ES2486190T3

ES2486190T3 - Métodos y ácidos nucleicos para análisis de trastornos proliferativos celulares

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Publication number: ES2486190T3
Application number: ES10156846.7T
Authority: ES
Inventors: Volker Liebenberg; Jürgen Distler; Jörn LEWIN; Fabian Model; Reimo Tetzner; Rene Cortese
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2014-08-18
Anticipated expiration: 2028-01-18
Also published as: AU2008207110B2; EP2115165B1; EA200970695A1; WO2008087040A3; PL2258871T3; JP5818374B2; ATE549418T1; HRP20140692T1; CY1115439T1; JP2010516234A; IL233548A0; IL199894A; CA2675895C; AU2008207110A1; AU2008207110A2; EP2258871A1; ES2384071T3; DK2258871T3; EA018010B1; JP2013150611A

Abstract

Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la hipermetilación resulta indicativa de la presencia de dicho cáncer.

Description

Métodos y ácidos nucleicos para análisis de trastornos proliferativos celulares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados morbosos respecto al estado normal. Las formas de realización particulares proporcionan métodos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits útiles para detectar o diagnosticar trastornos proliferativos celulares.

Antecedentes

Metilación de las islas CpG. Aparte de las mutaciones, la metilación aberrante de las islas CpG ha demostrado provocar un silenciamiento de la transcripción de ciertos genes que ha sido vinculado a la patogenia de diversos trastornos proliferativos celulares, incluido el cáncer. Las islas CpG son secuencias cortas ricas en dinucleótidos CpG que normalmente se suelen encontrar en la región 5' de aproximadamente el 50% de los genes humanos. La metilación de las citosinas de dichas islas provoca la pérdida de la expresión del gen y ha sido implicada en la inactivación del cromosoma X y en la impronta genómica.

Desarrollo de pruebas médicas. Dos medidas de evaluación claves de cualquier prueba de cribado o diagnóstico médico son su sensibilidad y su especificidad, las cuales miden la capacidad de la prueba para detectar con precisión a todos los individuos afectados sin excepción, y sin incluir falsamente individuos que no son portadores de la enfermedad de interés (valor predictivo). Históricamente, muchas pruebas diagnósticas han sido criticadas por su escasa sensibilidad y especificidad.

Un resultado positivo verdadero (TP) se da cuando la prueba es positiva y la enfermedad está presente. Un resultado falso positivo (FP) se da cuando la prueba es positiva pero la enfermedad no está presente. Un resultado negativo verdadero (TN) se da cuando la prueba es negativa y la enfermedad no está presente. Un resultado falso negativo (FN) se da cuando la prueba es negativa pero la enfermedad no está presente. En este contexto: Sensibilidad = TP/(TP+FN); Especificidad = TN/(FP+TN); y Valor predictivo = TP/(TP+FP).

La sensibilidad es una medida de la capacidad de una prueba para detectar correctamente la enfermedad de interés en el individuo que es analizado. Una prueba dotada de una mala sensibilidad produce una alta tasa de falsos negativos, es decir, individuos realmente afectados por la enfermedad que la prueba no detecta como tales. El riesgo que entraña el falso negativo es que el individuo enfermo permanezca sin diagnosticar y sin tratar durante un tiempo, periodo durante el cual la enfermedad puede avanzar hasta un estadio posterior en el que los tratamientos, si existen, pueden ser menos eficaces. Un ejemplo de una prueba dotada de una baja sensibilidad es un análisis de sangre de proteínas para detectar el VIH. Este tipo de pruebas adolece de una mala sensibilidad porque es incapaz de detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad está arraigada y el virus ha invadido el torrente sanguíneo en número sustancial. En cambio, un ejemplo de prueba dotada de una alta sensibilidad es la detección de la carga viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esa alta sensibilidad es posible porque este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequeñas del virus. La elevada sensibilidad es particularmente importante cuando las consecuencias de pasar por alto el diagnóstico son importantes.

La especificidad, por su parte, es una medida de la capacidad de una prueba para identificar con precisión a los pacientes que no están afectados por la enfermedad. Una prueba que posea una mala especificidad producirá una alta tasa de falsos positivos, es decir, individuos que son identificados como enfermos sin estarlo. Uno de los inconvenientes de los falsos positivos es que obligan a los pacientes a someterse a procedimientos o tratamientos médicos innecesarios y a afrontar los riesgos y el estrés emocional y económico que comportan, aparte de los efectos adversos que pueden tener en su salud. Una característica de las enfermedades que dificulta el desarrollo de pruebas diagnósticas dotadas de una alta especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, particularmente de los trastornos proliferativos celulares, implican a menudo una pluralidad de genes y proteínas. Además, ciertas proteínas pueden estar elevadas por razones ajenas a la enfermedad. La especificidad es importante cuando el coste o el riesgo asociados con los procedimientos diagnósticos o las intervenciones médicas ulteriores son muy altos.

El documento WO 2006/060653 divulga que los niveles de expresión de un grupo de genes que comprenden SHOX2 pueden ser utilizados para predecir la progresión de un cáncer de pulmón en un paciente que ya ha sido diagnosticado de cáncer de pulmón. No se menciona la metilación del gen SHOX2.

El documento WO 2006/008128 describe un gran número de marcadores de expresión y metilación para el cáncer de mama. Sin embargo, no menciona el SHOX2.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar el carcinoma de pulmón, mama y vejiga en un sujeto

que comprende determinar los niveles de metilación de SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la hipermetilación resulta indicativa de la presencia de dicho trastorno. Varios aspectos de la presente invención proporcionan un marcador genético eficiente y único, permitiendo así el análisis de expresión de dicho marcador la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo con la tabla 2 con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente elevados. Se prefiere un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

En una forma de realización la invención proporciona un método para detectar el cáncer de vejiga, mama o pulmón en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la metilación de CpG resulta indicativa de la presencia de dicho trastorno.

En una forma de realización preferida adicional dicha expresión se determina mediante la detección de la presencia

o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en el cual la infraexpresión indica la presencia trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). Dicho método comprende las siguientes etapas: i) puesta en contacto del ADN genómico aislado de una muestra biológica (preferiblemente seleccionada entre un grupo constituido por: células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejidos incluidos en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitada a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) obtenida del sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos que distinguen entre los dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprende por lo menos una secuencia de dinucleótido CpG de SHOX2 e ii) detectar los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón), por lo menos en parte. Preferentemente la región diana comprende, o se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83.

Preferiblemente, la sensibilidad de dicha detección oscila aproximadamente entre el 75% y el 96%, o entre aproximadamente el 80% y el 90%, o entre aproximadamente el 80% y el 85%. Preferiblemente, la especificidad oscila aproximadamente entre el 75% y el 96%, o entre aproximadamente el 80% y el 90%, o entre aproximadamente el 80% y el 85%.

Sin embargo, en la forma de realización más preferida de la invención, la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) es posible mediante el análisis del estado de metilación de por lo menos el gen SHOX2 y/o de los elementos promotores o reguladores del mismo.

La invención proporciona un método para el análisis de muestras biológicas para características asociadas con el desarrollo de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón), estando el método caracterizado por que el ácido nucleico, o un fragmento del mismo de SEC ID nº 5 se pone en contacto con un reactivo o serie de reactivos que pueden distinguir entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados en el interior de la secuencia genómica.

La presente invención proporciona un método para averiguar parámetros epigenéticos del ADN genómico que están asociados con los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). El método es útil para mejorar la detección y el diagnóstico de dicha enfermedad.

Preferiblemente, la fuente de la muestra problema debe seleccionarse entre el grupo constituido por: células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitada a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, el tipo de muestra se selecciona entre el grupo constituido por: plasma sanguíneo, esputo o materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitado a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial y raspado bronquial) y todas las combinaciones posibles de las mismas.

Específicamente, la presente invención proporciona un método de detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) adecuado para el uso como herramienta diagnóstica, que comprende: obtención de una muestra biológica que comprende ácido(s) nucleico(s) genómico(s); puesta en contacto del(los) ácido(s) nucleico(s), o de un fragmento de los mismos con un reactivo o una pluralidad de reactivos suficiente para distinguir entre las secuencias de dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de la secuencia diana del ácido nucleico del sujeto, donde la secuencia diana comprende, o se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia que comprende al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 5, comprendiendo dichos nucleótidos contiguos al menos una secuencia de dinucleótido CpG; y determinando, basándose al menos en parte en dicha discriminación, el estado de metilación de al menos

una secuencia de nucleótidos CpG diana, o una media, o un valor que refleje un estado de metilación medio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG diana.

Preferiblemente, la distinción entre las secuencias de nucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de la secuencia diana comprende la conversión o no conversión dependiente del estado de metilación de al menos una de tales secuencias de nucleótidos CpG respecto a la correspondiente secuencia de nucleótidos convertida o no convertida seleccionada entre el grupo de secuencias constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y de las regiones contiguas de las mismas correspondientes a la secuencia diana.

Otras formas de realización adicionales proporcionan un método para la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) que comprende: obtención de una muestra biológica que contiene ADN genómico del sujeto; extracción del ADN genómico; tratamiento del ADN genómico, o de un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina no metilada en la posición 5 en uracilo o en otra base que pueda detectarse como diferente de la citosina en virtud de sus propiedades de hibridación; puesta en contacto del ADN genómico tratado, o del fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y complementos de las mismas, donde el ADN tratado o el fragmento del mismo bien se amplifica y produce un amplificado o bien no se amplifica; y determinar, basándose en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilación o una media, o un valor que refleje una media del nivel de metilación de al menos una, pero más preferiblemente de una pluralidad de dinucleótidos CpG de la SEC ID nº 5.

Preferiblemente, la determinación comprende la utilización de al menos un método seleccionado entre el grupo constituido por: i) hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y complementos de las mismas; ii) hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico, unida a una fase sólida, que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o híbrida en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con una secuencia seleccionada entre grupo constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y complementos de las mismas; iii) hibridación de al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos de longitud que es complementaria a, o hibrida en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y complementos de las mismas, y elongación de al menos una de tales moléculas de ácido nucleico hibridadas en al menos una base nucleotídica; y iv) secuenciación del amplificado.

Otras formas de realización proporcionan un método para el análisis (es decir, la detección o el diagnóstico) de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón), que comprende: obtención de una muestra biológica que contiene ADN genómico del sujeto; extracción del ADN genómico; puesta en contacto del ADN genómico, o de un fragmento del mismo, que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo constituido por la SEC ID nº 5 o una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con ella, con una o más enzimas de restricción sensibles a metilación, a raíz de lo cual el ADN genómico es o digerido y convertido en fragmentos de digestión, o no es digerido; y determinación, basada en la presencia o ausencia de, o en la propiedad de al menos uno de tales fragmentos, el estado de metilación de al menos una secuencia de dinucleótidos CpG de la SEC ID nº 5 o una media, o un valor que refleje un estado de metilación medio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la misma. Preferiblemente, el ADN genómico digerido o no digerido es amplificado antes de dicha determinación.

Otras formas de realización adicionales proporcionan nuevas secuencias de ácido nucleico genómico y químicamente modificado, así como oligonucleótidos y/o oligómeros-PNA para el análisis de los patrones de metilación de las citosinas dentro de la SEC ID nº 5.

Descripción detallada de la invención

Definiciones:

El término "Cociente observado/esperado" ("Cociente O/E") se refiere a la frecuencia de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia concreta de ADN, y corresponde al [número de sitios CpG / (número de bases C x número de bases G)] / longitud de banda de cada fragmento.

El término "isla CpG" se refiere a una región contigua del ADN genómico que satisface los criterios siguientes: (1) tener una frecuencia de dinucleótidos CpG correspondiente a un "Cociente observado/esperado" >0,6, y (2) tener un "Contenido de GC" >0,5. Las islas CpG suelen tener normalmente, pero no siempre, aproximadamente entre 0,2 y 1 KB, o aproximadamente hasta 2 kb de longitud.

El término "estado de metilación" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metilcitosina ("5-mCyt") en uno o en una

pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN. El estado de metilación en uno o más sitios de metilación CpG concretos (cada uno con dos secuencias de dinucleótidos CpG) dentro de una secuencia de ADN incluye las opciones "sin metilar," "completamente metilado" y "hemimetilado".

El término "hemimetilación" se refiere al estado de metilación de un ADN bicatenario en el cual sólo una hebra del mismo está metilada.

El término 'AUC' se usa en la presente memoria como una abreviatura del área bajo la curva. En particular, se refiere al área bajo una curva de característica operativa del receptor (ROC). La curva ROC es una gráfica que representa la tasa de positivos verdaderos respecto a la tasa de falsos positivos de los distintos valores de corte posibles de una prueba diagnóstica. Esta curva señala el balance entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo del punto de corte seleccionado (todo aumento de la sensibilidad comporta un descenso de la especificidad). El área bajo la curva ROC (AUC) es una medida de la exactitud de una prueba diagnóstica (cuanto mayor es el área mejor); el óptimo es 1, una prueba aleatoria tendría una curva ROC situada en la diagonal con un área de 0,5; referencia bibliográfica: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975).

El término "micromatriz" se refiere en sentido amplio tanto a las "micromatrices de ADN" como a los 'chips de ADN', como se conocen en la técnica. Comprende todos los soportes sólidos conocidos en la técnica, y comprende todo los métodos para fijar moléculas de ácido nucleico a los mismos o sintetizar ácidos nucleicos sobre los mismos.

"Parámetros genéticos" son mutaciones y polimorfismos de los genes y de las secuencias necesarias para su regulación. Por mutaciones se entiende, en concreto, inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, inversiones y polimorfismos y, se prefieren particularmente, los SNP (polimorfismos de un solo nucleótido).

"Parámetros epigenéticos" son, en particular, la metilación de citosinas. Otros parámetros epigenéticos incluyen, por ejemplo, la acetilación de las histonas que, sin embargo, no puede ser analizada directamente mediante el método descrito pero que, a su vez, está correlacionada con la metilación del ADN.

El término "reactivo bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrógeno o combinaciones de los anteriores, útil como se revela en la presente memoria para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y sin metilar.

El término "ensayo de metilación" se refiere a cualquier ensayo destinado a determinar el estado de metilación de una o más secuencias de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de ADN.

El término "MS.AP-PCR" (reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios sensibles a la metilación) se refiere a la tecnología reconocida en la técnica que permite realizar un análisis general del genoma por medio cebadores ricos en CG que se centran en las regiones que con más probabilidad contienen dinucleótidos CpG, descrita por Gonzalgo et al., trastornos proliferativos celulares, preferiblemente los indicados en Cancer Research 57:594-599, 1997.

El término "MethyLight™" se refiere a la técnica reconocida en la disciplina consistente en una PCR en tiempo real con fluorescencia descrita por Eads et al., trastornos proliferativos celulares, preferiblemente aquellos indicados en Cancer Res. 59:2302-2306, 1999.

El término ensayo "HeavyMethyl™", en la forma de realización del mismo implementada en la presente memoria, se refiere a un ensayo en el cual sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en la presente memoria bloqueadoras) que cubren posiciones CpG situadas entre, o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en una forma de realización del mismo implementada en la presente memoria, se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en el cual el ensayo MethyLight™ se combina con sondas bloqueadoras específicas de metilación que cubren posiciones CpG situadas entre los cebadores de amplificación.

El término "Ms-SNuPE" (elongación mononucleotídica de cebador sensible a la metilación) se refiere al ensayo reconocido en la técnica descrito por Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997.

El término "MSP" (PCR específica de metilación) se refiere al ensayo de metilación conocido en la técnica descrito por Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996, y por la patente US nº 5.786.146.

El término "COBRA" (análisis de restricción con tratamiento con bisulfito combinado) se refiere al ensayo de metilación conocido en la técnica descrito por Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997.

El término "MCA" (amplificación de islas CpG metiladas) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota et al., trastornos proliferativos celulares, preferiblemente aquellos indicados en Cancer Res. 59:2307-12, 1999, y en el

documento WO 00/26401 A1.

El término "hibridación" hace referencia a la unión de un oligonucleótido a una secuencia complementaria siguiendo el apareamiento de bases de Watson-Crick en el ADN problema, que da lugar a una estructura doble.

"Condiciones de hibridación restrictivas", como se define en la presente memoria, implica la hibridación a 68°C en 5x SSC/5x solución de Denhardt/1,0% SDS, y lavado en 0,2x SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente, o implica el equivalente de las mismas conocido en la técnica (por ejemplo, condiciones en las cuales una hibridación tiene lugar a 60°C en 2,5x tampón SSC, seguido de varias etapas d e lavado a 37°C con una concentración baja de tampó n, y permanece estable). Las condiciones moderadamente restrictivas, como se definen en la presente memoria, implican incluir un lavado con 3x SSC a 42°C, o el eq uivalente conocida en la técnica de la misma. Los parámetros de concentración de sal y temperatura se pueden modificar para conseguir el nivel óptimo de identidad entre la sonda y el ácido nucleico diana. Existen guías sobre tales condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) Unidad 2.10.

Los términos "enzimas de restricción específicas de la metilación" o "enzimas de restricción sensibles a la metilación" se refieren a una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiendo del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. Si se trata de enzimas de restricción de esa condición que sólo cortan si el sitio de reconocimiento no está metilado o está hemimetilado, el corte no se producirá, o se producirá con una eficacia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento está metilado. Si se trata de enzimas de restricción de esa condición que sólo cortan si el sitio de reconocimiento está metilado, el corte no se producirá, o tendrá lugar con una eficiencia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento no está metilado. Se prefieren enzimas de restricción específicas de metilación cuya secuencia de reconocimiento contenga un dinucleótido CG (por ejemplo, cgcg o cccggg). Para ciertas formas de realización se prefieren además enzimas de restricción que no corten si la citosina de este dinucleótido está metilada en el átomo de carbono C5. "Enzimas de restricción no específicas de la metilación" o "enzimas de restricción no sensibles a la metilación" son enzimas de restricción que cortan una secuencia de ácido nucleico independientemente del estado de metilación con una eficiencia prácticamente idéntica. También se denominan "enzimas de restricción inespecíficas de la metilación".

En referencia a las secuencias de matriz compuestas, la frase "nucleótidos contiguos" se refiere a una región de secuencia contigua de cualquier secuencia contigua individual de la matriz compuesta, pero no incluye una región de la secuencia de matriz compuesta que incluya un "nodo," como se ha definido anteriormente en la presente memoria.

El término "al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1 " debe considerarse que incluye todas las variantes de transcripción del mismo y todos los elementos promotores y reguladores del mismo. Además, como se conoce una pluralidad de SNP dentro de dicho gen, el término debe considerarse que incluye todas las variantes de secuencia del mismo.

Visión general:

La presente invención proporciona un método para detectar el carcinoma de pulmón, mama o vejiga en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, en el que la hipermetilación es indicativa de la presencia de dicho trastorno. Dichos marcadores pueden ser utilizados para el diagnóstico de dicho cáncer.

Además de las formas de realización indicadas anteriormente en las que se efectúa el análisis de la metilación de SHOX2, la invención presenta además unos paneles de genes que comprenden al menos un gen o secuencia genómica seleccionada entre el grupo constituido por: PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1 con una utilidad nueva para la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón).

La modificación con bisulfito del ADN es una herramienta conocida en la técnica para evaluar el estado de metilación de CpG. La 5-metilcitosina es la modificación de base covalente más frecuente en el ADN de las células eucariotas. Desempeña una función, por ejemplo, en la regulación de la transcripción, en la impronta genética y en la oncogénesis. Por tanto, la identificación de la 5-metilcitosina como un componente de la información genética presenta un considerable interés. No obstante, las posiciones de 5-metilcitosina no pueden ser identificadas mediante secuenciación, porque la 5-metilcitosina comparte el mismo apareamiento de base que la citosina. Asimismo, la información epigénetica de la que es portadora la 5-metilcitosina se pierde completamente durante, por ejemplo, la amplificación con PCR.

El método utilizado con más frecuencia para analizar el ADN con el fin de detectar la presencia de 5-metilcitosina se basa en la reacción específica del bisulfito con la citosina; en él, tras la hidrólisis alcalina, la citosina se convierte en

uracilo que equivale a la timina en su conducta de apareamiento de base. Significativamente, sin embargo, la 5metilcitosina permanece sin modificar en tales condiciones. Por consiguiente, el ADN original se convierte de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no se podía distinguir de la citosina por su conducta de hibridación, puede entonces ser detectada como la única citosina restante mediante técnicas de biología molecular ordinarias y conocidas en la técnica, como por ejemplo, amplificación e hibridación, o secuenciación. Todas estas técnicas están basadas en diferencias en las propiedades de apareamiento de las bases, que pueden ser entonces aprovechadas plenamente.

La técnica anterior, en términos de sensibilidad, se define por un método que comprende la inclusión del ADN que se va a analizar en una matriz de agarosa, para evitar así su difusión y renaturalización (el bisulfito sólo reacciona con el ADN monocatenario), y la sustitución de todas las etapas de precipitación y purificación por una diálisis rápida (Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996). De ese modo es posible analizar el estado de metilación de células individuales, lo que demuestra la utilidad y la sensibilidad del método. Una visión general de los métodos conocidos en la técnica para detectar la 5metilcitosina es proporcionada en Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998.

La técnica del bisulfito, con pocas excepciones (p.ej., Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997), se utiliza únicamente en investigación. En todos los casos, fragmentos cortos y específicos de un gen conocido son amplificados después de ser sometidos a un tratamiento con bisulfito, y o bien son secuenciados completamente (Olek & Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997), son sometidos a una o más reacciones de elongación con cebador (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997; documento WO 95/00669; patente US nº 6.251.594) para analizar las posiciones individuales de citosina, o son tratados por digestión enzimática (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997). La detección mediante hibridación también ha sido descrita en la técnica (Olek et al., documento WO 99/28498). Además, se ha descrito el uso de la técnica del bisulfito para la detección de la metilación con respecto a genes individuales (Grigg & Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; documentos WO 9746705 y WO 9515373).

La presente invención proporciona la utilización de la técnica del bisulfito, en combinación con uno o más ensayos de metilación, para la determinación del estado de metilación de las secuencias de dinucleótidos CpG dentro de la SEC ID nº 5. Los dinucleótidos CpG genómicos pueden estar metilados o sin metilar (alternativamente conocidos como metilado al alza o a la baja, respectivamente). No obstante, los métodos de la presente invención son adecuados para el análisis de muestras biológicas de una naturaleza heterogénea, por ejemplo una baja concentración de células tumorales en un trasfondo de sangre. En consecuencia, cuando se analiza el estado de metilación de una posición CpG dentro de una muestra de ese tipo, el experto en la materia puede usar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo porcentaje, fracción, cociente, proporción o grado) de metilación en una posición CpG particular en opocisión a su estado de metilación. Por consiguiente, el término estado de metilación debe considerarse que significa un valor que refleja el grado de metilación en una posición CpG. A menos que se indique específicamente los términos "hipermetilado" o "metilado al alza" deben considerarse que significan un nivel de metilación superior al de un valor de corte especificado, mientras que dicho valor de corte puede ser un valor que represente la media o mediana del nivel de metilación correspondiente a una población dada, o es preferiblemente un nivel de corte optimizado. El "valor de corte" también se señala en la presente memoria como "umbral". En el contexto de la presente invención, los términos "metilado", "hipermetilado" o "metilado al alza” deben considerarse que incluyen un nivel de metilación superior al valor de corte cero (0) % (o equivalentes del mismo) de metilación para todas las posiciones CpG localizadas en y asociadas al (por ejemplo regiones promotoras o reguladoras) gen o secuencia genómica de SHOX2.

De acuerdo con la presente invención, la determinación del estado de metilación de las secuencias de dinucleótidos CpG dentro de la SEC ID nº 5 tiene utilidad en el diagnóstico y detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón).

Procedimientos para analizar la metilación. Diversos procedimientos de análisis de la metilación son conocidos en la técnica, y se pueden utilizar en conjunción con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas CpG) dentro de una secuencia de ADN. Estos ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación del ADN tratado con bisulfito, PCR (para la amplificación específica de secuencia), análisis de transferencia de Southern, y el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.

Por ejemplo, la secuenciación genómica se ha simplificado para el análisis de los patrones de metilación del ADN y de la distribución de la 5-metilcitosina mediante el uso del tratamiento con bisulfito (Frommer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Además, se usa la digestión con enzimas de restricción de los productos de PCR amplificados a partir del ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el método descrito por Sadri & Homsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059,1996), o COBRA (análisis combinado de restricción y bisulfito) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997).

COBRA. El análisis COBRA™ es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación

del ADN en loci génicos específicos en pequeñas cantidades de ADN genómico (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). En resumen, se utiliza la digestión con enzimas de restricción para revelar diferencias en la secuencia dependientes de la metilación en los productos de PCR derivados del ADN tratado con bisulfito sódico. Las diferencias en la secuencia dependientes de la metilación se introducen primero en el ADN genómico mediante el tratamiento estándar con bisulfito según el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). A continuación se efectúa la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito con cebadores específicos para las islas CpG de interés, seguida por la digestión con endonucleasa de restricción, electroforesis en gel, y detección mediante sondas de hibridación específicas marcadas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y sin digerir de una forma linealmente cuantitativa a lo largo de un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Asimismo, esta técnica se puede aplicar con fiabilidad al ADN obtenido de muestras de tejido incluidas en parafina y microdisecadas.

Los reactivos típicos (como por ejemplo los que se pueden encontrar en un kit COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla CpG tratadas con bisulfito); enzima de restricción y tampón adecuado; oligonucleótido de hibridación génica; oligonucleótido de control de hibridación; kit de marcaje con cinasa para sonda oligonucleotídica; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos para la conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización del ADN, tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación del ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes para la recuperación del ADN.

Preferiblemente, los ensayos tales como "MethyLight™" (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., trastornos proliferativos celulares, preferiblemente los indicados en Cancer Res. 59:23022306, 1999), las reacciones Ms-SNuPE™ (elongación mononucleotídica de cebador sensible a la metilación) (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997), PCR específica de metilación ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; patente US nº 5.786.146), y amplificación de islas de CpG metiladas ("MCA"; Toyota et al., trastornos proliferativos celulares, preferiblemente los indicados en Cancer Res. 59:2307-12, 1999) se usan solas o en combinación con otros de estos métodos.

El ensayo "HeavyMethyl™", es un método cuantitativo para evaluar diferencias de metilación mediante la amplificación específica de metilación del ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en la presente memoria bloqueadoras) comprenden posiciones de CpG situadas entre, o cubiertas por los cebadores de amplificación lo que permite la amplificación selectiva específica de la metilación de una muestra de ácido nucleico.

El término ensayo "HeavyMethyl™ MethyLight™", en la forma de realización del mismo implementada en la presente memoria, se refiere a un ensayo HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variación del ensayo MethyLight™, en la cual el ensayo MethyLight™ se combina con sondas bloqueadoras específicas de metilación que comprenden posiciones de CpG situadas entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethyl™ también se puede usar en combinación con cebadores de amplificación específicos de metilación.

Los reactivos típicos (como por ejemplo los que se pueden encontrar en un kit MethyLight™ típico) para el análisis HeavyMethyl™ pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR para genes específicos (o secuencia de ADN o isla de CpG tratadas con bisulfito); oligonucleótidos de bloqueo; tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR; y polimerasa Taq.

MSP. La MSP (PCR específica de metilación) permite la evaluación del estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG comprendidos en una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; patente US nº 5.786.146). En resumen, el ADN es modificado por bisulfito sódico que convierte todas las citosinas sin metilar en uracilo, y después se amplifica con cebadores específicos para el ADN metilado frente al ADN sin metilar. La MSP sólo requiere pequeñas cantidades de ADN, es sensible a alelos metilados un 0,1% de un locus de isla CpG dado, y se puede realizar con ADN extraído de muestras incluidas en parafina. Los reactivos típicos (como por ejemplo los que se pueden encontrar en un kit de MSP típico) para el análisis con MSP pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR metilados y sin metilar para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratadas con bisulfito), tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR, y sondas específicas.

MethyLight™. El ensayo MethyLight™ es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza una tecnología de PCR en tiempo real con fluorescencia (TaqMan™) que no requiere más manipulaciones después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). En pocas palabras, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mezclada de ADN genómico que se convierte, a través de una reacción con bisulfito sódico, en un conjunto mezclado de diferencias de secuencia dependientes de la metilación según procedimientos estándar (el tratamiento con bisulfito convierte los residuos de citosina sin metilar en uracilo). La PCR con fluorescencia se lleva a cabo por tanto en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que se solapan con dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de las secuencias se puede producir tanto a nivel del proceso de

amplificación como a nivel del proceso de detección por fluorescencia.

El ensayo MethyLight™ se puede usar como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en la cual la discriminación de las secuencias se produce a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de la metilación en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un posible sitio de metilación particular. Un control sin sesgo para la cantidad de ADN entrante es proporcionado en forma de una reacción en que ni los cebadores ni la sonda se solapan con ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se consigue una prueba cualitativa para la metilación genómica exponiendo a sondas el conjunto sesgado de la PCR con, bien oligonucleótidos control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión con fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) bien con oligonucleótidos que abarcan posibles sitios de metilación.

El proceso MethyLight™ se puede utilizar con cualquier sonda adecuada, por ejemplo "TaqMan®", Lightcycler®, etc. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario se trata con bisulfito sódico y es sometido a uno de dos conjuntos de reacciones de PCR con sondas TaqMan®; por ejemplo, con cebadores MSP y/o oligonucleótidos de bloqueo HeavyMethyl y sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® está marcada por partida doble con una molécula fluorescente indicadora (reporter) y otra atenuadora (quencher), y está diseñada para ser específica hacia una región con un contenido relativamente alto de GC de modo que se separa a una temperatura aproximadamente 10°C superi or durante el ciclo de PCR a los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de reasociación/elongación de la PCR. Como la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, acabará alcanzando la sonda TaqMan® reasociada. La actividad endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará entonces la sonda TaqMan® digeriéndola y liberando así la molécula fluorescente indicadora, lo que permitirá la detección cuantitativa de su señal, entonces desinhibida, mediante un sistema de detección de fluorescencia en tiempo real.

Los reactivos típicos (como por ejemplo los que se pueden encontrar en un kit MethyLight™ típico) para el análisis MethyLight™ puede comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratadas con bisulfito); sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR; y polimerasa Taq.

El ensayo QM™ (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en las que la discriminación de las secuencias se produce a nivel de la hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que se solapa con un posible sitio de metilación particular. Un control sin sesgo para la cantidad de ADN entrante se facilita en forma de una reacción en que ni los cebadores ni la sonda se solapan con ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, se consigue una prueba cualitativa para la metilación genómica exponiendo a sondas el conjunto sesgado de la PCR con, bien oligonucleótidos control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión con fluorescencia de las técnicas HeavyMethyl™ y MSP) bien con oligonucleótidos que abarcan posibles sitios de metilación.

El proceso QM™ se puede utilizar con cualquier sonda adecuada por ejemplo "TaqMan®", Lightcycler®, etc. en el proceso de amplificación. Por ejemplo, el ADN genómico bicatenario es tratado con bisulfito sódico y expuesto a cebadores sin sesgo y a la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® está marcada por partida doble con una molécula fluorescente indicadora y otra atenuadora, y está diseñada para ser específica hacia una región con un contenido relativamente alto de GC de modo que se separa a una temperatura aproximadamente 10°C superior durante el ciclo de PCR a los cebadores directos e inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de reasociación/elongación de la PCR. Como la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, acabará alcanzando la sonda TaqMan® reasociada. La actividad endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará entonces la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar así la molécula fluorescente indicadora, lo que permitirá la detección cuantitativa de su señal, entonces desinhibida, mediante un sistema de detección de fluorescencia en tiempo real.

Los reactivos típicos (como por ejemplo los se pueden encontrar en un kit QM™ típico) para el análisis QM™ pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratadas con bisulfito); sondas TaqMan® o Lightcycler®; tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR; y polimerasa Taq.

Ms-SNuPE. La técnica Ms-SNuPE™ es un método cuantitativo para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos basada en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguida de una elongación mononucleotídica con cebador (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). En resumen, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito sódico para convertir las citosinas sin metilar en uracilo mientras que la 5-metilcitosina permanece inalterada. A continuación, se efectúa la amplificación de la secuencia diana deseada con cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aisla y se usa como molde para el análisis de la metilación en el sitio o sitios CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, cortes microtomizados de anatomopatología), y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios CpG.

Los reactivos típicos (como por ejemplo los que se pueden encontrar en un kit Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla CpG tratadas con bisulfito); tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE ™ para un gen específico; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización del ADN; tampón de sulfonación; kit o agentes de recuperación del ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación del ADN.

Se determinó que la(s) secuencia(s) genómica(s) según las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83 y con las variantes tratadas de la misma que aparecen de forma no natural acordes a las SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60; SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103 presentaban una utilidad novedosa para la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón).

En una forma de realización el método de la invención comprende las etapas siguientes: i) determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 e ii) determinar la presencia o ausencia del cáncer de pulmón, mama o vejiga. Se prefiere un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

El método de la invención puede ser posibilitado mediante cualquier análisis de la expresión de un ARN transcrito a partir del mismo o polipéptido o proteína traducidos a partir de dicho ADN, preferentemente mediante el análisis de expresión de ARNm o el análisis de expresión de polipéptidos. Sin embargo, en una forma de realización todavía más preferida de la invención, la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) es posible mediante el análisis del estado de metilación de SHOX2, y/o de los elementos promotores o reguladores del mismo.

Son divulgados asimismo unos métodos y ensayos de diagnóstico, tanto cuantitativos como cualitativos para detectar la expresión de por lo menos un gen o secuencia genómica que se seleccionan de entre el grupo constituido por PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1 en un sujeto y determinar a partir de los mismos la presencia o ausencia de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) en dicho sujeto. Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo que consiste en adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico.

La expresión aberrante de ARNm transcrito a partir de por lo menos un gen o secuencia genómica que se seleccionan de entre el grupo constituido por PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1 es asociada con la presencia de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) en un sujeto. Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo constituido por adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, cáncer de pulmón escamoso, cáncer de pulmón microcítico. Según la presente invención, la hipermetilación y/o la subexpresión están asociadas con la presencia de los trastornos proliferativos celulares, en particular aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón).

Para detectar la presencia de ARNm que codifica un gen o secuencia genómica, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que comprenda material celular del tumor. Los tipos de muestra adecuados incluyen: células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejidos incluidos en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y material biológico derivado de broncoscopia (que incluye pero no limitado al lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial y todas las combinaciones posibles de los mismos). Más preferiblemente el tipo de muestra se selecciona del grupo constituido por: plasma sanguíneo, esputo y material biológico derivado de broncoscopia (que incluye de manera no limitativa: lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) y todas las combinaciones posibles de los mismos. La muestra puede ser tratada para extraer el ARN contenido en la misma. El ácido nucleico resultante de la muestra es analizado a continuación. Resultan conocidas muchas técnicas en el estado de la técnica para determinar los niveles absolutos y relativos de la expresión génica, incluyendo las técnicas utilizadas habitualmente apropiadas para su utilización en la presente invención la hibridación in situ (por ejemplo FISH), análisis Northern, ensayos de protección de la ribonucleasa (RPA), micromatrices y técnicas basadas en PCR, tales como la PCR cuantitativa y PCR de visualización diferencial o cualquier otro método de detección de ácidos nucleicos.

Resulta particularmente preferida la utilización de la técnica de reacción en cadena de polimerización/transcripción inversa (RT-PCR). El método de RT-PCR es bien conocido en la técnica (por ejemplo, ver Watson and Fleming, anteriormente).

El método de RT-PCR puede ser realizado como se expone a continuación. El ARN celular total es aislado mediante, por ejemplo, el método de isotiocianato de guanidinio y el ARN total es transcrito de manera inversa. El método de la transcripción inversa implica la síntesis de ADN sobre un patrón de ARN que utiliza una enzima transcriptasa inversa y un cebador de dT oligonucleótido de extremo 3’ y/o cebadores de hexámeros aleatorios. El ADNc así producido es amplificado a continuación mediante PCR. (Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 152, pp. 316-325, 1987). Resulta preferida adicionalmente la variante en “tiempo real” de RT-PCR, en la que el producto de la PCR es detectado mediante unas sondas de hibridación (por ejemplo, TaqMan, Lightcycler, Molecular Beacons & Scorpion) o SYBR green. La señal detectada a partir de las sondas o SYBR green es cuantificada a continuación mediante la referencia a una curva estándar o comparando los valores de Ct a los de una calibración estándar. El análisis de los genes constitutivos es utilizado habitualmente para normalizar los resultados.

En el análisis de transferencia Northern el ARNm total o poli(A)+ se manipula sobre un gel de agarosa desnaturalizante y es detectado por hibridacion respecto a una sonda marcada en el mismo gel seco o sobre una membrana. El resultado general es proporcional a la cantidad de ARN diana en la población de ARN.

La comparación de las señales de dos o más poblaciones celulares o tejidos muestra diferencias relativas en los niveles de expresión génica. La cuantificación absoluta puede ser realizada comparando la señal con una curva estándar generada utilizando unas cantidades conocidas de un transcrito in vitro correspondiente al ARN diana. El análisis de los genes constitutivos, genes cuyos niveles de expresión se espera que permanezcan relativamente constantes a pesar de las condiciones, es utilizado habitualmente para normalizar los resultados, eliminando cualquier diferencia aparente causada por la transferencia desigual de ARN a la membrana o la carga desigual de ARN sobre el gel.

La primera etapa en el análisis Northern es aislar ARN intacto, puro, a partir de las células o tejido de interés. Debido a que las transferencias Northern distinguen los ARN por su tamaño, la integridad de la muestra influye sobre el grado al que la señal es localizada en una banda única. Las muestras de ARN parcialmente degradado darán como resultado que la señal es expandida o distribuida sobre varias bandas con una pérdida total en sensibilidad y posiblemente una interpretación errónea de los datos. En el análisis de transferencia Northern, las sondas de oligonucleótido, ARN y ADN pueden ser utilizadas y estas sondas están marcadas preferentemente (por ejemplo marcadores radioactivos, marcadores de masa o marcadores fluorescentes). El tamaño del ARN diana, no la sonda, determinará el tamaño de la banda detectada, siendo por lo tanto adecuados para la síntesis de sonda métodos tales como el marcado por cebado aleatorio, que genera sondas de longitudes variables. La actividad específica de la sonda determinará el nivel de sensibilidad, de manera que resulta preferido que sean utilizadas las sondas con actividades muy específicas.

En un ensayo de protección de ribonucleasa, la diana de ARN y una sonda de ARN de una longitud definida son hibridadas en disolución. Tras la hibridación, el ARN es digerido con unas ribonucleasas específicas para los ácidos nucleicos monocatenarios para extraer cualquier sonda y ARN diana monocatenario no hibridado. Las ribonucleasas son inactivadas, y el ARN es separado por ejemplo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cantidad de sonda de ARN intacto es proporcional a la cantidad de ARN diana en la población de ARN. Puede ser utilizado el RPA para la cuantificación relativa y absoluta de la expresión génica y asimismo para mapear la estructura de ARN, tal como límites intrón/exón y sitios de inicio de la transcripción. El ensayo de protección de ribonucleasa resulta preferido al análisis por transferencia Northern ya que generalmente presenta un limite inferior de detección.

Las sondas de ARN no codificante utilizadas en el RPA son generadas mediante transcripción in vitro de una matriz de ADN con un extremo definido y se encuentran típicamente en el intervalo de 50 a 600 nucleótidos. La utilización de sondas de ARN que incluyen secuencias adicionales no homólogas al ARN diana permite que se distinga el fragmento protegido a partir de la sonda de longitud completa. Las sondas de ARN son utilizadas típicamente en detrimento de las sondas de ADN debido a la facilidad de generar sondas de ARN monocatenario y la capacidad de reproducción y fiabilidad de la digestión del dúplex ARN:ARN con ribonucleasas (Ausubel et al. 2003), resultando particularmente preferidas las sondas con actividades muy específicas.

Se prefiere particularmente el uso de micromatrices. El proceso de análisis de micromatriz se puede dividir en dos partes principales. La primera consiste en la inmovilización de las secuencias génicas conocidas en portaobjetos de vidrio u otro soporte sólido, seguida por la hibridación del ADNc marcado con fluorescencia (comprendiendo las secuencias que se deben analizar) con los genes conocidos inmovilizados en el portaobjetos de vidrio (u otra fase sólida). Después de la hibridación, las matrices se analizan con un escáner de micromatriz fluorescente. El análisis de la intensidad relativa de la fluorescencia de los diferentes genes proporciona una medida de las diferencias en la expresión génica. Las matrices de ADN se pueden generar inmovilizando oligonucleótidos presintetizados en portaobjetos de vidrio preparados u otras superficies sólidas. En este caso, las secuencias génicas representativas son fabricadas y preparadas con métodos estándar de síntesis y purificación de oligonucleótidos. Estas secuencias génicas sintetizadas son complementarias al o los transcritos de ARN de al menos un gen o secuencia genómica seleccionada entre el grupo constituido por: PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT;

IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1 y tienden a ser secuencias más cortas, del orden de 25-70 nucleótidos. Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente oligonucleótidos inmovilizados in situ sobre la superficie del portaobjetos. La síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de los nucleótidos adecuados en los puntos de la micromatriz; los puntos que no reciben un nucleótido resultan protegidos durante todas las etapas del proceso con máscaras físicas o virtuales. Preferiblemente dichos ácidos nucleicos sintetizados son ácidos nucleicos cerrados.

En los experimentos de micromatrices de perfil de expresión, las plantillas de ADN utilizadas resultan representativas del perfil de transcripción de las células o tejidos en estudio. El ARN es inicialmente aislado de las poblaciones celulares o tejidos para ser comparado. Cada muestra de ARN es utilizada a continuación como plantilla para generar un ADNc marcado de manera fluorescente mediante una reacción de transcripción inversa. El marcado fluorescente del ADNc puede conseguirse mediante métodos de marcado directo o marcado indirecto. Durante el marcado directo, los nucléotidos modificados de manera fluorescente (por ejemplo, Cy®3-o Cy®5-dCTP) son incorporados directamente en el interior del ADNc durante la transcripción inversa. Alternativamente, el marcado indirecto puede conseguirse incorporando nucleótidos aminoalil modificados durante la síntesis de ADNc y conjugando a continuación un colorante éster N-hidroxisuccinimida (NHS) al ADNc aminoalil modificado tras la compleción de la reacción de transcripción inversa. Alternativamente, la sonda puede estar sin marcar, pero puede resultar detectable mediante la unión específica a un ligando que está marcado, directa o indirectamente. Los marcadores y métodos apropiados para el marcado de ligandos (y sondas) son conocidos en la técnica, y comprenden, por ejemplo, marcadores radioactivos que pueden ser incorporados mediante métodos conocidos (por ejemplo desplazamiento de muesca –nick translation-o fosforilación mediante cinasas –kinasing-). Otros marcadores apropiados incluyen de manera no limitativa biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo dioxetanos, particularmente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos, y similares.

Para realizar un análisis de expresión génica diferencial, el ADNc generado a partir de las diferentes muestras de ARN es marcado con Cy®3. El ADNc marcado resultante es purificado para extraer los nucleótidos sin incorporar, el colorante libre y el ARN residual. Tras la purificación, las muestras de ADNc marcado son hibridadas con la micromatriz. La severidad de la hibridación es determinada mediante varios factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen la temperatura, la fuerza iónica, la duración y la concentración de formamida. Estos factores son expuestos en, por ejemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., 1989). La micromatriz es escaneada tras la hibridación utilizando un escáner de micromatriz fluorescente. La intensidad fluorescente de cada punto indica el nivel de expresión del gen analizado; los puntos brillantes corresponden a genes fuertemente expresados, mientras que los puntos tenues indican una expresión débil.

Una vez que se han obtenido las imágenes, los datos en bruto deben ser analizados. Inicialmente, la fluorescencia de fondo debe ser extraída de la fluorescencia de cada punto. Los datos son normalizados a continuación respecto a una secuencia de control, tal como ácidos nucleicos añadidos de manera exógena (preferentemente ARN o ADN), o un panel de genes constitutivos para dar cuenta de cualquier hibridación inespecífica, imperfecciones de matriz o variabilidad en la disposición de la matriz, marcado de ADNc, hibridación o lavado. La normalización de los datos permite la comparación de los datos de las múltiples matrices.

Se divulga asimismo un kit para su utilización en el diagnóstico de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón y se prefiere además un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico) en un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención, comprendiendo dicho kit: unos medios para medir el nivel de transcription de al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por: PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1. Los medios para medir el nivel de transcripción pueden comprender oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción de al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por: PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1. En una forma de realización todavía más preferida el nivel de transcripción es determinado mediante técnicas seleccionadas del grupo constituido por: análisis Northern Blot, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, protección ARNasa, y micromatriz. En otra forma de realización de la invención el kit comprende además unos medios para la obtención de una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que además comprende un recipiente que más preferiblemente es adecuado para contener los medios para medir el nivel de transcripción y la muestra biológica del paciente, y más preferiblemente comprende además instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

En una forma de realización preferida, el kit comprende (a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con los productos de transcripción de al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por: PTGER4; RUNX1; EVX2; EVX-1; SHOX2; SEC ID nº 6; CN027; LRAT; IL-12RB1; TFAP2C; BCL2; EN2; PRDM14; SEC ID nº 81; ARID5A; VAX1; (b) un recipiente, preferiblemente adecuado para contener los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente que comprenda los productos de transcripción con los cuales los oligonucleótidos o polinucleótidos se

pueden hibridar en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas, (c) unos medios para detectar la hibridación de (b); y opcionalmente, (d) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes como un tampón de hibridación (si los oligonucleótidos van a ser utilizados como una sonda) envasados en un recipiente independiente. Alternativamente, si los oligonucleótidos van a ser utilizados para amplificar una región diana, el kit puede contener, envasados en recipientes independientes, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la elongación con cebador mediada por la polimerasa, como la PCR. Preferiblemente dicha polimerasa es una transcriptasa inversa. Además se prefiere que dicho kit contenga adicionalmente un reactivo ARNasa.

La presente invención divulga además procedimientos para la detección de la presencia del polipéptido codificado por dichas secuencias génicas en una muestra obtenida de un paciente.

Los niveles aberrantes de la expresión polipeptídica de los polipéptidos que codificaron por lo menos un gen o secuencia genómica que se seleccionan de entre el grupo constituido por PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1 están asociados con la presencia de trastornos proliferativos celulares, preferentamente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón). Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo constituido por adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico.

Según la presente invención la subexpresión de dichos polipéptidos está asociada con la presencia de trastornos proliferativos celulares, preferentamente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón). Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo constituido por adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico.

Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para detectar polipéptidos. Dichos procedimientos incluyen de manera no limitativa espectrometría de masas, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, procedimientos inmunoquímicos, ensayos de ligando-ligante, técnicas inmunohistoquímicas, ensayos de aglutinación y complemento (por ejemplo, ver Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. Pp. 217-262, 1991 que se incorpora como referencia). Resultan preferidos los procedimientos de inmunoensayo ligando-ligante que incluyen anticuerpos de reacción con un epítopo o epítopos y que desplazan de manera competitiva un polipéptido marcado o su derivado.

Determinadas formas de realización del kit mencionado anteriormente comprenden la utilización de anticuerpos específicos para el(los) polipéptido(s) codificado(s) mediante por lo menos un gen o secuencia genómica que se seleccionan de entre el grupo constituido por PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1.

Dichos anticuerpos resultan útiles para los trastornos proliferativos celulares, preferentemente las enfermedades según la tabla 2, y todavía más preferentemente en el diagnóstico del carcinoma de pulmón. Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo que consiste en adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico. En determinadas formas de realización la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales puede ser inducida mediante la utilización de un epítopo codificado por un polipéptido de por lo menos un gen o secuencia genómica que se selecciona de entre el grupo constituido por PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1 como un antígeno. Dichos anticuerpos pueden a su vez ser utilizados para detectar los polipéptidos expresados como marcadores para los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 y todavía más preferentemente el diagnóstico del carcinoma de pulmón. Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo que consiste en adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico. Los niveles de dichos polipéptidos presentes pueden ser cuantificados mediante procedimientos convencionales. La unión anticuerpo-polipéptido puede ser detectada y cuantificada mediante una variedad de medios conocidos en la técnica, tales como marcado con ligandos fluorescentes o radioactivos. La invención divulga además unos kits para realizar los procedimientos mencionados anteriormente, en los que dichos kits contienen anticuerpos específicos para los polipéptidos investigados.

Son conocidos en la técnica numerosos inmunoensayos de unión polipeptídica competitivos y no competitivos. Los anticuerpos utilizados en dichos ensayos pueden estar sin marcar, por ejemplo como se utilizan en las pruebas de aglutinación, o marcados para su utilización en una variedad amplia de procedimientos de ensayo. Las etiquetas que pueden ser utilizadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustancias fluorescentes, sustancias quimioluminiscente, sustratos de enzimas o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y similares. Los ensayos preferidos incluyen de manera no limitada inmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo, ensayo inmunoenzimático por adsorción (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares. Los anticuerpos monoclonales o policlonales o sus epítopos pueden ser preparados para su utilizados en inmunoensayos mediante cualesquier de

entre un número de procedimientos conocidos en la técnica.

En una forma de realización alternativa del procedimiento las proteínas pueden ser detectadas mediante un análisis de transferencia Western. Dicho análisis es estándar en la técnica, siendo brevemente separadas proteínas mediante electroforesis, por ejemplo SDS-PAGE. Las proteínas separadas son a continuación transferidas a una membrana apta (o papel) por ejemplo nitrocelulosa, que retiene la separación especial conseguida mediante electroforesis. La membrana es incubada a continuación con un agente bloqueante para unir los lugares pegajosos restantes sobre la membrana, incluyendo los agentes utilizados habitualmente proteína genérica (por ejemplo proteína de la leche). Se añade a continuación un anticuerpo específico para la proteína de interés, siendo dicho anticuerpo marcado de manera detectable por ejemplo mediante colorantes o medios enzimáticos (por ejemplo fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano). Se detecta a continuación la ubicación del anticuerpo sobre la membrana.

En una forma de realización alternativa del procedimiento las proteínas pueden ser detectadas mediante inmunohistoquímica (la utilización de los anticuerpos para investigar los antígenos específicos en una muestra). Dicho análisis resulta estándar en la técnica, en el que la detección de los antígenos en los tejidos es conocida como inmunohistoquímica, mientras que la detección en células cultivadas es generalmente denominada inmunocitoquímica. En resumen el anticuerpo primario debe detectarse uniéndose a su antígeno específico. El complejo anticuerpo-antígeno es a continuación ligado por un anticuerpo conjugado con enzima secundario. En la presencia del cromógeno y del sustrato necesario la enzima ligada es detectada según los depósitos coloreados en los sitios de unión anticuerpo-antígeno. Existe una amplia gama de tipos de muestras adecuadas, afinidad antígenoanticuerpo, tipos de anticuerpo, y procedimientos de mejora de la detección. Por lo tanto las condiciones óptimas para la detección inmunohistoquímica o inmunocitoquímica pueden ser determinadas por el experto en la materia para cada caso individual.

Una aproximación para la preparación de anticuerpos a un polipéptido es la selección y la preparación de una secuencia de aminoácidos de la totalidad o parte del polipéptido, sintetizando químicamente la secuencia de aminoácidos e inyectándola en un animal apto, habitualmente un conejo o un ratón (Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981, que son incorporados como referencia en su totalidad). Los procedimientos para la preparación de polipéptidos o sus epítopos incluyen de manera no limitativa la síntesis química, las técnicas de ADN recombinante o el aislamiento de muestras biológicas.

En la etapa final del procedimiento es determinado el diagnóstico del paciente, siendo la subexpresión (de ARNm o polipéptidos) indicativa de la presencia de trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). Resulta particularmente preferido un cáncer de pulmón seleccionado de entre el grupo constituido por adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón, carcinoma de pulmón microcítico. El término subexpresión se adopta para hacer referencia a la expresión a niveles detectados inferiores a un corte predeterminado que puede ser seleccionado de entre el grupo que consiste en la media, la mediana o un valor umbral optimizado. El término sobreexpresión se adopta para hacer referencia a la expresión a un nivel detectado superior a un corte predeterminado que puede ser seleccionado de entre el grupo que consiste en media, mediana o un valor umbral optimizado.

Otro aspecto de la invención divulga un kit para su utilización en el diagnóstico de trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) en un sujeto según los procedimientos de la presente invención, que comprende: unos medios para detectar por lo menos un gen

o secuencia genómica que se seleccionan de entre el grupo que consiste en polipéptidos PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1. Los medios para detectar los polipéptidos comprenden preferentemente anticuerpos, derivados de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos. Los polipéptidos son detectados todavía más preferentemente mediante trasferencia Western utilizando un anticuerpo marcado. En otra forma de realización de la invención el kit comprende además unos medios para obtener una muestra biológica del paciente. Resulta preferido un kit que comprende además un recipiente apto para contener los medios para detectar los polipéptidos en la muestra biológica del paciente, y comprende además todavía más preferentemente unas instrucciones para la utilización e interpretación de los resultados del kit. En una forma de realización preferida el kit comprende: (a) unos medios para detectar por lo menos un gen o una secuencia genómica que se seleccionan de entre el grupo que consiste en polipéptidos PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1; (b) un recipiente apto para contener dichos medios y la muestra biológica del paciente que comprende los polipéptidos en el que los medios pueden formar complejos con los polipéptidos; (c) unos medios para detectar los complejos de (b); y opcionalmente (d) las instrucciones para la utilización y la interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes como tampones o soluciones adecuados para bloqueo, lavado o recubrimiento, envasados en recipientes independientes.

Ciertas formas de realización de la presente invención proporcionan una nueva aplicación del análisis de los niveles

y/o patrones de metilación dentro de SHOX2 que permite una detección precisa, caracterización y/o tratamiento de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón). Se prefiere particularmente un carcinoma de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico. La detección precoz de los trastornos proliferativos celulares, en particular el carcinoma de pulmón, está directamente vinculada con el pronóstico de la enfermedad, y el método descrito en la presente memoria permite al médico y al paciente tomar decisiones sobre el tratamiento mejores y con mayor información.

En la forma de realización más preferida del método, la presencia o ausencia de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón, en particular de un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico), se determina mediante el análisis del estado de metilación de uno o más dinucleótidos CpG de SHOX2.

En una forma de realización de la invención dicho método comprende las siguientes etapas: i) puesta en contacto del ADN genómico (preferiblemente aislado de líquidos corporales) obtenido del sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de SHOX2 (incluidas las regiones promotoras y reguladoras del mismo) y ii) detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón). Se prefiere particularmente un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

Se prefiere que dicho o dichos dinucleótidos CpG de SHOX2 estén comprendidos dentro de una secuencia genómica diana respectiva del mismo como se facilita en la SEC ID nº 5 y complementos de la misma. La presente invención proporciona además un método para averiguar parámetros genéticos y/o epigenéticos de SHOX2 y/o la secuencia genómica según la SEC ID nº 5 dentro de un sujeto mediante el análisis de la metilación de citosinas. Dicho método comprende poner en contacto un ácido nucleico que comprende la SEC ID nº 5 presente en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos, por el cual dicho reactivo o serie de reactivos, distingue entre dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro del ácido nucleico diana.

En una forma de realización preferida, dicho método comprende las siguientes etapas: en la primera etapa, se obtiene una muestra del tejido que se debe analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada, como: células

o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y material biológico derivado de broncoscopia (que comprende de manera no limitativa lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial y todas las combinaciones posibles de los mismos. Más preferiblemente, el tipo de muestra se selecciona del grupo constituido por: plasma sanguíneo, esputo y materia biológica derivada de broncoscopia (que comprende de manera no limitativa lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) y todas las combinaciones posibles de los mismos.

A continuación, el ADN genómico se aisla de la muestra. El ADN genómico se puede aislar mediante cualquier método estándar en la técnica, incluido el uso de kits comerciales. En resumen, cuando el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular, la muestra biológica debe ser fragmentada y lisada por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. Acto seguido, la solución de ADN puede ser limpiada de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo mediante digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera entonces de la solución. Esto se puede llevar a cabo mediante diversos métodos que incluyen la extracción con sales o con sustancias orgánicas o con la unión del ADN a un soporte de fase sólida. La elección del método está condicionada por varios factores que incluyen el tiempo, el coste y la cantidad necesaria de ADN.

Si el ADN de la muestra no está contenido en una membrana (por ejemplo ADN circulante de una muestra de sangre) se pueden utilizar métodos estándar en la técnica para el aislamiento y/o purificación del ADN. Tales métodos incluyen el uso de un reactivo degradador de proteínas por ejemplo sal caotrópica, por ejemplo clorhidrato de guanidina o urea; o un detergente por ejemplo dodecilsulfato sódico (SDS), bromuro de cianógeno. Otros métodos alternativos incluyen no exclusivamente la precipitación con etanol o con propanol, la concentración en vacío entre otros mediante una centrífuga. El experto en la materia también puede usar dispositivos tales como dispositivos de filtro por ejemplo ultrafiltración, superficies o membranas de sílice, partículas magnéticas, partículas de poliestirol, superficies de poliestirol, superficies cargadas positivamente, y membranas cargadas positivamente, membranas cargadas, superficies cargadas, membranas de intercambio cargadas, superficies de intercambio cargadas.

Una vez extraídos los ácidos nucleicos, el ADN genómico bicatenario se somete al análisis.

En la segunda etapa del método, la muestra de ADN genómico se trata de tal manera que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que es distinta de la citosina en términos de conducta de hibridación. Se hace receferencia a este proceso como 'pretratamiento' o 'tratamiento' en la

presente memoria.

Esto se consigue preferiblemente mediante el tratamiento con un reactivo bisulfito. El término "reactivo bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, hidrogenosulfito o combinaciones de los mismos, útil como se muestra en la presente memoria para distinguir entre secuencias de dinucleótidos CpG metilados y sin metilar. Los métodos de dicho tratamiento son conocidos en la técnica (por ejemplo el documento PCT/EP2004/011715). Se prefiere que el tratamiento con bisulfito se lleve a cabo en presencia de solventes desnaturalizantes como, entre otros, n-alquilenglicol, particularmente dietilenglicoldimetiléter (DME), o en presencia de dioxano o derivados del mismo. En una forma de realización preferida los solventes desnaturalizantes se usan en concentraciones entre 1% y 35% (v/v). También se prefiere que la reacción de bisulfito se produzca en presencia de captadores de radicales libres como, entre otros, derivados del cromano, por ejemplo, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano 2-carboxílico

o ácido trihidroxibenzoico y derivados del mismo, como por ejemplo ácido gálico (véase: documento PCT/EP2004/011715). La conversión con bisulfito se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de reacción entre 30°C y 70°C, en la cual la temperatura aument a por encima de 85°C durante breves periodos de tie mpo durante la reacción (véase: documento PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito se purifica preferiblemente antes de la cuantificación. Esto puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica, como entre otros, la ultrafiltración, preferiblemente mediante columnas Microcon ™ (fabricadas por Millipore). La purificación se efectúa siguiendo un protocolo del fabricante modificado (véase: documento PCT/EP2004/011715).

En la tercera etapa del método, fragmentos del ADN tratado son amplificados con juegos de cebadores oligonucleotídicos según la presente invención, y una enzima de amplificación. La amplificación de varios segmentos de ADN se puede llevar a cabo simultáneamente en un mismo recipiente de reacción. Normalmente, la amplificación se lleva a cabo a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Preferiblemente dichos amplificados tienen una longitud de 100 a 2.000 pares de bases. El juego de cebadores oligonucleotídicos incluye al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son complementarias inversas, idénticas o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de al menos 16 pares de bases de longitud de la secuencia de bases de una de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46 y secuencias complementarias de las mismas.

En una forma de realización alternativa del método, el estado de metilación de posiciones CpG preseleccionadas dentro de SHOX2 y preferiblemente dentro de la secuencia de ácido nucleico según la SEC ID nº 5 pueden ser detectadas mediante el uso cebadores oligonucleotídicos específicos de metilación. Esta técnica (MSP) ha sido descrita en la patente US nº 6.265.171 concedida a Herman. El uso de cebadores específicos del estado de metilación para la amplificación del ADN tratado con bisulfito permite distinguir entre los ácidos nucleicos metilados y sin metilar. Los pares de cebadores MSP contienen al menos un cebador que hibrida con un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los cebadores MSP específicos para el ADN sin metilar contienen una “T” en la posición de la C en el CpG. Preferiblemente, por tanto, es necesario que la secuencia de bases de dichos cebadores comprenda una secuencia de al menos 9 nucleótidos de longitud que hibride con la secuencia del ácido nucleico tratado según una de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46 y secuencias complementarias de las mismas, comprendiendo la secuencia de bases de dichos oligómeros al menos un dinucleótido CpG. Otra forma de realización preferida del método comprende el uso de oligonucleótidos bloqueadores (el ensayo HeavyMethyl™). El uso de estos oligonucleótidos bloqueadores ha sido descrito por Yu et al., BioTechniques 23: 714-720, 1997. Las sondas oligonucleotídicas de bloqueo se hibridan con el ácido nucleico tratado con bisulfito al mismo tiempo que los cebadores de PCR. La amplificación por PCR del ácido nucleico termina en la posición 5' de la sonda de bloqueo, de modo que la amplificación de un ácido nucleico resulta suprimida en el punto donde comienza la secuencia complementaria a la sonda de bloqueo. Las sondas pueden estar diseñadas para hibridar con el ácido nucleico tratado con bisulfito de un modo específico del estado de metilación. Por ejemplo, para la detección de ácidos nucleicos metilados dentro una población de ácidos nucleicos sin metilar, la supresión de la amplificación de ácidos nucleicos que no están metilados en la posición en cuestión se efectuaría utilizando sondas de bloqueo que comprendían un 'CpA' o 'TpA' en la posición en cuestión, en oposición a un 'CpG' si se deseara suprimir la amplificación de los ácidos nucleicos metilados.

En los métodos de PCR con oligonucleótidos bloqueadores, la interrupción eficaz de la amplificación mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueadores no sean elongados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se consigue mediante el uso de bloqueadores que son 3'-desoxioligonucleótidos, u oligonucleótidos modificados que en su posición 3' no incorporan un grupo hidroxilo "libre" sino otro grupo distinto. Por ejemplo, los oligonucleótidos 3'-O-acetil son representativos de una clase preferida de molécula bloqueadora.

Además, debe impedirse la descomposición mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueadores. Preferiblemente, ello comprende el uso de una polimerasa carente de actividad exonucleasa 5'-3', o el uso de oligonucleótidos de bloqueo modificados que poseen, por ejemplo, puentes de tioato en sus extremos 5' y que convierten la molécula de bloqueo en resistente a las nucleasas. Ciertas aplicaciones pueden no requerir tales modificaciones 5' del bloqueador. Por ejemplo, si los sitios de unión del bloqueador y del cebador se solapan, impidiendo la unión del cebador (por ejemplo, con un exceso de bloqueador), se impedirá notablemente la degradación del oligonucleótido bloqueador. Esto se explica porque la polimerasa no elongará el cebador hacia y a través (en dirección 5'-3') del bloqueador, un proceso que normalmente acaba provocando la degradación del oligonucleótido bloqueador hibridado.

Una forma de realización con bloqueador/PCR particularmente preferida, en el contexto de la presente invención y como se implementa en la presente memoria, comprende el uso de oligómeros de péptido-ácido nucleico (PNA) como oligonucleótidos de bloqueo. Tales oligómeros de bloqueo PNA son especialmente adecuados, porque no son descompuestos ni elongados por la polimerasa.

Preferiblemente, por tanto, es necesario que la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos de bloqueo comprenda una secuencia de al menos 9 nucleótidos de longitud que hibride con una secuencia de ácido nucleico tratada según una de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46 y secuencias complementarias de las mismas, comprendiendo la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar consigo directa o indirectamente un marcaje detectable. Los marcajes preferidos son marcadores de fluorescencia, radionúclidos, o fragmentos de moléculas desprendibles que poseen una masa típica y que pueden ser detectados en un espectrómetro de masas. Cuando dichos marcajes son marcadores de masa, se prefiere que los amplificados marcados tengan una única carga neta positiva o negativa, para facilitar así la detección en el espectrómetro de masas. La detección se puede llevar a cabo y visualizarse mediante por ejemplo, espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida con matriz (MALDI) o espectrometría de masas con electronebulización (ESI).

La espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida con matriz (MALDI-TOF) es una técnica muy eficaz para el análisis de biomoléculas (Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988). El analito se incluye en una matriz que absorbe la luz. La matriz se evapora mediante un breve impulso de láser que transporta la molécula de analito a la fase de vapor sin fragmentarse. El analito se ioniza por las colisiones con las moléculas de la matriz. La aplicación de un voltaje acelera los iones en un tubo de vuelo libre. Debido a sus diferentes masas, los iones son acelerados a diferente velocidad. Los iones más pequeños alcanzan el detector antes que los grandes. La espectrometría MALDI-TOF resulta muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas, pero los análisis de ácidos nucleicos son un poco más difíciles (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995). La sensibilidad del análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menor que la lograda con los péptidos, y disminuye de manera no proporcional a medida que aumenta el tamaño del fragmento. Es más, en el caso de los ácidos nucleicos, que poseen una estructura con múltiples cargas negativas, el proceso de ionización a través de la matriz resulta considerablemente menos eficaz. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz desempeña un papel muy importante. Para la desorción de péptidos, se han descubierto varias matrices muy eficaces que producen una cristalización muy fina. Existen varias matrices adecuadas para el ADN, pero sin embargo la diferencia de sensibilidad entre los péptidos y los ácidos nucleicos no se ha reducido. Esta diferencia de sensibilidad se puede reducir, sin embargo, modificando químicamente el ADN de tal manera que sea más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácido nucleicos fosforotioatos, en los que los fosfatos normales de la estructura son sustituidos por tiofosfatos, se pueden convertir en un ADN de carga neutra utilizando reacciones de alquilación sencillas (Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995). El acoplamiento de un marcador de carga a este ADN modificado mejora la sensibilidad de la MALDI-TOF hasta el mismo nivel observado con los péptidos. Otra ventaja del marcaje con carga es el aumento de la estabilidad del análisis frente a las impurezas, lo que dificulta considerablemente la detección de sustratos sin modificar.

En la cuarta etapa del método, los amplificados obtenidos durante la tercera etapa del método son analizados para averiguar el estado de metilación de los dinucleótidos CpG antes del tratamiento.

En formas de realización en las cuales los amplificados se obtienen mediante amplificación MSP, la presencia o ausencia de un amplificado es en sí misma indicativa del estado de metilación de las posiciones CpG cubiertas por el cebador, según las secuencias de bases de dicho cebador.

Los amplificados obtenidos mediante la PCR estándar y la PCR específica de metilación pueden ser analizados además mediante métodos basados en bases como, no exclusivamente, tecnología de matrices y tecnologías basadas en sondas así como mediante técnicas tales como secuenciación y elongación dirigida por el molde.

En una forma de realización del método, los amplificados sintetizados en la etapa tres son hibridados posteriormente con una matriz o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas PNA. En este contexto, la hibridación tiene lugar de la siguiente manera: el conjunto de sondas utilizado durante la hibridación está compuesto preferiblemente de al menos 2 oligonucleótidos u oligómeros de PNA; en el proceso, los amplificados sirven como sondas que se hibridan con los oligonucleótidos previamente unidos a una fase sólida; los fragmentos que no se han hibridado son eliminados posteriormente; dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases con una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en el presente listado de secuencias; y el segmento comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA. La fracción hibridada de los ácidos nucleicos hibridados tiene normalmente una longitud de al menos 9, 15, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos. No obstante, las moléculas más largas tienen una utilidad en la invención, y por tanto están comprendidas en el alcance de la presente invención.

En una forma de realización preferida, dicho dinucleótido está presente en el tercio central del oligómero. Por

ejemplo, si el oligómero comprende un dinucleótido CpG, dicho dinucleótido es preferiblemente el quinto a noveno nucleótido del extremo 5' de un 13-ámero. Un oligonucleótido existe para el análisis de cada dinucleótido CpG dentro de una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEC ID nº 5, y las posiciones equivalentes dentro de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46. Dichos oligonucleótidos también pueden estar presentes en forma de péptidos-ácidos nucleicos. A continuación se eliminan los amplificados que no han hibridado. Los amplificados hibridados se detectan. En este contexto, es preferible que los marcajes unidos a los amplificados sean identificables en cada posición de la fase sólida en la cual esté ubicada una secuencia oligonucleotídica.

En otra forma de realización del método, el estado de metilación genómico de las posiciones CpG se puede averiguar mediante sondas oligonucleotídicas (como se ha expuesto anteriormente) que se han hibridado al ADN tratado con bisulfito a la vez que los cebadores de amplificación por PCR (dichos cebadores pueden ser específicos de metilación o estándar).

Una forma de realización particularmente preferida de este método consiste en el uso de PCR cuantitativa en tiempo real con fluorescencia (Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; véase también la patente US nº 6.331.393) que utiliza una sonda oligonucleotídica fluorescente con doble marcaje (PCR TaqMan™, con un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California, EE.UU.). La reacción de PCR con TaqMan™ utiliza un oligonucleótido interrogante no extensible, denominado sonda TaqMan™, que, en formas de realización preferidas, está diseñado para hibridar con una secuencia rica en CpG localizada entre los cebadores de amplificación directos e inversos. La sonda TaqMan™ comprende además un componente indicador fluorescente y un componente atenuador unidos covalentemente a grupos de enlace (por ejemplo, fosforamiditos) unidos a su vez a los nucleótidos del oligonucleótido TaqMan™. Para el análisis de la metilación dentro de ácidos nucleicos que han sido sometidos al tratamiento con bisulfito, se necesita que la sonda sea específica de metilación, tal y como se describe en la patente US nº 6.331.393, (incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia) también conocido como ensayo MethyLightTM™. Las variaciones de la metodología de detección TaqMan™ que también son adecuadas para la utilización con la invención descrita incluyen la tecnología de sonda doble (Lightcycler™) o cebadores de amplificación fluorescentes (tecnología Sunrise™). Ambas técnicas se pueden adaptar adecuadamente para el uso con el ADN tratado con bisulfito, y asimismo para análisis de la metilación dentro de los dinucleótidos CpG.

En otra forma de realización preferida del método, la cuarta etapa del método comprende el uso de la elongación de oligonucleótidos dirigida por molde, como la MS-SNuPE descrita por Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997.

En otra forma de realización del método, la cuarta etapa del método comprende la secuenciación y el posterior análisis de la secuencia del amplificado generado en la tercera etapa del método (Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977).

Mejor modo

En la forma de realización más preferida del método, los ácidos nucleicos genómicos son aislados y tratados de acuerdo con las tres primeras etapas del método mencionadas anteriormente, a saber:

a) obtención de una muestra biológica de un sujeto que contiene ADN genómico del mismo;

b) extracción o aislamiento por otros medios del ADN genómico;

c) tratamiento del ADN genómico de b), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en su posición 5 en uracilo o en otra base que puede detectarse de forma distinta a la citosina gracias a sus propiedades de hibridación distintas; y

d) amplificación posterior al tratamiento aplicado en c) que se lleva a cabo de una manera específica de la metilación, a saber, mediante el uso de cebadores específicos de metilación u oligonucleótidos de bloqueo, y

e) detección de los amplificados mediante una sonda de detección en tiempo real, del modo descrito anteriormente.

Preferiblemente, la amplificación subsiguiente de d) se lleva a cabo mediante cebadores específicos de metilación, como se ha descrito anteriormente, comprendiendo dichos cebadores específicos de metilación una secuencia de al menos 9 nucleótidos de longitud que hibrida con una secuencia de ácido nucleico tratado según una de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y secuencias complementarias de las mismas, comprendiendo la secuencia de bases de dichos oligómeros al menos un dinucleótido CpG.

La etapa e) del método, es decir, la detección de los amplificados específicos indicativa del estado de metilación de una o más posiciones CpG según la SEC ID nº 5 se lleva a cabo mediante métodos de detección en tiempo real como se ha descrito anteriormente.

Otras formas de realización adicionales de la invención proporcionan un método para el análisis del estado de metilación de SHOX2 (preferiblemente la SEC ID nº 5, y complementos de la misma) sin necesidad de la conversión con bisulfito. Los métodos son conocidos en la técnica, en los que un reactivo a base de enzima de restricción sensible a la metilación, o una serie de reactivos de enzimas de restricción que comprenden una enzima de restricción sensible a la metilación que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de una región diana, son utilizados para determinar la metilación, por ejemplo, entre otros, por hibridación de metilación diferencial (DMH).

En la primera etapa de estas formas de realización adicionales, la muestra de ADN genómico se aisla de tejidos o células. El ADN genómico se puede aislar por cualesquier medios estándares en la técnica, incluido el uso de kits comerciales. En resumen, si el ADN de interés está encapsulado por una membrana celular la muestra biológica debe ser fragmentada y lisada por medios enzimáticos, químicos o mecánicos. A continuación, la solución de ADN se puede depurar de proteínas y otros contaminantes, por ejemplo mediante la digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera de la solución. Esto puede llevarse a cabo mediante diversos métodos que incluyen la extracción con sales o compuestos orgánicos o la unión del ADN a un soporte de fase sólida. La elección del método estará condicionada por diversos factores como el tiempo, el coste y la cantidad necesaria de ADN. Todos los tipos de muestra clínica que comprenden material neoplásico o potencialmente neoplásico son adecuados para la utilización con el presente método, preferentemente células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y material biológico derivado de broncoscopia (que incluye de manera no limitativa lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial y combinaciones de los mismos). Más preferiblemente el tipo de muestra se selecciona del grupo constituido por: plasma sanguíneo, esputo y material biológico derivado de broncoscopia (que incluye de manera no limitativa lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) y todas las combinaciones posibles de los mismos.

En una forma de realización preferida, el ADN puede ser segmentado antes del tratamiento con enzimas de restricción sensibles a la metilación. Tales métodos son conocidos en la técnica y pueden incluir tanto medios físicos como enzimáticos. Se prefiere particularmente el uso de una o una pluralidad de enzimas de restricción que no son sensibles a la metilación, y cuyos sitios de reconocimiento son ricos en AT y no comprenden dinucleótidos CG. El uso de tales enzimas permite la conservación de las islas CpG y de las regiones ricas en CpG en el ADN fragmentado. Las enzimas de restricción no específicas de metilación se seleccionan preferiblemente del grupo constituido por: MseI, BfaI, Csp6I, Tru1I, Tvu1I, Tru9I, Tvu9I, MaeI y XspI. Se prefiere particularmente el uso de dos

o tres de tales enzimas. Se prefiere particularmente el uso de una combinación de: MseI, BfaI y Csp6I.

El ADN fragmentado se puede entonces unir a oligonucleótidos adaptadores a fin de facilitar la posterior amplificación enzimática. La unión de oligonucleótidos a fragmentos de ADN con extremos romos y cohesivos es conocida en la técnica, y se efectúa mediante la desfosforilación de los extremos (por ejemplo utilizando fosfatasa alcalina de ternera o gamba) y la posterior unión por medio de enzimas ligasas (por ejemplo ADN ligasa T4) en presencia de dATP. Los oligonucleótidos adaptadores suelen tener normalmente al menos 18 pares de bases de longitud.

En la tercera etapa, el ADN (o fragmentos del mismo) se digieren con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación. La digestión se lleva a cabo de modo que la hidrólisis del ADN en el sitio de restricción aporta información sobre el estado de metilación de un dinucleótido CpG específico del gen SHOX2.

Preferiblemente, la enzima de restricción específica de metilación se selecciona del grupo constituido por: Bsi El, Hga I HinPl, Hpy99I, Ava I, Bce AI, Bsa HI, BisI, BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, McrBC, GlaI, MvnI, HpaII (HapII), HhaI, AciI, SmaI, HinPlI, HpyCH4IV, EagI y y mezclas de dos o más de dichos enzimas. Se prefiere una mezcla que contenga las enzimas de restricción: BstUI, HpaII, HpyCH4IV e HinPII.

En la cuarta etapa, que es opcional pero una forma de realización preferida, los fragmentos de restricción se amplifican. Esto se efectúa preferiblemente mediante una reacción en cadena de la polimerasa, y los amplificados resultantes pueden llevar marcajes detectables adecuados como se ha expuesto anteriormente, a saber, marcaje con fluoróforos, radionúclidos y marcadores de masa. Se prefiere particularmente la amplificación mediante una enzima de amplificación y al menos dos cebadores que comprendan, en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria de, o hibrida en condiciones restrictivas o moderadamente restrictivas con una secuencia como se define por SEC ID nº 5, y complementos de la misma. Preferiblemente dicha secuencia contigua tiene al menos 16, 20 o 25 nucleótidos de longitud. En una forma de realización alternativa dichos cebadores pueden ser complementarios a cualquier adaptador unido a los fragmentos.

En la quinta etapa se detectan los amplificados. La detección puede realizarse por cualesquier medios estándares en la técnica, por ejemplo, aunque no exclusivamente, análisis por electroforesis en gel, análisis por hibridación, incorporación de etiquetas detectables dentro de los productos de PCR, análisis con matriz de ADN, análisis MALDI

o ESI. Preferiblemente dicha detección se lleva a cabo mediante la hibridación de al menos un ácido nucleico o péptido-ácido nucleico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleótidos de longitud que es complementaria de, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia como se define por SEC ID nº 5, y complementos de la misma. Preferiblemente dicha secuencia contigua tiene al menos 16, 20 o 25 nucleótidos de longitud.

Después de la determinación del estado o nivel de metilación de los ácidos nucleicos genómicos, la presencia o ausencia de trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón) se deduce a partir del estado o nivel de metilación de al menos una secuencia de dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5, o una media, o un valor que refleje un estado de metilación medio de una pluralidad de secuencias de dinucleótidos CpG de la SEC ID nº 5 en la cual metilación está asociada con la presencia de trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón). En aquellos casos en que dicha metilación se determina mediante medios cuantitativos el punto de corte para determinar dicha presencia de metilación es preferiblemente cero (es decir, en el cual el que una muestra exhiba cualquier grado metilación se determina a partir del estado de metilación en la posición CpG analizada). Sin embargo, es previsible que el experto en la materia pueda pretender ajustar el valor de corte a fin de disponer de un ensayo de una sensibilidad o especificidad particularmente preferida. En consecuencia, el valor de corte puede aumentarse (aumentando así la especificidad), pudiendo estar comprendido dicho valor de corte en un intervalo seleccionado del grupo constituido por: 0%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-30% y 30%-50%. Se prefieren particularmente los siguientes valores de corte: 10%, 15%, 25% y 30%.

Después de la determinación de la metilación de SHOX2 la presencia o ausencia de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) se determina, en la cual la hipermetilación indica la presencia del carcinoma de pulmón y la hipometilación indica la ausencia de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) en el sujeto. Se prefiere particularmente un carcinoma de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

Otras mejoras

La invención dada a conocer divulga ácidos nucleicos tratados, derivados de la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83 genómica, cuyo tratamiento es adecuado para convertir al menos una base citosina sin metilar de la secuencia de ADN genómico en uracilo u otra base que puede detectarse de modo distinto de la citosina por sus características de hibridación. Las secuencias genómicas en cuestión pueden comprender una o más posiciones consecutivas de CpG metilado. Dicho tratamiento comprende preferiblemente el uso de un reactivo seleccionado entre el grupo constituido por: bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito y combinaciones de los mismos. En una forma de realización preferida de la invención, la invención divulga un ácido nucleico modificado no natural y que comprende una secuencia de al menos a 16 bases nucleotídicas contiguas de longitud de una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60, SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103. Dicho ácido nucleico tiene al menos 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en las SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60, SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103. Se divulga asimismo una molécula de ácido nucleico que no es idéntica o complementaria a toda o a una porción de las secuencias SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60, SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103 pero no la SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83 u otro ADN natural.

Se prefiere que dicha secuencia comprenda al menos un dinucleótido CpG, TpA o CpA y secuencias complementarias de los mismos. Las secuencias de SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60, SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103 proporcionan versiones modificadas no naturales del ácido nucleico de acuerdo con la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83, en la cual la modificación de cada secuencia genómica da como resultado la síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es única y distinta de dicha secuencia genómica como se indica a continuación. De cada hebra codificadora de ADN genómico, por ejemplo, la de la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83, se muestran cuatro versiones convertidas. Una primera versión en la cual la "C" se convierte en "T," pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso en que, en la secuencia genómica, todos los residuos de "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG están metilados y por ello no se convierten); una segunda versión muestra el complemento de la secuencia de ADN genómico mostrada (es decir, la hebra no codificadora), en la cual la "C" se convierte en "T," pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso en que, todos los residuos de "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG está metilados y por ello no se convierten). Las secuencias convertidas 'metiladas al alza' de la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83 corresponden a las SEC ID nº 13 & SEC ID nº 36, SEC ID nº 84 a SEC ID nº 93. Es divulgada una tercera versión convertida químicamente de cada secuencia genómica, en la cual la "C" se convierte en "T" en todos los residuos de "C", incluidos aquellos que forman parte de las secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir, corresponde al caso en que, en las secuencias genómicas, todos los residuos de "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG están sin metilar); una última versión convertida químicamente de cada secuencia, muestra el complemento de la secuencia de ADN genómico mostrada (es decir, la hebra no codificadora), en la cual la "C" se convierte en "T" en todo los residuos de "C", incluidos aquellos que forman parte de las secuencias de dinucleótidos "CpG" (es decir,

corresponde al caso en que, en el complemento (hebra no codificadora) de cada secuencia genómica, todo los residuos de "C" de las secuencias de dinucleótidos CpG están sin metilar). Las secuencias convertidas 'metiladas a la baja' de la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83 corresponden a las SEC ID nº 37 a SEC ID nº 60, SEC ID nº 84 a SEC IDnº 93.

Significativamente, hasta ahora, las secuencias y moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con las SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60, SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103 no estaban implicadas o conectadas con la detección o el diagnóstico de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). Se prefiere particularmente un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

En una forma de realización preferida alternativa, la invención proporciona además oligonucleótidos u oligómeros adecuados para la utilización en los métodos de la invención para detectar el estado de metilación de las citosinas dentro del ADN genómico o tratado (químicamente modificado), de acuerdo con las SEC ID nº 5, 21, 22, 45 o 46. Dichos oligonucleótidos o ácidos nucleicos oligoméricos proporcionan unos medios diagnósticos nuevos. Dichos oligonucleótidos u oligómeros comprenden una secuencia de ácido nucleico con una longitud de al menos nueve (9) nucleótidos que es idéntica a, e hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas (definidas anteriormente en la presente memoria) con una secuencia de ácido nucleico tratada acorde con las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46 y/o secuencias complementarias de las mismas, o con una secuencia genómica acorde con la SEC ID nº 5 y/o secuencias complementarias de las mismas.

Por lo tanto, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidos y moléculas de péptido-ácido nucleico (PNA) (oligómeros de PNA)) que hibridan en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas y/o restrictivas con toda o con una porción de las secuencias SEC ID nº 5, 21, 22, 45 o 46 o con los complementos de las mismas. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico que hibride en condiciones de hibridación moderadamente restrictivas y/o restrictivas con todas o con una porción de las secuencias SEC ID nº 21, 22, 45 o 46 pero no la SEC ID nº 5 u otro ADN genómico humano.

La porción idéntica o hibridante de los ácidos nucleicos que se hibridan tiene normalmente al menos 9, 16, 20, 25, 30 o 35 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las moléculas más largas también tienen utilidad para la invención, y por eso están comprendidas en el alcance de la presente invención.

Preferiblemente, la porción hibridante de los ácidos nucleicos que se hibridan inventivos es al menos un 95%, o al menos un 98%, o 100% idénticos a la secuencia, o a una porción de la misma de las SEC ID nº 5, 21, 22, 45 o 46, o a complementos de las mismas.

Los ácidos nucleicos hibridantes del tipo descrito en la presente memoria se pueden usar, por ejemplo, como un cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o una sonda o cebador diagnósticos. Preferiblemente, la hibridación de la sonda oligonucleotídica con una muestra de ácido nucleico se efectúa en condiciones restrictivas y la sonda es 100% idéntica a la secuencia diana. La estabilidad del dúplex o el híbrido de ácido nucleico se expresa como la temperatura de fusión o Tm, que es la temperatura a la cual las sondas se disocian del ADN diana. Esta temperatura de fusión se usa para definir las condiciones de restrictividad necesarias.

En el caso de las secuencias diana que están relacionadas y que son sustancialmente idénticas a la secuencia correspondiente de la SEC ID nº 5 (como las variantes alélicas y los SNP), pero no exactamente idénticas, es útil establecer primero la temperatura más baja a la cual sólo se produce la hibridación homóloga con una concentración de sal particular (por ejemplo, SSC o SSPE). A continuación, suponiendo que un 1% de desapareamiento se traduce en un descenso de 1°C de la Tm, la temperatura del lavado final en la reacción de hibridación se reduce en consonancia (por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad > 95% con la sonda, la temperatura del lavado final se reduce 5°C). En la práctica, el cambio de l a Tm puede oscilar entre 0,5°C y 1,5°C por 1% de desapareamiento.

Los ejemplos de los oligonucleótidos de longitud X (en nucleótidos), como se indica por las posiciones de los polinucleótidos con referencia a, por ejemplo, la SEC ID nº 1, incluyen aquellos correspondientes a conjuntos (de codificantes y no codificantes) de oligonucleótidos de longitud X consecutivamente solapados, donde los oligonucleótidos dentro de cada conjunto solapado consecutivamente (correspondiente a un valor X dado) se definen como el conjunto finito de Z oligonucleótidos de las posiciones nucleotídicas:

n a (n + (X-1));

donde n=1, 2, 3,...(Y-(X-1));

donde Y es igual a la longitud (nucleótidos o pares de bases) de la SEC ID nº 1 (3905);

donde X es igual a la longitud común (en nucleótidos) de cada oligonucleótido del juego (por ejemplo, X=20 para

un conjunto de 20-ámeros solapados consecutivamente); y

donde el número (Z) de oligómeros solapados consecutivamente de longitud X para una SEC ID nº 1 dada de longitud Y es igual a Y-(X-1). Por ejemplo: Z= 3905 -19= 3886 para los conjuntos codificantes y no codificantes de la SEC ID nº 1, donde X=20.

Preferiblemente, el conjunto está limitado a aquellos oligómeros que comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.

Los ejemplos de los oligonucleótidos 20-ámeros inventivos incluyen el siguiente conjunto de 3905 oligómeros (y al conjunto no codificante complementario de los mismos), indicado por las posiciones de polinucleótidos con referencia a la SEC ID nº 1: 1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, ............y 3886-3905.

De manera similar, ejemplos de oligonucleótidos 25-ámeros incluyen el siguiente conjunto de 3881 oligómeros (y el conjunto no codificante complementario de los mismos), indicado por las posiciones de polinucleótidos con referencia a la SEC ID nº 1: 1-25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29,.......y 3881-3905.

La presente invención comprende, para cada una de las secuencias SEC ID nº 5, 21, 22, 45 o 46 (codificante y no codificante), múltiples conjuntos solapados consecutivamente de oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X, donde, p. ej., X= 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 o 35 nucleótidos.

Los oligonucleótidos u oligómeros según la presente invención constituyen herramientas eficaces y útiles para averiguar parámetros genéticos y epigenéticos de la secuencia genómica correspondientes a la SEC ID nº 5. Los conjuntos preferidos de tales oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados de longitud X son aquellos conjuntos solapados consecutivamente de oligómeros correspondientes a las SEC ID nº 5, 21, 22, 45 o 46 (y los complementos de los mismos). Preferiblemente, dichos oligómeros comprenden al menos un dinucleótido CpG, TpG

o CpA.

Se prefieren particularmente aquellos oligonucleótidos u oligómeros según la presente invención en los cuales la citosina de las secuencias de dinucleótidos CpG (o del correspondiente dinucléotido convertido TpG o CpA) se encuentra dentro del tercio medio del oligonucleótido; esto es, si el oligonucleótido tiene, por ejemplo, 13 bases de longitud, el dinucleótido CpG, TpG o CpA está situado entre el quinto y el noveno nucleótido del extremo 5'.

Los oligonucleótidos de la invención también se pueden modificar mediante la unión química del oligonucleótido con uno o más componentes o conjugados para mejorar la actividad, estabilidad o detección del oligonucleótido. Estos componentes o conjugados incluyen cromóforos, fluoróforos, lípidos como el colesterol, ácido cólico, tioéter, cadenas alifáticas, fosfolípidos, poliaminas, polietilenglicol (PEG), grupos palmitilo, y otros mostrados en, por ejemplo, las patentes US nº 5.514.758, 5.565.552, 5.567.810, 5.574.142, 5.585.481, 5.587.371, 5.597.696 y

5.958.773. Las sondas también pueden adquirir la forma de PNA (péptido ácido nucleico) que poseen propiedades de apareamiento particularmente preferidas. Así pues, el oligonucleótido puede incluir otros grupos anexados como péptidos, y puede includir agentes de escisión activados por la hibridación (Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988) o agentes intercalantes (Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988). Con este fin, el oligonucleótido se puede conjugar con otra molécula, por ejemplo, un cromóforo, fluoróforo, péptido, agente de entrecruzamiento activado por la hibridación, agente de transporte, agente de escisión activado por la hibridación, etc.

El oligonucleótido también puede comprender al menos un azúcar modificado y/o una fracción de base conocido en la técnica, o puede comprender una estructura central modificada o un enlace entre nucleósidos no natural.

Los oligonucleótidos u oligómeros según las formas de realización particulares de la invención se utilizan normalmente en “conjuntos”, los cuales contienen al menos un oligómero para el análisis de cada uno de los dinucleótidos CpG de una secuencia genómica seleccionada del grupo constituido por la SEC ID nº 5 y las secuencias complementarias de las mismas, o con los correspondientes dinucleótidos CpG, TpG o CpA dentro de una secuencia de los ácidos nucleicos tratados de acuerdo con las SEC ID nº 21, 22, 45 o 46 y las secuencias complementarias de las mismas. No obstante, se prevé que por razones económicas u otros factores pueda ser preferible analizar una selección limitada de los dinucleótidos CpG situados dentro de dichas secuencias, y el contenido del conjunto de oligonucleótidos cambia en consecuencia.

Por consiguiente, en las formas de realización particulares, la presente invención proporciona un conjunto de al menos dos (2) (oligonucleótidos y/o oligómeros de PNA) útiles para detectar el estado de metilación de las citosinas en ADN genómico tratado (SEC ID nº 21, 22, 45 o 46), o en ADN genómico (SEC ID nº 5 y secuencias

complementarias de las mismas). Estas sondas permiten el diagnóstico y la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). Se prefiere particularmente un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico. El juego de oligómeros también se puede usar para detectar polimorfismos de nucleótido único (SNP) en ADN genómico tratado (SEC ID nº 21, 22, 45 o 46 o en ADN genómico (SEC ID nº 5 y secuencias complementarias de las mismas).

En formas de realización preferidas, al menos uno, y más preferiblemente todos los miembros de un juego de oligonucleótidos están unidos a una fase sólida.

En otras formas de realización, la presente invención proporciona un juego de al menos dos (2) oligonucleótidos que son utilizados como oligonucleótidos 'cebadores' para amplificar las secuencias de ADN de una de las SEC ID nº 5, 21, 22, 45 o 46 y las secuencias complementarias de las mismas, o segmentos de las mismas.

Está previsto que los oligonucleótidos puedan constituir toda o una parte de una "matriz" o "chip de ADN" (es decir, una disposición de diferentes oligonucleótidos y/o oligómeros de PNA unidos a una fase sólida). Esta matriz de diferentes secuencias de oligonucleótidos y/o oligómeros de PNA se puede caracterizar, por ejemplo, porque está organizada sobre la fase sólida en forma de una retícula rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida puede estar compuesta de sílice, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro. También se puede usar nitrocelulosa y plásticos como el nilón, que pueden aparecer en forma de granulado o también de matrices de resina. Una visión general de la técnica existente hasta ahora para la fabricación de matrices de oligómeros se puede obtener de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999, y de la bibliografía citada en ella). Las sondas fluorescentes se utilizan a menudo para escanear las matrices de ADN inmovilizado. La simple unión de colorantes Cy3 y Cy5 al 5'-OH de la sonda específica son particularmente adecuadas para los marcajes de fluorescencia. La detección de la fluorescencia en las sondas hibridadas se puede efectuar, por ejemplo, mediante un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles comercialmente.

También se prevé que los oligonucleótidos, o secuencias particulares de los mismos, puedan formar toda o una parte de una "matriz virtual" en la cual los oligonucleótidos, o secuencias particulares de los mismos, se usan, por ejemplo, a modo de 'especificadores' como parte de, o en combinación con una población diversa de sondas marcadas de forma única y distintiva para analizar una mezcla compleja de analitos. Un método así, se describe por ejemplo en el documento US 2003/0013091 (US nº de serie 09/898.743, publicada el 16 enero 2003). En tales métodos, se generan suficientes marcajes de modo que cada ácido nucleico presente en la mezcla compleja (es decir, cada analito) puede estar unido de forma singular a una marca única y de esa forma ser detectado (cada marca se cuenta directamente, dando como resultado una lectura digital de cada especie molecular presente en la mezcla).

Se prefiere particularmente que los oligómeros según la invención sean utilizados para detectar, o para diagnosticar los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). Se prefiere particularmente que sea un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

Kits

Además, un aspecto adicional de la presente invención es la utilización de un kit para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga, comprendiendo el kit un reactivo que contiene bisulfito; uno o varios oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de 9, o más preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46, y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el método de análisis de metilación descrito. En una forma de realización, la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, CpA o TpG.

En otra forma de realización, dicho kit puede comprender además reactivos estándares para llevar a cabo un análisis de la metilación específico de la posición del CpG, en el cual dicho análisis comprende una o más de las siguientes técnicas: MS-SNuPE, MSP, MethyLight™, HeavyMethyl, COBRA y secuenciación de ácido nucleico. No obstante, un kit a lo largo de la presente invención también puede contener sólo una parte de los componentes mencionados anteriormente.

En una forma de realización preferida el kit puede contener reactivos adicionales de conversión con bisulfito seleccionados del grupo constituido por: tampón de desnaturalización de ADN, tampón de sulfonación, reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad), tampón de desulfonación, y componentes de recuperación de ADN.

En otra forma de realización alternativa, el kit puede contener, envasado en recipientes separados, una polimerasa y

un tampón de reacción optimizado para la elongación del cebador mediada por la polimerasa, como la PCR. En otra forma de realización de la invención el kit comprende además unos medios para la obtención de una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que además comprenda un recipiente adecuado para contener los medios para determinar la metilación de SHOX2 en la muestra biológica del paciente, y más preferiblemente que comprende además instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit. En una forma de realización preferida el kit comprende: (a) un reactivo bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contenga dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso sean idénticas, sean complementarias, o se hibriden en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de 9, o más preferiblemente de 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46; y opcionalmente (d) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit. En una forma de realización preferida alternativa el kit comprende: (a) un reactivo bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un oligonucleótido y/o oligómero de PNA con una longitud al menos 9 o 16 nucleótidos que es idéntico a o se hibrida con una secuencia de ácido nucleico pretratado de acuerdo con una de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46 y secuencias complementarias de las mismas; y opcionalmente (d) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

En una forma de realización alternativa el kit comprende: (a) un reactivo bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contenga dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso sean idénticas, sean complementarias, o hibriden en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de 9 o más preferiblemente de 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46; (d) al menos un oligonucleótido y/o oligómero de PNA con una longitud de al menos 9 o 16 nucleótidos que es idéntico a o se hibrida con una secuencia de ácido nucleico pretratado de acuerdo con una de las SEC ID nº 21, 22, 45 y 46 y secuencias complementarias de las mismas; y opcionalmente (e) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes como tampones o soluciones adecuadas para el bloqueo, lavado o recubrimiento, envasadas en un recipiente separado.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit destinado a determinar la presencia y/o diagnosticar un cáncer de pulmón, mama o vejiga. Se prefiere particularmente un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

Dicho kit comprende preferiblemente: unos medios para medir el nivel de transcripción de al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido po SHOX2 y unos medios para determinar la metilación del gen SHOX2.

Los reactivos típicos (por ejemplo como los que se pueden encontrar en un kit COBRA™ típico) para el análisis COBRA™ pueden incluir, aunque no exclusivamente: cebadores de PCR para al menos el gen SHOX2, enzima de restricción y tampón adecuado; oligo de hibridación génica; oligo control de la hibridación; kit marcado con cinasa para sonda oligomérica; y nucleótidos marcados. Los reactivos típicos (por ejemplo como los que se pueden encontrar en un kit MethyLight™ típico) para el análisis MethyLight™ pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR para la secuencia convertida con bisulfito del gen SHOX2, sondas específicas de bisulfito (p. ej. TaqMan™ o Lightcycler™); tampones optimizados y desoxinucleótidos para PCR; y polimerasa Taq.

Los reactivos típicos (por ejemplo como los que se pueden encontrar en un kit Ms-SNuPE™ típico) para el análisis Ms-SNuPE™ pueden incluir, aunque no exclusivamente: cebadores de PCR para un gen específico (o una secuencia de ADN o una isla CpG tratados con bisulfito); tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE™ para la secuencia convertida con bisulfito del gen SHOX2; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados.

Los reactivos típicos (por ejemplo como los que se pueden encontrar en un kit MSP típico) para el análisis MSP pueden comprender de manera no limitativa: cebadores de PCR metilados y sin metilar para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por: PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1; tampones y desoxinucleótidos optimizados para PCR, y sondas específicas.

Asimismo, un aspecto adicional de la presente solicitud divulga un kit alternativo que comprende unos medios para determinar la de al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por: PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RH1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1 metilación, donde dichos medios comprenden preferiblemente al menos una enzima de restricción específica de metilación; uno o una pluralidad de oligonucleótidos cebadores (preferiblemente una o una pluralidad de parejas de cebadores) adecuados para la amplificación de una secuencia que comprenda al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº

83; y opcionalmente instrucciones para llevarlo a cabo y evaluar el método descrito de análisis de metilación. En una forma de realización las secuencias de bases de dichos oligonucleótidos son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con al menos un segmento de 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83.

Dicho kit puede comprender una o una pluralidad de sondas oligonucleotídicas para el análisis de los fragmentos digeridos, preferiblemente dichos oligonucleótidos son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con al menos un segmento de 16 bases de longitud de una secuencia seleccionada entrelas SECID nº 1 aSEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83.

El kit puede comprender reactivos adicionales seleccionados del grupo constituido por: tampón (por ejemplo enzima de restricción, PCR, tampones de conservación o lavado); kits o reactivos de recuperación del ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad) y componentes para la recuperación del ADN.

El kit puede contener, envasados en recipientes separados, una polimerasa y un tampón de reacción optimizado para la elongación con cebador mediada por la polimerasa, como la PCR. En otra forma de realización de la invención el kit comprende además unos medios para la obtención de una muestra biológica del paciente. En una forma de realización preferida el kit comprende: (a) un reactivo a base de enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos o péptidos-ácidos nucleicos que son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83; y opcionalmente (d) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

El kit puede comprender: (a) un reactivo a base de enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuado para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83; y opcionalmente (d) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

El kit puede comprender: (a) un reactivo a base de enzima de restricción sensible a la metilación; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biológica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleótidos cebadores adecuado para la amplificación de una secuencia que comprenda al menos un dinucleótido CpG de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83; (d) al menos un conjunto de oligonucleótidos, uno o varios acidos nucleicos o péptidos-ácidos nucleicos que son idénticos, son complementarios, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada entre las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83 y opcionalmente (e) instrucciones de uso y de interpretación de los resultados del kit.

El kit también puede contener otros componentes como tampones o soluciones adecuados para bloqueo, lavado o recubrimiento, envasados en un recipiente separado.

La solicitud divulga asimismo un kit destinado a facilitar el diagnóstico de presencia o ausencia de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón), en un sujeto mediante un análisis con una enzima de restricción sensible a la metilación. Dicho kit comprende un recipiente y un componente de micromatriz de ADN. Dicha micromatriz de ADN consistiría en una superficie sobre la cual se inmovilizan diversos oligonucleótidos en posiciones determinadas y en la cual el oligonucleótido comprende al menos un sitio de metilación CpG. Al menos uno de dichos oligonucleótidos es específico para al menos un gen o secuencia genómica seleccionados del grupo constituido por: PTGER4, RUNX1, EVX2, EVX-1, SHOX2, SEC ID nº 6, CN027, LRAT, IL-12RB1, TFAP2C, BCL2, EN2, PRDM14, SEC ID nº 81, ARID5A, VAX1 y comprende una secuencia de al menos 15 pares de bases de longitud pero no más de 200 pb de una secuencia según una de las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83. Preferiblemente dicha secuencia tiene al menos 15 pares de bases de longitud pero no más de 80 pb de una secuencia acorde con una de las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83. Además se prefiere que dicha secuencia tenga al menos 20 pares de bases de longitud pero no más de 30 pb de una secuencia acorde con una de las SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12; SEC ID nº 79 aSEC ID nº 83.

Dicho kit de análisis preferiblemente comprende además un componente de enzima de restricción que comprendería una o varias enzimas de restricción sensibles a la metilación.

Dicho kit de análisis se caracteriza además por comprender al menos una enzima de restricción específica de la metilación, y en la cual los oligonucleótidos comprenden un sitio de restricción para al menos una de dichas enzimas de restricción específicas de la metilación.

El kit puede comprender además uno o varios de los siguientes componentes, que son conocidos en la técnica para el enriquecimiento del ADN: un componente proteico, uniéndose dicha proteína selectivamente al ADN metilado; un

componente de ácido nucleico que forme un tríplex, uno o varios agentes de unión, opcionalmente en una solución adecuada; sustancias o soluciones para realizar una ligación por ejemplo ligasas, tampones; sustancias o soluciones para realizar una cromatografía en columna; sustancias o soluciones para realizar un enriquecimiento con métodos inmunológicos (por ejemplo inmunoprecipitación); sustancias o soluciones para realizar una amplificación de ácido

5 nucleico por ejemplo PCR; uno o varios colorantes, si procede con un reactivo de acoplamiento, y si procede en una solución; sustancias o soluciones para realizar una hibridación; y/o sustancias o soluciones para realizar una etapa de lavado.

La solicitud divulga además una composición de materia útil para la detección o para el diagnóstico de los trastornos

10 proliferativos celulares, preferentemente aquellos según la tabla 2 (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón). Se prefiere particularmente un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cancer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

Dicha composición comprende preferiblemente al menos un ácido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un

15 segmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en las SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60; SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103, y una o más sustancias tomadas del grupo que comprende: cloruro de magnesio 1-5 mM, 100-500 µM dNTP, 0,5-5 unidades de polimerasa taq, albúmina de suero bovino, un oligómero, en particular un oligonucleótido o un oligómero de péptido-ácido nucleico (PNA), comprendiendo dicho oligómero en cada caso al menos una secuencia de bases con una longitud de al menos 9 nucleótidos que es complementaria o hibrida en condiciones

20 moderadamente restrictivas o restrictivas con un ADN genómico pretratado de acuerdo con una de las SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60; SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103 y secuencias complementarias de las mismas. Se prefiere que dicha composición de materia comprenda una solución tampón adecuada para la estabilización de dicho ácido nucleico en una solución acuosa y que posibilite las reacciones de la polimerasa dentro de dicha solución. Los tampones adecuados son conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles.

25 Dicho por lo menos un ácido nucleico es de por lo menos 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en las SEC ID nº 13 a SEC ID nº 60; SEC ID nº 84 a SEC ID nº 103.

30 Tabla 1

Gen: Genómico SEC ID nº Secuencia metilada pretratada (codificante) SEC ID nº Hebra metilada pretratada (no codificante) SEC ID nº Secuencia sin metilar pretratada (codificante) SEC ID nº Secuencia sin metilar pretratada (no codificante) SEC ID nº

RUNX1: 1 13 14 37 38

EVX2: 2 15 16 39 40

EVX-1: 3 17 18 41 42

PTGER4: 4 19 20 43 44

SHOX2: 5 21 22 45 46

Gen no anotado, cuya secuencia está localizada entre los genes TIM14 y SOX-2: 6 23 24 47 48

CN027: 7 25 26 49 50

LRAT: 8 27 28 51 52

IL-12RB1: 9 29 30 53 54

TFAP2C: 10 31 32 55 56

BCL2: 11 33 34 57 58

ARID5A: 12 35 36 59 60

Proteína de caja homeótica engrailed-2 (Hu-En-2); EN2; HME2: 79 84 85 94 95

Proteína 14 con dedos de cinc y dominio PR (proteína con dominio PR 14); pRDM14: 80 86. 87 96 97

Localización cromosómica (NCBI36) cromosoma: 15 bp45139161 a 45139783: 81 88 89 98 99

Dominio interactivo rico en AT 5A; ARID5A: 82 90 91 100 101

Caja homeótica ventral anterior 1; VAX1: 83 92 93 102 103

Tabla 2

Gen: Trastorno preferido

EVX2: Cáncer, preferiblemente de pulmón

RUNX1: Cáncer, preferiblemente de pulmón, próstata y/o mama

PTGER4: Cáncer, preferiblemente de pulmón, próstata y/o mama

SHOX2: Cáncer, preferiblemente de pulmón, próstata y/o vejiga

ninguno; hacia 5’: TIM14 / hacia 3’: SOX-2: Cáncer, preferiblemente de próstata

CN027: Cáncer, preferiblemente de pulmón y/o próstata

LRAT: Cáncer, preferiblemente de colon

IL-12RB1: Cáncer, preferiblemente de próstata y/o mama

EVX-1: Cáncer

TFAP2C: Cáncer

BCL2: Cáncer, preferiblemente de pulmón

Proteína de caja homeótica engrailed-2 (Hu-En-2); EN2; HME2: Cáncer, preferiblemente de pulmón

Proteína 14 con dedos de cinc y dominio PR (proteína con dominio PR 14); PRDM14: Cáncer, preferiblemente de pulmón

Localización cromosómica (NCBI36) cromosoma: 15 bp45139161 a 45139783: Cáncer, preferiblemente de pulmón

Dominio interactivo rico en AT 5A; ARID5A: Cáncer, preferiblemente de pulmón

Caja homeótica ventral anterior 1; VAX1: Cáncer, preferiblemente de pulmón

Tabla 3A

Gen/región genómica: Cebador 1 SEC ID nº Cebador 2 SEC ID nº Sonda SEC ID nº

SEC ID Nº6: 64 65 66

CN027: 67 68 69

LRAT: 70 71 72

TFAP2C: 73 74 75

EVX-1: 76 77 78

EVX2: 79 80 81

SHOX2: 82 83 84

ARID5A: 85 86 87

RUNX1: 88 89 90

PTGER4: 91 92 93

BCL2: 94 95 96

IL-12RB1: 97 98 99

Tabla 3B

Secuencia diana (genómica): Oligo SEC ID nº Secuencia

SEC ID nº 79 Cebador directo: 104 tatcgcggagattttcgagttttcgttg

SEC ID nº 79 Sonda: 105 ggggttgttttcgggatt

SEC ID nº 79 Cebador inverso: 106 gataaccctaaaacgcaactcgaa

SEC ID nº 80 Cebador inverso: 107 cgtttcgtaaggagcgtgtt

SEC ID nº 80 Cebador directo: 108 cgcgttgttcgcggttagtttcgt

SEC ID nº 80 Sonda: 109 cgacgttttcgcgtgg

SEC ID nº 81 Cebador directo: 110 gttttgaaatttattagaataacgacgtt

SEC ID nº 81 Cebador inverso: 111 ctttctaaaaataaccgaactatactacgac

SEC ID nº81 Sonda: 112 tacggacgttcgcgggtcgtt

SEC ID nº 82 Sonda: 113 agtaagttcgcgtagattcggttt

SEC ID nº 82 Cebador inverso: 114 taaaacgacgaaacgaccgat

SEC ID nº 82 Cebador directo: 115 tcgtcgttttcgggttgtcgagtg

SEC ID nº 83 Sonda: 116 aaggaagtggaaataatcgtcgta

SEC ID nº 83 Cebador directo: 117 aggcgtttttgttttttcggaaattcgaaattc

SEC ID nº 83 Cebador inverso: 118 ctacgactaataccgtaaacgccta

10 Tabla 4A

Tipo de tejido: Cáncer de pulmón de cualquier tipo Adenocarcinoma de pulmón Cáncer de pulmón macrocítico Carcinoma escamoso de pulmón Carcinoma de pulmón microcítico Carcinoma de próstata

Umbral PMR (%): >20 >20 >20 >20 >20 >20

N total: 61 21 12 21 7 10

Gen

EVX2: 76,8 52,4 75,0 90,5 100,0 60,0

RUNX1: 76,7 61,9 58,3 85,7 100,0 100,0

PTGER4: 66,1 66,7 66,7 61,9 71,4 100,0

SHOX2: 63,0 38,1 50,0 90,5 71,4 20,0

SEQ IDN.º 6: 68,2 38,1 33,3 95,2 100,0 100,0

CN027: 55,9 38,1 41,7 71,4 71,4 100,0

LRAT: 41,7 42,9 33,3 42,9 42,9 30,0

IL-12RB1: 24,9 14,3 16,7 28,6 42,9 100,0

EVX-1: 47,4 38,1 33,3 57,1 57,1 100,0

TFAP2C: 68,1 38,1 58,3 85,7 100,0 100,0

BCL2: 14,1 23,8 8,3 14,3 0,0 50,0

Tabla 4B

Tipo de tejido: Cáncer colorrectal Carcinoma de mama Carcinoma de vejiga Enfermedades pulmonares (No cáncer) Pulmón sano Sangre

Umbral PMR (%): >20 >20 >20 >5 >5 >0,2

N (total): 10 10 10 7 12 20

Gen

EVX2: 40,0 80,0 80,0 0,0 0,0 55,0

RUNX1: 20,0 80,0 60,0 0,0 0,0 0,0

PTGER4: 0,0 80,0 30,0 0,0 0,0 0,0

SHOX2: 60,0 80,0 70,0 0,0 0,0 10,0

SEC ID nº 6: 60,0 50,0 50,0 28,6 33,3 25,0

CN027: 90,0 70,0 70,0 0,0 8,3 25,0

LRAT: 90,0 60,0 60,0 0.0 0,0 0,0

IL-12RB1: 0,0 80,0 30,0 85,7 100,0 0,0

EVX-1: 80,0 80,0 90,0 0,0 0,0 0,0

TFAP2C: 100,0 100,0 60,0 14,3 0,0 25,0

BCL2: 0,0 10,0 60,0 0,0 0,0 0,0

Tabla 4C

Umbral PMR (%): >20 >20 >20 >20 >20 >20

N (total): 61 21 12 21 7 10

SEC ID Nº

SEC ID Nº 79: 38 29 33 57 29 55

SEC ID Nº 80: 42 29 16 66 43 11

SEC ID Nº 81: 24 24 8 28 29 11

SEC ID Nº 82: 58 57 50 62 57 66

SEC ID Nº 83: 45 24 33 66 57 25

Tabla 4D

Tipo de tejido: Próstata sana Cáncer colorrectal Colon sano Carcinoma de mama Mama sana Carcinoma de vejiga Vejiga sana Enfermedades pulmonares (No cáncer) Pulmón sano Sangre

Umbral PMR (%): >5 >20 >5 >20 >5 >20 >5 >5 >5 >0,2

N (total): 11 10 9 10 12 10 10 7 12 20

SEC ID Nº

SEC ID Nº 79: 0 40 0 50 0 40 0 0 0 0

SEC ID Nº 80: 0 50 0 40 0 30 0 0 0 0

SEC ID Nº 81: 0 40 0 20 0 10 0 0 0 0

SEC ID Nº 82: 12 10 22 60 0 90 70 0 0 0

SEC ID Nº 83: 12 60 0 50 0 60 10 0 0 0

Tabla 5

PTGER4: RUNX1

NSCLC: Sens. Espec. Sens. Espec.

Lavado bronquial: 52% 91% 39% 91%

Plasma sanguíneo: 69% 91% -- --

5 Ejemplos

Ejemplo 1

Se llevó a cabo un análisis de la metilación de los genes/secuencias indicados en la Tabla 1 en múltiples muestras 10 de tejido canceroso y control mediante un ensayo de MSP en tiempo real con los componentes indicados en la Tabla

3.

Muestras

15 Tipo de tejido N.º de muestras Adenocarcinoma de pulmón 21 Cáncer de pulmón macrocítico 12 Carcinoma escamoso de pulmón 21 Carcinoma pulmonar microcítico 7

20 Carcinoma prostático 10 Cáncer colorrectal 10 Carcinoma de mama 10 Carcinoma de vejiga 10 Enfermedades pulmonares (no cáncer)7

25 Pulmón sano 12 Sangre/leucocitos 20

Extracción del ADN y tratamiento con bisulfito

30 El ADN se aisló de todas las muestras siguiendo un protocolo modificado basado en el manual Genomic ADN Handbook de Qiagen (agosto 2001) (págs. 28-31, 44-47). El ADN contenido en el eluato se cuantificó y el eluato fue tratado de acuerdo con la siguiente reacción de bisulfito.

El eluato se mezcló con 354 µl de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 µl de un captador de radicales que contenía

35 dioxano (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano 2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99°C y de spués se incubó con el siguiente programa de temperatura durante un total de 7 h min 50°C; un pico térmico ( 99,9°C) durante 3 min; 1,5 h 50°C; un pico térmico (99°C) durante 3 min; 3 h 50°C. La mezcla de reacción se purificó después mediante ultrafiltración en una columna Millipore Microcon™. La purificación se efectuó básicamente siguiendo las instrucciones del fabricante. Con este fin, la

40 mezcla de reacción se mezcló con 300 µl de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y después se lavó con tampón TE 1 x. El ADN permaneció sobre la membrana durante este tratamiento. A continuación, se realizó la desulfonación. Con ese fin, se añadió NaOH 0,2 mol/l y se incubó durante 10 min. Acto seguido, se sometió a centrifugación (10 min), y se lavó con tampón TE 1 x. Después, se eluyó el ADN. Con tal fin, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 µl de tampón TE 1 x caliente (50°C). La membrana se gir ó

45 siguiendo las instrucciones del fabricante y después se volvió a repetir la centrifugación para desprender el ADN de la membrana. Se utilizaron 10 µl del eluato para el análisis de PCR en tiempo real Lightcycler.

Ensayo de referencia

50 El diseño del ensayo de referencia GSTP1 lo convierte en adecuado para cuantificar el ADN convertido con bisulfito procedente de diferentes fuentes, tales como muestras frescas/congeladas, muestra remotas como plasma o suero, y ADN obtenido de muestras archivadas como material incluido en parafina. El ensayo mide el ADN total independientemente de su estado de metilación, siempre que ningún CpG quede cubierto por los oligonucleótidos de la PCR.

55 Los componentes siguientes se utilizarán en la reacción para amplificar el amplificado de control:

• 10 µl de ADN molde

• 2 µl de mezcla FastStart LightCycler Mix para sondas de hibridación (Roche Diagnostics) 60 • MgCl2 3,5 mmol/l (Roche Diagnostics)

•: Cebador directo 0,60 µmol/l (SEC ID nº 61, TIB-MolBiol)

•: Cebador inverso 0,60 µmol/l (SEC ID nº 62, TIB-MolBiol)

• Sonda 0,2 µmol/l (SEC ID nº 63, TIB-MolBiol)

Los oligonucleótidos siguientes se usaron en la reacción para amplificar el amplificado de control:

Cebador 1: GGAGTGGAGGAAATTGAGAT (SEC ID nº 61) Cebador 2: CCACACAACAAATACTCAAAAC (SEC ID nº 62) Sonda: FAM-TGGGTGTTTGTAATTTTTGTTTTGTGTTAGGTT-TAMRA (SEC ID nº 63)

El ensayo se realizó en un termociclador LightCycler 480 siguiendo el siguiente perfil de temperatura-tiempo:

-: Activación 10 min a 95°C

-: 50 ciclos: 10 s a 95 °C

30 s a 56°C

10 s a 72°C

La detección se efectuó durante la fase de la asociación a 56°C en el canal de 530 nm con una sonda de fluorescencia específica de diana (Seq ID-63).

PCR en tiempo real específica de la metilación

Las reacciones de PCR en tiempo real específica de la metilación (MSP) se realizaron con una muestra de ADN convertido con bisulfito. Todas las mezclas maestras para MSP eran Roche FastStart TaqMan Probe Master y contenían colorante de referencia ROX 300 nM en el instrumento ABI7900. Cada reacción contenía 600 nM del cebador directo, 600 nM del cebador inverso, y 200 nM de la sonda de detección (véase la tabla con las Seq-ID de los marcadores). Las reacciones se llevaron a cabo con un volumen final de 20 microlitros con el instrumento ABI7900, utilizando el siguiente perfil de temperatura-tiempo:

-Activación 10 min a 95 °C -50 ciclos: 15 s a 95°C 60 s a 60°C

Interpretación de los datos

Cálculo de la concentración de ADN.

El CP (valores del punto de corte) calculado por el software del instrumento ABI7900 con un umbral específico se usó en cada ensayo para determinar la concentración de ADN. La concentración de ADN se calculó interpolando el valor CP de cada pocillo en una curva patrón de calibración. La curva patrón de calibración se preparó con ADN humano convertido con bisulfito y metilado que contenía 10, 5, 2,5, 1, 0,4, 0,1, y 0,05 ng por reacción. Las curvas de calibración se usaron tanto para los ensayos con marcador específico de la metilación como para el ensayo de referencia C3.

Porcentaje de metilación

Se calculó el porcentaje de metilación de cada muestra dividiendo la concentración de ADN cuantificada con los ensayos de metilación por la concentración de ADN presente en la muestra cuantificada mediante el ensayo C3. Los cocientes de metilación se calcularon siguiendo el método del valor PMR (Eads et al., Cancer Res. 2001 Apr 15; 61(8): 3410-8, PMID 11309301) respecto al ADN total cuantificado con la PCR de referencia C3.

La detección de la metilación se determinó en múltiples niveles de umbral diferentes, véanse las Tablas 4A a 4D).

Los resultados se facilitan en las Tablas 4A a 4D indicando el % de muestras de cada clase de tejido con metilación superior al umbral PMR (% metilación).

Ejemplo 2

El análisis de metilación de los genes PTGER4 y RUNX1 resultó confirmado en muestras de líquido corporal control y muestras oncológicas (plasma, lavado bronquial).

Muestras

Grupo de análisis plasma lavado

Adenocarcinoma de pulmón 50 50

Neumopatía benigna 50 50

El ADN se extrajo del plasma y del lavado bronquial con MagnaPure (Roche Diagnostics)

Las muestras de lavado bronquial (LB) se sometieron al siguiente procesamiento previo:

Se centrifugó 1 ml de muestra de LB durante 10 minutos a 8.000 x g para sedimentar la muestra. Después de

5 extraer 900 µl de sobrenadante, las células se resuspendieron en los restantes 100 µl de líquido. A continuación se añadieron a la muestra 130 µl de tampón de lisis bacteriano y 20 µl de proteinasa K, y se vorteó durante 10 segundos. Después de una corta centrifugación para depositar la muestra en el fondo del tubo, ésta se incubó durante 10 minutos a 60 ºC y durante 15 minutos a 90 ºC. A continuación, la muestra se dejó enfriar 60 segundos y se recogió del fondo del tubo centrifugándola brevemente.

10 Se llevaron a cabo el tratamiento con bisulfito y los ensayos de referencia, básicamente como se ha indicado anteriormente. El análisis de metilación se efectuó con un ensayo HM de PCR en tiempo real.

Los resultados se muestran en la Tabla 5. 15

Listado de secuencias

<110> Epigenomics AG

20 <120> Métodos y ácidos nucleicos para análisis de trastornos proliferativos celulares.

<160> 118

<210> 1

<211> 3905 25 <212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 5338

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 3

<211> 5332

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 4

<211> 4215

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 5

<211> 5473

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 6

<211> 5328

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 7

<211> 4324

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 8

<211> 5683

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 2347

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 10

<211> 6709

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 11

<211> 2296

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 12

<211> 4247

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 13

<211> 3905 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 13

<210> 14

<211> 3905 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 14

<210> 15

<211> 5338 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 15

<210> 16

<211> 5338 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 16

<210> 17

<211> 5332 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 17

<210> 18

<211> 5332 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 18

<210> 19

<211> 4215

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 20

<211> 4215 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 20

<210> 21

<211> 5473 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 21

<210> 22

<211> 5473 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 23

<210> 24

<211> 5328 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 24

<210> 25

<211> 4324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 26

<211> 4324 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 26 <210> 27

<211> 5683 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 27

<210> 28

<211> 5683 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 28

<210> 29

<211> 2347 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 29

15 <210> 30

<211> 2347

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

20 <220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 31

<211> 6709

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 31

<210> 32

<211> 6709 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 32

<210> 33

<211> 2296 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 33 <210> 34

<211> 2296 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 34 <210> 35

<211> 4247 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 35 <210> 36

<211> 4247 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 36 <210> 37

<211> 3905 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 37

<210> 38

<211> 3905

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 39

<211> 5338

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 40

<211> 5338 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 40

<210> 41

<211> 5332 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 41

<210> 42 <211> 5332

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 43

<211> 4215 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 43 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 44

<210> 45

<211> 5473

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 46

<211> 5473 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 46

<210> 47

<211> 5328 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 47

<210> 48

<211> 5328

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 49

<211> 4324 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 49

<210> 50

<211> 4324

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 51

<211> 5683 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 51

<210> 52

<211> 5683 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 53

<211> 2347 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 53 <210> 54

<211> 2347 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 54 <210> 55

<211> 6709 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 55

<210> 56

<211> 6709 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 56

<210> 57

<211> 2296 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 57

<210> 58

<211> 2296

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 59

<211> 4247

<212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

20 <400> 59

<210> 60

<211> 4247

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 61 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 61 ggagtggagg aaattgagat: 20

<210> 62 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 62 ccacacaaca aatactcaaa ac: 22

<210> 63 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 63 tgggtgtttg taatttttgt tttgtgttag gtt: 33

<210> 64 <211> 22

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 64 aaccgcaacg actaacaacg aa: 22

<210> 65 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 65 agggcgttta gttaattcgc g: 21

<210> 66 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 66 cgcgacgaca aaacgccctt taaaaacgaa: 30

<210> 67 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 67 cacgcacgat actaaacgcc: 20

<210> 68 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 68 tcgatcgtgt tggttgttcg: 20

<210> 69 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 69 cgaccgccta ccgcttcata ataacgt: 27

<210> 70 <211> 21

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 70 acccgataaa aacatcgcgt a: 21

<210> 71 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 71 gttcgtgcgt ttgtagttcg at: 22

<210> 72 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 72 aacgcgacca acgcttcaac gac: 23

<210> 73 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 73 tttttgttaa gcggtttcgg attt: 24

<210> 74 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 74 ccgcctaaaa acgtctacgc aa: 22

<210> 75 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 75 taaaaactcg cgcaacaccg taccgtaaa: 29

<210> 76 <211> 30

<212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 76 gttagttttt ttttgtcgtt tttttttcgt: 30

<210> 77 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 77 tcgcctaaac tcaactacac ga: 22

<210> 78 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 78 gcgttcggga gtttcgtgag g: 21

<210> 79 <211> 4513 <212> ADN <213> Homo Sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 2280

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<210> 81

<211> 3640

<212> ADN 15 <213> Homo Sapiens

<400> 81

<210> 82

<211> 3240

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 2155

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 4513 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 84

<210> 85

<211> 4513

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 86

<211> 2280 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 86 <210> 87

<211> 2280 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 87

15 <210> 88

<211> 3640

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 89

<211> 3640

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 90

<211> 3240

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<210> 91

<211> 3240

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 91

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>: 10 <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 92

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>: 10 <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 93 <210> 94

<211> 4513 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 94

<210> 95

<211> 4513 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 95 <210> 96

<211> 2280 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 96 <210> 97

<211> 2280 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 97 <210> 98

<211> 3640 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 98 <210> 99

<211> 3640 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 99 <210> 100

<211> 3240 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<210> 101

<211> 3240 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 101 <210> 102

<211> 2155 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 102 <210> 103

<211> 2155 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens) 10

<400> 103

15 <210> 104

<211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 104 tatcgcggag attttcgagt tttcgttg: 28

<210> 105 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 105 ggggttgttt ttcgggatt: 19

<210> 106 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 106 gataacccta aaacgcaact cgaa: 24

<210> 107 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 107 cgtttcgtaa ggagcgtgtt: 20

<210> 108 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 108 cgcgttgttc gcggttagtt tcgt: 24

<210> 109 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 109 cgacgttttc gcgtgg: 16

<210> 110

<211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 110 gttttgaaat ttattagaat aacgacgtt: 29

<210> 111 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 111 ctttctaaaa ataaccgaac tatactacga c: 31

<210> 112 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 112 tacggacgtt cgcgggtcgt t: 21

<210> 113 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 113 agtaagttcg cgtagattcg gttt: 24

<210> 114 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 114 taaaacgacg aaacgaccga t: 21

<210> 115 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 115 tcgtcgtttt cgggttgtcg agtg: 24

<210> 116

<211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 116 aaggaagtgg aataaatcgt cgta: 24

<210> 117 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 117 aggcgttttt gttttttcgg aaattcgaaa ttc: 33

<210> 118 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> ADN genómico tratado químicamente (Homo sapiens)

<400> 118 ctacgactaa taccgtaaac gccta: 25

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la hipermetilación resulta indicativa de la presencia de dicho cáncer.
2.

Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según la reivindicación 1, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o una serie de reactivos que distingue entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un región diana del ADN genómico, en el que la región diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con, una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 5, en el que dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG.
3.

Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según la reivindicación 1 o 2, que comprende:

a) extraer o si no aislar el ADN genómico de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto;

b) tratar el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en su posición 5´ en uracilo o en otra base que puede ser detectada como distinta de la citosina respecto a sus propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45, y 46, y sus complementos, en el que el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo o bien es amplificado para producir al menos un amplificado, o bien no es amplificado; y

d) determinar, sobre la base de la presencia o la ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5, o una media, o un valor que refleje un estado o nivel de metilación medio de una pluralidad de dinucleótidos CpG de la SEC ID nº 5.
4.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica obtenida de dicho sujeto es seleccionada del grupo que comprende células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y material biológico derivado de una broncoscopia (que incluye de manera no limitativa lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial y combinaciones de los mismos).
5.

Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según la reivindicación 1, que comprende:

a) extraer o si no aislar de otra manera el ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto;

b) digerir el ADN genómico de a), o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación;

c) poner en contacto el digerido de enzima de restricción del ADN de b), con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5; y

d) determinar, sobre la base de la presencia o la ausencia de un amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5.
6.

Utilización de un ácido nucleico que comprende por lo menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 21, 22, 45, 46, y sus secuencias complementarias para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7.

Utilización según la reivindicación 6, en la que dicho ácido nucleico comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos.
8.

Utilización de un kit para realizar el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el kit

(a) un reactivo bisulfito; (b) un recipiente apto para contener dicho reactivo bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) por lo menos un conjunto de oligonucleótidos que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de 9 o más preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº: 21, 22, 45y 46.