представляет результат, при котором тест является положительным, но заболевание отсутствует. Истинноотрицательным результатом (ΤΝ) является результат, при котором тест является отрицательным, и заболевание отсутствует. Ложноотрицательный результат (ΡΝ) представляет результат, при котором тест является отрицательным, но заболевание имеет место. В данном контексте: чувствительность = ΤΡ/(ΤΡ+ΡΝ); специфичность = ΤΝ/(ΡΡ+ΤΝ) и прогностическая ценность = ТР/ (ТР+РР).

Чувствительность является показателем способности теста правильно обнаруживать интересуемое заболевание у индивидуума, у которого проводят тестирование. Тест с низкой чувствительностью дает большое число ложноотрицательных результатов, т.е. число индивидов, которые имеют заболевание, но которые были ложно идентифицированы как индивиды, у которых отсутствует заболевание. Потенциальная опасность ложноотрицательных результатов заключается в том, что индивидов не диагностируют и не лечат в течение некоторого периода времени, во время которого заболевание может прогрессировать и перейти на более поздние стадии, при которых лечение может быть менее эффективным или бесполезным. Примером теста с низкой чувствительностью является тест на основе белка крови для диагностики ВИЧ. Этот тип теста имеет низкую чувствительность в результате того, что с его помощью невозможно обнаружить наличие вируса до тех пор, пока заболевание сильно не прогрессирует, и вирус не появляется в кровяном русле с высоким титром. Противоположным примером теста, обладающего высокой чувствительностью, является обнаружение вируса с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Тест имеет высокую чувствительность, поскольку с помощью данного типа теста можно обнаруживать очень небольшие количества вируса. Высокая чувствительность имеет особое значение, если отсутствие своевременного диагноза влечет за собой значительные последствия.

С другой стороны, специфичность является показателем способности теста правильно идентифицировать индивидов, у которых заболевание отсутствует. Тест с низкой специфичностью дает большое число ложноположительных результатов, т.е. число индивидов, которых ложно идентифицируют как индивидов с заболеванием. Недостатком ложноположительных результатов является то, что пациенты вынуждены подвергаться ненужным медицинским процедурам, несущим риск, эмоциональный стресс и финансовые затраты, и которые могут оказать неблагоприятное воздействие на здоровье пациентов. Характерным признаком заболеваний, для которых трудно разработать диагностические тесты с высокой специфичностью, является сложный механизм развития заболевания, в частности нарушений клеточной пролиферации, в который вовлечены множество генов и белков. Кроме того, уровень некоторых белков может быть повышен по причинам, не связанным с заболеванием. Специфичность важна, когда стоимость или риск, связанные с дополнительными диагностическими процедурами или дополнительным медицинским вмешательством, являются очень высокими.

- 1 018010

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2, и наиболее предпочтительно карциномы легких у индивида, причем способ включает определение уровня экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; ΚΗΝΧΙ; ЕУХ2; ЕУХ1; БН0Х2; БЕО ГО N0:6; ΟΝ027; ЬКЛТ; 1Ь-12КБ1; ТЕЛР2С; ВСЬ2; ΕΝ2; РКБМ14; БЕО ГО N0:81; АК.ГО5А; УАХ1, в биологическом образце, взятом у указанного индивида, при этом гиперметилирование и/или низкая экспрессия являются показателем наличия указанного нарушения. Различные аспекты настоящего изобретения относятся к эффективному или уникальному генетическому маркеру, а анализ экспрессии указанного маркера делает возможным определить нарушения клеточной пролиферации, предпочтительно приведенные в табл. 2, с особо высокой чувствительностью, специфичностью и/или прогностической ценностью. Предпочтительным нарушением является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), у индивида, причем способ включает определение уровней экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; ΒϋΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; БЕО ГО N0:6; СМ27; ЬКЛТ; ГО-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКЭМ14; БЕО ГО N0:81; ЛКГО5Л; УАХ1, в биологическом образце, взятом у указанного индивида, а низкая экспрессия и/или метилирование СрО являются показателем наличия указанного нарушения. В одном из вариантов осуществления указанный уровень экспрессии определяют по наличию, отсутствию или уровню экспрессии мРНК, транскрибированной из указанного гена. В дополнительном варианте осуществления указанный уровень экспрессии определяют по наличию, отсутствию или уровню полипептида, кодированного указанным геном или его последовательностью.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную экспрессию определяют по наличию или отсутствию метилирования СрО в указанном гене, где низкая экспрессия указывает на наличие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

Указанный способ включает следующие стадии:

ί) контактирование геномной ДНК, выделенной из биологического образца (предпочтительно выбранного из группы, состоящей из клеток или клеточных линий, гистологических препаратов, материала биопсии, залитой в парафин ткани, жидкостей организма, эякулята, мочи, плазмы крови, сыворотки крови, цельной крови, выделенных клеток крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов), взятого у индивидов по меньшей мере с одним реагентом или группами реагентов, с помощью которых можно различить метилированные или неметилированные динуклеотиды СрО по меньшей мере в одной области-мишени геномной ДНК, в которой нуклеотидная последовательность указанной области-мишени содержит по меньшей мере одну динуклеотидную последовательность СрО по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КиЯХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БН0Х2; БЕО ГО N0:6; Ш027; ЬКЛТ; 1Ь12КВ1; ТЕЛР2С; ВСЬ2; Е№; РКБМ14; БЕО ГО N0:81; АКГО5А; УАХ1; и

и) обнаружение нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), по меньшей мере частично. Предпочтительно областьмишень содержит или гибридизуется в жестких условиях с последовательностью по меньшей мере из 16 смежных нуклеотидов БЕО ГО Х0:1-БЕ0 ГО N0:12; БЕО ГО Х0:79-БЕО ГО N0:83.

Предпочтительно чувствительность указанного обнаружения находится в пределах примерно от 75 до примерно 96%, или примерно от 80 до примерно 90%, или примерно от 80 до примерно 85%. Предпочтительно специфичность составляет примерно от 75 до примерно 96%, или примерно от 80 до примерно 90%, или примерно от 80 до примерно 85%.

Указанное использование гена можно осуществлять посредством любого анализа экспрессии гена, посредством анализа экспрессии мРНК или анализа экспрессии белка. Однако в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения обнаружение нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), проводят посредством анализа статуса метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КиЯХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БН0Х2; БЕО ГО N0:6; €N027; ЬВАТ; ГО-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКБМ14; БЕО ГО N0:81; АК.ГО5А; УАХ1, и/или их промоторов или регуляторных элементов.

Изобретение относится к способу анализа биологических образцов на характерные признаки, связанные с развитием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), где способ отличается тем, что нуклеиновая кислота или ее фрагмент с последовательностью БЕО ГО Х0:1-БЕ0 ГО N0:12; БЕО ГО Х0:79-БЕО ГО N0:83 контактирует с реагентом или группой реагентов, с помощью которых можно различить метилированные или не

- 2 018010 метилированные динуклеотиды СрС в геномной последовательности.

Настоящее изобретение относится к способу установления эпигенетических параметров геномной ДНК, связанных с развитием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Способ можно использовать для усовершенствованного обнаружения и диагностики указанного заболевания.

Предпочтительно источник тестируемого образца выбран из группы, состоящей из клеток, клеточных линий, гистологических препаратов, материала биопсии, залитой в парафин ткани, жидкостей организма, эякулята, мочи, плазмы крови, сыворотки крови, цельной крови, выделенных клеток крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов), и их комбинаций. Более предпочтительный тип образцов выбран из группы, состоящей из плазмы крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и всех их возможных комбинаций.

В частности, настоящее изобретение относится к способу обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), которые могут использоваться в качестве диагностического инструмента, включающему получение биологического образца, содержащего геномную нуклеиновую кислоту(ы); приведение нуклеиновой кислоты(т) или ее фрагмента в контакт с реагентом или множеством реагентов, достаточных для того, чтобы различить метилированные или неметилированные динуклеотидные последовательности СрС в последовательности-мишени этой нуклеиновой кислоты, где последовательность-мишень содержит или гибридизуется в жестких условиях с последовательностью, содержащей по меньшей мере 16 смежных нуклеотидов 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1-8ΕΟ ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ ΝΘ:79-8ΕΟ ΙΌ N0:83, где указанные смежные нуклеотиды содержат по меньшей мере одну динуклеотидную последовательность СрС; и определение, основываясь, по меньшей мере частично, на указанном различии, состояния метилирования по меньшей мере одной динуклеотидной последовательности-мишени СрС, или в среднем, или по показателю, отражающему среднее состояние метилирования множества динуклеотидных последовательностей-мишеней СрС.

Предпочтительно различие между метилированными или неметилированными динуклеотидными последовательностями СрС в последовательности-мишени включает зависимое от состояния метилирования преобразование или отсутствие преобразования по меньшей мере одной такой динуклеотидной последовательности СрС в соответствующую преобразованную или непреобразованную динуклеотидную последовательность в последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей 8Е0 ΙΌ Ν0:13-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ Ν0:84-8ΕΟ ΙΌ N0:103 и их смежных областей, соответствующих последовательности-мишени.

Дополнительные варианты осуществления относятся к способу обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), включающему получение биологического образца с данной геномной ДНК; экстракцию геномной ДНК; обработку геномной ДНК или ее фрагмента одним или несколькими реагентами с преобразованием неметилированных оснований цитозина в 5-положении в урацил или другое основание, которое обнаруживается иначе по сравнению с цитозином в отношении гибридизирующих свойств; контактирование обработанной геномной ДНК или ее обработанного фрагмента с ферментом для амплификации и по меньшей мере двумя праймерами, содержащими в каждом случае смежную последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0:13-5^0 ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ N0:84-5+0 ΙΌ N0:103 и комплементарных им последовательностей, где обработанная ДНК или ее фрагмент либо амплифицируют с получением амплификата, либо не амплифицируют; и определение, основываясь на наличии или отсутствии или на свойстве указанного амплификата состояния метилирования или в среднем, или по показателю, отражающему средний уровень метилирования по меньшей мере одного, но более предпочтительно множества динуклеотидных последовательностей СрС 8Е0 ΙΌ N04-5+0 ГО N0:12; 5+0 ΙΌ N0:79-8+0 ΙΌ N0:83.

Предпочтительно определение включает использование по меньшей мере одного способа, выбранного из группы, состоящей из:

ί) гибридизации по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей смежную последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NΟ:13-8Ε^ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ NΟ:84-8Ε^ ΙΌ N0:103 и комплементарных им последовательностей;

ίί) гибридизации по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, связанной с твердой фазой, содержащей смежную последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ NΟ:13-8Ε^ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ NΟ:84-8Ε^ ΙΌ N0:103 и комплементарных им последовательностей;

- 3 018010 ίίί) гибридизации по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей смежную последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ ΝΘ:13-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Е0 ГО ΝΟ:84-8ΕΟ ГО N0:103 и комплементарных им последовательностей; и элонгации по меньшей мере одной такой гибридизованной молекулы нуклеиновой кислоты по меньшей мере одним нуклеотидом; и ίν) секвенирования амплификата.

Дополнительные варианты осуществления относятся к способу анализа (т.е. обнаружения или диагностики) нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), включающему получение биологического образца, с данной геномной ДНК; экстракцию геномной ДНК; приведение геномной ДНК или ее фрагмента в контакт, содержащей одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8Е0 ГО ΝΟ:1-8Ε0 ГО N0:12; 8Е0 ГО ΝΟ:79-8Ε0 ГО N0:83, или последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с ними, с одной или более чувствительных к метилированию рестриктаз, где геномную ДНК либо расщепляют с получением тем самым фрагментов расщепления, либо не подвергают расщеплению; и определение, основываясь на наличии или отсутствии или на свойстве по меньшей мере одного такого фрагмента состояния метилирования по меньшей мере одной динуклеотидной последовательности СрО 8Е0 ГО NΟ:1-8Ε^ ГО N0:12; 8Е0 ГО NΟ:79-8Ε^ ГО N0:83, или в среднем, или по показателю, отражающему среднее состояние метилирования множества динуклеотидных последовательностей СрО.

Предпочтительно расщепленную или нерасщепленную геномную ДНК амплифицируют перед указанным определением.

Дополнительные варианты осуществления относятся к новым геномным и химически модифицированным последовательностям нуклеиновых кислот, а также олигонуклеотидам и/или ΡNΑ-олигомерам для анализа параметров метилирования цитозина в последовательностях 8Е0 ГО NΟ:1-8Ε^ ГО N0:12; 8Е0 ГО N0:79^0 ГО N0:83.

Подробное описание изобретения

Определения.

Термин наблюдаемое/предполагаемое отношение (отношение Н/П) относится к частоте динуклеотидов СрО в конкретной последовательности ДНК и соответствует [число сайтов СрО /(число оснований Схчисло оснований О)]/длина полосы для каждого фрагмента.

Термин островок СрО относится к смежной области геномной ДНК, которая соответствует критериям: (1) имеет частоту динуклеотидов СрО, соответствующих наблюдаемому/предполагаемому отношению >0,6; и (2) имеет содержание ОС >0,5. Как правило, но не всегда, островки СрО имеют длину примерно от 0,2 до примерно 1 т.п.н. или до примерно 2 т.п.н.

Термин состояние метилирования или статус метилирования относится к наличию или отсутствию 5-метилцитозина (5-шСу!) в одном или множестве динуклеотидов СрО в последовательности ДНК. Состояния метилирования в одном или более определенных сайтах СрО метилирования (каждый имеющий две динуклеотидные последовательности СрО) в последовательности ДНК включают неметилированные, полностью метилированные и полуметилированные.

Термин полуметилирование относится к состоянию метилирования двухцепочечной ДНК, в которой метилирована только одна цепь ДНК.

В контексте настоящего изобретения термин АИС означает сокращенное название площади под кривой. В частности, он относится к площади под кривой функциональных характеристик приемника (К0С). Кривая К0С представляет график истинноположительных результатов против ложноположительных результатов для различных возможных уровней отсечения диагностического теста. Кривая К0С показывает баланс между чувствительностью и специфичностью в зависимости от выбранного порога отсечения (любое повышение чувствительности будет сопровождаться снижением специфичности). Площадь под кривой К0С (АИС) является показателем точности диагностического теста (чем больше площадь, тем лучше, оптимально она равняется 1, произвольный тест будет иметь кривую К0С, лежащую на диагонали с площадью 0,5; источник: ЕР. Едап. 81дпа1 Ос1сс1юп Тйеоту аиб К0С Апа1у818, Асабеш1с Рге§8, №\ν Уотк, 1975).

Термин микрочип в широком смысле относится к микрочипам ДНК и ДНК-чипу(ам), известным в данной области, включающему все известные в данной области твердые подложки, и он включает все способы фиксации молекул нуклеиновых кислот к ним или синтез нуклеиновых кислот на них.

Генетические параметры представляют мутации и полиморфизмы генов и последовательностей, дополнительно необходимых для их регуляции. Мутации представляют, в частности, инсерции, делеции, точковые мутации, инверсии и полиморфизмы и особенно предпочтительные 8№ (однонуклеотидные полиморфизмы).

Эпигенетические параметры представляют, в частности, метилирование цитозина. Дополнительные эпигенетические параметры включают, например, ацетилирование гистонов, которые, однако, невозможно непосредственно анализировать с использованием описанного способа, но которые, в свою

- 4 018010 очередь, коррелируют с метилированием ДНК.

Термин бисульфитный реагент относится к реагенту, содержащему бисульфит, дисульфит, вторичный кислый сульфит или их комбинации, которые могут использоваться, как описано в настоящем описании, для обеспечения отличия метилированных и неметилированных динуклеотидных последовательностей СрС.

Термин тест оценки метилирования относится к любому тесту для определения состояния метилирования одной или более динуклеотидных последовательностей СрС в последовательности ДНК.

Термин М8.АР-РСК (чувствительная к метилированию произвольно-праймированная полимеразная цепная реакция) относится к хорошо известной в данной области технологии, которая позволяет проводить глобальное сканирование генома с использованием СС-богатых праймеров для фокусирования на областях, которые с наибольшей вероятностью содержат динуклеотиды СрС, и она описана Сопха1до с1 а1., Се11 ргойГегайуе б1зогбегз, ргсГсгаЫу 11юзе ассогбтд 1о Сапсег КезеагсН. 57:594-599, 1997.

Термин МеЛуЫдН!™ относится к хорошо известной в данной области основанной на флуоресценции ПЦР в режиме реального времени, описанной Еабз е1 а1., Се11 ргойГегайуе б1зогбегз, ргеГегаЫу Позе ассогбтд 1о Сапсег Кезеагсй. 59:2302-2306, 1999.

Термин анализ НеаууМеШу1™ в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к тесту, в котором специфические к метилированию блокирующие зонды (также называемые в настоящем описании блокаторами), покрывающие положения СрС или покрытые праймерами для амплификации, делают возможным протекание специфической к метилированию избирательной амплификации образца нуклеиновой кислоты.

Термин анализ НеаууМе1Ну1™ МеФуЫдЫ™ в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к тесту НеаууМе1Ну1™ МеНуЫдЫ™, который представляет собой вариант теста МеШуЫдЫ™. в котором тест МеФуЫдЫ™ объединяют со специфическими к метилированию блокирующими зондами, покрывающими положениями СрС между праймерами для амплификации.

Термин Мк-ЗЫиРЕ (чувствительная к метилированию однонуклеотидная элонгация праймера) относится к хорошо известному в данной области тесту, описанному Соп7а1до&1оиез, М.1с1с1с Ас1бз Кез., 25:2529-2531, 1997.

Термин М8Р (специфическая к метилированию ПЦР) относится к хорошо известному в данной области тесту оценки метилирования, описанному Негтап е1 а1., Ргос. Ыа11. Асаб. 8сг И8А, 93:9821-9826, 1996 и в патенте США № 5786146.

Термин СОВКА (объединенный бисульфитный рестрикционный анализ) относится к хорошо известному в данной области тесту оценки метилирования, описанному Хюид&Ьайб, МШею Ас1бз Кез., 25:2532-2534, 1997.

Термин МСА (амплификация метилированных островков СрС) относится к тесту оценки метилирования, описанному Тоуо1а е1 а1., Се11 ргойГегайуе б1зогбегз, ргеГегаЫ1у Лозе ассогбшд 1о Сапсег Кез., 59:2307-12, 1999 и в заявке АО 00/26401 А1.

Под термином гибридизация следует понимать как связывание олигонуклеотида с комплементарной последовательностью вдоль линий спаривания оснований в модели Уотсона-Крика в образце ДНК с образованием дуплексной структуры.

Жесткие условия гибридизации в контексте настоящего изобретения включают гибридизацию при 68°С в 5х88С/5х раствор Дэнхардта/1,0% 8Ό8 и промывание в 0,2х88С/0,1% 8Ό8 при комнатной температуре или включают известные в данной области их эквивалентные варианты (например, условия, в которых гибридизацию проводят при 60°С в буфере 2,5х88С с последующими несколькими стадиями промывания при 37°С в буфере с низкой концентрацией, которая остается постоянной). Условия средней жесткости в контексте настоящего изобретения включают промывание в буфере 3х88С при 42°С или известные в данной области их эквивалентные варианты. Параметры концентрации соли и температуры могут варьировать для достижения оптимального уровня идентичности между зондом и нуклеиновой кислотой-мишенью. В данной области имеются рекомендации, касающиеся таких условий, 8атЫгоок е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошид, А ЬаЫога1огу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЫог Ргезз, Ν.Υ. и АизиЫе1 е1 а1. (ебз.), 1995, Сиггеп! Рго1осо1з ш Мо1еси1аг Вю1о§у ОоНп А11еу&8оп8, Ν.Υ.) на ипй 2.10.

Под термином специфические к метилированию рестриктазы или чувствительные к метилированию рестриктазы следует понимать фермент, который избирательно расщепляет нуклеиновую кислоту в зависимости от состояния метилирования его сайтов распознавания. В случае таких рестриктаз, которые специфически расщепляют, если сайт распознавания не метилирован или полуметилирован, то расщепление не будет иметь место или будет проходить с существенно пониженной эффективностью, если сайт распознавания метилирован. В случае таких рестриктаз, которые расщепляют специфически, если сайт распознавания метилирован, то расщепление не будет иметь место или будет проходить с существенно пониженной эффективностью, если сайт распознавания не метилирован. Предпочтительными являются специфические к метилированию рестриктазы, последовательность распознавания которых содержит динуклеотид СС (например, сдсд или сссддд). Дополнительными предпочтительными для некоторых вариантов осуществления являются рестриктазы, которые не расщепляют, если цитозин в данном динук

- 5 018010 леотиде метилирован по атому углерода С5. Неспецифические к метилированию рестриктазы или нечувствительные к метилированию рестриктазы представляют рестриктазы, которые расщепляют последовательность нуклеиновой кислоты независимо от состояния метилирования примерно с одинаковой эффективностью. Их также называют неспецифическими к метилированию рестриктазами.

В отношении сложного спектра последовательностей выражение смежные нуклеотиды относится к смежной области последовательности любой отдельной смежной последовательности сложного спектра, но не включает область сложного спектра последовательностей, которая включает узел, имеющий значения, определенные выше.

Термин по меньшей мере один ген или геномная последовательность, выбранные из группы, состоящей из РТОЕК4; ΒϋΝΧΙ; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; 8ЕО ГО N0:6; ΟΝ027; ЬКАТ; ГО-12КБ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; ΕΝ2; РКОМ14; 8Е0 ГО N0:81; АКГО5А; УАХ1, включает все варианты их транскриптов и все их промоторы и регуляторные элементы. Кроме того, поскольку известно множество 8ΝΡ в указанном гене, то термин включает все варианты их последовательностей.

Обзор.

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), у индивида, включающему определение уровней экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ0ЕК4; ΚΗΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; 8Е0 ГО N0:6; С^27; ЬКАТ; ГО-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКОМ14; 8ЕО ГО N0:81; АКГО5А; УАХ1, в биологическом образце, взятом у указанного индивида, в котором гиперметилирование и/или низкая экспрессия являются показателем наличия указанного нарушения. Указанные маркеры можно использовать для диагностики нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

Кроме приведенных выше вариантов осуществления, в которых проводят анализ метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ0ЕК4; ВиЯХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; 8ЕО ГО N0:6; Ш027; ЬКАТ; ГО-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКЭМ14; 8Е0 ГО N0:81; АКГО5А; УАX1, изобретение относится к дополнительным панелям генов, содержащим по меньшей мере один ген или геномную последовательность, выбранные из группы, состоящей из РТ0ЕК4; КИ№1; ΕУX2; ЕУК-1; 8Η0Χ2; 8ЕО ГО N0:6; Ш027; ЬКАТ; ГО-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РК0М14; 8Е0 ГО N0:81; АКГО5А; УАX1, с новым вариантом использования для обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

Бисульфитная модификация ДНК является хорошо известным в данной области инструментом, используемым для оценки статуса метилирования СрО. 5-Метилцитозин представляет собой наиболее частую ковалентную модификацию основания в ДНК эукариотических клеток. Он играет роль, например, в регуляции транскрипции в генетическом импринтинге и опухолегенезе. Следовательно, идентификация 5-метилцитозина в качестве компонента генетической информации представляет большой интерес. Однако положения 5-метилцитозина невозможно идентифицировать секвенированием, поскольку 5-метилцитозин обладает тем же характером спаривания оснований, что и цитозин. Кроме того, эпигенетическая информация, которую несет 5-метилцитозин, полностью теряется, например, во время амплификации ПЦР.

Наиболее часто используемый метод анализа ДНК на наличие 5-метилцитозина основан на специфической реакции бисульфита с цитозином, посредством чего при последующем щелочном гидролизе цитозин преобразуется в урацил, который по своему поведению при спаривании оснований соответствует тимину. Однако важно, что 5-метилцитозин остается немодифицированным в данных условиях. Следовательно, исходная ДНК преобразуется таким образом, что метилцитозин, который первоначально невозможно было отличить от цитозина по его характеру гибридизации, после этого можно обнаружить в качестве единственного оставшегося цитозина с использованием стандартных, известных в области молекулярной биологии методов, например амплификацией и гибридизацией или секвенированием. Все эти методы основаны на различающихся свойствах в отношении спаривания оснований, которые на данное время можно полностью использовать.

На предшествующем уровне чувствительность определяют способом, содержащим включение ДНК, которая подвергается анализу, в агарозный матрикс с предупреждением тем самым диффузии и ренатурации ДНК (бисульфит реагирует только с одноцепочечной ДНК) и замещением всех стадий преципитации и очистки на быстрый диализ (01ек с1 а1., А тоб1к1еб аиб 1тртоуеб текйоб кот Ь18и1йке Ьазеб сукозте текйу1айои аиа1у818, ШсШс Ас1бз Кез., 24:5064-6, 1996). Таким образом, становится возможным анализировать отдельные клетки в отношении статуса метилирования, что демонстрирует использование и чувствительность способа. Обзор известных в данной области способов обнаружения 5-метилцитозина приведен в статье Кет Т., ек а1., М.1с1е1с Ас1бз Кез., 26:2255, 1998.

Бисульфитный способ, за некоторым исключением (например, Хезсйшдк М. ек а1., Еиг. 1. Ηιιιη. Оеиек., 5:94-98, 1997), является единственным используемым в настоящее время способом для исследований. Во всех случаях короткие специфические фрагменты известного гена амплифицируют после об

- 6 018010 работки бисульфитом и либо полностью секвенируют (01ек&\а11ег, №11. Сспс!.. 1997, 17:275-6, 1997), подвергнув одной или нескольким реакциям элонгации с праймерами (Сопха1до&.1опс5. Νιιοίοίο Ас1бк Кек., 25:2529-31, 1997; заявка \0 95/00669; патент США № 6251594) для анализа отдельных положений цитозина, либо обрабатывают ферментативным расщеплением (Хюпд&Еашб, ΝιιοΚίο Ас1бк Кек., 25:25324, 1997). В данной области также описано обнаружение гибридизацией (01ек е! а1., \0 99/28498). Кроме того, описано использование бисульфитного способа обнаружения метилирования в отношении отдельных генов (Ст1дд&С1атк, Вюеккаук, 16:431-6, 1994; 2ексйшдк М. е! а1., Нит. Мо1. Сепе!. 6:387-95, 1997; Рей К. е! а1., ΝιιοΚίο Ас1бк Кек., 22:695, 1994; Майш V. е! а1., Сепе, 157:261-4, 1995; заявки \0 9746705 и \\'0 9515373).

Настоящее изобретение относится к использованию бисульфитного способа в сочетании с одним или несколькими анализом оценки метилирования для определения статуса метилирования динуклеотидных последовательностей СрС 8ЕО ΙΌ Ν0:1-8ΕΟ ΙΌ N0:12; 8ЕО ΙΌ Ν0:79-8ΕΟ ΙΌ N0:83. Геномные динуклеотиды СрС могут быть метилированными или неметилированными (альтернативно известные соответственно как высоко- или низкометилированные). Однако способы по настоящему изобретению подходят для анализа биологических образцов гетерогенной природы, например небольшого количества опухолевых клеток на фоне крови. Следовательно, при анализе статуса метилирования положения СрС в таком образце специалист в данной области может использовать количественный анализ для определения уровня (например, процента, фракции, соотношения, относительного количества или степени) метилирования в определенном положении СрС по сравнению с состоянием метилирования. Следовательно, термин статус метилирования или состояние метилирования следует также понимать как показатель, отражающий степень метилирования положений СрС. Если не указано иначе, то под терминами гиперметилированный или высокометилированный следует понимать уровень метилирования, который выше определенного порога отсечения, где указанный порог отсечения может представлять показатель, представляющий средний или усредненный уровень для определенной популяции или предпочтительно оптимизированный уровень отсечения. Порог отсечения также относится в настоящем описании к пороговому уровню. В контексте настоящего изобретения термины метилированный, гиперметилированный или высокометилированный включают уровень метилирования, который выше порога отсечения, равного нулевому (0) % (или его эквивалентным вариантам) метилирования для всех положений СрС в или связанных с (например, промоторах или регуляторных областях) по меньшей мере одном гене или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТСЕК4; ΚυΝΧ1; ΕνΧ2; ΕνΧ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ Ν0:6; С№27; ЬКАТ; 1Ь-12КВ1; ТРАР2С; ВСЬ2; ΕΝ2; РКОМ14; 8ЕО ГО Ν0:81; АКГО5А; νΑΧ1.

По настоящему изобретению определение статуса метилирования динуклеотидных последовательностей СрС 8Е0 ГО Ν0:1-8Ε0 ΙΌ Ν0:12; 8Е0 ΙΌ Ν0:79-8ΕΟ ΙΌ Ν0:83 можно использовать при диагностике и обнаружении нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

Тесты оценки метилирования.

В данной области известны различные тесты оценки метилирования и их можно использовать в сочетании с настоящим изобретением. Эти тесты позволяют определить состояние метилирования одного или множества динуклеотидов СрС (например, островков СрС) в последовательности ДНК. Такие тесты включают, среди других методов, секвенирование обработанной бисульфитом ДНК, ПЦР (для последовательность-специфической амплификации), саузерн-блоттинг и применение чувствительных к метилированию рестриктаз.

Например, геномное секвенирование было упрощено для анализа параметров метилирования ДНК и распределения 5-метилцитозина с использованием обработки бисульфитом (Рготтег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. υδΑ, 89:1827-1831, 1992). Кроме того, используют расщепление рестриктазами продуктов ПЦР, амплифицированных из преобразованной под действием бисульфита ДНК, например, с использованием метода, описанного 8абг1&НогпкЬу (№с1. Ас1бк Кек., 24:5058-5059, 1996), или С0ВКА (комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ) (Хюпд&Ьайб, №.1с1ею Ас1бк Кек., 25:2532-2534, 1997).

С0ВКА.

Анализ С0ВКА™ является количественным анализом оценки метилирования, подходящим для определения уровней метилирования ДНК в определенных локусах гена в небольших количествах геномной ДНК (Хюпд&Ьаиб, №1с1ею Аабк Кек., 25:2532-2534, 1997). Коротко, используют расщепление рестриктазами для выявления зависимых от метилирования различий последовательностей в продуктах ПЦР, обработанной бисульфитом натрия ДНК. Вначале в геномную ДНК вводят метилирование - зависимые различия последовательностей с использованием обычной обработки бисульфитом согласно способу, описанному Рготтег е! а1. (Ргос. №!1. Асаб. 8ск и8А, 89:1827-1831, 1992). Затем проводят амплификацию ПЦР, преобразованной под действием бисульфита ДНК, с использованием праймеров, специфичных для интересующих островков СрС с последующим расщеплением рестрицирующими эндонуклеазами, электрофорезом и обнаружением с использованием специфических, меченых гибридизующихся зондов. Уровни метилирования в исходном образце ДНК представлены относительными количествами расщепленного и нерасщепленного продукта ПЦР в линейной зависимости среди широкого спектра уровней

- 7 018010 метилирования ДНК. Кроме того, этот метод можно надежно использовать для ДНК, полученной из микропрепаратов, залитых в парафин образцов тканей.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для СОВКА™) для анализа СОВКА™ могут включать, но не ограничиваются ими, праймеры для ПЦР для определенного гена (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрО); рестриктазу и соответствующий буфер; олигонуклеотид, гибридизирующийся с геном; контрольный гибридизирующийся олигонуклеотид; набор для мечения киназой для олигонуклеотидного зонда и меченые нуклеотиды. Кроме того, реагенты для преобразования бисульфитом могут включать буфер для денатурации ДНК; буфер для сульфонирования; реагенты или наборы для выделения ДНК (например, преципитации, ультрафильтрации, аффинной колонки); буфер для десульфонирования и компоненты для выделения ДНК.

Предпочтительно используют такие анализы, как МейуЫдй!™ (основанная на флуоресценции ПЦР в режиме реального времени) (Еабз е! а1., Се11 ртойГетабуе б1зотбетз, ргеГегаЫу Птозе ассотбшд !о Сапсег Кез., 59:2302-2306, 1999); Мз-БЫиРЕ™ реакции (чувствительная к метилированию однонуклеотидная элонгация праймера) (Оои7а1до&1опез, ШсШс АсИз Кез., 25:2529-2531, 1997); специфическая к метилированию ПЦР (МБР; Негтап е! а1., Ргос. N<111. Асаб. Бск ИБА, 93:9821-9826, 1996; патент США № 5786146); амплификация метилированных островков СрО (МСА; Тоуо!а е! а1., Се11 ртойГетаЙуе б1зотбетз, ргеГегаЫу Птозе ассотбшд !о Сапсег Кез., 59:2307-12, 1999), одни или в сочетании с другими из данных методов.

Тест НеаууМе1йу1™ представляет количественный метод для оценки различий в метилировании, основанный на специфической к метилированию амплификации обработанной бисульфитом ДНК. Специфические к метилированию блокирующие зонды (также называемые в описании блокаторами), покрывающие положения СрО или покрытые праймерами для амплификации, делают возможным проведение специфической к метилированию избирательной амплификации образца нуклеиновой кислоты.

Термин анализ НеаууМе!йу1™ МеИуЫДи™ в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к тесту НеаууМе!йу1™ МеИуЫдй!™, который представляет собой вариант теста МеШуЫдй!™, в котором тест МеИуЫдЫ™ объединяют со специфическими к метилированию блокирующими зондами, покрывающими положения СрО между праймерами для амплификации. Тест НеаууМе1йу1™ также можно использовать в комбинации со специфическими к метилированию праймерами для амплификации.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в наборе для теста МеШуЫдй!™) для анализа НеаууМе!йу1™ могут включать, но не ограничиваются ими, ПЦР-праймеры для определенных генов (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрО); блокирующие олигонуклеотиды; оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды и Тад-полимеразу.

МБР.

МБР (специфическая к метилированию ПЦР) позволяет оценить статус метилирования практически любой группы сайтов СрО в островке СрО независимо от использования чувствительных к метилированию рестриктаз (Негтап е! а1., Ргос. N<111. Асаб. Бск ИБА, 93:9821-9826, 1996; патент США № 5786146). Коротко, ДНК модифицируют преобразованием с использованием бисульфита натрия всех неметилированных, но неметилированных цитозинов в урацил, и затем амплифицируют с использованием праймеров, специфических для метилированной, но не для неметилированной ДНК. Для МБР необходимы только очень небольшие количества ДНК? и метод чувствителен к 0,1% метилированных аллелей данного локуса островка СрО и его можно проводить на ДНК, экстрагированной из залитых в парафин образцов. Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для МБР) для анализа МБР могут включать, но не ограничиваются ими, метилированные и неметилированные ПЦР-праймеры для определенного гена (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрО); оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды и специфические зонды.

МеПцТщЫ™.

Тест МеИуЫдй!™ представляет высокоэффективный количественный метод оценки метилирования, в котором используется основанная на флуоресценции ПЦР в режиме реального времени (ТадМап), для которой не требуются дополнительные манипуляции после стадии ПЦР (Еабз е! а1., Сапсег Кез., 59:2302-2306, 1999). Коротко, процесс МеИуЫДи™ начинается со смешанного образца геномной ДНК, которую преобразуют, в реакции с бисульфитом натрия, в смешанный пул зависимых от метилирования различий последовательностей согласно стандартным методам (в результате процесса с бисульфитом происходит преобразование остатков цитозина в урацил). Затем проводят ПЦР, основанную на флуоресценции, в несимметричной реакции (с праймерами для ПЦР, которые перекрывают известные динуклеотиды СрО). Различие последовательностей может иметь место на уровне амплификации и на уровне обнаружения флуоресценции.

Тест МеИуЫдй!™ можно использовать в качестве количественного анализа для оценки параметров метилирования в образце геномной ДНК, в котором отличие последовательностей имеет место на уровне гибридизации зонда. В этой количественной версии реакцию ПЦР проводят для специфической к метилированию амплификации в присутствии флуоресцентного зонда, который перекрывает определенный

- 8 018010 предполагаемый сайт метилирования. Объективный контроль для количества входной ДНК обеспечивается реакцией, в которой ни праймеры, ни зонд не перекрывают динуклеотиды СрО. Альтернативно, количественный анализ для геномного метилирования проводят зондированием несимметричного пула ПЦР либо с контрольными олигонуклеотидами, которые не покрывают известные сайты метилирования (основанная на флуоресценции версия методов Ме111уЫд111™ и МБР), либо с олигонуклеотидами, покрывающими потенциальные сайты метилирования.

Процесс МеШуЬщЦ™ можно использовать с любыми подходящими зондами, например ТацМап®, ЫдЫсус1ет® и т.д. Например, двухцепочечную геномную ДНК обрабатывают бисульфитом натрия и подвергают одному из двух циклов реакций ПЦР с использованием зондов ТацМап®; например, с праймерами МБР и/или олигонуклеотидами-блокаторами Неа\уМе111у1 и зондом ТацМап®. Зонд ТацМап® имеет двойную метку молекулами флуоресцентного репортера и гасителя и сконструирован со специфичностью для области с относительно высоким содержанием ОС таким образом, что он плавится при температуре примерно на 10°С выше, чем прямой или обратный праймеры в цикле ПЦР. Это позволяет зонду ТацМап® оставаться полностью гибридизованным во время стадий отжига/элонгации при ПЦР. По мере того как Тац-полимераза ферментативно синтезирует новую цепь во время ПЦР, она будет достигать подвергнутого отжигу зонда ТацМап®. Затем 5'-3' эндонуклеазная активность Тац-полимеразы будет вытеснять зонд ТацМап® его расщеплением с высвобождением флуоресцентной репортерной молекулы для количественного обнаружения его непогашенного сигнала с использованием системы флуоресцентного обнаружения в режиме реального времени.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для теста МеШуЬщЦ™) для анализа МеШуЬщЦ™ могут включать, но не ограничиваются ими, ПЦР-праймеры для определенных генов (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрО); зонды ТацМап® или Ыдй1сус1ет®; оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды и Тац-полимеразу.

Тест ОМ™ (количественное метилирование) представляет собой альтернативный количественный анализ для оценки параметров метилирования в образцах геномной ДНК, где различие последовательностей имеет место на уровне гибридизации зонда. В данной количественной версии реакцию ПЦР проводят для объективной амплификации в присутствии флуоресцентного зонда, который перекрывает определенный предполагаемый сайт метилирования. Объективный контроль для количества входной ДНК обеспечивается реакцией, в которой ни праймеры, ни зонд не перекрывают динуклеотиды СрО. Альтернативно, качественный тест для геномного метилирования проводят зондированием несимметричного пула ПЦР либо с контрольными олигонуклеотидами, которые не покрывают известные сайты метилирования (основанная на флуоресценции версия методов Неа\уМе111у1™ и МБР), либо с олигонуклеотидами, покрывающими потенциальные сайты метилирования.

Анализ ОМ™ можно использовать с любыми подходящими зондами, например ТацМап®, ЬщЫсус1ет® и т.д., в процессе амплификации. Например, двухцепочечную геномную ДНК обрабатывают бисульфитом натрия и подвергают воздействию объективных праймеров ПЦР и зонду ТацМап®. Зонд ТацМап® имеет двойную метку из молекул флуоресцентного репортера и гасителя и сконструирован со специфичностью для области с относительно высоким содержанием ОС таким образом, что он плавится при температуре примерно на 10°С выше, чем прямой или обратный праймеры в цикле ПЦР. Это позволяет зонду ТацМап® оставаться полностью гибридизованным во время стадий отжига/элонгации ПЦР. По мере того как Тац-полимераза ферментативно синтезирует новую цепь во время ПЦР, она будет достигать подвергнутого отжигу зонда ТацМап®. Затем 5'-3' эндонуклеазная активность Тац-полимеразы будет вытеснять зонд ТацМап®, расщепляя его с высвобождением флуоресцентной репортерной молекулы для количественного обнаружения его непогашенного сигнала с использованием системы флуоресцентного обнаружения в режиме реального времени.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для теста ЦМ™) для анализа ОМ'™ могут включать, но не ограничиваются ими, ПЦР-праймеры для определенного гена (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрО); зонды ТацМап® или ЬщЫсус1ет®; оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды и Тац-полимеразу.

Мк-БЫиРЕ.

Метод М5-8М.1РЕ представляет количественный метод для оценки различий в метилировании в определенных сайтах СрО, основанный на обработке ДНК бисульфитом. с последующей однонуклеотидной элонгацией праймеров (Оопга^о&Топек, ЫисШс АсИк Век., 25:2529-2531, 1997). Коротко, геномную ДНК подвергают взаимодействию с бисульфитом натрия с преобразованием неметилированного цитозина в урацил, в то время как 5-метилцитозин остается без изменений. Затем проводят амплификацию желаемой последовательности-мишени с использованием специфических ПЦР-праймеров, для преобразованной под действием бисульфита ДНК, и полученный продукт выделяют и используют в качестве матрицы для анализа метилирования в интересующем сайте(ах) СрО. Можно анализировать небольшие количества ДНК (например, микропрепараты патологических срезов), при этом устраняется необходимость в применении рестриктаз для оценки статуса метилирования в сайтах СрО.

- 9 018010

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для Μ5-8Ν1.1ΡΕ™) для анализа Μ5-8Ν1.1ΡΕ™ могут включать, но не ограничиваются ими, праймеры для ПЦР для определенного гена (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрС); оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды; набор для экстракции геля; положительные контрольные праймеры; праймеры Μ5-8Ν1.1ΡΕ для определенного гена; буфер для реакции (для реакции Μ5-8Ν1.1ΡΕ™) и меченые нуклеотиды. Кроме того, реагенты для преобразования бисульфитом могут включать буфер для денатурации ДНК; буфер для сульфонирования; реагенты или наборы для выделения ДНК (например, преципитации, ультрафильтрации, аффинной колонки); буфер для десульфонирования и компоненты для выделения ДНК.

Было установлено, что геномные последовательности БЕО ГО ΝΟΤ-БЕф ΙΌ N0:12; БЕО ΙΌ ΝΟ:79^Εφ ΙΌ ΝΟ:83 и их неприродные обработанные варианты БЕО ГО ΝΟ:13^Εφ ΙΌ ΝΟ:60; БЕО ГО ΝΟ:84^Εφ ГО ΝΟ:103 имеют новый вариант использования для обнаружения нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

В одном из вариантов осуществления способ по изобретению включает следующие стадии:

ί) определение экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТСЕР4; ΒϋΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БΗΟX2; БЕО ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; БВЛТ; 1Б-12ВВ1; ТРЛР2С; ВСБ2; ЕШ; РКБМ14; БЕО ГО ΝΟ:81; ЛКГО5Л; УЛХ1; и

и) определение наличия или отсутствия нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Способ по изобретению можно осуществлять анализом экспрессии РНК, транскрибированной из них или полипептида, или белка, транслированного из указанной РНК, предпочтительно посредством анализа экспрессии мРНК или анализа экспрессии полипептида. Однако в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения обнаружение нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), можно проводить посредством анализа статуса метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕВ4; ΒϋΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БΗΟX2; БЕО ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; БВЛТ; 1Б-12ВВ1; ТРЛР2С; ВСБ2; ЕШ; РРОМ14; БЕО ГО ΝΟ:81; ЛК.ГО5Л; УЛХ1 и/или их промоторов или регуляторных элементов.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к диагностическим теста и способам, количественным и качественным для обнаружения экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТСЕР4; ΚυNX1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БΗΟX2; БЕО ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; БВЛТ; 1Б-12КВ1; ТРЛР2С; ВСБ2; ЕШ; РВЭМ14; БЕО ГО ΝΟ:81; ЛК.ГО5Л; УЛХ1, у индивида и определение по ней наличия или отсутствия нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких) у индивида. Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Патологическая экспрессия мРНК, транскрибированной по меньшей мере из одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТСЕР4; ΚυNX1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БΗΟX2; БЕО ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; БВЛТ; 1Б-12ВВ1; ТРЛР2С; ВСБ2; ЕШ; РВБМ14; БЕО ГО ΝΟ:81; ЛВГО5Л; УЛХ1, связана с наличием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких. По настоящему изобретению гиперметилирование и/или низкая экспрессия связана с наличием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких).

Для обнаружения кодирующих мРНК гена или геномной последовательности у пациента берут пробу. Проба может представлять любой подходящий образец, содержащий клеточное вещество опухоли. Подходящие типы проб включают клетки или клеточные линии, гистологические препараты, материал биопсии, залитую в парафин ткань, жидкости организма, эякулят, мочу, плазму крови, сыворотку крови, цельную кровь, выделенные клетки крови, мокроту и биологическое вещество, полученные при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и все их возможные комбинации. Более предпочтительный вариант проб выбран из группы, состоящей из плазмы крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и всех их возможных комбинаций.

- 10 018010

Образец можно обработать для экстракции РНК, содержащейся в нем. Затем полученную из образца нуклеиновую кислоту анализируют. В данной области известно большое число методов определения абсолютного и относительного уровня экспрессии генов, наиболее часто используемые методы, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают гибридизацию ίη κίΐι,ι (например, ΕΙ8Η), нозерн-блоттинг, тесты защиты от РНКазы (КРЛ), микрочипы и методы, основанные на ПЦР, такой как количественная ПЦР и ПЦР с дифференциальным дисплеем, или любой другой метод обнаружения нуклеиновых кислот.

Особенно предпочтительным является использование способа обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР хорошо известен в данной области (например, см. \Уа1коо и Е1ешшд, см. выше).

ОТ-ПЦР можно провести следующим образом. Выделяют общую клеточную фракцию РНК, например, обычным способом с использованием гуанидина изотиоцианата и общую РНК подвергают обратной транскрипции. Обратная транскрипция включает синтез ДНК на матрице РНК с использованием фермента обратной транскриптазы и З'-концевого олигонуклеотидного бТ-праймера и/или произвольных гексамерных праймеров. Затем полученную таким образом кДНК амплифицируют с помощью ПЦР (Ве1уаукку е1 а1., Ыис1. Ас1бк Век., 17:2919-2932, 1989; Кгид апб Вегдег, МеШобк ίη Еп/уто^ду. Асабеиис Ргекк, Ν.Υ., Уо1. 152, р. 316-325, 1987, эти источники включены в настоящее описание для сведения). Еще более предпочтительным вариантом является вариант ОТ-ПЦР в режиме реального времени, в котором продукт ПЦР обнаруживают с использованием гибридизирующихся зондов (например, ТадМап, ЬщЫсус1ег, Мо1еси1аг Веасопк&Бсотрюп) или 8ΥΒΒ зеленого. Затем обнаруживаемый сигнал от зондов или 8ΥΒΒ зеленого оценивают количественно по калибровочной кривой или сравнением со значениями С1 для стандарта, используемого для построения калибровочной кривой. Часто используют анализ генов домашнего хозяйства для нормализации данных.

При нозерн-блоттинге общую фракцию или поли(А)+ мРНК помещают на агарозный гель и обнаруживают по гибридизации с меченым зондом непосредственно в высушенном геле или на мембране. Полученный сигнал пропорционален количеству РНК-мишени в популяции РНК. При сравнении сигналов двух или более клеточных популяций или тканей выявляют относительные различия в уровнях экспрессии генов. Абсолютное количественное определение можно проводить при сравнении сигнала с калибровочной кривой, полученной ίη νίΙΐΌ с использованием известных количеств транскрипта, соответствующего мРНК-мишени. Анализ генов домашнего хозяйства, генов, уровни экспрессии которых предположительно остаются относительно постоянными независимо от условий, часто используют для нормализации данных, что приводит к устранению любых кажущихся различий, вызванных неправильным переносом РНК на мембрану или неправильным нанесением РНК на гель.

Первой стадией при нозерн-блоттинге является выделение чистой, интактной РНК из интересующих клеток или ткани. В результате того, что при нозерн-блоттинге молекулы РНК различаются по размеру, целостность образца оказывает влияние на степень, с которой сигнал локализуется в одной полосе. Частично разрушенные образцы РНК будут приводить к появлению сигнала, который размыт или распределен на несколько полос с общей потерей в чувствительности и возможно ошибочной интерпретацией данных. При нозерн-блоттинге можно использовать ДНК-, РНК- и олигонуклеотидные зонды, и эти зонды предпочтительно метят (например, радиоактивными метками, массовыми метками или флуоресцентными метками). Размер РНК-мишени, но не зонда, будет определять размер обнаруживаемой полосы, таким образом, методы произвольного праймированного мечения, которые обеспечивают зонды различных длин, являются подходящими для синтеза зондов. Специфическая активность зонда будет определять уровень чувствительности метода, таким образом, предпочтительно чтобы использовались зонды с высокой специфической активностью.

В тесте защиты от РНКазы РНК-мишень и РНК-зонд определенной длины гибридизуют в растворе. После гибридизации РНК расщепляют РНКазой, специфичной для одноцепочечных нуклеиновых кислот, для удаления любой негибридизованной, одноцепочечной РНК-мишени и зонда. РНКазы инактивируют и отделяют РНК, например, электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле. Количество интактного РНК-зонда пропорционально количеству РНК-мишени в популяции РНК. ВРА можно использовать для относительного и абсолютного количественного анализа экспрессии гена и также картирования структуры РНК, такого как определение границ интрона/экзона и стартовых сайтов транскрипции. Тест защиты от РНКазы предпочтителен по сравнению с нозерн-блоттингом, поскольку обычно он имеет более низкий предел обнаружения.

Антисмысловые РНК-зонды, используемые в ВРА, получают транскрипцией ДНК-матрицы в условиях ίη уйто с определенной конечной точкой, и, как правило, их длина составляет примерно 50-600 нуклеотидов. Использование РНК-зондов, которые включают дополнительные последовательности, не гомологичные РНК-мишени, позволяет отличить защищенный фрагмент от полноразмерного зонда. Как правило, РНК-зонды используют вместо ДНК-зондов за счет простоты получения одноцепочечных РНКзондов и воспроизводимости и надежности расщепления дуплекса РНК:РНК РНКазой (АикиЬе1 е1 а1., 2003), особенно предпочтительными являются зонды с высокой специфической активностью.

- 11 018010

Особенно предпочтительно использование микрочипов. Анализ с использованием микрочипов можно разделить на две основные части. Первая представляет иммобилизацию известных последовательностей генов на предметных стеклах или другой твердой подложке с последующей гибридизацией меченной флуоресцентной меткой кДНК (содержащей последовательности для анализа) с известными генами, иммобилизованными на предметном стекле (или другой твердой фазе). После гибридизации чипы сканируют с использованием флуоресцентного сканера для микрочипов. Анализ относительной интенсивности флуоресценции различных генов дает показатель различий в экспрессии генов.

ДНК-микрочипы можно получить иммобилизацией предварительно синтезированных олигонуклеотидов на полученные предметные стекла или других твердых поверхностях. В данном случае получают и готовят характерные последовательности генов с использованием методов синтеза и очистки олигонуклеотидов. Данные синтезированные последовательности генов являются комплементарными транскрипту(м) РНК по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕР4; ΒϋΝΧΙ; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕБ) ГО N0:6; СЫ027; БРАТ; 1Б-12РВ1; ТЕАР2С; ВСБ2; ΕΝ2; РРЭМ14; 8Е0 ГО N0:81; АРГО5А; УАХ1, и они являются более короткими последовательностями с длиной в пределах 25-70 нуклеотидов. Альтернативно, иммобилизованные олигонуклеотиды можно синтезировать химически ίη δίΐιι на поверхности предметного стекла. Синтез олигонуклеотидов ίη 811и включает последовательное добавление соответствующих нуклеотидов на точки на микрочипах; точки, на которые не наносили нуклеотид, защищают на каждой стадии процесса с использованием физических или виртуальных масок. Предпочтительно указанные синтезированные нуклеиновые кислоты представляют замкнутые нуклеиновые кислоты.

В опытах с микрочипами по определению характера экспрессии используемые РНК-матрицы представляют характер транскрипции клеток или тканей, которые исследуют. Вначале выделяют РНК из клеточных популяций или тканей, которые используют для сравнения. Затем каждый образец РНК используют в качестве матрицы с получением меченных флуоресцентной меткой кДНК посредством реакции обратной транскрипции. Введение флуоресцентной метки в кДНК можно проводить либо прямым мечением, либо опосредованным мечением. Во время прямого мечения модифицированные флуоресцентной меткой нуклеотиды (например, Су®3- или Су®-5-бСТР) включаются непосредственно в кДНК во время обратной транскрипции. Альтернативно, можно проводить опосредованное мечение включением аминоаллил-модифицированных нуклеотидов во время синтеза кДНК и затем конъюгированием красителя Ν-гидроксисукцинимидного (ΝΗ8) эфира с аминоаллил-модифицированной кДНК после завершения реакции обратной транскрипции. Альтернативно, в зонд можно не вводить метку, но можно сделать его обнаруживаемым посредством специфического связывания с лигандом, который является меченым, напрямую или опосредованно. Подходящие метки и способы мечения лигандов (и зондов) известны в данной области и к ним относятся, например, радиоактивные метки, которые можно вводить известными способами (например, ник-трансляцией или мечением киназой). Другие подходящие метки включают, но не ограничиваются ими, флуоресцентные группы, хемилюминесцентные группы (например, диоксетаны, в частности запущенные диоксетаны), ферменты, антитела и т.п. Для дифференциального анализа экспрессии генов кДНК, полученную из различных образцов РНК, метят Су®3. Полученную меченую кДНК очищают для удаления невключенных нуклеотидов, свободного красителя и остаточной РНК. После очистки меченые образцы кДНК гибридизуют с микрочипами. Жесткость условий гибридизации определяют с учетом ряда факторов во время гибридизации и во время отмывки, включающих температуру, ионную силу, время и концентрацию формамида. Данные факторы описаны, например, 8ашЬгоок с1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬога1огу Мапиа1, 2'¹ еб., 1989). После гибридизации микрочипы сканируют с использованием флуоресцентного сканера для микрочипов. Интенсивность флуоресценции каждой точки указывает на уровень экспрессии анализируемого гена; яркие пятна соответствуют генам с высокой экспрессией, в то время как тусклые пятна означают слабую экспрессию.

После получения изображений необработанные данные необходимо подвергнуть анализу. Вначале фоновую флуоресценцию следует вычесть из значения флуоресценции каждой точки. Затем данные нормализуют к контрольной последовательности, такой как экзогенно внесенные нуклеиновые кислоты (предпочтительно РНК или ДНК), или к панели генов домашнего хозяйства для учета любой неспецифической гибридизации, несовершенства микрочипов или вариабельности в микрочипах, мечении кДНК, гибридизации или отмывке. Нормализация данных позволяет сравнить результаты множества микрочипов.

Другой аспект изобретения относится к набору для использования в диагностике нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких и дополнительно предпочтительной карциномы легких, выбранной из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких), у индивида согласно способам по настоящему изобретению, где указанный набор содержит средства для определения уровня транскрипции по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ0ЕР4; ΡυΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; 8ЕБ) ГО N0:6; СМ27; БРАТ; 1Б-12РВ1; ТЕАР2С; ВСБ2; Е№; РРОМ14; 8ЕБ) ГО N0:81;

- 12 018010

ΑΚΙΌ5Α; УАХ1. В предпочтительном варианте осуществления средства для определения уровня транскрипции включают олигонуклеотиды или полинуклеотиды, способные гибридизоваться в жестких условиях или условиях средней жесткости с продуктами транскрипции по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; ΚΠΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; ΟΝ027; ЬКАТ; 1Ь-12ВВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; ΕΝ2; Р1ЮМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; ΑΚΙΌ5Α; УАХ1. В наиболее предпочтительном варианте осуществления уровень транскрипции определяют способами, выбранными из группы, состоящей из нозерн-блоттинга, обратной транскрипции-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, теста защиты от РНКазы и технологии микрочипов. В еще одном варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит средства для получения биологического образца у пациента. Предпочтительным является набор, который дополнительно содержит контейнер, который наиболее предпочтительно подходит для включения средств для определения уровня транскрипции и биологического образца пациента и наиболее предпочтительно дополнительно содержит инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

В предпочтительном варианте осуществления набор содержит:

(a) множество олигонуклеотидов или полинуклеотидов, способных гибридизоваться в жестких условиях или условиях средней жесткости с продуктами транскрипции по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ0ЕК4; ΚΗΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; 8ЕО ΙΌ N0:6; €N027; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; Р1ЮМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; ΑΒΙΌ5Α; УАХ1;

(b) контейнер, предпочтительно подходящий для введения олигонуклеотидов или полинуклеотидов и биологического образца пациента, содержащего продукты транскрипции, где олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут гибридизоваться в жестких условиях или условиях средней жесткости с продуктами транскрипции;

(c) средства для обнаружения гибридизации по (Ь); и, необязательно, (ά) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

Также набор может содержать другие компоненты, такие как буфер для гибридизации (где олигонуклеотиды используют в качестве зонда), упакованные в отдельном контейнере. Альтернативно, когда олигонуклеотиды используют для амплификации области-мишени, то набор может содержать упакованные в отдельных контейнерах полимеразу и буфер для реакции, оптимизированный для элонгации праймера, опосредованной полимеразой, такой как для ПЦР. Предпочтительно указанная полимераза является обратной транскриптазой. Дополнительно предпочтительно, чтобы указанный набор содержал реагент РНКазу.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к способам обнаружения наличия полипептида, кодированного указанными последовательностями генов в образце, полученном от пациента.

Патологические уровни экспрессии полипептидов, кодированных по меньшей мере одним геном или геномной последовательностью, выбранными из группы, состоящей из РТ0ЕК4-; ΒυNΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; Ш027; ЬКАТ; ΙΕ-12ΡΒ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКОМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; ΑΚΙΌ5Α; УАХ1, связаны с наличием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

По настоящему изобретению низкая экспрессия указанных полипептидов связана с наличием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Можно использовать любой метод, известный в данной области, для обнаружения полипептидов. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, масс-спектрометрию, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, иммунохимические методы, тесты на основе образования комплекса связывающее вещество-лиганд, иммуногистохимические методы, агглютинацию и тесты с комплементом (например, см. Ваис апб С11П1са1 Ιιηιηιιηο1ο§ν. 8йе§ апб Тегг, еб5., Арр1е1оп&Еапде, №г\\а1к, Сопп., р. 217-262, 1991, этот источник включен в настоящее описание для сведения). Предпочтительными являются методы иммуноанализа на основе комплексов связывающее вещество-лиганд, включающие взаимодействие антител с эпитопом или эпитопами и конкурентное вытеснение меченого полипептида или его производного.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают применение антител, специфических к полипептиду(м), кодированному по меньшей мере одним геном или геномной последовательностью, выбранными из группы, состоящей из РТ0ЕК4; ΒυNΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; €N027; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РВОМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; ΑΒΙΌ5Α; УАХ1.

Такие антитела являются подходящими для диагностики нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2, наиболее предпочтительно для диагностики карциномы легких. Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкокле

- 13 018010 точной карциномы легких. В некоторых вариантах осуществления продукцию моноклональных или поликлональных антител можно индуцировать применением эпитопа, кодированного полипептидом по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; ΚΗΝΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Η0Χ2; 8ЕО ГО N0:6; ΟΝ027; ЬКАТ; ГО-12КБ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; ΕΝ2; РВЭМ14; 8Е0 ГО N0:81; ЛКГО5Л; УАХ1, в качестве антигена. В свою очередь, такие антитела можно использовать для обнаружения экспрессированных полипептидов в качестве маркеров для нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2, наиболее предпочтительно для диагностики карциномы легких. Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких. Уровни таких присутствующих полипептидов можно количественно определить обычными методами. Связывание антитело-полипептид можно обнаружить и оценить количественно различными средствами, известными в данной области, такими как введение флуоресцентной метки или радиоактивных лигандов. Изобретение дополнительно включает наборы для указанных выше методов, где такие наборы содержат антитела, специфичные для исследуемых полипептидов.

В данной области хорошо известны многочисленные иммунологические методы конкурентного и неконкурентного связывания полипептидов. Антитела, используемые в таких тестах, могут быть без метки, например, которые используют в тестах агглютинации, или они могут содержать метку и использоваться в самых различных аналитических тестах. Метки, которые можно использовать, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные метки, люминесцентные метки, субстраты ферментов или кофакторы, ингибиторы ферментов, частицы, краски и т.п. Предпочтительные тесты включают, но не ограничиваются ими, радиоиммуноанализ (ΒΙΑ), иммуноферментные тесты, например, твердофазный иммуноферментный метод (ЕЬ18А), флуоресцентные иммунологические тесты и т.п. Можно получить поликлональные или моноклональные антитела или эпитопы для использования в любом из ряда иммунологических способов, известных в данной области.

В альтернативном варианте осуществления способа белки можно обнаружить посредством вестернблоттинга. Указанный анализ является обычным в данной области, и, коротко, белки разделяют электрофорезом, например электрофорезом в 8Ό8-ΡΑΟΕ. Затем разделенные белки переносят на подходящую мембрану (или бумагу), например нитроцеллюлозную мембрану, сохраняя их пространственное разделение с помощью электрофореза. Затем мембрану инкубируют с блокирующим реагентом для связывания оставшихся липких мест на мембране, обычно используемые реагенты включают белок-генерик (например, белок молока). Затем добавляют антитело, специфичное к интересующему белку, где указанное антитело содержит обнаруживаемую метку, например краски или ферменты (например, щелочную фосфатазу или пероксидазу из хрена). Затем обнаруживают локализацию антитела на мембране.

В альтернативном варианте осуществления способа белки можно обнаружить посредством иммуногистохимии (применение антител к антигенам, специфичных к зонду, в образце). Указанный анализ является обычным в данной области, когда обнаружение антигенов в тканях известно как иммуногистохимия, в то время как обнаружение в культивированных клетках обычно называют иммуноцитохимией. Коротко, первичное антитело обнаруживают по связыванию с его специфическим антигеном. Затем комплекс антитело-антиген связывают со вторым антителом, конъюгированным с ферментом. В присутствии необходимого субстрата и хромогена связанный фермент обнаруживают по окрашенным отложениям в местах связывания антитела-антигена. Существует широкий ряд подходящих типов образцов, аффинности антиген-антитело, типов антител и методов усиления обнаружения. Таким образом, специалистам в данной области необходимо определить оптимальные условия для иммуногистохимического или иммуноцитохимического обнаружения для каждого отдельного случая.

Одним подходом для получения антител к полипептиду является выбор и получение аминокислотной последовательности всего или фрагмента полипептида, химический синтез аминокислотной последовательности и его введение соответствующему животному, обычно кролику или мыши (М11к!еш аий КоЫет, №11иге. 256:495-497, 1975; Си1Гге апй Мййеш, Ме11юйк ίη Епхушо1оду: 1ттипосйет1са1 Тес11пк|иек. 73:1-46, Ьапдопе апй Вапайк ейк., Асайетю Ргекк, 1981, эти источники в полном объеме включены в настоящее описание для сведения). Способы получения полипептидов или их эпитопов включают, но не ограничиваются ими, химический синтез, методы рекомбинантной ДНК или выделение из биологических образцов. На конечной стадии способа пациенту ставят диагноз, при этом низкая экспрессия (мРНК или полипептидов) указывает на наличие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких. Термин низкая экспрессия следует понимать как экспрессию на уровне обнаружения, который ниже заранее определенного порога отсечения, который можно выбрать из группы, состоящей из среднего, усредненного или оптимизированного порогового значения. Термин гиперэкспрессия следует понимать как экспрессию на уровне обнаружения, который выше заранее определенного порога отсечения, который можно выбрать из группы, состоящей из среднего, усредненного или оптимизированного поро

- 14 018010 гового значения. Другой аспект изобретения относится к набору для использования при диагностике нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), у индивида согласно способам по настоящему изобретению, включающим средства для обнаружения по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из полипептидов ΡΤ6ΕΚ4; ΚϋΝΧΙ; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8НОХ2; БЕС) ΙΌ ΝΟ:6; ΟΝ027; ΕΚΑΤ; ГО-12НВ1; ΤΕΑΡ2^ БСЬ2; ΕΝ2; ΡΚΌΜ14; БЕС) ГО ΝΟ:81; ЛКГО5Л; УАХ1. Средства для обнаружения полипептидов предпочтительно включают антитела, производные антител или фрагменты антител. Наиболее предпочтительно полипептиды обнаруживают посредством вестерн-блоттинга с использованием меченых антител. В еще одном варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит средства для получения биологического образца у пациента. Предпочтительным является набор, который дополнительно содержит подходящий контейнер, содержащий средства для обнаружения полипептидов в биологическом образце пациента, наиболее предпочтительно набор дополнительно содержит инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора. В предпочтительном варианте осуществления набор содержит: (а) средства для обнаружения по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из полипептидов ΡΤ6ΕΚ4; КЦИХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БНОХ2; БЕС) ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; ΕΚΆΤ; ГО-12КБ1; ΤΕΑΡ2€; ВСЬ2; Е№; ΡΚΌΜ14; БЕС) ГО ΝΟ:81; ЛКГО5Л; УАХ1; (Ь) подходящий контейнер, содержащий указанные средства и биологический образец пациента, содержащий полипептиды, где средства могут образовывать комплексы с полипептидами; (с) средства для обнаружения комплексов по (Ь) и, необязательно, (б) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

Также набор может содержать другие компоненты, такие как буферы или растворы, подходящие для блокирования, промывания или покрытия, упакованные в отдельные контейнеры.

Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к новому применению анализа уровней и/или параметров метилирования по меньшей мере в одном гене или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ΡΤ6ΕΚ4; КЦЫХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8НОХ2; БЕС) ГО ΝΟ:6; ΌΝ027; ΕΚΑΤ; 1Б-12ЕВ1; ΤΕΑΡ2€; ВСЬ2; Е№; ΡΚΌΜ14; БЕС) ГО ΝΟ:81; АКГО5А; УАХ1, что делает возможным обнаружить, охарактеризовать и/или лечить нарушения клеточной пролиферации, предпочтительно приведенные в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциному легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких. Раннее обнаружение нарушений клеточной пролиферации, в частности карциномы легких, непосредственно связано с прогнозом заболевания, и, таким образом, раскрытый способ делает возможным, чтобы врач и пациент лучше и более информировано принимали решение по поводу лечения.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления способа наличие или отсутствие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких, в частности карциномы легких, выбранной из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких), определяют анализом статуса метилирования одного или более динуклеотидов СрС по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ΡΤСΕΚ4; КиКХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БНΟX2; БЕС) ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; ΕΚΑΤ; 1Б-12РВ1; ΤΕΑΡ2€; ВСЬ2; Е№; ΡΚΌΜ14; БЕС) ΙΌ ΝΟ:81; ΑΚΙΌ5Α; УАХ1.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ включает следующие стадии: ί) контактирование геномной ДНК, выделенной из биологического образца (предпочтительно выделенного из жидкостей организма), взятого у индивида, по меньшей мере с одним реагентом или группами реагентов, с помощью которых можно различить метилированные или неметилированные динуклеотиды СрС, по меньшей мере в одном гене или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ΡΤΟΡΚ4; ЯиКХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; Б1Ю.Х2; БЕС) ГО ΝΟ:6; ΌΝ027; ΕΚΑΤ; 1Б-12РВ1; ΤΕΑΡ2^ ВСЬ2; ЕИ2; ΡΚΌΜ14; БЕО ΙΌ ΝΟ:81; АРГО5А; УАХ1 (включая их промотор и регуляторные области) и ίί) обнаружение нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Предпочтительно, чтобы указанный один или более динуклеотидов СрС по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ΡΤСΕΚ4; КЦИХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БНΟX2; БЕС) ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; ΕΚΑΤ; 1Б-12РВ1; ΤΕΑΡ2€; ВСЬ2; Е№; ΡΚΌΜ14; БЕС) ГО ΝΟ:81; ΑΚΙΌ5Α; УАХ1, находились в их соответствующей геномной последовательности-мишени БЕО ГО ΝΟ: 1-БЕО ГО ΝΟ:12; БЕО ГО ΝΟ^-БЕр ГО ΝΟ:83 и комплементарных им последовательностях. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу установления генетических и/или эпигенетических параметров по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ΡΤ6ΕΚ4; ЯиКХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БНΟX2; БЕС) ГО ΝΟ:6; ΟΝ027; ΕΚΑΤ; ГО-12РВ1; ΤΕΑΡ2Ο; ВСЬ2; ЕИ2; ΡΚΌΜ14; БЕО ГО ΝΟ:81; ΑΚΙΌ5Α; УАХ1, и/или геномной последовательности БЕО ГО ΝΟΗ-БЕО ГО ΝΟ:12; БЕО ГО ΝΟ^-БЕр ГО ΝΟ:83, у индивида анализом метилирования цито

- 15 018010 зина. Указанный способ включает контактирование нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности 8Е0 ΙΌ Ы0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ NΟ:79-8Ε^ ΙΌ N0:83, в биологическом образце, взятом у указанного индивида, по меньшей мере с одним реагентом или группами реагентов, где с помощью указанного реагента или групп реагентов можно различить метилированные и неметилированные динуклеотиды СрС в нуклеиновой кислоте-мишени.

В предпочтительном варианте осуществления указанный способ включает следующие стадии: на первой стадии получают образец ткани для анализа. Источником может быть любой подходящий источник, такой как клетки или клеточные линии, гистологические препараты, материал биопсии, залитую в парафин ткань, жидкости организма, эякулят, моча, плазма крови, сыворотка крови, цельная кровь, выделенные клетки крови, мокрота и биологическое вещество, полученные при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и все их возможные комбинации. Более предпочтительный тип образца выбран из группы, состоящей из плазмы крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и всех их возможных комбинаций.

Затем из образца выделяют геномную ДНК. Г еномную ДНК можно выделить обычными методами в данной области, включая применение промышленно доступных наборов. Коротко, в том случае, когда интересующая ДНК инкапсулирована клеточной мембраной, то биологический образец необходимо разрушить и лизировать ферментативным, химическим или механическим способом. Затем раствор ДНК очищают от белков и других примесей, например расщеплением с помощью протеиназы К. Далее геномную ДНК выделяют из раствора. Это можно проводить с помощью различных методов, включая высаливание, экстракцию органическим растворителем или связывание ДНК с твердофазной подложкой. На выбор метода будут оказывать влияние несколько факторов, которые включают время, стоимость и необходимое количество ДНК.

В том случае, когда образец ДНК не находится в мембране (например, циркулирующая ДНК из образца крови), то можно использовать методы, известные в данной области для выделения и/или очистки ДНК. Такие методы включают применение разрушающего белок реагента, например хаотропной соли, например, гуанидина гидрохлорида или мочевины; или детергента, например додецилсульфата натрия (8Ό8), бромистого циана. Альтернативные методы включают, но не ограничиваются ими, преципитацию этанолом или преципитацию пропанолом, концентрирование в вакууме, среди прочего, с помощью центрифуги. Также специалист в данной области может применить устройства, такие как устройства для фильтрования, например для ультрафильтрации, поверхности или мембраны из диоксида кремния, магнитные частицы, частицы из полистирола, поверхности из полистирола, положительно заряженные поверхности и положительно заряженные мембраны, заряженные мембраны, заряженные поверхности, мембраны с переключаемым зарядом, поверхности с переключаемым зарядом.

После экстракции нуклеиновых кислот геномную двухцепочечную ДНК используют для анализа.

На второй стадии способа образец геномной ДНК обрабатывают таким образом, что основания цитозины, которые не метилированы в 5'-положении, преобразуются в урацил, тимидин или другое основание, которое отличается от цитозина в отношении поведения при гибридизации. Эту стадию следует понимать в настоящем описании как предварительную обработку или обработку.

Это предпочтительно достигается обработкой бисульфитным реагентом. Термин бисульфитный реагент относится к реагенту, включающему бисульфит, дисульфит, вторичный кислый сульфит или их комбинации, подходящему, как раскрыто в настоящем описании, для обеспечения различия метилированных и неметилированных динуклеотидных последовательностей СрС. Методы указанной обработки известны в данной области (например, описаны в РСТ/ЕР2004/011715, этот источник в полном объеме включен в настоящее описание для сведения). Предпочтительно, чтобы обработку бисульфитом проводили в присутствии денатурирующих растворителей, таких как, но не ограничиваясь ими, налкиленгликоль, в частности диметиловый эфир диэтиленгликоля (ЭМЕ), или в присутствии диоксана или производных диоксана. В предпочтительном варианте осуществления денатурирующие растворители используют в концентрации в пределах от 1 до 35% (об./об.). Также предпочтительно, чтобы реакцию с бисульфитом проводили в присутствии поглотителей, таких как, но не ограничиваясь ими, производные хромана, например 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман 2-карбоновая кислота, или тригидроксибензойная кислота и ее производные, например галловая кислота (см. РСТ/ЕР2004/011715, этот источник в полном объеме включен в настоящее описание для сведения). Преобразование с использованием бисульфита предпочтительно проводят при температуре реакции между 30 и 70°С, затем температуру повышают до более чем 85°С в течение коротких периодов времени во время проведения реакции (см. РСТ/ЕР2004/011715, этот источник в полном объеме включен в настоящее описание для сведения). Обработанную бисульфитом ДНК предпочтительно очищают перед количественным анализом. Это можно проводить любыми средствами, известными в данной области, такими как, но не ограничиваясь ими, ультрафильтрация, предпочтительно ее проводят с помощью колонок Мютосои (ТМ) (производства М11Нроге (ТМ)). Очистку проводят по модифицированному протоколу изготовителя (см. РСТ/ЕР2004/011715, этот источник в полном объеме включен в настоящее описание для сведения).

- 16 018010

На третьей стадии способа фрагменты обработанной ДНК амплифицируют с использованием рядов олигонуклеотидов-праймеров по настоящему изобретению и фермента для амплификации. Амплификацию нескольких сегментов ДНК можно проводить одновременно в одном и том же реакционном сосуде. Как правило, амплификацию проводят с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Предпочтительно указанные амплификаты имеют длину от 100 до 2000 п.н. Ряд олигонуклеотидов-праймеров включает по меньшей мере два олигонуклеотида, последовательности каждого из которых обратно комплементарны, идентичны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости, по меньшей мере, с сегментом длиной 16 пар оснований из одной последовательности оснований 8ЕО ΙΌ N043-^0 ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ NΟ:84-8Ε^ ΙΌ N0:103 и комплементарных им последовательностей. В альтернативном варианте осуществления способа статус метилирования заранее выбранных положений СрО по меньшей мере в одном гене или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КШХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; €N027; ЬКАТ; ΙΕ-12ΚΒ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКЭМ14; 8Е0 ΙΌ N0:81; ΛΕΙ05Λ; УАХ1, и предпочтительно в последовательностях нуклеиновых кислот 8Е0 ΙΌ N0:1-8Ε^ ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ NΟ:79-8Ε^ ΙΌ N0:83 можно обнаружить при использовании специфических к метилированию олигонуклеотидов-праймеров. Данный метод (М8Р) описан в патенте США № 6265171, Негтап. Применение специфических к статусу метилирования праймеров для амплификации обработанной бисульфитом ДНК позволяет дифференцировать метилированные и неметилированные нуклеиновые кислоты. Пары праймеров М8Р включают по меньшей мере один праймер, который гибридизуется с обработанным бисульфитом динуклеотидом СрО. Следовательно, последовательность указанных праймеров содержит по меньшей мере один динуклеотид СрО. М8Р праймеры, специфичные для неметилированной ДНК, содержат Т в С-положении в СрО. Следовательно, предпочтительно, чтобы последовательность оснований указанных праймеров включала последовательность с длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая гибридизуется с обработанной последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ NΟ:13-8Ε^ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ NΟ:84-8Ε^ ΙΌ N0:103 и комплементарными им последовательностями, где последовательность оснований указанных олигомеров содержит по меньшей мере один динуклеотид СрО. Дополнительный предпочтительный вариант осуществления способа включает применение олигонуклеотидов-блокаторов (тест НеаууМе!йу1™). Применение таких олигонуклеотидов-блокаторов описано Уи е! а1., ВюТес11пк|ие5. 23:714-720, 1997. Блокирующие олигонуклеотиды-зонды гибридизуются с обработанной бисульфитом нуклеиновой кислотой одновременно с ПЦР-праймерами. Амплификация нуклеиновой кислоты ПЦР заканчивается в 5'-положении блокирующего зонда так, что амплификация нуклеиновой кислоты подавляется, когда имеется комплементарная последовательность для блокирующего зонда. Можно сконструировать зонды для гибридизации с обработанной бисульфитом нуклеиновой кислотой со специфическим для статуса метилирования профилем. Например, для обнаружения метилированных нуклеиновых кислот в популяции неметилированных нуклеиновых кислот необходимо подавить амплификацию нуклеиновых кислот, которые неметилированы в интересующем положении, с помощью блокирующих зондов, содержащих СрА или ТрА в интересующем положении, в противоположность СрО, когда желательно подавить амплификацию метилированных нуклеиновых кислот.

Для методов на основе ПЦР, в которых используются олигонуклеотиды-блокаторы, необходимо эффективное подавление опосредованной полимеразой амплификации для того, чтобы олигонуклеотиды-блокаторы не подвергались элонгации под действием полимеразы. Предпочтительно это достигается применением блокаторов, которые представляют собой 3'-дезоксиолигонуклеотиды или олигонуклеотиды, дериватизованные в 3'-положении иной группой, чем свободная гидроксильная группа. Например, 3'-О-ацетилолигонуклеотиды являются примерами предпочтительной группы молекулы блокатора.

Кроме того, следует предотвратить опосредованное полимеразой разрушение олигонуклеотидовблокаторов. Предпочтительно такое предупреждение включает применение полимеразы, у которой отсутствует 5'-3'-экзонуклеазная активность, или применение модифицированных олигонуклеотидовблокаторов, содержащих, например, тиоатные мостики на их 5'-концах, что придает молекуле блокатора устойчивость к воздействию нуклеазы. Для определенных применений могут не потребоваться такие 5'-модификации блокатора. Например, если связывающие сайты блокатора и праймера перекрываются, тем самым при этом предупреждается связывание праймера (например, избытком блокатора), то деградация олигонуклеотида-блокатора будет, по существу, исключаться. Это происходит в результате того, что полимераза не будет наращивать праймер в направлении к и через (в 5'-3'-направлении) блокатор процесс, который обычно приводит к разрушению гибридизованного олигонуклеотида-блокатора.

Особенно предпочтительным вариантом осуществления блокатора/ПЦР для целей настоящего изобретения, который обеспечивается в настоящем описании, является применение в качестве блокирующих олигонуклеотидов пептидных олигомеров нуклеиновых кислот (РNА). Такие РNА блокаторыолигомеры подходят идеально, поскольку они не разрушаются и не подвергаются наращению под действием полимеразы.

Следовательно, предпочтительно, чтобы последовательность оснований указанных блокирующих олигонуклеотидов содержала последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая гибридизуется с одной из обработанных последовательностей нуклеиновых кислот

- 17 018010

БЕО ΙΌ Н0:13-БЕО ΙΌ N0:60; БЕО ΙΌ Н0:84-БЕО ΙΌ N0:103 и комплементарными им последовательностями, где последовательность оснований указанных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере один динуклеотид СрО, ТрО или СрА.

Фрагменты, полученные посредством амплификации, могут нести прямо или опосредованно обнаруживаемую метку. Предпочтительными являются метки в виде флуоресцентных меток, радионуклидов или отщепляемых молекулярных фрагментов с типичной массой, которую можно обнаружить на массспектрометре. В том случае, когда указанные метки представляют массовые метки, предпочтительно чтобы меченые амплификаты имели один положительный или отрицательный общий заряд, позволяющий лучше обнаружить на масс-спектрометре. Обнаружение и визуализацию можно проводить посредством, например, масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЬШ) или с использованием масс-спектрометрии с электрораспылением (ЕБ1).

Масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЬБ1-Т0Е) представляет собой очень хорощую разработку для анализа биологических молекул (Кагак&НШепкатр, Апа1. СЬет., 60:2299-301, 1988). Анализируемое вещество погружают в абсорбирующий свет матрикс. Матрикс выпаривают под действием короткого лазерного импульса так, что молекула анализируемого вещества переходит в паровую фазу в нефрагментированной форме. Анализируемое вещество ионизируется при столкновении с молекулами матрикса. Под действием приложенного напряжения ионы поступают в пролетную трубку без поля. За счет разницы в массах ионы передвигаются с различными скоростями. Более мелкие ионы достигают детектора раньше по сравнению с более крупными. МАЬБ1-Т0Б спектрометрия хорошо подходит для анализа пептидов и белков. Анализ нуклеиновых кислот является несколько более трудным (Ои1&Веск, Сиггеп! ΙηηονηΙίοηκ апб Би1иге Тгепйк, 1:147-57, 1995). Чувствительность при анализе нуклеиновых кислот примерно в 100 раз ниже по сравнению с пептидами, и она непропорционально снижается с увеличением размера фрагмента. Кроме того, нуклеиновые кислоты имеют скелет с множеством отрицательных зарядов, и процесс ионизации через матрикс является существенно менее эффективным. При МАЬБ1-Т0Б спектрометрии выбор матрикса играет очень важную роль. Для десорбции пептидов было найдено несколько очень эффективных матриксов, которые обеспечивают очень хорошую кристаллизацию. В настоящее время имеется несколько подходящих для ДНК матриксов, что, однако, не привело к уменьшению различий в чувствительности анализа пептидов и нуклеиновых кислот. Однако данное различие в чувствительности можно снизить посредством химической модификации ДНК таким образом, что она приближается к таковой для пептида. Например, фосфоротиоатные нуклеиновые кислоты, в которых обычные фосфаты скелета замещены на тиофосфаты, можно превратить в ДНК с нейтральным зарядом с использованием обычного алкилирования (Ои1&Веск, №.1с1ею АсИк Кек., 23:1367-73, 1995). Сочетание метки-заряда с данной модифицированной ДНК приводит к повышению чувствительности МАЬБ1-Т0Б до уровня, аналогичного для пептидов. Дополнительным преимуществом введения зарядной метки является повышенная стабильность анализа против примесей, что делает обнаружение немодифицированных субстратов значительно более трудным.

На четвертой стадии способа амплификаты, полученные на третьей стадии способа, анализируют для установления статуса метилирования динуклеотидов СрО, который был перед обработкой.

В вариантах осуществления, где амплификаты получали посредством МБР-амплификации, присутствие или отсутствие амплификата само по себе указывает на состояние метилирования положений СрО, покрытых праймером, соответственно последовательностям оснований указанного праймера.

Амплификаты, полученные с помощью стандарта и специфической к метилированию ПЦР, можно дополнительно анализировать посредством методов основание-основание, таких как, но не ограничиваясь ими, технология микрочипов и технологии на основе зондов, а также с помощью методов, таких как секвенирование и направленное матрицей наращение.

В одном из вариантов осуществления способа амплификаты, синтезированные на третьей стадии, затем гибридизуют с микрочипами или рядом олигонуклеотидов и/или РNЛ-зондов. В данном контексте гибридизация происходит следующим образом: ряд зондов, использованных во время гибридизации, предпочтительно состоит по меньшей мере из 2 олигонуклеотидов или РNЛ-олигомеров; в способе амплификаты служат в качестве зондов, которые гибридизуются с олигонуклеотидами, предварительно связанными с твердой фазой; затем негибридизованные фрагменты удаляют; указанные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере одну последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая обратно комплементарна или идентична сегменту последовательностей оснований, приведенных в списке последовательностей; и сегмент содержит по меньшей мере один динуклеотид СрО, ТрО или СрА. Гибридизующийся фрагмент гибридизующихся нуклеиновых кислот, как правило, имеет длину по меньшей мере 9, 15, 20, 25, 30 или 35 нуклеотидов. Однако применимы молекулы с большей длиной, и, таким образом, они находятся в объеме настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления указанный динуклеотид находится в центральной трети олигомера. Например, когда олигомер содержит один динуклеотид СрО, то указанный динуклеотид предпочтительно является пятым-девятым нуклеотидом с 5'-конца 13-мера. Один олигонуклеотид имеется для анализа каждого динуклеотида СрО в последовательности, выбранной из группы, состоящей из БЕО ΙΌ Н0:1-БЕ0 ΙΌ N0:12; БЕО ΙΌ Н0:79-БЕО ΙΌ N0:83, и эквивалентные положения в последова

- 18 018010 тельностях 8ΕΟ ΙΌ ΝΘ:13-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Ε0 ΙΌ ΝΘ:84-8ΕΟ ΙΌ N0:103. Указанные олигонуклеотиды также могут находиться в форме пептидных нуклеиновых кислот. Затем негибридизованные амплификаты удаляют. Затем обнаруживают гибридизованные амплификаты. В данном контексте предпочтительно, чтобы метки, присоединенные к амплификатам, были идентифицируемыми в каждом положении твердой фазы, на которой находится олигонуклеотидная последовательность.

В еще одном варианте осуществления способа статус геномного метилирования положений СрО можно оценить с помощью олигонуклеотидных зондов (как подробно описано выше), которые гибридизуются с обработанной бисульфитом ДНК одновременно с ПЦР-праймерами для амплификации (где указанные праймеры могут быть специфическими к метилированию или обычными).

Особенно предпочтительным вариантом осуществления данного способа является применение основанной на флуоресценции количественной ПЦР в режиме реального времени (Не1б е! а1., Оепоше Кек., 6:986-994, 1996; также см. патент США № 6331393) с использованием флуоресцентных олигонуклеотидных зондов с двойной меткой (ТацМап™ ПЦР с использованием прибора ΑΒΙ Рпкт 7700 8ес.|иепсе Ое1есбоп 8ук1ет, Реткт Е1тег Аррйеб Вюкуйетк, Еок1ег Сйу, СаНГогша). В реакции ТацМап™ ПЦР используется ненаращиваемый любопытный олигонуклеотид, называемый ТацМап™ зондом, который в предпочтительных вариантах осуществления сконструирован для гибридизации с богатой последовательностью СрО, расположенной между прямым и обратным праймерами для амплификации. Зонд ТацМап™ дополнительно содержит флуоресцентную репортерную группу и гасящую группу, ковалентно связанные с линкерами (например, фосфорамидитами), соединенными с нуклеотидами ТацМап™ олигонуклеотида. Для анализа метилирования в нуклеиновых кислотах после обработки бисульфитом необходимо, чтобы зонд был специфичным для метилирования, как описано в патенте США № 6331393 (этот источник включен в полном объеме в настоящее описание для сведения), также известный как тест Ме1йуЬ1дй1™. Варианты методологии обнаружения с использованием ТацМап™, которые также подходят для использования в описанном изобретении, включают использование технологии с двумя зондами (Ь1дй1сус1ег™) или флуоресцентных праймеров для амплификации (технологии 8иппке™). Оба метода можно адаптировать таким образом, чтобы они подходили для использования с обработанной бисульфитом ДНК и, кроме того, для анализа метилирования в динуклеотидах СрО.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления способа четвертая стадия способа включает применение направляемой матрицей элонгации олигонуклеотидов, такой как М8-^иРЕ, как описано Ооп7а1до&1опек, Шс1ею Аабк Кек., 25:2529-2531, 1997.

В еще одном варианте осуществления способа четвертая стадия способа включает секвенирование и последующий анализ последовательности амплификата, полученного на третьей стадии способа (8ап§ет Е. е! а1., Ргос. Асаб. 8сЕ И8А, 74:5463-5467, 1977).

Описание наиболее предпочтительного варианта осуществления

В наиболее предпочтительном варианте осуществления способа геномные нуклеиновые кислоты выделяют и обрабатывают согласно первым трем стадиям способа, описанного выше, а именно:

a) получение у индивида биологического образца с данной геномной ДНК;

b) экстракция или выделение иным образом геномной ДНК;

c) обработка геномной ДНК со стадии Ь) или ее фрагмента одним или несколькими реагентами для преобразования оснований цитозинов, которые являются неметилированными в 5-положении, в урацил или другое основание, которое обнаруживается иначе по сравнению с цитозином в отношении гибридизирующих свойств;

где

б) амплификацию после обработки на стадии с) проводят специфическим к метилированию образом, а именно применением специфических к метилированию праймеров или блокирующих олигонуклеотидов, и далее, где

е) обнаружение амплификатов проводят посредством обнаружения зонда в режиме реального времени, как описано выше.

Предпочтительно, когда последующую амплификацию на стадии б) проводят с помощью специфических к метилированию праймеров, как описано выше, то указанные специфические к метилированию праймеры содержат последовательность длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая гибридизуется с одной из обработанных последовательностей нуклеиновых кислот 8Ε0 ΙΌ Ν0:13-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Ε0 ΙΌ Ν0:84-8ΕΟ ΙΌ N0:103 и комплементарными им последовательностями, где последовательность оснований указанных олигомеров содержит по меньшей мере один динуклеотид СрО.

Стадия е) способа, а именно обнаружение специфических амплификатов, указывающих на статус метилирования одного или более положений СрО в последовательностях 8Ε0 ΙΌ N0:1-8Ε^ ΙΌ N0:12; 8Ε0 ΙΌ N0:79-8Ε^ ΙΌ N0:83, проводят с помощью способов обнаружения в режиме реального времени, как описано выше.

Дополнительные варианты осуществления изобретения относятся к способу анализа статуса метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; ΚϋΚΧ1; ΕΥΧ2; ΕΥΧ-1; 8Н0Х2; 8ΕΟ ΙΌ N0:6; Ш027; ЬКАТ; ΙΌ-12ΚΒ1; ТЕАР2С;

- 19 018010

ВСЬ2; ΞΝ2; РВБМ14; БЕО ΙΌ ΝΟ:81; ЛКТО5Л; УЛХ1 (предпочтительно БЕО ΙΌ \С):1-БЕО ΙΌ ΝΟ:12; БЕО ΙΌ ΝΟ^-БЕф ΙΌ ΝΟ:83 и комплементарных им последовательностей), без необходимости в преобразовании с использованием бисульфита. В данной области известны способы, в которых чувствительные к метилированию рестриктазы или группы рестриктаз, включающие чувствительные к метилированию рестриктазы, с помощью которых можно различить метилированные и неметилированные динуклеотиды СрО в области-мишени, используют для определения метилирования, например, но не ограничиваясь ими, ΌΜΗ.

На первой стадии таких дополнительных вариантов осуществления геномную ДНК выделяют из тканевых или клеточных источников. Геномную ДНК можно выделить обычными методами в данной области, включая применение промышленно доступных наборов. Коротко, в том случае, когда интересующая ДНК инкапсулирована клеточной мембраной, биологический образец необходимо разрушить и лизировать ферментативным, химическим или механическим способом. Затем раствор ДНК можно очистить от белков и других примесей, например, расщеплением с помощью протеиназы К. Затем геномную ДНК выделяют из раствора. Это можно проводить с помощью различных методов, включая высаливание, экстракцию органическим растворителем или связывание ДНК с твердофазной подложкой. На выбор метода будут оказывать влияние несколько факторов, которые включают время, стоимость и необходимое количество ДНК. Все типы образцов, имеющих клиническое значение, содержащих неопластический или потенциально неопластический материал, подходят для использования в настоящем способе, предпочтительными являются клетки или клеточные линии, гистологические препараты, материал биопсии, залитая в парафин ткань, жидкости организма, эякулят, моча, плазма крови, сыворотка крови, цельная кровь, выделенные клетки крови, мокрота и биологическое вещество, полученные при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и их комбинации. Более предпочтительный тип образцов выбран из группы, состоящей из плазмы крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и всех их возможных комбинаций.

После экстракции нуклеиновых кислот геномную двухцепочечную ДНК используют для анализа.

В предпочтительном варианте осуществления ДНК можно расщепить до обработки чувствительными к метилированию рестриктазами. Такие методы известны в данной области, и они могут включать физические и ферментативные средства. Особенно предпочтительным является применение одной или множества рестриктаз, которые не являются чувствительными к метилированию, и чьи сайты распознавания являются АТ-богатыми и не содержат СО-динуклеотидов. Применение таких ферментов делает возможным сохранить островки СрО и богатые области СрО во фрагментированной ДНК. Неспецифичные к метилированию ферменты предпочтительно выбраны из группы, состоящей из МзеЕ ВГаЕ С'.'5р6Е ТгиН, ТуиП, ТГ119Е Туи9Е ΜαοΙ и ХзрГ Особенно предпочтительным является применение двух или трех таких ферментов. Особенно предпочтительным является применение комбинации ферментов ΜδβΙ, ВЕ-ιΙ и С8р6Г

Затем фрагментированную ДНК можно лигировать с олигонуклеотидами-адаптерами для облегчения протекания последующей ферментативной амплификации. В данной области известно лигирование олигонуклеотидов к затупленным и липким концевым фрагментам ДНК, и его проводят посредством дефосфорилирования концов (например, с использованием бычьей или креветочной щелочной фосфатазы) и последующего лигирования с использованием ферментов лигаз (например, Т4 ДНК-лигазы) в присутствии 6ЛТР. Как правило, олигонуклеотиды-адаптеры имеют длину по меньшей мере 18 пар оснований.

На третьей стадии ДНК (или ее фрагменты) затем расщепляют с помощью одной или более чувствительных к метилированию рестриктаз. Расщепление проводят таким образом, что гидролиз ДНК в сайтах рестрикции является показателем статуса метилирования определенного динуклеотида СрО по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕВ4; ВШХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; БΗΟX2; БЕО ΙΌ ΝΟ:6; ΟΝ027; ЬВЛТ; Ш-12ВВ1; ТГЛР2С; ВСЬ2; ЕШ; РВЭМ14; БЕО ΙΌ ΝΟ:81; ЛВ^Л; УЛХ1.

Предпочтительно специфическая к метилированию рестриктаза выбрана из группы, состоящей из В81 Е1, Нда Ι Н1пР1, Нру991, Л\а Ι, Все λΙ, Вза ΗΙ, βΪ8Ι, ВбО, В8Ы2361, ЛееИ, β8ΐΓΝΙ, МсгВС, ОШ, ΜνηΙ, НраП (НарП), НЫаЕ ЛсП, БшаЕ Н1пРП, НруСН4Ш, ЕаД и смеси двух или более указанных выше ферментов. Предпочтительной является смесь, содержащая рестриктазы ВзО, НраП, НруСН4Ш и НшРП.

На четвертой стадии, которая является необязательным, но предпочтительным вариантом осуществления, фрагменты рестрикции амплифицируют. Это предпочтительно проводят с использованием полимеразной цепной реакции, и указанные амплификаты могут содержать подходящие обнаруживаемые метки, описанные выше, а именно флуорофоры, радионуклиды и массовые метки. Особенно предпочтительной является амплификация с использованием фермента для амплификации и по меньшей мере двух праймеров, содержащих в каждом случае смежную последовательность длиной по меньшей мере 16 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или же

- 20 018010 стких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ Ν0:1-δΕΟ ΙΌ Ν0:12; δΕΟ ΙΌ Ν0:79-δΕΟ ΙΌ Ν0:83 и комплементарных им последовательностей. Предпочтительно указанная смежная последовательность имеет длину по меньшей мере 16, 20 или 25 нуклеотидов. В альтернативном варианте осуществления указанные праймеры могут быть комплементарны любым адаптерам, связанным с фрагментами.

На пятой стадии амплификаты обнаруживают. Обнаружение можно проводить любыми известными в данной области способами, например гель-электрофорезом, гибридизацией, включением обнаруживаемых меток в продукты ПЦР, анализом ДНК-микрочипов, МАЬ-ΌΙ или ΕδΙ анализом. Предпочтительно указанное обнаружение проводят гибридизацией по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой или пептидной нуклеиновой кислотой, содержащей в каждом случае смежную последовательность длиной по меньшей мере 16 нуклеотидов, которая комплементарна или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ Ν0:1-δΕΟ ΙΌ Ν0:12; δΕΟ ΙΌ Ν0:79-δΕΟ ΙΌ Ν0:83 и комплементарных им последовательностей. Предпочтительно указанная смежная последовательность имеет длину по меньшей мере 16, 20 или 25 нуклеотидов.

После определения состояния или уровня метилирования геномных нуклеиновых кислот о наличии, отсутствии нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), судят на основе состояния или уровня метилирования по меньшей мере одной динуклеотидной последовательности СрС в δΕΟ ΙΌ Ν0:1-δΕΟ ΙΌ Ν0:12; δΕΟ ΙΌ Ν0:79-δΕΟ ΙΌ Ν0:83, или в среднем, или по показателю, отражающему среднее состояние метилирования множества динуклеотидных последовательностей СрС в δΕΟ ΙΌ Ν0:1-δΕΟ ΙΌ Ν0:12; δΕΟ ΙΌ Ν0:79-δΕΟ ΙΌ Ν0:83, где метилирование связано с наличием нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). В том случае, когда метилирование определяют количественными способами, предел отсечения для определения указанного наличия метилирования, предпочтительно равняется нулю (т.е., где образец показывает любую степень метилирования, то его определяют как имеющий метилированный статус в анализированном положении СрС). Тем не менее, можно предвидеть, что специалист в данной области может пожелать скорректировать указанное значение порога отсечения для обеспечения теста с особенно предпочтительной чувствительностью или специфичностью. Следовательно, указанное значение порога отсечения можно увеличить (с повышением, таким образом, специфичности), где указанное значение порога отсечения может находиться в пределах, выбранных из группы, состоящей из 0-5%, 5-10%, 10-15%, 1520%, 20-30% и 30-50%. Особенно предпочтительными порогами отсечения являются значения 10, 15, 25 и 30%.

После определения метилирования и/или экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТСЕК4; КиЯХ1; ΕνΧ2; ΕνΧ-1; δΗ0Χ2; δΕΟ ΙΌ Ν0:6; С№27; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТРАР2С; ВСЬ2; ΕΝ2; РКОМ14; δΕΟ ΙΌ Ν0:81; АКГО5А; VΑΧ1, определяют наличие или отсутствие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), где гиперметилирование и/или низкая экспрессия указывает на наличие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), и гипометилирование и/или повышенная экспрессия указывает на отсутствие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), у индивида. Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Дополнительные усовершенствования.

Раскрытое изобретение относится к обработанным нуклеиновым кислотам, полученным из геномных последовательностей δΕΟ ΙΌ Ν0:1-δΕΟ ΙΌ Ν0:12; δΕΟ ΙΌ Ν0:79-δΕΟ ΙΌ Ν0:83, где обработка подходит для преобразования по меньшей мере одного неметилированного основания цитозина геномной последовательности ДНК в урацил или другое основание, которое обнаруживается иначе по сравнению с цитозином в отношении гибридизации. Интересующие геномные последовательности могут содержать одно или несколько последовательных метилированных положений СрС. Предпочтительно указанная обработка включает применение реагента, выбранного из группы, состоящей из бисульфита, дисульфита, вторичного кислого сульфита или их комбинаций. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к неприродным модифицированным нуклеиновым кислотам, содержащим последовательность длиной по меньшей мере 16 смежных нуклеотидных оснований, последовательности, выбранной из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ Ν0:13-δΕΟ ΙΌ Ν0:60; δΕΟ ΙΌ Ν0:84-δΕΟ ΙΌ Ν0:103. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная нуклеиновая кислота имеет длину по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250 или 500 пар оснований сегмента последовательности нуклеиновой кислоты δΕΟ ΙΌ Ν0:13-δΕΟ ΙΌ Ν0:60; δΕΟ ΙΌ Ν0:84-δΕΟ ΙΌ Ν0:103. Особенно предпочтительной является молекула нуклеиновой кислоты, которая не идентична или не комплементарна всем или части последовательностей δΕΟ ΙΌ Ν0:13-δΕΟ ΙΌ Ν0:60; δΕΟ ΙΌ Ν0:84-δΕΟ ΙΌ Ν0:103, но не последовательностям δΕΟ ΙΌ Ν0:1-δΕΟ ΙΌ Ν0:12; δΕΟ ΙΌ Ν0:79-δΕΟ ΙΌ Ν0:83, или другим есте

- 21 018010 ственным ДНК.

Предпочтительно, чтобы указанная последовательность содержала по меньшей мере один динуклеотид СрС, ТрА или СрА и комплементарные ему последовательности. Последовательности 8ЕО ГО Н0:13-8ЕО ГО N0:60; 8Е0 ГО Н0:84-8ЕО ГО N0:103 представляют неприродные модифицированные варианты нуклеиновой кислоты с последовательностями 8Е0 ГО Н0:1-8Е0 ГО N0:12; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:83, где модификация каждой геномной последовательности приводит к синтезу нуклеиновой кислоты с последовательностью, которая является уникальной и отличной от указанной геномной последовательности в следующем. Для каждой смысловой цепи геномной ДНК, например 8Е0 ГО N0:1-8Е0 ГО N0:12; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:83, раскрыто четыре преобразованных варианта. Первый вариант, в котором С преобразован в Т, но СрС остается СрС (т.е. соответствует случаю, когда для геномной последовательности все остатки С динуклеотидных последовательностей СрС метилированы и, таким образом, не подверглись преобразованию); второй вариант представляет комплемент раскрытой геномной последовательности ДНК (т.е. антисмысловую цепь), где С преобразован в Т, но СрС остается СрС (т.е. соответствует случаю, когда все остатки С динуклеотидных последовательностей СрС метилированы и, таким образом, не подверглись преобразованию). Высокометилированные последовательности 8Е0 ГО Н0:1-8Е0 ГО N0:12; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:83 соответствуют последовательностям 8Е0 ГО Н0:13-8ЕО ГО N0:36; 8Е0 ГО Н0:84-8ЕО ГО N0:93. Обеспечивается третий химически преобразованный вариант каждой геномной последовательности, где С преобразован в Т для всех С остатков, включая таковые в СрС-динуклеотидных последовательностях (т.е. соответствует случаю, когда для геномных последовательностей все С остатки СрС динуклеотидных последовательностей не метилированы); последний химически модифицированный вариант каждой последовательности раскрывает комплемент раскрытой последовательности геномной ДНК (т.е. антисмысловую цепь), где С преобразован в Т для всех С остатков, включая таковые в СрСдинуклеотидных последовательностях (т.е. соответствует случаю, когда для комплемента (антисмысловой цепи) каждой геномной последовательности все С остатки СрС-динуклеотидных последовательностей не метилированы). Модицифированные последовательности с низким метилированием 8Е0 ГО Н0:1-8Е0 ГО N0:12; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:83 соответствуют последовательностям 8Е(9 ГО ^:37-8Ер ГО N0:60; 8Е(9 ГО ^:84-8Ер ГО N0:93.

Следовательно, важно, что последовательности нуклеиновых кислот и молекулы 8Е0 ГО Н0:13-8ЕО ГО N0:60; 8Е0 ГО Н0:84-8ЕО ГО N0:103 не принимают участия или не связаны с обнаружением или диагностикой нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления изобретение дополнительно относится к олигонуклеотидам или олигомерам, которые могут использоваться в способах по изобретению для обнаружения состояния метилирования цитозина в геномной или обработанной (химически модифицированной) ДНК 8Е0 ГО Н0:1-8ЕС ГО N0:60; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:103. Указанные олигонуклеотидные или олигомерные нуклеиновые кислоты обеспечивают новые диагностические средства. Указанные олигонуклеотид или олигомер, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая идентична, гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях (которые определены в настоящем описании выше) с обработанной последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО Н0:13-8ЕО ГО N0:60; 8Е0 ГО Н0:84-8ЕО ГО N0:103 и/или комплементарными им последовательностями, или геномной последовательностью 8Е0 ГО N0:1-8Е0 ГО N0:12; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:83, и/или комплементарными им последовательностями.

Таким образом, настоящее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот (например, олигонуклеотиды и пептидные нуклеиновые кислоты (ΡNА) (ΡNА-олигомеры), которые гибридизуются в условиях средней жесткости или жестких условиях со всеми или частью последовательностей 8Е0 ГО Н0:1-8Е0 ГО N0:60; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:103 или комплементарными им последовательностями. Особенно предпочтительной является молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях со всеми или частью последовательностей 8Е0 ГО N0:13-8Ε^ ГО N0:60; 8Е0 ГО N0:84-8Ε^ ГО N0:103, но не последовательностями 8Е0 ГО Н0:1-8Е0 ГО N0:12; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:83 или другими человеческими геномными ДНК.

Как правило, длина идентичного или гибридизующегося фрагмента гибридизующихся нуклеиновых кислот составляет по меньшей мере 9, 16, 20, 25, 30 или 35 нуклеотидов. Однако применимость по изобретению имеет более длинные молекулы, и, таким образом, они входят в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно гибридизующийся фрагмент по изобретению гибридизующихся нуклеиновых кислот по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98%, или на 100% идентичен последовательности или ее участку 8Е0 ГО Н0:1-8Е0 ГО N0:60; 8Е0 ГО Н0:79-8ЕО ГО N0:103 или их комплементарным

- 22 018010 последовательностям.

Гибридизующиеся нуклеиновые кислоты типа, описанного в настоящем описании, можно использовать, например, в качестве праймера (например, праймера для ПЦР) или диагностического зонда или праймера. Предпочтительно гибридизацию олигонуклеотидного зонда с нуклеиновой кислотой образца проводят в жестких условиях, и зонд на 100% идентичен последовательности-мишени. Стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты или гибрида выражается в виде температуры плавления или Тт, которая является температурой, при которой зонд диссоциирует от ДНК-мишени. Температуру плавления используют для определения условий необходимой жесткости.

Для последовательностей-мишеней, которые близки или, по существу, идентичны соответствующей последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΘ:1-8ΕΟ ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ ΝΟ:79-8ΕΟ ΙΌ N0:83 (такой как аллельные варианты и 8ΝΡ), в большей степени идентичны, является подходящим вначале установить самую низкую температуру, при которой имеет место только гомологичная гибридизация при определенной концентрации соли (например, 88С или 88РЕ). Затем с учетом того, что со снижением Тт на 1°С имеет место 1% ошибочных спариваний, следовательно, температуру конечного промывания при постановке реакции гибридизации уменьшают (например, если проводят поиск последовательностей, которые обладают идентичностью >95% с зондами, то температуру конечного промывания снижают на 5°С). На практике изменение Тт может составлять от 0,5 до 1,5°С на 1% ошибочного спаривания.

Примеры олигонуклеотидов по изобретению с длиной X (в нуклеотидах), как указано положениями полинуклеотида по отношению, например, к 8Е0 ΙΌ N0:1, включают таковые, соответствующие рядам (смысловым и антисмысловым рядам) последовательно перекрывающихся олигонуклеотидов длиной X, где олигонуклеотиды в каждом последовательно перекрывающемся ряду (соответственно данному значению X) определяются как ограниченный ряд Ζ олигонуклеотидов по положениям в нуклеотиде:

η до (η + (Х-1)), где η=1, 2, 3, ..., (Υ-(Χ-1));

Υ равен длине (в нуклеотидах или парах оснований) 8Е0 ΙΌ N0:1 (3905);

X равен обычной длине (в нуклеотидах) каждого олигонуклеотида в ряду (например, Х=20 для группы последовательно перекрывающихся 20-меров);

количество (Ζ) последовательно перекрывающихся олигомеров длиной X для данной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 длиной Υ равно Υ-^-:!), например Ζ=3905-19=3886 для каждого смыслового или антисмыслового ряда 8Е0 ΙΌ N0:1, где X=20.

Предпочтительно ряд ограничивается такими олигомерами, которые содержат по меньшей мере один динуклеотид СрО, ТрО или СрА.

Примеры 20-мерных олигонуклеотидов по изобретению включают следующий ряд из 3905 олигомеров (и антисмысловые комплементарные к ним), указанные положениями в полинуклеотидах по отношению к 8Е0 ΙΌ N0:1:

1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, ... и 3886-3905.

Предпочтительно ряд ограничивается такими олигомерами, которые содержат по меньшей мере один динуклеотид СрО, ТрО или СрА.

Аналогично примеры 25-мерных олигонуклеотидов по изобретению включают следующий ряд 3881 олигомеров (и антисмысловый ряд, комплементарный ему), указанные положениями в полинуклеотидах по отношению к 8Е0 ΙΌ N0:1:

1-25, 2-26, 3-27, 4-23, 5-29, ... и 3886-3905.

Предпочтительно ряд ограничивается такими олигомерами, которые содержат по меньшей мере один динуклеотид СрО, ТрО или СрА.

Настоящее изобретение включает для каждой из последовательностей 8Е0 ΙΌ NΟ:1-8Е^ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ NΟ:79-8Е^ ΙΌ N0:103 (смысловые и антисмысловые) множественные последовательно перекрывающиеся ряды олигонуклеотидов или модифицированных олигонуклеотидов длиной X, где, например, X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 или 35 нуклеотидам.

Олигонуклеотиды или олигомеры по настоящему изобретению представляют эффективные инструменты, подходящие для установлениия генетических и эпигенетических параметров геномной последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1-8Е^ ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ NΟ:79-8Е^ ΙΌ N0:83. Предпочтительные ряды таких олигонуклеотидов или модифицированных олигонуклеотидов длиной X представляют последовательно перекрывающиеся ряды олигомеров 8Е0 ΙΌ NΟ:1-8Е^ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ NΟ:79-8Е^ ΙΌ N0:103 (и комплементарных им последовательностей). Предпочтительно указанные олигомеры содержат по меньшей мере один динуклеотид СрО, ТрО или СрА.

Особенно предпочтительные олигонуклеотиды или олигомеры по настоящему изобретению представляют таковые, в которых цитозин динуклеотида СрО (или его соответствующего преобразованного динуклеотида ТрО или СрА) находится в средней трети олигонуклеотида; т.е., когда олигонуклеотид имеет длину, например, 13 оснований, то динуклеотид СрО, ТрО или СрА находится в пятом-девятом нуклеотиде от 5'-конца.

Олигонуклеотиды по изобретению также можно модифицировать химическим связыванием олигонуклеотида с одной или более группами или конъюгатами для повышения активности, стабильности или

- 23 018010 обнаружения олигонуклеотида. Такие группы или конъюгаты включают хромофоры, флуорофоры, липиды, такие как холестерин, холиевую кислоту, тиоэфир, алифатические цепи, фосфолипиды, полиамины, полиэтиленгликоль (ПЭГ), пальмитильные группы и другие, раскрытые, например, в патентах США № 5514758, 5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5597696 и 5958773. Зонды также могут находиться в виде РЫА (пептидной нуклеиновой кислоты), которая обладает особенно предпочтительными свойствами к спариванию. Таким образом, олигонуклеотид может включать другие присоединенные группы, такие как пептиды, и может включать запущенные гибридизацией расщепляющие агенты (Кго1 е! а1., ВюТесйтдиез, 6:958-976, 1988) или интеркалирующие агенты (2оп, РНагт. Кез., 5:539-549, 1988). Наконец, олигонуклеотид можно конъюгировать с другой молекулой, например хромофором, флуорофором, пептидом, запущенным гибридизацией сшивающим агентом, транспортером, запущеным гибридизацией расщепляющим агентом и т.д.

Также олигонуклеотид может содержать по меньшей мере один известный в данной области модифицированный сахар и/или основание или может включать модифицированный скелет или неприродную межнуклеозидную связь.

Олигонуклеотиды или олигомеры по конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения, как правило, используют в рядах, которые содержат по меньшей мере один олигомер для анализа каждого из динуклеотидов СрО геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из БЕР ΙΌ N0:1-БЕр ΙΌ N0:12; БЕР ΙΌ Н0:79-БЕР ГО N0:83 и комплементарных им последовательностей, или соответствующего динуклеотида СрО, ТрО или СрА в последовательности обработанных нуклеиновых кислот БЕО ГО N0:13-БЕ^ ГО N0:60; БЕО ГО Н0:84-БЕР ГО N0:103 и комплементарных им последовательностей. Однако полагается, что в результате экономических или других факторов может быть предпочтительным проводить анализ ограниченного числа динуклеотидов СрО в данных указанных последовательностях, и, следовательно, состав ряда олигонуклеотидов будет изменяться.

Следовательно, в конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ряду по меньшей мере 2 олигонуклеотидов и/или РNА-олигомеров, подходящих для обнаружения состояния метилирования цитозина в обработанной геномной ДНК (БЕО ГО Н0:13-БЕР ГО N0:60; БЕР ГО Ы0:84-8Ер ГО N0:103) или в геномной ДНК (БЕр ГО Ы0:1-8Ер ГО N0:12; БЕр ГО Н0:79-БЕр ГО N0:83 и комплементарных им последовательностях). С помощью данных зондов становится возможным диагностировать и обнаруживать нарушения клеточной пролиферации, предпочтительно приведенные в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциному легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких. Ряд олигомеров также можно использовать для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (8ЦР) в обработанной геномной ДНК (БЕр ГО Ы0:13-8Ер ГО N0:60; БЕр ГО Ы0:84-8Ер ГО N0:103) или в геномной ДНК (БЕр ГО Н0:1-БЕР ГО N0:12; БЕр ГО Н0:79-БЕР ГО N0:83 и комплементарных им последовательностей).

В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере один и более предпочтительно все члены ряда олигонуклеотидов связаны с твердой фазой.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ряду по меньшей мере 2 олигонуклеотидов, которые используются в качестве праймера - олигонуклеотидов для амплификации последовательностей ДНК БЕр ГО Н0:1-БЕР ГО N0:60; БЕр ГО Н0:79-БЕР ГО N0:103 и комплементарных им последовательностей.

Полагается, что олигонуклеотиды могут составлять все или часть чипов или ДНК-чипов (т.е. расположение различных олигонуклеотидов и/или РNА-олигомеров, связанных с твердой фазой). Такие чипы с различными последовательностями олигонуклеотидов и/или РNА-олигомеров можно охарактеризовать, например, в том отношении, что они расположены на твердой фазе в виде прямоугольной или шестиугольной решетки. Поверхность твердой фазы может быть из силикона, стекла, полистирола, алюминия, стали, железа, меди, никеля, серебра или золота. Также можно использовать нитроцеллюлозу, а также пластики, такие как нейлон, которые могут находиться в виде гранул или также в виде резиновой матрицы. Обзор данных предшествующего уровня по производству чипов олигомеров можно найти в №11иге Оепебсз (№11иге Оепебсз Бирр1етеп!, Уо1ите 21, Фапиагу 1999 и в источниках литературы, цитированных в настоящем описании). Часто используют меченные флуоресцентной меткой зонды для сканирования иммобилизованных ДНК-чипов. Простое присоединение Су3 и Су5 красителей к 5'-ОН конкретного зонда особенно подходит в качестве флуоресцентных меток. Обнаружение флуоресценции гибридизованных зондов можно проводить, например, с помощью конфокального микроскопа. Су3 и Су5 красители, помимо многих других, являются промышленно доступными.

Также полагается, что олигонуклеотиды или их конкретные последовательности могут составлять все или часть виртуальных чипов, где олигонуклеотиды или их конкретные последовательности используют, например, в качестве определителей как часть или в комбинации с другой популяцией уникальных меченых зондов для анализа сложной смеси анализируемых веществ. Такой метод, например, описан в заявке на патент США 2003/001391 (серийный номер заявки на патент США 09/898743, опубликованной 16 января 2003 г.). В данных методах получают достаточное количество меток, так что каж

- 24 018010 дая нуклеиновая кислота в сложной смеси (т.е. каждое анализируемое вещество) может быть уникально связана с уникальной меткой и, таким образом, обнаруживаться (каждую метку непосредственно определяют количественно, приводя к цифровым данным по каждому виду молекул в смеси).

Особенно предпочтительным является то, что олигомеры по изобретению используют для обнаружения или диагностики нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Наборы.

Кроме того, дополнительным аспектом настоящего изобретения является набор, содержащий средства для определения экспрессии метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ6ЕР4; РυNΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕЦ ГО N0:6; С^27; БРАТ; 1Б-12РВ1; ТЕАР2С; ВСБ2; Е№; РРЭМ14; 8ЕБ) ГО N0:81; АРГО5А; УАХ1. Средства для определения экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ6ЕР4; РиЫХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕБ) ГО N0:6; Ш027; БРАТ; 1Б-12РВ1; ТЕАР2С; ВСБ2; Е№; РРЭМ14; 8ЕЦ ГО N0:81; АЕГО5А; УАХ1, предпочтительно включают бисульфитсодержащий реагент; один или множество олигонуклеотидов, последовательности которых в каждом случае идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной 9 или более предпочтительно 18 оснований последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО Н0:Е3-8ЕЦ ГО N0:60; 8ЕЦ ГО Н0:84-8ЕЦ ГО N0:103, и, необязательно, инструкции для проведения или оценки описанного способа анализа метилирования. В одном из вариантов осуществления последовательность оснований указанных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере один динуклеотид СрС. ТрС или СрА. В дополнительном варианте осуществления указанный набор может дополнительно содержать стандартные реагенты для специфического анализа метилирования СрС-положений, где указанный анализ включает один или более из следующих тестов: М8-8NиРΕ, М8Р, МеШуЫдЦ™, НеаууМе£Ъу1, С0ВРА и секвенирование нуклеиновой кислоты. Однако набор соответственно направлениям настоящего изобретения также может содержать только часть указанных выше компонентов.

В предпочтительном варианте осуществления набор может содержать дополнительные бисульфитные реагенты для преобразования, выбранные из группы, состоящей из буфера для денатурации ДНК; буфера для сульфонирования; реагентов или наборов для выделения ДНК (например, преципитации, ультрафильтрации, аффинную колонку); буфера для десульфонирования и компонентов для выделения ДНК.

В дополнительном альтернативном варианте осуществления набор может содержать упакованные в отдельных контейнерах полимеразу и буфер для проведения реакции, оптимизированный для элонгации праймера, опосредованной полимеразой, такой как в ПЦР. В другом варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит средства для получения биологического образца у пациента. Предпочтительным является набор, который дополнительно содержит подходящий контейнер, содержащий средства для определения метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТ6ЕР4; РυNΧ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕЦ ГО N0:6; С№027; БРАТ; ББ-12РВ1; ТЕАР2С; ВСБ2; Е№; РРЭМ14; 8ЕБ) ГО N0:81; АРГО5А; УАХ1, в биологическом образце, взятом у пациента, и наиболее предпочтительно дополнительно содержит инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

В предпочтительном варианте осуществления набор содержит:

(a) бисульфитный реагент;

(b) подходящий контейнер, содержащий указанный бисульфитный реагент и биологический образец пациента;

(c) по меньшей мере один ряд праймеров-олигонуклеотидов, содержащий два олигонуклеотида, последовательности которых в каждом случае идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной 9 или более предпочтительно 18 оснований последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО Н0:Е3-8ЕЦ ГО N0:60; 8ЕЦ ГО Н0:84-8ЕЦ ГО N0:103; и, необязательно, (б) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления набор содержит:

(a) бисульфитный реагент;

(b) подходящий контейнер, содержащий указанный бисульфитный реагент и биологический образец пациента;

(c) по меньшей мере один олигонуклеотид и/или РNА-олигомер длиной по меньшей мере 9 или 16 нуклеотидов, который идентичен или гибридизуется с одной из предварительно обработанных последовательностей нуклеиновых кислот 8ЕЦ ГО Н0:Е3-8ЕЦ ГО N0:60; 8ЕЦ ГО Н0:84-8ЕЦ ГО N0:103 и комплементарных им последовательностей; и, необязательно, (б) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

- 25 018010

В альтернативном варианте осуществления набор содержит:

(a) бисульфитный реагент;

(b) подходящий контейнер, содержащий указанный бисульфитный реагент и биологический образец пациента;

(c) по меньшей мере один ряд праймеров-олигонуклеотидов, содержащий два олигонуклеотида, последовательности которых в каждом случае идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной 9 или более предпочтительно 18 оснований последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ ΝΟ:13-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ ΝΟ:84-8ΕΟ ΙΌ N0:103;

(б) по меньшей мере один олигонуклеотид и/или ΡΝΑ-олигомер длиной по меньшей мере 9 или 16 нуклеотидов, который идентичен или гибридизуется с одной из предварительно обработанных последовательностей нуклеиновых кислот 8Е0 ΙΌ Ν0:13-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ Ν0:84-8ΕΟ ΙΌ N0:103 и комплементарных им последовательностей; и, необязательно, (е) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

Также набор может содержать другие компоненты, такие как буферы или растворы, подходящие для блокирования, промывания или покрытия, упакованные в отдельные контейнеры.

Другой аспект изобретения относится к набору для использования при определении наличия и/или диагностики нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Указанный набор предпочтительно содержит средства для определения уровня транскрипции по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КШХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; Ш027; ЬКАТ; ΙΕ-12ΒΒ1; ТЕАР2С; БСЬ2; Е№; РВЭМ14; 8Е0 ΙΌ N0:81; ΑΚΙΌ5Α; УАХ1, и средства для определения метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КиКХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; Ш027; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКОМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; АКЮ5А; УАХ1.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для С0ВКА™) для анализа С0ВКА™ могут включать, но не ограничиваются ими, праймеры для ПЦР по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КиНХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; Ш027; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РРПМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; АКГО5А; УАХ1; рестриктазу и соответствующий буфер; олигонуклеотид, гибридизующийся с геном; контрольный гибридизующийся олигонуклеотид; набор для мечения олигонуклеотидного зонда киназой и меченые нуклеотиды. Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для теста МеШуЬщЫ™) для анализа МеШуЬщЫ™ могут включать, но не ограничиваются ими, ПЦРпраймеры для преобразованной под действием бисульфита последовательности по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КиНХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; Ш027; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКБМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; АК1О5А; УАХ1; бисульфит-специфические зонды (например, ТацМап® или ЫдЫсус1ег®); оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды и Тац-полимеразу.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для М8-8М.1РЕ™) для анализа М8-8Ш1РЕ™ могут включать, но не ограничиваются ими, ПЦР-праймеры для определенного гена (или обработанной бисульфитом последовательности ДНК или островка СрО); оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды; набор для экстракции геля; положительные контрольные праймеры; праймеры М8-8М.1РЕ™ для преобразованной под действием бисульфита последовательности по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КШХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; СМ27; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКЭМ14; 8Е0 ΙΌ N0:81; АЕЮ5А; УАХ1; буфер для реакции (для реакции Мк-БШРЕ™) и меченые нуклеотиды.

Характерные реагенты (например, которые можно найти в обычном наборе для М8Р) для анализа М8Р могут включать, но не ограничиваются ими, метилированные и неметилированные ПЦР-праймеры для преобразованной под действием бисульфита последовательности по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; ВИКХ!; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; СМ27; ЬКАТ; ΙΕ-12ΚΒ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКОМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; АКГО5А; УАХ1; оптимизированные буферы для ПЦР и дезоксинуклеотиды и специфические зонды.

Кроме того, дополнительным аспектом настоящего изобретения является альтернативный набор, содержащий средства для определения метилирования по меньшей мере одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТОЕК4; КиНХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ΙΌ N0:6; СМ27; ЬКАТ; Ш-12КВ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РКБМ14; 8ЕО ΙΌ N0:81; АКГО5А; УАХ1, где указанные средства предпочтительно содержат по меньшей мере одну специфическую к метилированию рестриктазу; один или множество праймеров-олигонуклеотидов (предпочтительно одну или множе

- 26 018010 ство пар праймеров), подходящих для амплификации последовательности, содержащей по меньшей мере один динуклеотид СрС последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ ΝΟ:1-8ΕΟ ΙΌ N0:12; 8Е0 ГО Ν0:79-8ΕΟ ГО N0:83; и, необязательно, инструкции для постановки и оценки описанного способа анализа метилирования. В одном из вариантов осуществления последовательность оснований указанных олигонуклеотидов идентична, комплементарна или гибридизуется в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной по меньшей мере 18 оснований последовательности, выбранной из 8 ЕС) ГО ΝΟ:1-8ΕΡ ΙΌ N0:12; 8ЕС) ΙΌ ΝΟ:79-8Ερ ΙΌ N0:83.

В дополнительном варианте осуществления указанный набор содержит один или множество олигонуклеотидных зондов для анализа фрагментов расщепления, где предпочтительно указанные олигонуклеотиды идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной по меньшей мере 16 оснований последовательности, выбранной из 8ЕС) ΙΌ ^:1-8Ер ΙΌ N0:12; 8ЕС) ΙΌ ^:79-8Ер ΙΌ N0:83.

В предпочтительном варианте осуществления набор может содержать дополнительные реагенты, выбранные из группы, состоящей из буфера (например, буферов для рестриктазы, ПЦР, хранения или промывания); реагенты или наборы для выделения ДНК (например, преципитация, ультрафильтрация, аффинная колонка); компоненты для выделения ДНК.

В дополнительном альтернативном варианте осуществления набор может содержать упакованные в отдельных контейнерах полимеразу и буфер для проведения реакции, оптимизированный для элонгации праймера, опосредованного полимеразой, такой как в ПЦР. В другом варианте осуществления изобретения набор дополнительно содержит средства для получения биологического образца у пациента. В предпочтительном варианте осуществления набор содержит: (а) специфическую к метилированию рестриктазу; (Ы) подходящий контейнер, содержащий указанный реагент и биологический образец пациента; (с) по меньшей мере один ряд олигонуклеотидов одной или множества нуклеиновых кислот или пептидных нуклеиновых кислот, которые идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной по меньшей мере 9 оснований последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ Н0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ Н0:79-8ЕО ΙΌ N0:83; и, необязательно, (ά) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

В альтернативном предпочтительном варианте осуществления набор содержит: (а) специфическую к метилированию рестриктазу; (Ы) подходящий контейнер, содержащий указанный реагент и биологический образец пациента; (с) по меньшей мере один ряд праймеров-олигонуклеотидов, подходящих для амплификации последовательности, содержащей по меньшей мере один динуклеотид СрС последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ Н0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ Н0:79-8ЕО ΙΌ N0:83; и, необязательно, (ά) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

В альтернативном варианте осуществления набор содержит: (а) специфическую к метилированию рестриктазу; (Ы) подходящий контейнер, содержащий указанный реагент и биологический образец пациента; (с) по меньшей мере один ряд праймеров-олигонуклеотидов, подходящих для амплификации последовательности, содержащей по меньшей мере один динуклеотид СрС последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ Н0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ Н0:79-8ЕО ΙΌ N0:83; (ά) по меньшей мере один ряд олигонуклеотидов одной или множества нуклеиновых кислот или пептидных нуклеиновых кислот, которые идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной по меньшей мере 9 оснований последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ Н0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ Н0:79-8ЕО ΙΌ N0:83; и, необязательно, (е) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

Также набор может содержать другие компоненты, такие как буферы или растворы, подходящие для блокирования, промывания или покрытия, упакованные в отдельные контейнеры.

Изобретение дополнительно относится к набору для использования при диагностике наличия или отсутствия нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких), у индивида с помощью анализа со специфическими к метилированию рестриктазами. Указанный набор содержит контейнер и компонент на основе ДНК-микрочипов. Указанный компонент на основе ДНК-микрочипов представляет поверхность, на которой иммобилизовано множество олигонуклеотидов в определенных положениях, где олигонуклеотид содержит по меньшей мере один сайт метилирования СрС. По меньшей мере один из указанных олигонуклеотидов является специфическим по меньшей мере для одного гена или геномной последовательности, выбранной из группы, состоящей из РТСЕК4; КиЯХ1; ЕУХ2; ЕУХ-1; 8Н0Х2; 8ЕО ГО N0:6; €N027; ЬКАТ; ΙΌ-12ΚΒ1; ТЕАР2С; ВСЬ2; Е№; РК0М14; 8Е0 ΙΌ N0:81; ΛΚΙΌ5Λ; УАХ1, и содержит последовательность длиной по меньшей мере 15 пар оснований, но не более чем из 200 п.о., последовательности 8Е0 ΙΌ Н0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ Н0:79-8ЕО ΙΌ N0:83. Предпочтительно указанная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 пар оснований, но не более чем из 80 п.о., последовательности 8Е0 ΙΌ Н0:1-8Е0 ΙΌ N0:12; 8Е0 ΙΌ Н0:79-8ЕО ΙΌ N0:83. Дополнительно, предпочтительно, чтобы указанная последовательность имела длину по меньшей мере 20 пар оснований, но не более чем из 30 п.о., последовательности 8ЕС) ГО ^:1-8Ер ГО N0:12; 8ЕС) ГО ^:79-8Ер ГО N0:83.

- 27 018010

Предпочтительно, чтобы указанный набор для тестирования дополнительно содержал компонент рестриктазу, включающий одну или множество специфических к метилированию рестриктаз.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к указанному набору для тестирования дополнительно отличается тем, что он содержит по меньшей мере одну специфическую к метилированию рестриктазу, в котором олигонуклеотиды содержат сайт рестрикции для указанной по меньшей мере одной специфической к метилированию рестриктазы.

Набор может дополнительно содержать один или несколько из следующих компонентов, которые известны в данной области для обогащения ДНК: белковый компонент, где указанный белок избирательно связывается с метилированной ДНК; триплекс-образующий компонент нуклеиновой кислоты, один или множество линкеров, необязательно в подходящем растворе; соединения или растворы для проведения лигирования, например буферы для лигаз; соединения или растворы для проведения колоночной хроматографии; соединения или растворы для проведения обогащения, основанного на иммунологических методах (например, иммунопреципитации); соединения или растворы для проведения амплификации нуклеиновых кислот, например ПЦР; красителей или нескольких красителей, если они применимы с реагентом для сочетания, если они применимы в растворе; соединения или растворы для проведения гибридизации и/или соединения или растворы для проведения стадии промывания.

Описанное изобретение дополнительно относится к композиции вещества, подходящей для обнаружения или диагностики нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2 (наиболее предпочтительно карциномы легких). Особенно предпочтительной является карцинома легких, выбранная из группы, состоящей из аденокарциномы легких; крупноклеточной карциномы легких; плоскоклеточной карциномы легких; мелкоклеточной карциномы легких.

Указанная композиция предпочтительно содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту длиной 18 пар оснований сегмента последовательности нуклеиновой кислоты 5>ЕО ΙΌ Ν0:Ε3-8ΕΟ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ Ν0:84-8ΕΟ ΙΌ N0:103 и одно или более соединений, выбранных из группы, включающей 1-5 мМ хлорида магния, 100-500 мкМ й№ТР, 0,5-5 Ед. Тад-полимеразы, бычий сывороточный альбумин, олигомер, в частности олигонуклеотид или пептидную нуклеиновую кислоту (ΡNΑ)-олигомер, где указанный олигомер содержит в каждом случае по меньшей мере одну последовательность оснований длиной по меньшей мере 9 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с заранее обработанной геномной ДНК 8Е0 ΙΌ N0:13-§Ε^ ΙΌ N0:60; 8Е0 ΙΌ N0:84-5^0 ΙΌ N0:103 и комплементарными им последовательностями. Предпочтительно, чтобы указанная композиция вещества содержала буферный раствор, подходящий для стабилизации указанной нуклеиновой кислоты в водном растворе и способствующий протеканию реакций с участием полимеразы в указанном растворе. В данной области известны подходящие буферы, и они являются промышленно доступными.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна нуклеиновая кислота имеет длину по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 250 или 500 пар оснований сегмента последовательности нуклеиновой кислоты 5>Е0 ΙΌ N0:13-5^0 ΙΌ N0:60; 8ЕО ΙΌ N0:84-^ ΙΌ N0:103.

- 28 018010

Таблица 1

Ген	Геномная последи ватед ьность 8ΕΡΙΕ>ΝΟ:	Предварительно обработанная метилированная поедедэвагельиость (смысловая) 8ΕΡΦΝΟ:	Предварительно обработанная метилированная последовательность (антисмысловая) ЙЕрГОЫО:	Предварительно обработанная неметилированкая последовательность (смысловая) 5Ер Ю ΝΟ:	Предварительно обработанная немегнлн рованная последователь ность (антисмысловая) 5ЕО ΪΟΝΟ:
κυΝχι	1	13	14	37	38
ЕУХ2	2	15	16	39	40
ЕУХ-1	3	17	18	41	42
РТСЕК.4	4	19	20	43	44
5НОХ2	5	21	22	45	46
Ген без комментария, поел едовате лъ ность, расположенная между генами ΤΪΜ14&5ΟΧ-2	6	23	24	47	48
СШ27	7	25	26	49	50
БЕАТ	8	27	28	51	52
Ιί-12ΚΒ1	9	29	30	53	54
ТРАР2С	10	31	32	55	56
ВСЕ2	11	33	34	57	58
ΑΚΙΟ5Α	12	35	36	59	60
Гомеобокс белок еп§гаПе4-2 (Ии-Еп2); ΕΝ2; НМЕ2	79	84	85	94	95
Домен белка «цинковый палец» 14 (РЕ домецсо держащий белок 14);РКОМ14	80	86	87	96	97
Локализация в хромосоме (ΝΓΒ136) хромосома: 15Ьр45139161 45139783	81	88	89	98	99
АТ-богатый интерактивный домен 5А; ΑΚΙΟ5А	82	90	91	100	100
Вентральный передний гомеобокс 1, УАХ1	83	92	93	102	ЮЗ

- 29 018010

Таблица 2

Ген	Предпочтительное нарушение
ЕУХ2	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких
кимх1	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких, предстательной железы и/или молочной железы
РТСЕК4	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких, предстательной железы и/или молочной железы
5НОХ2	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких, молочной железы и/или мочевого пузыря
Без комментария; слева: ΤΙΜ14/справа: 5ОХ-2	Карциномы, предпочтительно, карцинома предстательной железы
04027	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких и/или предстательной железы
ЬВАТ	Карциномы, предпочтительно, карцинома ободочной кишки
1Д-12КВ1	Карциномы, предпочтительно, карцинома предстательной железы и/или молочной железы
ЕУХ-1	Карциномы
ТГАР2С	Карциномы
ВСЬ2	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких
Гомеобокс белок епдгаИед-2 (Ни-Еп-2); ΕΝ2; НМЕ2	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких
Домен белка «цинковый палец» 14 (РК доменсодержащий белок 14); РКВМ14	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких
Локализация в хромосоме (МСВ136) хромосома: 15Ьр45139161-45139783	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких
АТ-богатый интерактивный домен 5А; АКЮ5А	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких
Вентральный передний гомеобокс 1/ УАХ1	Карциномы, предпочтительно, карцинома легких

- 30 018010

Таблица ЗА

Ген/геномная	Праймер 1 5Ξζ)	Праймер 2 ЗЕО	Зонд 3Εζ) 10
область	ТО N0:	Ю N0:	N0:
ЗЕО Ю N0:6	64	65	66
СЫ027	67	68	69
ЬКАТ	70	71	72
ТГАР2С	73	74	75
ЕУХ-1	76	77	78
ЕУХ2	79	80	81
ЗНОХ2	82	83	84
АКЮ5А	85	86	87
киих1	88	89	90
РТ5ЕН4	91	92	93
ВС1>2	94	95	96
1Ь-12КВ1	97	98	99

Таблица ЗВ

Последовательностьмишень (геномная)	олигонуклеотид δΕΟ ΙΟΝΟ:	Последовательность
8Е(? ГО N0: 79 Прямой праймер	104	1а1СЕС§§а§а«Псеа§(И1свН8
8Е0 10110:79 ЗОНД	105	йййв«йшйсйй?зН
5Ε0ΙΟΝΟ: 79 Обратный праймер	106	§а1аассс(аааасвсаас(с§аа
5Е<3 Ю N0: 80 Обратный праймер	107	скЙ1С81аа88а8СВ1еО
5ЕОГОМ>:80 Прямой праймер	108	евср1ВИС8СЯДГ1а£№В·
5Е0ГОМ0: 80 ЗОНД	109	сйасеЙПсвсйШв
8Ες)1ΟΝΟ:81 Прямой праймер	ПО	ЁПй@аааП(а1Таваа1аас8ас£П
8Е(} Ш ΝΟ: 81 Обратный праймер	111	сШсиаааа1аасс ^аасШастас^ас
5Е0 ΙΟΝΟ: 81 зонд	112	1аСЁ8ас8Исвс§йВ1сВ«
КЕр ГО МО: 82 зонд	113	ак1аа£ПскСЙЙкаПсв81П
5Е(}ГО1Ю: 82 Обратный праймер	114	1аааасвасвааасвасска1
5Ер 1ΡΝΟ:82 Прямой праймер	115	1сви;кппс8ввия1«еаёгк
5Εζ>1ϋΝ0: 83 зонд	116	аайкаая(ййаа1ааа<св1с81а
5Ε(2ΙΟΝΟ:33 Прямой праймер	117	аййсйютвттйсееааапскааапс
5Ер 10 N0: 83 Обратный праймер	Ιίί	<яас8асйа1ассй1ааас8сс1а

- 31 018010

Таблица 4А

Тип ткани	Все карциномы легких;	Адемокарцинс гиа легких	Круги сжпе- ТФ*1«И к^рцяноиа тпшм	Плоскоклеточная карцинома легким;	Мелкоклеточная карцинома • легких	Карцинома предстятельной
ί*2	>20	>20	>20	>20	>20	>20
N (общее)	61	21	12	21	7	10
Ген
ЕУХ2	76,8	82,4	75.0	90,5	100.0	60,0
κυΝχι	76,7	61,9	58.3	85,7	100,0	100.0
РТОЕВ4	66,1	66,7	-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------! 66,7	61,9	71,4	100,0
5НОХ2	63,9	38.1	50.0	90.5	71,4	20,0
8Е<? ШЬЮ: ύ	68,3	38,1	53,3	95,2	100,0	100,0
СМ027	55,9	38,1	41,7	71,4	4,4	100,0
1ЛАТ	41,7	42.9	33,3	42,9	42,9	30,0
1Ы2ЯВ1	24,9	14,3	16,7	28,6	42,9	100,0
ЕУХ-1	47,4	38,1	33,3	57,1	— 57, ί	___ίΟΰ,ΰ
ТТАР2С	68,1	38,1	58,3	85,7	ιοο,ο	100,0
ВСЬ2	14,1	23,8	ДЗ	14.3	0.0	50,0

Таблица 4В

Тип ткани	Карцинома ободочной и прямой , кишки	Карцинома молодой железы	Карцинома мочевого пузыря	Заболевание легких (не карциноме)	Нормальные легкие	Кровь
)рогоаыА доеень РМК ί%]	>20	>20	>20	>5	>5	>0,2
N (общее)	10	10	10	7	12	20
Ген
ЕУХ2	40,0	80,0	80,0	0,0	0,0	55,0
ΚϋΝΧΙ	20,0	80.0	60,0	0.0	0,0	0,0
РТ6ЕК4	0,0	80,0	30,0	0,0	0,0	0,0
6110X2	60,0	80,0	70,0	0,0	0,0	10,0
5Ε(?ΙϋΝΟ 6	60,0	50,0	50,0	28,6	33,3	25,0
€N02 7	90,0	70,0	70,0	0,0	8,3	25,0
ЬКАТ	90,0	60,0	60,0	0,0	0,0	0,0
1Ы2КВ1	0,0	80,0	30,0	85,7	100,0	0,0
ЕУХ-1	80,0	80,0	90,0	0,0	0,0	0,0
ТЕАР2С	100,0	100,0	60,0	14,3	0,0	25,0
ВСБ2	0,0	10,0	60,0	0,0	—ДО	0,0

Таблица 4С

Тип ткани	Все карциномы легких	Аденокарцинома легких	Крупнокттсчняя г КЭЕЦ4М011Я гдомч	Плоскоклеточная карцинома легких	Мелкоклеточная карцинома легких	Карцжсма предстатель ной железы
Пороговый уровень РМК	>20	>20	>20	>20	>20	>20
N (общее)	61	21	12	21	7	10
8Ε<2ΙϋΝΟ:
8ЕО ΙΟ ΝΟ. 79	38	29	33	57	29	55
8 ЕС? ΙΟ ΝΟ; 80	42	29	16	66	43	И
8ЕС}ГО ΝΟ: 81	24	24	8	28	29	11
8Εζ) ГО ΝΟ: 82	58	57	50	62	57	66
8Е(? ГО ΝΟ: 83	45	24	33	66	57	25

- 32 018010

Таблица 4Ό

Тип ткани	Норма «мая лредотатшъч? х»пеха	Карцйнслм СбоДОчНйЙИ Гфямойммм*	Нормально оОодочнм нрияО	Карцинома молочной железы	Нормальная молочная железа	Карцинома мочевого пузыря	Нормальный мочевой пузырь	Заболевание легких (не карцинома)	Нормальные легкие	Кровь
Пороговый уровень РМР (%)	>5	>20	>5	>20	>5	>20		>5	>5	>0,2
N (общее)	11	10	9	10	12	10	10	7	' 1 1 12	20
8Е0 ГО N0:
5Е0ГО N0: 79	0	40	0	50	0	40	0	0	0	0
5Е(} ГО N0: 80	0	50	0	40	0	30	0	0	0	0
8Е(?ГО ΝΟ: 81	0	40	0	20	0	10	0	0	0	0
5Εζ> ГО N0: 82	12	10	22	60	0	90	70	0	0	0
8Е0 ГО N0: 83	12	60	0	50	0	60	10	0	0	0

Таблица 5

	РТСЕК4	ΚϋΝΧΙ
кзсьс	Чувствительность	Специфичность	Чувствительность	Специфичность
Бронхиальный лаваж	52%	91%	39%	91%
Плазма крови	69%	91%	—	—

Примеры

Пример 1.

Анализ метилирования генов/последовательностей, приведенных в табл. 1, в образцах многих карцином и контрольных тканей проводили с помощью МБР в режиме реального времени с использованием компонентов, представленных в табл. 3.

Образцы.

Тип ткани	Количество образцов
Аденокарцинома легких	21
Крупноклеточная карцинома легких	12
Плоскоклеточная карцинома легких	21
Мелкоклеточная карцинома легких	7
Карцинома предстательной железы	10
Карцинома ободочной и прямой кишки	10

Карцинома молочной железы	10
Карцинома мочевого пузыря	10
Заболевание легких (не относящееся к карциноме)	7
Здоровое легкое	12
Кровь/эритроциты	20

- 33 018010

Экстракция и обработка бисульфитом ДНК.

ДНК выделяли из всех образцов согласно протоколу, описанному в О1адеп Сепотю ^NΑ НапйЬоок (Аидик! 2001) (р. 28-31, 44-47), в модификации. ДНК в элюате определяли количественно и элюат обрабатывали с использованием следующей реакции с бисульфитом.

Элюат смешивали с 354 мкл раствора бисульфита (5,89 моль/л) и 146 мкл диоксана, содержащего поглотитель радикалов (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман 2-карбоновую кислоту, 98,6 мг в 2,5 мл диоксана). Реакционную смесь денатурировали в течение 3 мин при 99°С и затем инкубировали при следующей температурной программе, в целом состоящей из 7 ч при 50°С; один температурный скачок (99,9°С) в течение 3 мин; 1,5 ч при 50°С; один температурный скачок (99°С) в течение 3 мин; 3 ч при 50°С. Затем реакционную смесь очищали ультрафильтрацией с использованием колонки Мйкроге Мюгосоп™. Очистку в основном проводили согласно инструкциям изготовителя. Для данной цели реакционную смесь смешивали с 300 мкл воды, помещали на мембрану для ультрафильтрации, центрифугировали в течение 15 мин и затем промывали буфером 1хТЕ. На мембране оставалась ДНК для данной обработки. Затем проводили десульфонирование. Для данной цели добавляли 0,2 моль/л №10Н и инкубировали в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование (10 мин) с последующей стадией промывания буфером 1хТЕ. После этого элюировали ДНК. Для данной цели мембрану перемешивали в течение 10 мин с 75 мкл теплого буфера 1хТЕ (50°С). Затем мембрану переворачивали согласно инструкциям изготовителя. Затем еще раз центрифугировали, с помощью чего ДНК удаляли с мембраны. 10 мкл элюата использовали для анализа ПЦР Ыдк!Сус1ег в режиме реального времени.

Референс тест.

Дизайн референс теста С5ТР1 делает возможным количественно анализировать преобразованную под действием бисульфита ДНК из различных источников, включая свежие/замороженные образцы, отличные образцы, такие как плазма или сыворотка, и ДНК, полученную из архивных образцов, таких как залитый в парафин материал. С помощью теста можно определить общую фракцию ДНК независимо от ее статуса метилирования при условии, что СрС не покрываются олигонуклеотидами для ПЦР.

Следующие компоненты использовали в реакции для амплификации контрольного амплификата: 10 мкл ДНК-матрицы, мкл смеси Еак181аг1 Ыдк!Сус1ег для гибридизации зондов (Коске П1адпоккск),

3,5 ммоль/л МдС1₂ (Коске П1адпоккск),

0,60 мкмоль/л прямого праймера (8ЕО ΙΌ N0:61, Т!В-Мо1Вю1),

0,60 мкмоль/л обратного праймера (5ЕО ΙΌ N0:62, Т!В-Мо1Вю1),

0,2 мкмоль/л зонда (5Е0 ΙΌ N0:63, Т!В-Мо1Вю1).

Следующие олигонуклеотиды использовали в реакции для амплификации контрольного амплификата:

праймер 1: 66А6Т66А66АААТТ6А6АТ (8ЕО ΙΌ N0:61); праймер 2: ССАСАСААСАААТАСТСААААС (8ЕО ΙΌ N0:62);

праймер 3: ЕАМ-Т666Т6ТТТ6ТААТТТТТ6ТТТТ6Т6ТТА66ТТ-ТАМКА (8ЕО ΙΌ N0:63).

Тест проводили в термоциклере Ыдк!Сус1ег 480 согласно следующему температурному характеру:

10	мин	при	95°С
10	с	при	95°С
30	с	при	56°С
10	с	при	72ЙС

Обнаружение проводили во время фазы отжига при 56°С в канале при 530 нм со специфическим флуоресцентным зондом-мишенью (5ес.| ΙΌ-63).

Специфическая к метилированию ПЦР в режиме реального времени.

Реакции специфической к метилированию ПЦР в режиме реального времени (М5Р) проводили на преобразованном с использованием бисульфита образце ДНК. Все смеси для М5Р были производства Коске Еак181аг1 ТадМап РгоЬе Мак!ег, и они содержали 300 нМ референс-краски К0Х на приборе АВП900. Каждая реакционная смесь содержала 600 нМ прямого праймера, 600 нМ обратного праймера и 200 нМ зонда обнаружения (см. таблицу с 8ец-ГО маркеров). Реакции проводили в конечном объеме, равном 20 мкл, с использованием прибора АВ!7900 в следующих температурном и временном режимах:

активация	10	МИН	при	95°С
50 циклов	15	с	при	95°С
	60	с	при	60°С

Интерпретация данных.

Расчет концентрации ДНК.

СР (значения пересекающей точки), рассчитанные с помощью программного обеспечения к прибору АВП900, с использованием определенного порогового значения использовали для каждого теста для определения концентрации ДНК. Концентрацию ДНК рассчитывали по СР значению для каждой лунки по калибровочной кривой. Стандарт для калибрования получали из метилированной преобразованной под действием бисульфита человеческой ДНК в концентрации 10; 5; 2,5; 1; 0,4; 0,1 и 0,05 нг на реакцию.

- 34 018010

Калибровочные кривые использовали для теста со специфическим к метилированию маркером и референс-тесту С3.

Процент метилирования.

Для каждого образца рассчитывали обнаруженный процент метилирования в виде определенной концентрации ДНК, рассчитанной с использованием тестов оценки метилирования, по концентрации ДНК в образце, количественно определенной С3 тестом. Отношения метилирования рассчитывали по методу РМК (Еабк е! а1., Сапсег Кек., 2001 Арг. 15; 61(8):3410-8, РМГО 11309301) к общей концентрации ДНК, рассчитанной с использованием С3 референс ПЦР.

Обнаружение метилирования проводили при многих различных пороговых уровнях (см. табл. 4А-4Э).

Результаты приведены в табл. 4А-4Э, которые указывают % образцов в каждой группе тканей с метилированием выше РМК (% метилирования) порогового уровня.

Пример 2.

Анализ метилирования генов РТСЕК4 и ΕυΝΧ1 подтверждали для образцов карцином и контрольных жидкостей организма (плазмы, бронхиального лаважа).

Образцы.

Анализированная группа	Плазма	Лаваж
Аденокарцинома легких	50	50
Доброкачественное заболевание легких	50	50

ДНК экстрагировали из плазмы и материала, полученного при бронхиальном лаваже, с использованием МадпаРиге (Косйе О1адпокйск).

Для образцов, полученных при бронхиальном лаваже (ВЬ), проводили следующую предварительную обработку: 1 мл образца ВЬ центрифугировали в течение 10 мин при 8000хд для получения осадка образца. После удаления 900 мкл супернатанта клетки ресуспендировали в оставшихся 100 мкл жидкости. Затем к образцу добавляли 130 мкл буфера для лизиса бактерий и 20 мкл протеиназы К, которые перемешивали на вортексе в течение 10 с. После быстрого центрифугирования для сбора образца на дне пробирки его инкубировали в течение 10 мин при 60°С и в течение 15 мин при 90°С. Затем образец охлаждали в течение 60 с и собирали на дне пробирки быстрым центрифугированием.

Обработку бисульфитом и постановку референс тестов в основном проводили, как описано выше. Анализ метилирования проводили с использованием НМ ПЦР в режиме реального времени.

Claims (19)

1. Способ обнаружения нарушений клеточной пролиферации у индивида, включающий определение уровней экспрессии по меньшей мере одного гена или геномной последовательности δΗ0Χ2 в биологическом образце, взятом у указанного индивида, при этом гиперметилирование и/или низкая экспрессия являются показателем наличия указанного нарушения.

2. Способ по п.1, в котором указанное нарушение является раком.

3. Способ по п.2, в котором указанная карцинома является карциномой легких.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный уровень экспрессии определяют по наличию уровня мРНК, транскрибированной из указанного гена.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный уровень экспрессии определяют по наличию уровня полипептида, кодированного указанным геном или его последовательностью.

6. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный уровень экспрессии определяют по наличию или отсутствию метилирования СрС в указанном гене, в котором наличие метилирования указывает на наличие нарушений клеточной пролиферации, предпочтительно приведенных в табл. 2.

7. Способ обнаружения нарушений клеточной пролиферации по любому из пп.1-3, включающий контактирование геномной ДНК, выделенной из биологического образца, взятого у указанного пациента по меньшей мере с одним реагентом или группами реагентов, с помощью которых можно различить метилированные и неметилированные динуклеотиды СрС по меньшей мере в одной области-мишени геномной ДНК, где область-мишень содержит или гибридизуется в жестких условиях с последовательностью по меньшей мере из 16 смежных нуклеотидов δΕΟ ΙΌ Ν0:5, где указанные смежные нуклеотиды содержат по меньшей мере одну динуклеотидную последовательность СрС, посредством чего обеспечивается обнаружение нарушений клеточной пролиферации.

8. Способ обнаружения нарушений клеточной пролиферации по любому из пп.1-3, включающий:

a) экстракцию или выделение иным образом геномной ДНК из биологического образца, взятого у индивида;

b) обработку геномной ДНК со стадии а) или ее фрагмента одним или несколькими реагентами для преобразования оснований цитозинов, которые являются неметилированными в 5-положении, в урацил или другое основание, которое обнаруживается иначе по сравнению с цитозином в отношении гибридизирующих свойств;

- 35 018010

с) контактирование обработанной геномной ДНК или ее обработанного фрагмента с ферментом для амплификации и по меньшей мере одним праймером, содержащим смежную последовательность по меньшей мере из 9 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется в условиях средней жесткости или жестких условиях с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:21; 8Е0 ΙΌ N0:22; 8Е0 ΙΌ N0:45 или 8Е0 ΙΌ N0:46 и комплементарных им последовательностей, где обработанную геномную ДНК или ее фрагмент амплифицируют с получением по меньшей мере одного амплификата или не амплифицируют; и

б) определение, основываясь на наличии или отсутствии или на свойстве указанного амплификата, состояния метилирования по меньшей мере одного динуклеотида СрО 8Е0 ΙΌ N0:5 или в среднем, или по показателю, отражающему среднее состояние или уровень метилирования множества динуклеотидов СрО 8Е0 ΙΌ N0:5, посредством чего обеспечивается по меньшей мере одно из обнаружения и диагностики нарушений клеточной пролиферации.

9. Способ по п.8, в котором обработка геномной ДНК или ее фрагмента на стадии Ь) включает использование реагента, выбранного из группы, состоящей из бисульфита, вторичного кислого сульфита, дисульфита и их комбинаций.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором биологический образец, полученный от индивида, выбран из группы, состоящей из клеток или клеточных линий, гистологических препаратов, материала биопсии, залитой в парафин ткани, жидкостей организма, эякулята, мочи, плазмы крови, сыворотки крови, цельной крови, выделенных клеток крови, мокроты и биологического вещества, полученных при бронхоскопии (включая, но не ограничиваясь ими, бронхиальный лаваж, бронхоальвеолярный лаваж, щеточную биопсию бронхов, абразию бронхов) и их комбинаций.

11. Способ обнаружения нарушений клеточной пролиферации по любому из пп.1-3, включающий:

a) экстракцию или выделение иным образом геномной ДНК из биологического образца, взятого у индивида;

b) расщепление геномной ДНК со стадии а) или ее фрагмента одной или более чувствительной к метилированию рестриктазой; контактирование смеси после расщепления ДНК рестриктазой со стадии Ь) с ферментом для амплификации и по меньшей мере двумя праймерами, подходящими для амплификации последовательности, содержащей по меньшей мере один динуклеотид СрО 8Е0 ΙΌ N0:5;

c) определение, основываясь на наличии или отсутствии амплификата, уровня метилирования по меньшей мере одного динуклеотида СрО 8Е0 ΙΌ N0:5, посредством чего обеспечивается по меньшей мере одно из обнаружения и диагностики нарушений клеточной пролиферации.

12. Нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере 16 смежных нуклеотидов обработанной последовательности геномной ДНК, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:21; 8Е0 ΙΌ N0:22; 8Е0 ΙΌ N0:45 или 8Е0 ΙΌ N0:46 и комплементарных им последовательностей.

13. Нуклеиновая кислота, содержащая по меньшей мере 50 смежных нуклеотидов последовательности ДНК, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:21; 8Е0 ΙΌ N0:22; 8Е0 ΙΌ N0:45 или 8Е0 ΙΌ N0:46 и комплементарных им последовательностей.

14. Нуклеиновая кислота по любому из пп.12, 13, где смежная последовательность оснований содержит по меньшей мере одну СрО-, ТрО- или СрА-динуклеотидную последовательность.

15. Применение нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 16 смежных нуклеотидов обработанной последовательности геномной ДНК, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:21; 8Е0 ΙΌ N0:22; 8Е0 ΙΌ N0:45 или 8Е0 ΙΌ N0:46 и комплементарных им последовательностей, в качестве диагностических средств.

16. Набор, подходящий для проведения способа по п.4, включающий:

(a) множество олигонуклеотидов или полинуклеотидов, способных гибридизоваться в жестких условиях или условиях средней жесткости с продуктами транскрипции по меньшей мере одного гена или геномной последовательности 5^0X2;

(b) подходящий контейнер, содержащий олигонуклеотиды или полинуклеотиды и биологический образец пациента, содержащий продукты транскрипции, где олигонуклеотиды или полинуклеотиды могут гибридизоваться в жестких условиях или условиях средней жесткости с продуктами транскрипции;

(c) средства для обнаружения гибридизации на стадии (Ь) и, необязательно, (б) инструкции по применению и интерпретации результатов применения набора.

17. Набор, подходящий для осуществления способа по п.5, включающий:

(a) средства для обнаружения по меньшей мере одного гена или геномной последовательности 8ΗΟX2;

(b) подходящий контейнер, содержащий указанные средства и биологический образец пациента, содержащий полипептиды, где средства могут образовывать комплексы с полипептидами;

(c) средства для обнаружения комплексов со стадии (Ь).

18. Набор, подходящий для осуществления способа по п.6, включающий:

(a) бисульфитный реагент;

(b) подходящий контейнер, содержащий указанный бисульфитный реагент и биологический образец пациента;

- 36 018010 (с) по меньшей мере один набор олигонуклеотидов, содержащий два олигонуклеотида, последовательности которых в каждом случае идентичны, комплементарны или гибридизуются в жестких условиях или условиях высокой жесткости с сегментом длиной 9 или более предпочтительно 18 оснований последовательности, выбранной из 8ЕО ΙΌ N0:21; 8Е0 ΙΌ N0:22; 8Е0 ΙΌ N0:45 или 8Е0 ΙΌ N0:46.

19. Применение способа по пп.1-11, нуклеиновой кислоты по пп.12-15 и/или набора по пп.16-18 при диагностике и/или обнаружении нарушений клеточной пролиферации.