EA036328B1 - Способ определения абсолютных количеств hla-рестриктированных раковых пептидов, образовавшихся в результате естественного процессинга - Google Patents
Способ определения абсолютных количеств hla-рестриктированных раковых пептидов, образовавшихся в результате естественного процессинга Download PDFInfo
- Publication number
- EA036328B1 EA036328B1 EA201791148A EA201791148A EA036328B1 EA 036328 B1 EA036328 B1 EA 036328B1 EA 201791148 A EA201791148 A EA 201791148A EA 201791148 A EA201791148 A EA 201791148A EA 036328 B1 EA036328 B1 EA 036328B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- mhc
- peptides
- cell
- tumor
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 332
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 107
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 96
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 128
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title abstract description 40
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title abstract description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 122
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 75
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 55
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 48
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 12
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 10
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 52
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 52
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 52
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 31
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000011230 antibody-based therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011293 immunotherapeutic strategy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 abstract 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 63
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 24
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 13
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 11
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 5
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 102100036367 Dual 3',5'-cyclic-AMP and -GMP phosphodiesterase 11A Human genes 0.000 description 3
- 101001072029 Homo sapiens Dual 3',5'-cyclic-AMP and -GMP phosphodiesterase 11A Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000002553 single reaction monitoring Methods 0.000 description 3
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000027317 positive regulation of immune response Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 206010001014 Acute polyneuropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 210000003359 CD4-positive helper T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108010025464 Cyclin-Dependent Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000013701 Cyclin-Dependent Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000032320 Germ cell tumor of testis Diseases 0.000 description 1
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000010159 IgA glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010021263 IgA nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000005615 Interstitial Cystitis Diseases 0.000 description 1
- 208000000209 Isaacs syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- WLKPHJWEIIAIFW-BYPYZUCNSA-N N-Nitrosoproline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1N=O WLKPHJWEIIAIFW-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010072359 Neuromyotonia Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 201000011152 Pemphigus Diseases 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 1
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001780 adrenocortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 208000002557 hidradenitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001948 isotopic labelling Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000003631 narcolepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002023 papillomaviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001976 pemphigus vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012913 prioritisation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000010833 quantitative mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000002918 testicular germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in epitope analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к способу определения абсолютных количеств HLA-рестриктированных раковых пептидов, образовавшихся в результате естественного процессинга, т.е. определению числа копий пептида(ов), презентируемых одной клеткой. Настоящее изобретение может быть использовано не только для разработки методов лечения на основе антител или пептидных вакцин, но оно также обладает высокой ценностью для иммуномониторинга на молекулярном уровне и пригодно в процессах идентификации новых пептидных антигенов для иммунотерапевтических стратегий, таких как соответствующие методы лечения на основе вакцин, антител или подходы адоптивного переноса Т-клеток при раковых, инфекционных и/или аутоиммунных заболеваниях.
Description
Настоящее изобретение относится к способу определения абсолютных количеств HLAрестриктированных раковых пептидов, образовавшихся в результате естественного процессинга, т.е. определению числа копий пептида(ов), презентируемых одной клеткой. Настоящее изобретение может быть использовано не только для разработки методов лечения на основе антител или пептидных вакцин, но оно также обладает высокой ценностью для иммуномониторинга на молекулярном уровне, и пригодно в процессах идентификации новых пептидных антигенов для иммунотерапевтических стратегий, таких как соответствующие методы лечения на основе вакцин, антител или подходы адоптивного переноса Т-клеток при раковых, инфекционных и/или аутоиммунных заболеваниях.
Область изобретения
Разработка противораковых иммунотерапевтических средств и методов иммунотерапии для лечения аутоиммунных и инфекционных заболеваний, направленных на активацию Т-клеточной ветви иммунной системы в целях борьбы с раковыми заболеваниями, может быть существенно улучшена за счет глубокого познания уровней презентации пептидов, связанных с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA), на тканях, пораженных первичным заболеванием. Данная информация относится к методам лечения на основе антител или пептидным вакцинам в частности, а также к любому другому виду Тклеточной вакцины на основе молекулярных структурных единиц, таких как белок, ДНК или РНК. До сих пор данный вид количественных данных относительно абсолютного числа копий на клетку не был доступен для полученной от пациентов ткани.
Способ идентификации пептидов, как описанный выше, позволяющий предотвратить проблему, связанную с иммунологией с обратным действием, был раскрыт в патенте ЕР 1508047 В1. Как описывается выше, этот способ не может быть использован для определения количества указанных пептидов. Другой способ, включающий стратегию введения меток, был раскрыт в патентной заявке WO 2005/076009, который позволял в некоторой степени определять количество, но не в абсолютном масштабе. Другие метки были раскрыты, например, в патентной заявке WO 03/025576 или в работе Martin и соавторов в Proteomics 2003, 3, 2208-2220.
Другой способ был раскрыт в работе Fortier и соавторов (The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome, JEM, Vol. 205, No. 3, March 17, 2008 595-610). Недостатком данного способа является необходимость отделения пептидов, связанных с молекулами МНС, от пептидов, не связывающихся с молекулами МНС, что обусловлено кислотной элюцией. Это осуществляется с использованием клеточных линий b2m с генетическим нокаутом: таким образом, этот способ не может использоваться для первичных (полученных от пациента) опухолевых материалов. В рамках данного способа первичные тимоциты мыши сравнивали с клеточной линией мыши EL4. Исходные количества корректировали посредством измерения количества молекул МНС I класса. Уже один этот процесс является существенным ограничением способа, раскрытого Fortier и соавторами. Кроме того, требуемая для первичных тканей различных размеров и происхождения нормализация не применялась. Вместо этого использовались сбалансированные исходные материалы, делая проведение нормализации излишним. Тем не менее, нормализация является абсолютно необходимым этапом для первичных материалов (пациента).
В WO 2011/128448 раскрыт способ количественной идентификации релевантных пептидных антигенов, связанных с HLA, из препаратов первичной ткани в крупном масштабе без применения подходов с введением меток. Способ включает этапы получения по меньшей мере одного образца первичной ткани, пораженной заболеванием, и по меньшей мере одного образца первичной здоровой ткани, предпочтительно соответствующей пораженной заболеванием ткани, выделения пептидных лигандов МНС из указанного(ых) образца(ов), осуществления анализа методом ВЭЖХ-МС указанных пептидных лигандов МНС, выделения интенсивности сигнала ионов-предшественников (площади) для каждого из сигналов, полученного при анализах, идентификации последовательностей указанных пептидных лигандов МНС, этапы нормализации и этапы по контролю качества данных в целях определения относительного количества указанных пептидных лигандов МНС без введения меток.
Hassan и соавторы (в работе: Hassan С, et al, Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes, J Prot (2014), http://dx.doi.org/10.1016/jjprot.2014.07.009) раскрывают подход, в котором приготавливают мономерные комплексы пептид-МНС (hpMHC) с изотопными метками и добавляют их непосредственно после лизиса клеток, т.е. до обычной обработки образца. При использовании данного подхода все потери во время обработки образца могут быть учтены, что позволяет произвести точное определение специфических лигандов, презентируемых МНС I класса. Это исследование выделяет этап иммуноаффинной очистки в качестве источника достаточно крупных потерь во время предварительной обработки образца и предлагает решение, чтобы учитывать эти потери. Представленная стратегия может использоваться для получения достоверного представления о количестве копий эпитопов, и, таким образом, считается, что это позволяет улучшить дизайн вакцины и стратегии для иммунотерапии.
Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов и антигенов заболевания повысило возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы управления обеими ветвями иммунной системы, как гуморальной,
- 1 036328 так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, CD8-положительные Т-клетки (T-CD8+), которые распознают пептиды, связанные с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС). Эти пептиды, обычно состоящие из 8-12 аминокислотных остатков, получены из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIP), находящихся в цитозоле, и играют важную роль в иммунном ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA).
Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, встречающиеся на большинстве клеток, имеющих ядро. Молекулы МНС состоят из альфа-тяжелой цепи и бета-2-микроглобулина (рецепторы МНС I класса) или альфа- и бета-цепи (рецепторы МНС II класса) соответственно. Их трехмерная форма образует связывающую бороздку, которая используется для нековалентного взаимодействия с пептидами. МНС I класса презентируют пептиды, образующиеся при протеолитическом расщеплении преимущественно эндогенных белков, DRIP и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и в первую очередь презентировать пептиды экзогенных или трансмембранных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и молекул МНС I класса распознаются CD8-положuтельными цитотоксическими Т-лимфоцитами, несущими подходящий ТКР (Тклеточный рецептор), тогда как комплексы из пептида и молекул МНС II класса распознаются CD4положительными хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.
Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС I класса, как правило, имеют 8-12 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка (якори) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет связывающий мотив, который контролирует способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой.
В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР).
Антигены, которые распознаются специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами опухоли, то есть их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессируются и по сравнению с не измененными клетками того же происхождения имеют повышенный уровень в клетках соответствующей опухоли.
Современная классификация опухолеассоциированных или ассоциированных с заболеванием антигенов включает следующие основные группы.
Раково-тестикулярные антигены: первые в истории идентифицированные ТАА (опухолеассоциированные антигены; сокращение для ассоциированных с заболеванием антигенов: DAA), которые могут распознаваться Т-клетками, принадлежат к этому классу, называвшемуся первоначально раковотестикулярные антигены (СТ), так как его представители экспрессируются в отличных по гистологической структуре опухолях человека, а среди нормальных тканей - только в сперматоцитах/сперматогониях семенника и изредка в плаценте. Так как клетки семенника не экспрессируют молекулы HLA I и II класса, то эти антигены не могут быть распознаны Т-клетками в нормальных тканях и поэтому могут рассматриваться как иммунологически опухолеспецифические. Хорошо известными примерами антигенов СТ являются члены семейства MAGE или NY-ESO-1.
Антигены дифференциации: данные ТАА встречаются в опухолевых и нормальных тканях, из которых образуется опухоль; большинство из них имеется в меланомах и нормальных меланоцитах. Многие из этих линиеспецифических белков меланоцитов участвуют в биосинтезе меланина и поэтому не являются опухолеспецифическими, однако, несмотря на это, они широко применяются в противораковой терапии. Примеры включают (но не ограничиваются) тирозиназу и Melan-A/MART-1 для меланомы или ПСА для рака предстательной железы.
Избыточно экспрессируемые ТАА: гены, кодирующие широко экспрессированные ТАА, были обнаружены в различных по гистологической структуре опухолях, а также во многих нормальных тканях, в основном с более низким уровнем экспрессии. Возможно, что многие эпитопы, процессируемые и потенциально презентируемые нормальными тканями, находятся ниже порогового уровня для распознавания Т-клетками, в то время как их избыточная экспрессия в опухолевых клетках может инициировать противораковый ответ, нарушая установившуюся ранее толерантность. Известными примерами ТАА этого класса являются Her-2/neu, сурвивин, теломераза или WT1.
- 2 036328
Опухолеспецифические антигены: данные уникальные ТАА образуются в результате мутаций нормальных генов (таких как β-катенин, CDK4 и т.д.). Некоторые из этих молекулярных изменений ассоциированы с неопластической трансформацией и/или прогрессией. Опухолеспецифические антигены в основном способны индуцировать сильные иммунные ответы, не заключая в себе риска аутоиммунных реакций по отношению к нормальным тканям. С другой стороны, данные ТАА в большинстве случаев релевантны только для определенной опухоли, на которой они были идентифицированы, и обычно не являются общими для многих отдельных опухолей.
ТАА, образующиеся в результате аномальных пост-трансляционных модификаций: такие ТАА могут образоваться из белков, которые не являются ни специфическими, ни избыточно экспрессируемыми в опухолях, однако, несмотря на это, становятся опухолеассоциированными в ходе посттрансляционных процессов, происходящих преимущественно в опухолях. Примеры для этого класса возникают в результате изменения характера гликозилирования, приводящего к появлению новых эпитопов в опухолях, как в случае MUC1, или при таких событиях как белковый сплайсинг во время деградации, которые могут быть опухолеспецифическими или могут не быть ими.
Онковирусные белки: данные ТАА являются вирусными белками и могут играть ведущую роль в онкогенном процессе, и, так как они являются чужеродными (не человеческого происхождения), они могут провоцировать Т-клеточный ответ. Примерами таких белков являются вирусные белки человеческой папилломы типа 16, Е6 и Е7, которые экспрессированы в карциноме шейки матки.
Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или опухолеассоциированного антигена (или специфического для или ассоциированного с заболеванием антигена) и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками или инфицированными клетками и не экспрессироваться вообще или экспрессироваться в сравнительно малом количестве нормальными здоровыми тканями, например в меньшем количестве в 5, 10 или более раз.
При инфекционных заболеваниях существует две возможности, первая из которых - инфицированные клетки экспрессируют антиген, который не экспрессируется здоровыми клетками, непосредственно ассоциированный с инфекцией, или инфицированные клетки избыточно экспрессируют антиген, который экспрессируется лишь в чрезвычайно малом количестве здоровыми клетками - избыточная экспрессия антигена, обычно представленного в пептидоме здоровой клетки.
Кроме того, желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, инфекции или штамма, но и также имел высокую концентрацию (т.е. несколько копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены и специфические для или ассоциированные с заболеванием антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую/инфицированную в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или подавлении апоптоза.
В случае ракового заболевания дополнительные нисходящие мишени белков, непосредственно являющихся причиной трансформации, могут быть также представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода (Singh-Jasuja H., Emmerich N.P., Rammensee H.G., Cancer Immunol. Immunoether. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). В обоих случаях необходимо, чтобы эпитопы присутствовали в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного или ассоциированного с заболеванием антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу.
В сущности, любой пептид, который способен связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу.
Поэтому ТАА и DAA являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и определения характеристики ТАА и DAA основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены из организма пациентов или здоровых субъектов, или же они могут быть основаны на генерировании различающихся транскрипционных профилей или различающихся паттернов экспрессии пептидов между опухолевыми и нормальными тканями.
Однако идентификация генов, избыточно экспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из экспрессированных избыточно или экспрессированных селективно белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка оп- 3 036328 ределяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена посредством клонирования и способна к выполнению эффекторных функций (эффекторная Т-клетка).
Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции CD8-положumельных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, экспонирующих комплексы опухолеассоциированного пептида и МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
Знания о точном количестве копий лигандов, презентируемых молекулами HLA I или II класса, важно в вопросах фундаментальной и клинической иммунологии. На данный момент лучшие способы определения количества копий основываются на масс-спектрометрическом анализе при использовании мониторинга отдельной реакции (SRM) в комбинации с известным количеством пептида с изотопной меткой. Тем не менее, данные подходы все-таки недостаточно точны для эффективного применения в указанных выше подходах.
Учитывая сказанное выше, задачей настоящего изобретения является предложить способ для определения абсолютного количества копий лигандов, презентируемых молекулами HLA I или II класса, который является точным, эффективным, простым в применении и может осуществляться на высокопроизводительном уровне. Другие задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидными для специалиста данной области при изучении предлагаемого последующего описания.
В первом аспекте настоящего изобретения задача изобретения решена с помощью способа определения абсолютного количества по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС на клетке, причем указанный способ включает
а) приготовление клеток, презентирующих указанный по меньшей мере один пептидный лиганд МНС из биологического образца, включающего клетки;
б) определение числа клеток в указанном препарате этапа а);
в) добавление известного количества указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС и/или комплекса пептидного лиганда с МНС, подлежащего количественному определению, в указанный препарат этапа а) (добавка I);
г) выделение по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС из указанного препарата этапа в) в целях получения пептидного элюата;
д) добавление известного количества по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, подлежащего количественному определению, в указанный пептидный элюат (добавка II);
е) проведение масс-спектрометрического анализа указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС в целях получения по меньшей мере одного аа) сигнала для эффективности выделения на этапе г);
бб) сигнала для известного количества указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, добавленного на этапе д); и вв) сигнала для указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС из указанного препарата клеток этапа а);
ж) количественное определение указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС на основе сравнения сигналов, полученных на этапе е) с аа) полученным числом клеток, бб) известным количеством указанного по меньшей мере одного лиганда пептида МНС и/или комплекса пептидного лиганда с МНС, подлежащего определению, добавленного на этапе в), вв) известным количеством по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, подлежащего количественному определению, добавленного на этапе д), за счет чего осуществляется по меньшей мере частичное, абсолютное количественное определение по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС на клетке.
В способе согласно настоящему изобретению, когда параллельно анализируют несколько проб, этап в), описанный выше, может быть опущен после того как установлена эффективность выделения, поскольку эффективность для одного образца может быть использована для оценки эффективности выделения для второго пептидного лиганда МНС и/или комплекса пептидного лиганда с МНС (т.е. значение может использоваться в качестве перекрестной ссылки).
Предпочтительным является способ, в котором, кроме того, используется сигнал, полученный по результатам внутренней калибровки (добавка II) на этапе д) в качестве постоянного и фиксированного (контрольного) стандарта для сигнала, полученного для выделенного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, с помощью расчета соотношения между этими двумя сигналами. Данное соотношение сравнивают с построенной калибровочной кривой, которая также включает внутренний калибратор в том же самом количестве, предпочтительно при использовании идентичной аликвоты такого внутреннего калибратора. Калибровочная кривая затем описывает связь между этими соотношениями и количествами
- 4 036328 пептидов. См. также фиг. 3 и условные обозначения к ней.
Неожиданно в контексте настоящего изобретения авторы изобретения обнаружили, что при объединении описываемых выше этапов анализа впервые становится возможным прямое абсолютное количественное определение уровня МНС, предпочтительно HLA-рестриктированного, пептида на раковых или других пораженных заболеванием тканях в сравнении с несколькими различными, не пораженными раковым заболеванием или не инфицированными тканями и органами.
В контексте настоящего изобретения термин добавка относится к добавлению известного количества или концентрации по меньшей мере одного известного, например несвязанного (свободного) пептидного лиганда МНС, подлежащего количественному определению, в образец, такой как, например, препарат (называемый в данном контексте добавка I) или пептидный элюат (называемый в данном документе добавка II). Количества/концентрации пептида(ов), которые необходимо добавить, могут быть легко скорректированы и зависят, по меньшей мере отчасти, от образца, к которому надлежит добавить известное количество добавки, и метода, используемого для анализа.
Предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, где по меньшей мере один пептидный лиганд МНС выбирают из опухолеассоциированного пептида (ТАА) или ассоциированного с заболеванием пептида (DAA).
Кроме того, предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, где указанный биологический образец, включающий клетки, выбирают из тканевого образца, образца крови, образца опухоли или образца инфицированной ткани. В контексте настоящего изобретения образцы, полученные непосредственно из организма индивидов, таких как пациенты, обозначаются термином первичные, например первичные тканевые или опухолевые образцы, в отличие от образцов клеточных линий, таких как, например, устойчивые опухолевые клеточные линии. Образцы могут быть свежими или консервированными (например, замороженными или в виде препаратов), при условии, что они подходят для способа в соответствии с изобретением. Предпочтительным является биологический образец, который не включает постоянных клеточных линий.
В качестве предпочтительного примера: пулы пептидов HLA из подвергнутых шоковой заморозке (первичных) образцов тканей могут быть получены методом иммунопреципитации из плотных тканей при использовании, например, HLA-A, -В, -С-специфического антитела w6/32 или HLA-A*O2специфического антитела ВВ7.2, связанного с CNBr-активированной сефарозой, с последующей кислотной обработкой и ультрафильтрацией. Для различных аллелей HLA могут использоваться другие специфические антитела, известные из уровня техники, так как имеются, например, GAP-Аз для А*03, В1.23.2 для В-аллелей. Существуют соответствующие способы для получения пептидов в комплексе с молекулами МНС I класса для других млекопитающих, которые хорошо известны из уровня техники.
Способ в соответствии с изобретением может быть также использован в контексте инфекционных заболеваний, таких как вирусные или бактериальные инфекции, например лихорадка денге, Эбола, вирус Марбурга, туберкулез (ТБ), менингит или сифилис, предпочтительно, если способ применяется на резистентных к антибиотикам штаммах возбудителей инфекций, для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как артрит, паразитарных инфекций, таких как малярия, и других заболеваний, таких как рассеянный склероз и болезнь Паркинсона, при условии, что элементом-мишенью является пептид, связанный с молекулой МНС I класса.
Примеры аутоиммунных заболеваний (в том числе заболевания, которые официально не считаются аутоиммунными): хроническое обструктивное заболевание легких, анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Крона (одна из двух форм идиопатического воспалительного заболевания кишечника ВЗК), дерматомиозит, сахарный диабет 1-го типа, эндометриоз, синдром Гудпасчера, базедова болезнь, синдром Гийена - Барре (СГБ, острый полирадикулоневрит), аутоиммунный тиреоидит, гнойный гидраденит, болезнь Кавасаки, IgA-нефропатия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, интерстициальный цистит, эритематозная волчанка, смешанное заболевание соединительной ткани, локализованная склеродермия, миастения гравис, нарколепсия, нейромиотония, обыкновенная (вульгарная) пузырчатка, пернициозная анемия, псориаз, псориатический артрит, полимиозит, первичный билиарный цирроз, рецидивирующий полихондрит, ревматоидный артрит, шизофрения, склеродермия, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, темпоральный артериит (гигантоклеточный артериит), язвенный колит (одна из двух форм идиопатического воспалительного заболевания кишечника ВЗК), васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.
Настоящее изобретение не ограничивается заболеваниями человека, но может использоваться для млекопитающих, например коров, свиней, лошадей, кошек, собак, грызунов, таких как крыса, мышь, коз и других домашних животных.
В другом предпочтительном воплощении способа в соответствии с настоящим изобретением приготовление клеток включает, по меньшей мере, частичное ферментативное расщепление тканей и/или клеточный лизис.
Предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, где указанное число клеток определяют с помощью метода, выбранного из подсчета клеточных ядер, фотометрического ме- 5 036328 тода определения ДНК, флуориметрического метода определения ДНК (такого как, например, с применением технологии Qubit®) и количественной ПЦР.
Другим предпочтительным способом в соответствии с настоящим изобретением является способ, кроме того, включающий определение количества по меньшей мере одного вида молекул HLA в указанном препарате этапа а). Определение количества может быть произведено с помощью известных из уровня техники методов, таких как методы, включающие специфические антитела, например ELISA, методы с использованием гелей, сортировка клеток и/или хроматография.
Другим предпочтительным способом в соответствии с настоящим изобретением является способ, где по меньшей мере один добавленный комплекс пептида с МНС и/или по меньшей мере один добавленный пептидный лиганд МНС являются мечеными и предпочтительно мечеными разными метками. Соответствующие метки известны специалисту данной области и включают изотопные метки, радиоактивные и нерадиоактивные метки, ферменты и другие группы предпочтительно с разными массами. Предпочтительно, если метки являются специфическими для конкретных пептидов, подлежащих количественному определению. Наиболее предпочтительным является дважды меченый ТАА (опухолеассоциированный антиген)/TUMAP (опухолеассоциированный пептид), например в случаях, когда для одного и того же эксперимента необходимы две добавки с различными метками (см. примеры внизу).
Предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, где выделение включает хроматографию, такую как аффинную хроматографию. Таким образом, выделенные лиганды MHC/HLA могут быть разделены в соответствии с их гидрофобностью обратнофазовой хроматографией (например, nanoAcquity UPLC system, Waters) с последующим обнаружением на гибридном массспектрометре Orbitrap (ThermoElectron). Каждый образец предпочтительно анализируется с получением данных повторных (например) циклов ЖХ-МС. Данные ЖХ-МС затем обрабатывают путем анализа данных тандемной МС (МС/МС).
Спектры, записанные в желаемом виде с помощью метода тандемной масс-спектрометрии с фокусом внимания на значениях m/z пептидов, подлежащих количественному определению, оценивают предпочтительно с использованием программного обеспечения, которое экстрагирует уровни интенсивности предварительно отобранных фрагментных ионов предварительно заданных переходов. Примером такого программного обеспечения является программа Skyline (MacLean В. et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 2010 Apr 1; 26(7):9668., http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq054), прикладная программа для анализа данных массспектрометрических экспериментов методами независимого от данных анализа (DIA) для мониторинга параллельных реакций (PRM - целевая МС-МС). Эта программа может использоваться для совместного элюирования пептида с изотопной меткой в целях определения специфичности, а также в целях выделения интенсивности отдельных переходов для дальнейшей обработки.
Сопоставимость групп пептидов, рестриктированных по одному и тому же аллелю HLA, среди различных образцов возможна на основании общего аллель-специфического антитела, используемого для очистки, при наличии такового или же альтернативно на основании отнесения последовательностей к общим HLA-аллелям при помощи шаблонов, содержащих якорные аминокислотные остатки.
С точки зрения статистики предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, где по меньшей мере два повторных цикла масс-спектрометрического анализа осуществляются для каждого по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к способу согласно настоящему изобретению, дополнительно включающему выбор избыточно презентируемых, избыточно экспрессируемых и/или опухолеспецифических пептидных лигандов МНС для анализа.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу согласно настоящему изобретению, где указанный способ может быть осуществлен или осуществляется на высокопродуктивном уровне, предпочтительно вплоть до 50-100 пептидных лигандов могут быть проанализированы параллельно.
В другом предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению этапы указанного способа осуществляются в порядке, указанном в прилагаемой формуле изобретения, или как было описано выше. В другом предпочтительном способе согласно настоящему изобретению указанный способ состоит из этапов, описанных выше в контексте настоящего документа.
В другом предпочтительном аспекте способа согласно настоящему изобретению указанный способ относится к персонализированной терапии и диагностике. В этих целях указанный(ые) анализируемый(ые) образец(образцы) получают от одного индивида или группы индивидов, страдающих от одного и того же патологического состояния, как описано в данном документе. Также на основании способа согласно настоящему изобретению может быть создан персонализированный профиль лигандов МНС, предпочтительно персонализированный, количественно охарактеризованный, специфический для заболевания профиль лигандов МНС, исходя из содержания пептидных лигандов МНС, определяемых количественно, как описано в настоящим документе.
Наиболее предпочтительно, если способ согласно настоящему изобретению осуществляется in vitro.
В еще одном предпочтительном аспекте способа согласно настоящему изобретению указанный способ включает, кроме того, этап синтеза, предпочтительно химического синтеза, указанного по мень- 6 036328 шей мере одного пептидного лиганда МНС, количественно определяемого с помощью указанного способа, в аппарате для синтеза или вручную. Другой аспект данного изобретения, таким образом, относится к способу для получения иммунореактивного пептида, в соответствии с которым производится количественное определение пептида согласно раскрытому способу, и указанный пептид является химически синтезированным, in vitro или in vivo. Пептиды могут быть получены с помощью химического соединения аминокислот при использовании стандартных методик, известных из уровня техники.
Пептиды могут быть получены in vitro, например в бесклеточных системах, и in vivo с использованием клеток. Пептиды могут быть получены, как раскрыто, например, в патенте ЕР 2111867, заявленном Lewandrowski и соавторами.
Еще один другой аспект относится к способу согласно настоящему изобретению, где проводится дополнительный этап, на котором обнаруживают присутствие Т-лимфоцитов. При использовании данного способа возможно конкретно определить, в какой степени Т-лимфоциты, направленные против выделенных и идентифицированных пептидов, изначально существуют в организме пациентов. При выполнении данного этапа возможно введение в качестве вакцины только тех пептидов, против которых у пациента уже изначально существуют Т-лимфоциты. Затем пептиды могут использоваться для активации этих специфических Т-лимфоцитов.
Дальнейший аспект относится к способу согласно настоящему изобретению, где обнаружение специфических изначально существующих Т-лимфоцитов осуществляется посредством мечения лейкоцитов восстановленными комплексами антигенпрезентирующих молекул и антигенного пептида.
В другом предпочтительном варианте осуществления способа согласно настоящему изобретению указанный способ исключает, кроме того, использование клеток, клеточных линий или животных с генетическим нокаутом.
Другим предпочтительным факультативным этапом настоящего изобретения является автоматический контроль качества на основе молекул, добавляемых в известном количестве в образцы.
С помощью способа согласно изобретению, более того, возможно идентифицировать пациентспецифические пептиды, т.е. возможно с точностью подобрать подходящие для пациента пептиды, предназначенные для использования в вакцине, чтобы вызвать специфический иммунный ответ.
Далее другой аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей установленные количества одного или более пептидов ТАА и/или DAA, которые были количественно определены способом согласно изобретению.
Композиция может применяться, например, парентерально, например подкожно, внутрикожно или внутримышечно, или водиться перорально в зависимости от лекарственной формы и имеющегося заболевания. В этих целях пептиды растворяют или суспендируют в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе; композиция может, кроме того, включать добавки, например буферы, связующие вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены совместно с иммуностимулирующими веществами, например цитокинами.
Согласно одному аспекту изобретения пептиды могут применяться для лечения опухолевых заболеваний и для получения лекарственного средства для лечения опухолевых заболеваний. Опухолевые заболевания, подлежащие лечению, включают солидные опухоли, такие как рак почек, молочной железы, поджелудочной железы, желудка, семенника и/или кожи, или раковые заболевания крови, например ОМЛ. Данный список опухолевых заболеваний представляет собой лишь пример и не направлен на ограничение области применения.
Данные пептиды могут, кроме того, использоваться для оценки курса лечения опухолевого заболевания.
Данные пептиды могут также использоваться для мониторинга лечения в других видах иммунизации или методах лечения. Таким образом, пептид может использоваться не только в терапевтических, но и в диагностических целях.
Другой аспект изобретения относится затем к применению пептидов, определяемых количественно, для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены общеизвестным способом, иммунизацией животных с помощью инъекции пептидов и последующей очисткой иммуноглобулина. Моноклональные антитела могут быть получены согласно стандартизованным протоколам, известным из уровня техники.
Настоящее изобретение имеет особую значимость для подходов, основанных на использовании антител, поскольку количество копий мишеней на поверхности клетки-мишени определяет и/или отражает, восприимчива ли мишень к антителу вообще и, если это так, какие эффекторные функции могут быть использованы, такие как конъюгированные лекарственные средства, токсины, биспецифические антитела, рекрутирующие Т-клетки или другие эффекторные клетки. Другие аспекты относятся к применению в контексте так называемых молекул, образующих каркас, таких как аптамеры (связывающиеся с мишенью молекулы олигонуклеиновых кислот или пептидов) и/или растворимые Т-клеточные рецепторы (ТКР). В данном случае, подобно антителам, количество копий определяет требуемую авидность и эффекторные функции для указанных каркасообразующих молекул.
Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознаваемых иммунной сис- 7 036328 темой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. В настоящее время исследуются различные механизмы использования для иммунотерапии рака обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, CD8-положuтельные Т-клетки, которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), связанные с пептидами, имеющими обычно 8-12 аминокислотных остатков, образованных из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIP), находящихся в цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA).
Молекулы МНС I класса могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся после протеолитического расщепления преимущественно эндогенных, цитозольных или ядерных белков, DRIP и более крупных пептидов. Однако пептиды, образованные из эндосомальных компартментов или экзогенных источников, также часто встречаются на молекулах МНС I класса. Этот неклассический способ презентации I классом в литературе называется кросспрезентацией.
Для того чтобы белки были распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического или -ассоциированного антигена и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен экспрессироваться преимущественно опухолевыми клетками и не экспрессироваться или экспрессироваться в сравнительно малом количестве здоровыми тканями. Кроме того, желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. несколько копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифические и опухолеассоциированные антигены часто образованы из белков, напрямую задействованных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или в апоптозе. В дополнение также нисходящие мишени белков, непосредственно являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного или ассоциированного с заболеванием антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу.
В сущности, любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие иммунологической толерантности к данному конкретному эпитопу. Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и определения характеристики ТАА основаны на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены из организма пациентов или здоровых индивидов, или же они могут быть основаны на генерировании различающихся транскрипционных профилей или различающихся паттернов экспрессии пептидов между опухолевыми и нормальными тканями (Lemmel et al. 450-54;Weinschenk et al. 5818-27). Однако идентификация генов, избыточно экспрессированных в опухолевых тканях или человеческих опухолевых клеточных линиях или же селективно экспрессированных в таких тканях или клеточных линиях, не дает точной информации об использовании антигенов, транскрибированных с данных генов, в иммунотерапии. Это обусловлено тем, что только отдельная субпопуляция эпитопов этих антигенов подходит для такого применения, так как Т-клетка с соответствующим ТКР должна быть в наличии, и необходимо, чтобы отсутствовала или была минимальной иммунологическая толерантность к этому конкретному эпитопу. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из избыточно экспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС, против которых может быть обнаружена функциональная Т-клетка. Такая функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции специфическим антигеном может быть распространена клонально и способна к выполнению эффекторных функций (эффекторная Т-клетка).
Ввиду серьезных побочных эффектов и расходов, связанных с лечением рака, крайне необходимы улучшенные методы прогнозирования и диагностики.
Термин пептид в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом обычно пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Предпочтительно, чтобы пептиды имели длину в 9 аминокислот, но они могут быть короче, длиной в 8 аминокислот, и длиннее - 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислот в длину.
Термин олигопептид в контексте настоящего описания обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом обычно пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина олигопептида не особенно важна для изобретения до тех пор,
- 8 036328 пока в нем сохраняются надлежащие эпитоп или эпитопы. Олигопептиды типично бывают менее чем около 30 аминокислотных остатков в длину и более чем около 14 аминокислот в длину.
Термин полипептид обозначает серии аминокислотных остатков, связанных друг с другом типично пептидными связями между альфа-аминными и карбонильными группами смежных аминокислот. Длина полипептида не особенно важна для изобретения до тех пор, пока сохраняются надлежащие эпитопы. В отличие от терминов пептид или олигопептид, термин полипептид введен для обозначения молекул, содержащих более приблизительно 30 аминокислотных остатков.
Пептид, олигопептид, белок или полинуклеотид, кодирующий для такой молекулы, является иммуногенным (и, таким образом, иммуногеном в рамках настоящего изобретения), если он способен индуцировать иммунный ответ. В случае настоящего изобретения иммуногенность получает более специфическое определение как способность индуцировать Т-клеточный ответ. Таким образом, иммуноген будет представлять собой молекулу, которая способна индуцировать иммунный ответ, и, в случае настоящего изобретения, молекулу, способную индуцировать Т-клеточный ответ.
Для Т-клеточного эпитопа необходим короткий пептид, который связан с рецептором МНС I класса, образующим трехчленный комплекс (альфа-цепь МНС класса I, бета-2-микроглобулин и пептид), который может быть распознан Т-клеткой, несущей подходящий Т-клеточный рецептор, связывающийся с комплексом МНС/пептид с подходящей аффинностью. Пептиды, связывающиеся с молекулами МНС I класса, типично имеют длину в 8-14 аминокислот и особенно типично длину в 9 аминокислот.
В контексте настоящего изобретения для описания изобретения в качестве примера используется раковое заболевание. Тем не менее, способ по изобретению может также применяться к инфекционным заболеваниям, аутоиммунным заболеваниям и паразитарным инфекциям при условии, что соответствующий иммунный ответ является ответом с привлечением молекул МНС I класса.
Настоящее изобретение будет описано далее с помощью примеров, тем не менее не ограничивающих объем изобретения.
В прилагаемых чертежах и списке последовательностей изображено следующее.
На фиг. 1 представлена краткая обзорная схема экспериментального подхода в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 2 представлен сравнительный МС анализ смеси пептидов TUMAP с 10 фмоль каждого TUMAP из табл.1. Каждый пептид дает разный сигнал МС, демонстрируя возможность обнаружения пептид-зависимым способом. Пептид 5 не включен в табл.1, т.е. последовательности 1-4 в табл.1 соответствуют №№ 1-4 фиг. 2 и последовательности 5-11 в табл. 1 соответствуют №№ 6-12 фиг. 2.
Кроме того, пептиды 19, 21 и 22 фиг. 2 не указаны в табл.2, т.е. последовательности 13-18 фиг. 2 соответствуют №№ 12-17 табл.2, последовательность 20 фиг. 2 соответствует № 18 табл.2 и последовательности 23-28 из фиг. 2 соответствуют №№ 19-24 табл.2.
На фиг. 3 представлен принцип осуществления метода внутреннего стандарта. Калибровочная кривая получена с помощью титрования пептида TUMAP с изотопной меткой одной версии (обозначено светло-серым цветом). Для всех масс-спектрометрических измерений в образцы для МС добавляли постоянное количество пептида TUMAP как внутреннего стандарта с изотопной меткой другой версии (обозначено темно-серым цветом). Для построения калибровочной кривой рассчитывали соотношение МС-сигналов с помощью метода логистической регрессии. Нижний предел количественного определения (НПКО) определяют визуально с учетом отклонения от прямолинейности. Образцы для количественного определения (обозначены зеленым цветом) представляют собой показатели интенсивности сигнала, измеренные в опухолевых образцах, выбранных для определения абсолютного количества TUMAP.
На фиг. 4 представлены калибровочные кривые HLA-A*02 пептидов TUMAP, выбранных для абсолютного количественного определения. Результаты МС-измерений соответствующих пептидов TUMAP в образцах опухолевых тканей, использованных для анализа абсолютного числа на клетку, образцы для количественного определения показаны на каждом графике.
На фиг. 5 представлены дополнительные калибровочные кривые HLA-A*02 пептидов TUMAP, выбранных для абсолютного количественного определения. Результаты масс-спектрометрического анализа соответствующих пептидов TUMAP в образцах опухолевой ткани, использованных для анализа абсолютного числа TUMAP на клетку (образцы для количественного определения), показаны на каждом графике.
На фиг. 6 представлены калибровочные кривые HLA-A*24 пептидов TUMAP, выбранных для абсолютного количественного определения. Результаты масс-спектрометрического анализа соответствующих пептидов TUMAP в образцах опухолевой ткани, использованных для анализа абсолютного числа пептидов TUMAP на клетку (образцы для количественного определения), показаны на каждом графике.
На фиг. 7 представлены дополнительные калибровочные кривые HLA-A*24 пептидов TUMAP, выбранных для абсолютного количественного определения. Результаты масс-спектрометрического анализа соответствующих пептидов TUMAP в образцах опухолевой ткани, использованных для анализа абсолютного числа пептидов TUMAP на клетку (образцы для количественного определения), показаны на каждом графике.
На фиг. 8 представлены расчетные значения вариаций повторных измерений методом МС по
- 9 036328 всем проанализированным пептидам TUMAP. Каждая точка представляет собой коэффициент вариации (KB в %) для повторных измерений методом МС отдельного пептида TUMAP в одном конкретном образце ткани. Медиана KB среди всех пептидов TUMAP обозначает среднюю вариацию при повторных циклах МС.
На фиг. 9 представлена эффективность выделения комплексов пептид-МНС. Эффективность выделения комплексов пептид-МНС определяли на восьми А*02-положительных образцах для А*02 пептидов TUMAP (А) и на шести А*24-положительных образцах для А*24 пептидов TUMAP (В). Вариабельность эффективности выделения составляет в среднем примерно 24% в случае А*02 пептидов TUMAP и 32% в случае пептидов А*24 TUMAP соответственно (С).
На фиг. 10 представлены методы оценки анализа содержания ДНК.
А. Сравнение трех различных методов интерполяции числа клеток из заданного количества ДНК: при использовании стандартной кривой, полученной на опухолевых клеточных линиях (темно-серый), на МКПК здоровых доноров (серый) и при использовании теоретической массы диплоидного генома человека (светло-серый). Репликаты биологических образцов, т.е. независимо приготовленные препараты лизата ткани из различных фрагментов одной опухоли, выделены серым цветом.
В. График стандартной кривой для МКПК, которая использовалась для определения общего числа клеток тканевых образцов, проанализированных в рамках абсолютного количественного определения пептидов TUMAP.
На фиг. 11 представлено определение числа клеток в твердых, замороженных тканевых образцах. Анализ по определению числа клеток А*02-и А*24-положительных опухолевых образцов (А) и расчетные значения вариации результатов анализа по определению числа клеток (В). Репликаты биологических образцов выделены серым цветом.
На фиг. 12 показаны результаты определения числа копий пептидов на одну клетку для пептидов HLA-A*02 TUMAP. Были проанализированы восемь различных опухолей РЖ, три из которых с повторным измерением (параллельные биологические образцы выделены серым цветом). НПКО относится к диапазону количественного определения в одном МС эксперименте и экстраполируется на образец- и TUMAP-специфический НПКО, т.е. самое низкое количество копий, которое поддается количественному определению в конкретном образце конкретного пептида TUMAP (выделены серым цветом).
На фиг. 13 показаны дополнительные результаты определения числа копий пептида на одну клетку для пептидов HLA-A*02 TUMAP. Были проанализированы восемь различных опухолей РЖ, три из которых с повторным измерением (параллельные биологические образцы выделены серым цветом). НПКО относится к диапазону количественного определения в одном МС эксперименте и экстраполируется на образец- и TUMAP-специфический НПКО, т.е. самое низкое количество копий, которое поддается количественному определению в конкретном образце конкретного пептида TUMAP (выделены серым цветом).
На фиг. 14 показаны результаты определения числа копий пептидов на одну клетку для пептидов HLA-A*24 TUMAP. Были проанализированы шесть различных опухолей РЖ, три из которых с повторным измерением (параллельные биологические образцы выделены серым цветом). НПКО относится к диапазону количественного определения в одном МС эксперименте и экстраполируется на образец- и TUMAP-специфический НПКО, т.е. самое низкое количество копий, которое поддается количественному определению в конкретном образце конкретного пептида TUMAP (выделены серым цветом).
На фиг. 15 показаны дополнительные результаты определения числа копий пептидов на одну клетку для пептидов HLA-A*24 TUMAP. Были проанализированы шесть различных опухолей РЖ, три из которых с повторным измерением (параллельные биологические образцы выделены серым цветом). НПКО относится к диапазону количественного определения в одном МС эксперименте и экстраполируется на образец- и TUMAP-специфический НПКО, т.е. самое низкое количество копий, которое поддается количественному определению в конкретном образце конкретного пептида TUMAP (выделены серым цветом).
На фиг. 16 представлены результаты исследования влияния добавки свободных пептидов с концентрацией 500 фмоль в препарат МНС/пептидный мономер. Свободный пептид в анализе не оказывает существенного влияния на указанные пептиды.
На фиг. 17 представлены результаты испытаний воспроизводимости выделения ДНК при использовании Qubit HS (флуоресцентной индикацией) в сравнении со стандартной кривой. Образцы (раковые образцы, такие как НМРЛ) демонстрируют достаточную гомогенность. ДНК выделяли из 3 аликвот по 50 мкл.
Последовательности с SEQ ID NO 1 по 24 представляют собой пептиды табл. 1 и 2, которые были выбраны для абсолютного количественного определения в соответствии с примерами.
Примеры
Последующие примеры описывают способ по изобретению в контексте ТАА/раковых заболеваний. Изобретение не ограничивается данными примерами, поскольку они являются только предпочтительными вариантами осуществления изобретения. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитируемые источники включены в данное описание во всей полноте путем ссылки.
- 10 036328
Таблица 1. HLA-A*02 пептиды TUMAP, выбранные для абсолютного количественного определения
| № | Код пептида | Последовательность |
| 1 | IGF2BP3-001 | KIQEILTQV |
| 2 | FAP-003 | YVYQNNIYL |
| 3 | COL12A1-002 | FLVDGSWSV |
| 4 | MXRA5-001 | TLSSIKVEV |
| 5 | NCAPG-001 | YLLSYIQSI |
| 6 | COL6A3-002 | FLLDGSANV |
| 7 | WNT5A-001 | AMSSKFFLV |
| 8 | F2R-001 | TLDPRSFLL |
| 9 | HIF1A-001 | ALDGFVMVL |
| 10 | МЕТ-001 | YVDPVITSI |
| 11 | CCNB1-002 | ILIDWLVQV |
Для абсолютного количественного определения было выбрано одиннадцать пептидов.
Таблица 2. HLA-A*24 пептиды TUMAP, выбранные для абсолютного количественного определения
| № | Код пептида | Последовательность |
| 12 | ASPM-002 | SYNPLWLRI |
| 13 | SLC6A6-001 | VYPNWAIGL |
| 14 | ММРЗ-001 | VFIFKGNQF |
| 15 | CDC2-001 | LYQILQGIVF |
| 16 | PLK4-001 | QYASRFVQL |
| 17 | ASPM-001 | RYLWATVTI |
| 18 | ATAD2-002 | KYLTVKDYL |
| 19 | KIF2C-001 | IYNGKLFDLL |
| 20 | МЕТ-006 | SYIDVLPEF |
| 21 | AVL9-001 | FYISPVNKL |
| 22 | РРАР2С-001 | AYLVYTDRL |
| 23 | UCHL5-001 | NYLPFIMEL |
| 24 | UQCRB-001 | YYNAAGFNKL |
Для абсолютного количественного определения было выбрано четырнадцать пептидов. Как оказалось, свойства одного пептида (PLK4-001) неприемлемы для дальнейших исследований. Для остальных 13 пептидов были выполнены эксперименты по абсолютному количественному определению.
Количественное определение копий TUMAP на клетку в образцах солидных опухолей требует (раздельного) количественного определения
а) выделенного TUMAP,
б) потерь TUMAP во время выделения,
в) числа клеток проанализированного образца ткани.
Обзор экспериментального подхода в соответствии с настоящим изобретением приводится в фиг. 1. Количественное определение пептида с помощью наноЖХ-МС/МС
Для точного определения количества пептидов методом масс-спектрометрии сначала необходимо получить базовые знания о специфической для пептида корреляции количества пептида и МС-сигнала. Например, измерения с помощью МС смеси пептидов с концентрацией каждого пептида 10 фмоль позволяют обнаружить, что МС-сигналы разных пептидов существенно различаются (фиг. 2). Это также означает, что диапазон, в котором может быть произведено достоверное определение количества пептида с помощью МС, зависит от индивидуальных характеристик каждого отдельного пептида.
Кроме того, линейная корреляция между количеством конкретного пептида и МС-сигналом может
- 11 036328 ожидаться только в конкретном диапазоне. Поэтому авторы изобретения решили построить отдельную калибровочную кривую для каждого пептида. Диапазон каждой калибровочной кривой был выбран так, чтобы отражать не только индивидуальный диапазон определения количества пептида, но также и диапазон МС-сигналов для каждого пептида в предварительно проанализированных опухолевых образцах. Цель состояла в том, чтобы каждая калибровочная кривая включала специфический для пептида диапазон МС-сигналов по меньшей мере 80% типичных образцов, использующихся авторами изобретения.
Для построения точных калибровочных кривых необходим синтетический стандарт, который должен быть количественно проанализирован независимым способом и иметь такие же характеристики, что и природный TUMAP. Авторы изобретения использовали версии TUMAP с двойными изотопными метками, т.е. во время синтеза TUMAP были введены две аминокислоты с изотопными метками. Дважды меченные версии можно отличить от природного пептида TUMAP по разнице в массе 12-18 Да в зависимости от меченной аминокислоты. Помимо массы, мечение изотопами не меняет свойства пептида при МС, т.е. пептиды с одинаковыми последовательностями, но разными изотопными метками приведут к одинаковой интенсивности МС-сигналов (Anderson et al., 2012). После синтеза пептиды TUMAP с двойными метками прошли точное количественное определение с помощью анализа на содержание азота в целях установления точной корреляции между количеством пептида и МС-сигналом.
Калибровочные кривые были построены по меньшей мере в трех разных матрицах, т.е. элюатах пептида HLA из природных образцов, подобных обычным образцам для МС, и каждый препарат прошел два цикла измерений на МС. Чтобы компенсировать любые технические различия между циклами МС, во все измерения был включен пептид внутреннего стандарта. Соотношение МС-сигналов титрованного пептида и фиксированного внутреннего стандарта было нанесено на график, и калибровочная кривая была рассчитана методом логистической регрессии (фиг. 3). Нижний предел количественного определения (НПКО) был определен визуально с учетом отклонения от линейности. Если отклонение от линейности не было очевидным, как в случае пептида FAP-003 (фиг. 4), для вычисления НПКО использовали среднее соотношение самых низких количеств пептида. Верхний предел количественного определения, т.е. отклонение от линейности при высших концентрациях, ни для одной калибровочной кривой достигнут не был.
В реальных экспериментах по количественному определению в каждый образец добавляли то же самое количество внутреннего стандарта, что и для построения калибровочной кривой, и рассчитывали соотношение природного пептида и пептида внутреннего стандарта. Данный метод внутреннего стандарта является известным методом количественного определения белков на основе результатов МС, например для анализа биомаркеров в биологических образцах (Sturm et al., 2012; Prasad and Unadkat, 2014; Sato et al., 2012). Калибровочные кривые и значения, измеренные на реальных образцах опухолей, представлены на фиг. 4 и 5 для HLA-A*02 и на фиг. 6 и 7 для HLA-A*24 для всех пептидов TUMAP, выбранных для абсолютного количественного определения.
Для оценки вариации количественных МС измерений был рассчитан коэффициент вариации (KB в %) содержания пептида для каждого МС образца. Значения KB каждого МС образца были нанесены на график, и полную вариацию МС измерений оценивали как медианный KB (фиг. 8).
Эффективность выделения комплексов пептид/МНС
Как в случае любого процесса очистки белков, выделение белков из образцов ткани связано с определенными потерями исследуемого белка. Для определения эффективности выделения пептида TUMAP для всех пептидов TUMAP, выбранных для абсолютного количественного определения, были получены комплексы пептид-МНС. Чтобы отличить комплексы пептид-МНС со стандартными добавками от комплексов с природным пептидом, использовали версии пептидов TUMAP с одной изотопной меткой, т.е. во время синтеза TUMAP вводили одну аминокислоту с изотопной меткой. Данные комплексы добавляли в качестве стандартной добавки в свежеприготовленные лизаты тканей, т.е. в самый ранний возможный момент процесса выделения пептида TUMAP, а затем проводили улавливание, как природных комплексов пептид-МНС в процессе последующей аффинной очистки. Таким образом, измерение степени извлечения однократно меченных пептидов TUMAP позволяет сделать заключения относительно эффективности выделения отдельных природных пептидов TUMAP.
Эффективность выделения определяли на 13 образцах, которые были выбраны для абсолютного количественного определения пептидов TUMAP (7 HLA-А*02-положительных, 5 HLA-A*24положительных и 1 HLA-A*02/A*24 дважды положительный образец). Восемь А*02-положительных образцов были проанализированы на эффективность выделения А*02 пептидов TUMAP и шесть А*24положительных образцов - для А*24 пептидов TUMAP (фиг. 9 А, В). Результаты позволяют предположить, что для большинства пептидов эффективность выделения является сопоставимой среди различных образцов тканей. Напротив, эффективность выделения отдельных пептидов различна. Поэтому можно предположить, что эффективность выделения, хотя она определялась только для ограниченного числа образцов тканей, может быть экстраполирована на любой другой препарат ткани. Тем не менее, необходимо проанализировать каждый пептид TUMAP в отдельности, поскольку эффективность выделения не может быть экстраполирована с одного пептида на другие.
В редких случаях эффективность выделения нереалистично высока и/или сильно варьируется, на
- 12 036328 пример для пептида NCAPG-001 (фиг. 9 А). В случаях когда эффективность было невозможно определить, например, вследствие связанных с пептидом сложностей количественного определения (например, высокий уровень НПКО для пептидов CCNB1-002, ASPM-001) или расчет эффективности дал результат, превышающий 100%, авторы изобретения принимали значение эффективности выделения равным 100%. Это консервативный подход, который, скорее всего, дает завышенные результаты эффективности выделения и тем самым приводит к занижению числа копий пептида на одну клетку.
Для оценки вариации в эффективности выделения TUMAP был построен график для коэффициента вариации (KB в %) для выделения отдельных пептидов TUMAP из 6-8 образцов (фиг. 9 С). Итак, средняя вариация для пептидов А*02 TUMAP составляет 24% и для А*24 пептидов TUMAP - 32% соответственно.
Определение числа клеток в твердой замороженной ткани
Другим критическим фактором для расчета числа копий пептида на клетку является оценка общего числа клеток образцов ткани, использованных для выделения пептида TUMAP. Авторы изобретения приняли решение использовать анализ содержания ДНК, поскольку этот метод применим к широкому диапазону образцов различного происхождения и, что наиболее важно, к замороженным образцам (Forsey and Chaudhuri, 2009; Alcoser et al., 2011; Alcoser et al., 2011; Silva et al., 2013).
С учетом внутриопухолевой гетерогенности число клеток необходимо определять из фрагмента ткани, являющегося репрезентативным для всего тканевого образца, использованного для выделения пептида TUMAP. Тканевый лизат, приготовленный во время выделения пептида TUMAP, является подходящим образцом для анализа ДНК, поскольку он более гомогенный по сравнению с фракцией твердой ткани. После выделения ДНК проводили количественное определение суммарной концентрации ДНК в анализе на основе флуоресценции (Life Technologies, набор Qubit HS для количественного определения ДНК), и вычисляли суммарное содержание ДНК в образцах.
Для расчета числа клеток из заданного количества ДНК авторы изобретения учитывали два различных способа. Во-первых, число клеток может быть рассчитано с помощью теоретической массы человеческого генома, которая составляет, по оценкам, приблизительно 6,67 пг ДНК на диплоидный геном (Alcoser et al., 2011; Konigshoff et al., 2003). В качестве альтернативы образцы с известным числом клеток могут быть использованы для построения стандартной кривой ДНК с помощью тех же методов, что и для образцов ткани. Этот метод уже компенсирует какое-либо влияние процедур выделения и количественного определения ДНК, таким образом, увеличивая точность полученных результатов. Авторы изобретения построили две разные стандартные кривые, одну из семи различных линий опухолевых клеток и одну - из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) шести здоровых доноров.
Для сравнения всех трех методов оценки (теоретическая масса ДНК и две разные стандартные кривые на основе клеток) рассчитывали число клеток на 1 г ткани для нескольких образцов (фиг. 10 А). Расчеты с использованием результата стандарта клеточной линии дают существенно более низкое число клеток (макс. занижение в 3,6 раза) по сравнению с использованием стандарта МКПК. Это было ожидаемым, если учесть, что в линиях опухолевых клеток, как правило, выше доля анеуплоидных клеток с более высоким содержанием ДНК по сравнению со здоровыми диплоидными МКПК. Из литературных источников известно, что доля диплоидных опухолей желудка колеблется от 25 до 67% в зависимости от исследования (Hiyama et al., 1995; Tamura et al., 1991; Wiksten et al., 2008; Zhang et al., 2005; Sugai et al., 2005). Поскольку плоидность и доля анеуплоидных клеток образцов ткани неизвестны, обе стандартные кривые могут дать лишь приблизительную оценку истинного числа клеток, но не учитывают все свойства отдельного образца ткани. Другим источником вариабельности является неизвестный статус пролиферации в образце ткани или присутствие некротических клеток. В частности, удвоение содержания ДНК в пролиферирующих клетках увеличивает количество ДНК по отношению к числу клеток и тем самым приводит к искажению результатов вычисления числа клеток. В двух образцах нормальной ткани желудка авторы изобретения вычислили более низкое число клеток на 1 г ткани по сравнению с опухолевыми образцами при использовании всех трех подходов.
В качестве консервативного подхода авторы изобретения решили использовать стандартную кривую МКПК (фиг. 10 В), которая может привести к завышению числа клеток в части гипердиплоидных образцов ткани, приводя к заниженному числу копий пептида на клетку в таких образцах, однако это никогда не приведет к завышению их числа в каком-либо образце.
Для анализа образцов ткани, выбранных для абсолютного количественного определения пептидов TUMAP, авторы изобретения выделили ДНК из 2-3 аликвот тканевого лизата, и каждый препарат ДНК был количественно проанализирован с 2-3 повторами с помощью флуоресцентного анализа. Общее число клеток и число клеток на 1 г ткани рассчитывали из суммарного содержания ДНК с помощью стандартной кривой МКПК (фиг. 11 А). В целях получения оценки полной вариации для анализа числа клеток сначала определяли коэффициент вариации (%) на уровне каждого образца или, если такой имелся, биологического репликата (т.е. независимые препараты тканевого лизата из различных участков одной опухоли). При данных расчетах учитывали вариацию между аликвотами тканевого лизата, а также результаты повторных измерений в флуоресцентном анализе. Эти KB представлены На фиг. 11 В, и полную вариацию определяли в виде медианы показанных КВ. Вариабельность может быть отчасти объяснена тем фактом, что тканевые лизаты были не полностью гомогенизированы, т.е. оставшиеся частицы
- 13 036328 ткани, содержащие недиссоциированные клетки, приводят к более высокому числу клеток для отдельных репликатов, полученных при выделении (см., например, GC816T на фиг. 11 А).
Число копий пептида на одну клетку
Имея данные количественного определения пептида методом наноЖХ-МС/МС (общий пептид), эффективности выделения пептида TUMAP (% эффективности выделения) и число клеток каждого имеющегося опухолевого образца, можно вычислить число копий пептида TUMAP на одну клетку по следующей формуле.
Количество общего пептида рассчитывается по результатам 2-4 экспериментов наноЖХ-МС/МС (пептид/цикл [фмоль]) при использовании калибровочных кривых, представленных на фиг. 4-7.
total peptide = Ί χ χ χ ; \ ИП 1 1J I——1 -Jill·. J.·? Uil· l·
J
0№ :: ϊ ;ς·; Ί'.. >.? ;ϊϊ<3;;ϊλ
| iota/ peptide | общий пептид |
| peptide | пептид |
| run | ЦИКЛ |
| fmol | фмоль |
| mol | моль |
| peptide eluate | пептидний элюат |
| PL | МКЛ |
| MS | МС |
| sample per run | образец на цикл |
| % of lisate used for TUMAP isolation | % лизата, использованного для выделения пептидов TUMAP |
Для расчета абсолютного числа копий пептида использовались только результаты МС измерений выше НПКО, как определено с помощью калибровочных кривых. НПКО относится к количеству пептида TUMAP по результатам эксперимента методом наноЖХ-МС/МС (НПКО/цикл [фмоль]).
Число копий на одну клетку всех пептидов, которые могли быть количественно проанализированы, находится в диапазоне от 50 до 30000 копий на клетку (см. табл.3).
Таблица 3. Сводка данных по числу копий на клетку для HLA-A*O2 и HLA-A*24 пептидов TUMAP
| Аллель HLA | Код пептида | Количественное определение в «п» образцов (% проанализированных образцов) | Копий на клетку (диапазон отдельных образцов и репликатов биологических образцов) |
| А *02 | IGF2BP3- 001 | 1 (13%) | 350-450 |
| А*02 | FAP-003 | 1 (13%) | 200-250 |
| А *02 | COL12A1- 002 | 0 (0%) | nq |
| А*02 | MXRA5-001 | 1 (13%) | 450 |
| А*02 | NCAPG-001 | 1 (13%) | 1000 |
| А*02 | COL6A3-002 | 0 (0%) | nq |
| А*02 | WNT5A-001 | 1 (13%) | 400 |
| А*02 | F2R-001 | 5 (63%) | 50-300 |
| А*02 | HIF1A-001 | 3 (38%) | 9000-30000 |
| А *02 | МЕТ-001 | 2 (25%) | 200-250 |
| А*02 | CCNB1-002 | 0 (0%) | nq |
| А *24 | ASPM-002 | 0 (0%) | nq |
| А*24 | SLC6A6-001 | 2 (33%) | 1000-5000 |
- 14 036328
| А *24 | ММРЗ-001 | 2 (33%) | 100-250 |
| А*24 | CDC2-001 | 0 (0%) | nq |
| А *24 | ASPM-001 | 0 (0%) | nq |
| А*24 | ATAD2-001 | 2 (33%) | 1500-6000 |
| А *24 | KIF2C-001 | 1 (17%) | 3500 |
| А*24 | МЕТ-006 | 3 (50%) | 2500-13500 |
| А*24 | AVL9-001 | 4 (67%) | 1000-10000 |
| А*24 | РРАР2С-001 | 5 (83%) | 200-1500 |
| А *24 | UCHL5-001 | 1 (17%) | 2500 |
| А*24 | UQCRB-001 | 1 (17%) | 900 |
HLA-A*O2 пептиды TUMAP анализировали в восьми образцах, HLA-A*24 TUMAP - в шести образцах, nq = не были количественно определены, поскольку количество пептида было ниже НПКО.
В целях визуализации НПКО в контексте числа копий пептида на клетку для каждого пептида TUMAP в каждом образце рассчитывали НПКО на клетку с использованием двух приведенных выше формул. Поскольку образцы различаются по общему числу клеток, у каждого образца имеется свой НПКО на клетку (см. фиг. 12 и 13 для А*02 пептидов TUMAP и фиг. 14 и 15 для А*24 пептидов TUMAP).
Оценка погрешности абсолютного количественного определения пептидов TUMAP
Для оценки вариации абсолютного количественного определения пептидов TUMAP авторы изобретения учитывали относительную вариацию трех основных результатов экспериментов, как было описано выше:
а) количества выделенных пептидов TUMAP: относительное отклонение 1,8% (А*02) и 2,1%(А*24);
б) эффективности выделения пептидов TUMAP: относительное отклонение 24% (А*02) и 32% (А*24);
в) число клеток тканевого образца: относительное отклонение 27%.
Допуская нормальное распределение переменных величин, относительная погрешность (σ) числа копий на одну клетку может быть рассчитана как квадратный корень из суммы квадратных относительных погрешностей каждой переменной:
J ; ~ ^eopies . s;· 1 ~ +
| copies | копий |
| total cell count | общего числа клеток |
| total peptide | общего пептида |
| isolation efficiency | эффективности выделения |
Из значений, приведенных выше, коэффициент вариации абсолютного числа копий пептида на одну клетку составляет приблизительно 36 % для HLA-A*O2- и 42 % для HLA-А*24-связывαющих пептидов. Чтобы получить представление о вариации результатов, были рассчитаны абсолютная и относительная погрешности числа копий пептида на одну клетку для модельного пептида и образца (табл. 4).
- 15 036328
Таблица 4. Примеры результатов расчета абсолютной и относительной погрешности абсолютного количественного определения пептидов TUMAP для модельного пептида
| значение | А*02 | А*24 | |||
| отн. погрешность (%) | абс. погрешность | ОТН. погрешность (%) | абс. погрешность | ||
| Общее число клеток/образец | 1x108 | 27% | - | 27% | - |
| Общий пептид [фмоль] | 16,25 | 1,8% | - | 2,1% | - |
| Эффективность выделения комплекса пептид/МНС | 10% | 24% | 32% | ||
| Число копий пептида на одну клетку | 1000 | 36% | 360 | 42% | 420 |
Расчет с использованием данной модели позволяет предположить, что для комплексного многоэтапного анализа абсолютного количественного определения вариация результатов все еще находится в приемлемом диапазоне. Для отдельных пептидов TUMAP относительная погрешность может отклоняться от усредненного значения погрешности, вычисленного в этом описании. Число копий пептида TUMAP на одну клетку можно количественно сравнивать для разных пептидов TUMAP, что позволяет установить приоритет для пептидов TUMAP в целях выбора подходящих мишеней для антител и/или растворимых Т-клеточных рецепторов.
Сравнение способа количественного определения пептидов TUMAP с известными опубликованными способами
До сих пор не было представлено точного подхода для абсолютного количественного определения числа копий пептида, ассоциированного с МНС, на одну клетку. Еще более важно, что опубликованные ранее способы количественного определения связанных с молекулами МНС пептидов с использованием МС анализа не учитывали потери антигена во время подготовки образца (Tan et al., 2011; Hogan et al., 2005). Группа исследователей во главе с Peter A. von Velen недавно опубликовала способ точного количественного определения связанных с молекулами МНС пептидов (Hassan et al., 2014). В данном техническом документе использовали подход для количественного определения двух минорных антигенов гистосовместимости, LB-NISCH-1A и LB-SSR1-1S на клетках EBV-LCL JYpp65. Однако отдельные этапы проведения эксперимента, по существу, различны, что вкратце представлено ниже в таблице.
Таблица 5. Сравнение способов количественного определения пептидов TUMAP согласно Hassan и соавторам и согласно настоящему изобретению
| Hassan и соавт. | Настоящее изобретение | |
| Калибровочные кривые для пептидов | Использовались только для определения диапазона линейности, с допущением, что все пептиды имеют одинаковую корреляцию количества пептида и МС сигнала (наклон - 1) | Для определения диапазона линейности, НПКО и в целях определения количества пептида; учитывает пептидспецифическую корреляцию количества и МС сигнала для каждого отдельного пептида |
| Количественное | Калибровка по одной точке: | Метод внутреннего |
- 16 036328
| определение пептидов | соотношение сигнала с сигналом добавленного стандарта пептида | стандарта, основанный на пептид-специфической калибровочной кривой, количественное определение образцов вблизи НПКО |
| Эффективность выделения | комплексов пептид-МНС, добавленных в лизат после 2 часов лизиса и разделение центрифугированием, потери пептида на этих этапах не принимаются во внимание | комплексов пептид-МНС, введенных как стандартные добавки непосредственно после гомогенизации ткани, т. е. в самый ранний момент времени в процессе выделения пептида |
| Образцы | Клеточная линия | Твердая опухолевая ткань |
| Подготовка образца | Дополнительный этап хроматографии с фазой С18, использованный для снижения уровня сложности образца, перед конечной наноЖХ-МС/МС. | Незамедлительное использование образца после иммунопреципитации и фильтрации для наноЖХМС/МС |
| Определение числа клеток | Подсчет клеток во время подготовки клеточного осадка | Анализ содержания ДНК в лизате твердых тканей |
| Расчет погрешности | Учитывается только вариация повторных измерений методом МС (КВ 0,1-7,1%), но не вариацию при выделении комплекса пептид-МНС (26% и 91%, соответственно) и подсчета числа клеток. | Учитываются вариации повторных измерений методом МС (КВ в среднем 1,8-2,1%), эффективности выделения комплексов пептид-МНС (КВ в среднем 24-32%) и определения числа клеток (КВ в среднем 27%). |
Число копий двух пептидов, проанализированных Hassan и соавторы, варьировалось от 800 до 5300 (относительное отклонение 74%) и от 3000 до 12000 (относительное отклонение 60%) копий на клетку среди репликатов биологических образцов соответственно. Причина этих вариаций четко не обсуждается, но может быть связана с использованием различных приборов для МС.
Итак, ожидается, что усовершенствованный способ настоящего изобретения внесет свой вклад в получение более точных и достоверных результатов.
Количественное определение пептидов с низким числом копий
В целях демонстрации достоинств способа по изобретению были получены данные, которые представлены далее в таблице. Были идентифицированы пептиды, которые представлены очень малым числом копий, среди них пептид PDE11-001. Можно видеть, что данный способ позволяет определение такого малого числа копий как приблизительно 10 копий пептида на клетку.
- 17 036328
Таблица 6. Количественное определение пептидов с низким числом копий
| Код пептида | Число копий на клетку | Количество образцов | Источник/HLA | ||||
| Мин. | Медиана | Макс. | > нпко | > пко | подлежащие оценке | ||
| Пептид 1 | 20 | 20 | 20 | 1 | 5 | 16 | NSCLC/A*02 |
| Пептид 2 | 10 | 30 | 300 | 13 | 16 | 17 | NSCLC/A*02 |
| Пептид 3 | 10 | 30 | 50 | 4 | 10 | 18 | NSCLC/A*02 |
| Пептид 4 | 10 | 30 | 100 | 17 | 17 | 19 | NSCLC/A*02 |
| Пептид 5 | 20 | 20 | 90 | 7 | 8 | 11 | NSCLC/A*02 |
| Пептид 6 | 10 | 20 | 50 | 6 | 6 | 10 | NSCLC/A*02 |
| Пептид 7 | < 10 | 30 | 200 | 9 | 12 | 15 | PC/A*02 |
| PDE11-001 | < 10 | 10 | 30 | 8 | 9 | 10 | PC/A*02 |
РПрЖ - рак предстательной железы - последовательность PDE11-001 - это ALLESRVNL (SEQ ID NO 25)
PDE11-001 является связывающимся с HLA-A*02 пептидом, полученным из фосфодиэстеразы 11А (PDE11A), которая катализирует гидролиз цАМФ и цГМФ, тем самым подавляя соответствующие сигнальные пути. Мутации PDE11A ассоциировались с адренокортикальной гиперплазией, а также с семейной формой герминогенной опухоли яичек. Пептид был обнаружен на образцах раковых опухолей предстательной железы, а также в тканях гепатоклеточной карциномы, карциномы поджелудочной железы и почечноклеточной карциномы, но не в каких-либо нормальных тканях.
Цитируемая литература.
Alcoser SY, Kimmel DJ, Borgel SD, Carter JP, Dougherty KM, Hollingshead MG (2011). Real-time PCR-based assay to quantify the relative amount of human and mouse tissue present in tumor xenografts. BMC. Biotechnol. 11, 124.
Anderson NL, Razavi M, Pearson TW, Kruppa G, Paape R, Suckau D (2012).
Precision of heavy-light peptide ratios measured by maldi-tof mass spectrometry. J Proteome. Res 11, 1868-1878.
Forsey RW, Chaudhuri JB (2009). Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol. Lett. 31, 819-823.
Hassan C, Kester MG, Oudgenoeg G, de Ru AH, Janssen GM, Drijfhout JW, Spaapen RM, Jimenez CR, Heemskerk MH, Falkenburg JH, van Veelen PA (2014). Accurate quantitation of МНС-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. J Proteomics.
Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y, Kodama T, Piatyszek MA, Shay JW, Matsuura Y (1995). Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res 55, 3258-3262.
Hogan KT, Sutton JN, Chu KU, Busby JA, Shabanowitz J, Hunt DF, Slingluff CL, Jr. (2005). Use of selected reaction monitoring mass spectrometry for the detection of specific MHC class I peptide antigens on A3 supertype family members. Cancer Immunol. Immunother. 54, 359-371.
- 18 036328
Konigshoff M, Wilhelm J, Bohle RM, Pingoud A, Hahn M (2003). HER-2/neu gene copy number quantified by real-time PCR: comparison of gene amplification, heterozygosity, and immunohistochemical status in breast cancer tissue. Clin Chem. 49, 219-229.
Prasad B, Unadkat JD (2014). Comparison of Heavy Labeled (SIL) Peptide versus SILAC Protein Internal Standards for LC-MS/MS Quantification of Hepatic Drug Transporters. Int. J Proteomics. 2014, 451510.
Sato Y, Miyashita A, Iwatsubo T, Usui T (2012). Simultaneous absolute protein quantification of carboxylesterases 1 and 2 in human liver tissue fractions using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Drug Metab Dispos. 40, 1389-1396.
Silva AL, Rosalia RA, Sazak A, Carstens MG, Ossendorp F, Oostendorp J, Jiskoot W (2013). Optimization of encapsulation of a synthetic long peptide in PLGA nanoparticles: low-burst release is crucial for efficient CD8(+) T cell activation. Eur. J Pharm. Biopharm. 83, 338-345.
Sturm R, Sheynkman G, Booth C, Smith LM, Pedersen JA, Li L (2012). Absolute quantification of prion protein (90-231) using stable isotope-labeled chymotryptic peptide standards in a LC-MRM AQUA workflow. J Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 1522-1533.
Sugai T, Habano W, Jiao YF, Suzuki M, Takagane A, Nakamura S (2005). Analysis of genetic alterations associated with DNA diploidy, aneuploidy and multiploidy in gastric cancers. Oncology 68, 548-557.
Tamura G, Kihana T, Nomura K, Terada M, Sugimura T, Hirohashi S (1991). Detection of frequent p53 gene mutations in primary gastric cancer by cell sorting and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis. Cancer Res 51, 3056-3058.
Tan CT, Croft NP, Dudek NL, Williamson NA, Purcell AW (2011). Direct quantitation of МНС-bound peptide epitopes by selected reaction monitoring. Proteomics. 11, 2336-2340.
Wiksten JP, Lundin J, Nordling S, Kokkola A, Haglund C (2008). Comparison of the prognostic value of a panel of tissue tumor markers and established clinicopathological factors in patients with gastric cancer. Anticancer Res 28, 22792287.
Zhang H, Yi EC, Li XJ, Mallick P, Kelly-Spratt KS, Masselon CD, Camp DG, Smith RD, Kemp CJ, Aebersold R (2005). High throughput quantitative analysis of serum proteins using glycopeptide capture and liquid chromatography mass spectrometry. Mol. Cell Proteomics. 4, 144-155.
Claims (9)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ определения абсолютного количества по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС на клетке, где указанный способ включает:а) приготовление клеток, презентирующих указанный по меньшей мере один пептидный лиганд МНС из биологического образца, выбранного из образца ткани, образца крови, образца опухоли или образца инфицированной ткани, включающего указанные клетки, включающее ферментативное расщепление тканей, и/или лизис клеток;б) определение числа клеток в указанном препарате этапа а), включающее способ, выбранный из подсчета ядер клеток, фотометрического метода определения ДНК, флуориметрического метода определения ДНК или количественной ПЦР;в) добавление известного количества указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС и/или комплекса пептидного лиганда с МНС, подлежащего количественному определению, в указанный препарат этапа а) непосредственно после гомогенизации ткани (добавка I);г) выделение по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС из указанного препарата этапа в) в целях получения пептидного элюата;д) добавление известного количества по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, подлежащего количественному определению, в указанный пептидный элюат (добавка II);е) проведение масс-спектрометрического анализа указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС в целях получения по меньшей мере одного аа) сигнала для эффективности выделения на этапе г), бб) сигнала для известного количества указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, добавленного на этапе д), и вв) сигнала для указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС из указанного препарата клеток этапа а), и;ж) количественное определение указанного по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС на основе сравнения сигналов, полученных на этапе е), с аа) полученным числом клеток, бб) известным количеством указанного по меньшей мере одного лиганда пептида МНС и/или комплекса пептидного лиганда с МНС, подлежащего определению, добавленного на этапе в), и вв) известным количеством по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС, подлежащего количественному определению, добавленного на этапе д), за счет чего осуществляется определение абсолютного количества по меньшей мере одного пептидного лиганда МНС на клетке.
- 2. Способ в соответствии с п.1, где указанный по меньшей мере один пептидный лиганд МНС выбран из опухолеассоциированного пептида (ТАА) или ассоциированного с заболеванием пептида (DAA).
- 3. Способ в соответствии с п.1 или 2, который дополнительно включает определение количества по меньшей мере одного вида молекул HLA в указанном препарате этапа а).
- 4. Способ в соответствии с любым из пп.1-3, где добавленный по меньшей мере один комплекс пептида с МНС и/или добавленный по меньшей мере один пептидный лиганд МНС являются мечеными и предпочтительно меченными различными изотопами.
- 5. Способ в соответствии с любым из пп.1-4, где выделение включает хроматографию, такую как аффинную хроматографию.
- 6. Способ в соответствии с любым из пп.1-5, дополнительно включающий выбор избыточно презентируемых, избыточно экспрессируемых и/или опухолеспецифических пептидных лигандов МНС для анализа.
- 7. Способ в соответствии с любым из пп.1-6, где указанный способ осуществляется на высокопродуктивном уровне.
- 8. Способ в соответствии с любым из пп.1-7, где указанный(ые) биологический(ие) образец(ы) получен(ы) от одного индивида или от группы индивидов, страдающих от одинакового патологического состояния.
- 9. Способ в соответствии с п.8, дополнительно включающий этап получения персонализированного профиля лигандов МНС, предпочтительно персонализированного специфичного для заболевания профиля лигандов МНС, основанного на указанных пептидных лигандах МНС, определяемых количественно.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462097994P | 2014-12-30 | 2014-12-30 | |
| GBGB1423361.3A GB201423361D0 (en) | 2014-12-30 | 2014-12-30 | Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides |
| PCT/EP2015/079873 WO2016107740A1 (en) | 2014-12-30 | 2015-12-15 | Method for the absolute quantification of naturally processed hla-restricted cancer peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201791148A1 EA201791148A1 (ru) | 2017-11-30 |
| EA036328B1 true EA036328B1 (ru) | 2020-10-27 |
Family
ID=52471641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201791148A EA036328B1 (ru) | 2014-12-30 | 2015-12-15 | Способ определения абсолютных количеств hla-рестриктированных раковых пептидов, образовавшихся в результате естественного процессинга |
Country Status (35)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10545154B2 (ru) |
| EP (1) | EP3241026B1 (ru) |
| JP (1) | JP6735741B2 (ru) |
| KR (1) | KR102336968B1 (ru) |
| CN (1) | CN107003322B (ru) |
| AU (1) | AU2015373584B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017008212B1 (ru) |
| CA (1) | CA2972306C (ru) |
| CL (1) | CL2017001071A1 (ru) |
| CO (1) | CO2017004543A2 (ru) |
| CR (1) | CR20170297A (ru) |
| CY (1) | CY1124223T1 (ru) |
| DK (1) | DK3241026T3 (ru) |
| EA (1) | EA036328B1 (ru) |
| ES (1) | ES2871035T3 (ru) |
| GB (1) | GB201423361D0 (ru) |
| HR (1) | HRP20210811T1 (ru) |
| HU (1) | HUE054455T2 (ru) |
| IL (1) | IL250982B (ru) |
| LT (1) | LT3241026T (ru) |
| MA (2) | MA41287B1 (ru) |
| MD (1) | MD3241026T2 (ru) |
| MX (1) | MX383806B (ru) |
| MY (1) | MY190199A (ru) |
| PE (1) | PE20171136A1 (ru) |
| PH (1) | PH12017500483A1 (ru) |
| PL (1) | PL3241026T3 (ru) |
| PT (1) | PT3241026T (ru) |
| RS (1) | RS61914B1 (ru) |
| SG (2) | SG11201703841VA (ru) |
| SI (1) | SI3241026T1 (ru) |
| TW (1) | TWI632370B (ru) |
| UA (1) | UA122774C2 (ru) |
| WO (1) | WO2016107740A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201701646B (ru) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201423361D0 (en) * | 2014-12-30 | 2015-02-11 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides |
| MY190083A (en) * | 2015-03-17 | 2022-03-25 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against pancreatic cancer and other cancers |
| GB201513921D0 (en) | 2015-08-05 | 2015-09-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against prostate cancer and other cancers |
| MY198087A (en) | 2015-10-05 | 2023-07-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against small cell lung cancer and other cancers |
| GB201604458D0 (en) | 2016-03-16 | 2016-04-27 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against cancers |
| EP4317432A3 (en) | 2016-12-08 | 2024-04-17 | Immatics Biotechnologies GmbH | T cell receptors with improved pairing |
| DE102016123893A1 (de) | 2016-12-08 | 2018-06-14 | Immatics Biotechnologies Gmbh | T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung |
| PT3428194T (pt) | 2017-07-14 | 2021-11-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Molécula de polipéptido com especificidade dupla melhorada |
| DE102017127984B4 (de) | 2017-11-27 | 2019-12-05 | Immatics US, Inc. | Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen |
| JP7470640B2 (ja) * | 2018-02-09 | 2024-04-18 | イマティクス ユーエス，アイエヌシー． | Ｔ細胞を製造する方法 |
| DE102018107224A1 (de) | 2018-02-21 | 2019-08-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
| DE102018108612A1 (de) | 2018-03-21 | 2019-09-26 | Immatics US, Inc. | Verfahren zur erhöhung der persistenz von adoptiv infundierten t-zellen |
| KR102731127B1 (ko) | 2018-09-05 | 2024-11-18 | 에스케이하이닉스 주식회사 | 메모리 컨트롤러 및 이를 포함하는 메모리 시스템 |
| TW202039535A (zh) | 2018-12-18 | 2020-11-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | B*08限制肽和肽組合物抗癌免疫治療和相關方法 |
| WO2020191172A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | Immatics US, Inc. | Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof |
| MA56036A (fr) | 2019-05-27 | 2022-04-06 | Immatics Us Inc | Vecteurs viraux et leur utilisation dans une thérapie cellulaire adoptive |
| US20200384028A1 (en) | 2019-06-06 | 2020-12-10 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Sorting with counter selection using sequence similar peptides |
| DE102019121007A1 (de) | 2019-08-02 | 2021-02-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden |
| US20210032370A1 (en) | 2019-08-02 | 2021-02-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Recruiting agent further binding an mhc molecule |
| JP2022543687A (ja) | 2019-08-09 | 2022-10-13 | イマティクス ユーエス，アイエヌシー． | ペプチド質量分析断片化を予測するための方法 |
| US12480958B2 (en) * | 2019-08-13 | 2025-11-25 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method for the characterization of peptide:MHC binding polypeptides |
| AU2021225817A1 (en) | 2020-02-24 | 2022-10-20 | Immatics US, Inc. | Methods for expanding T cells for the treatment of cancer and related malignancies |
| DE102020106710A1 (de) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Immatics US, Inc. | Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren |
| DE102020111571A1 (de) | 2020-03-11 | 2021-09-16 | Immatics US, Inc. | Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren |
| US12312412B2 (en) | 2020-05-19 | 2025-05-27 | Amgen Inc. | MAGEB2 binding constructs |
| US20220056411A1 (en) | 2020-08-21 | 2022-02-24 | Immatics US, Inc. | Methods for isolating cd8+ selected t cells |
| DE102020125457A1 (de) | 2020-09-29 | 2022-03-31 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten |
| PE20250846A1 (es) | 2020-12-31 | 2025-03-21 | Immatics Us Inc | Polipeptidos cd8, composiciones y metodos de uso de estos |
| BR112023022765A2 (pt) | 2021-05-05 | 2024-01-02 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Proteínas de ligação ao antígeno que ligam especificamente o prame |
| BR112023022975A2 (pt) | 2021-05-05 | 2024-01-23 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Polipeptídeos de ligação ao antígeno bma031 melhorados |
| US20230024554A1 (en) | 2021-06-28 | 2023-01-26 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules |
| EP4113120A1 (en) | 2021-06-28 | 2023-01-04 | Immatics Biotechnologies GmbH | Method of characterizing the binding characteristics between a peptide of interest and mhc molecules |
| JP2024529467A (ja) | 2021-07-27 | 2024-08-06 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | Ｃｔ４５に特異的に結合する抗原結合タンパク質 |
| JP2024534825A (ja) | 2021-08-24 | 2024-09-26 | イマティクス ユーエス，アイエヌシー． | 条件付きリガンド交換により産生されたペプチドｍｈｃ複合体を使用する免疫細胞の選択 |
| WO2023044488A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Immatics US, Inc. | Monocyte depletion of t cells populations for t-cell therapy |
| EP4408468A4 (en) | 2021-09-28 | 2025-07-02 | Frontaim Biomedicines Inc | MULTIPLE FORMATS OF MOLECULAR COMPLEXES |
| US20230190806A1 (en) | 2021-10-06 | 2023-06-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Methods of treating metastatic lesions and compositions thereof |
| US20230192886A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-06-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Adoptive cell therapy combination treatment and compositions thereof |
| IL316515A (en) | 2022-04-28 | 2024-12-01 | Immatics Us Inc | Membrane-bound IL15 CD8 proteins, cells, compositions and methods for their use |
| EP4514821A1 (en) | 2022-04-28 | 2025-03-05 | Immatics US, Inc. | Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof |
| EP4514834A1 (en) | 2022-04-28 | 2025-03-05 | Immatics US, Inc. | Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof |
| US20230355678A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Immatics US, Inc. | Methods for improving t cell efficacy |
| WO2025008513A1 (en) | 2023-07-05 | 2025-01-09 | Immatics Biotechnologies Gmbh | A method of identifying mhc-binding proteins and interacting peptides in a sample |
| WO2025021979A1 (en) | 2023-07-27 | 2025-01-30 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel t cell receptors targeting melanoma-associated antigen (mage) b2 and immune therapy using the same |
| AU2024300235A1 (en) | 2023-07-27 | 2026-01-08 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Antigen binding proteins against mageb2 |
| WO2025040598A2 (en) | 2023-08-18 | 2025-02-27 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides displayed by mhc for use in immunotherapy against different types of cancer |
| WO2025096649A1 (en) | 2023-11-01 | 2025-05-08 | Immatics US, Inc. | Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof |
| WO2025125536A1 (en) | 2023-12-13 | 2025-06-19 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Absolute copy number prediction of mhc-presented peptides by relative quantitative measurement |
| WO2025125535A1 (en) | 2023-12-13 | 2025-06-19 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Differential population-scale immunopeptidomics |
| WO2025233431A1 (en) | 2024-05-07 | 2025-11-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Heteromeric proteins comprising three heteromerization improving substitution, production, combinations and applications thereof |
| WO2025233432A1 (en) | 2024-05-07 | 2025-11-13 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Use and dosage of an antigen-binding protein comprising a tcr specific for an hla-a*02 restricted peptide |
| WO2026008886A1 (en) | 2024-07-05 | 2026-01-08 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Means and methods for the quantification of target expression |
| WO2026033136A1 (en) | 2024-08-09 | 2026-02-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Advanced treatment modalities for anti-prame tcr-engineered immune cells |
| WO2026096743A1 (en) | 2024-10-30 | 2026-05-07 | Immatics US, Inc. | Methods for gamma delta t cells manufacturing |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011128448A1 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method for differentially quantifying naturally processed hla-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4290003B2 (ja) | 2001-09-14 | 2009-07-01 | エレクトロフォレティクス リミテッド | 質量標識体 |
| DE10225139A1 (de) | 2002-05-29 | 2004-02-26 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von immunreaktiven Peptiden |
| US20050221350A1 (en) * | 2002-05-29 | 2005-10-06 | Toni Weinschenk | Method for identifying immunoreactive peptides |
| US6644103B1 (en) | 2002-10-24 | 2003-11-11 | Simmonds Precision Products, Inc. | Method and apparatus for detecting a dry/wet state of a thermistor bead |
| AU2003277610A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-06-07 | Shuichi Hanada | Method of examining cancer cells and reagent therefor |
| WO2005076009A2 (en) | 2004-01-28 | 2005-08-18 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method for identifying and quantifying of tumour-associated peptides |
| JP2008043332A (ja) * | 2006-08-17 | 2008-02-28 | Panomics Inc | 組織スライドからの核酸定量 |
| RS53782B1 (sr) * | 2008-10-01 | 2015-06-30 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Preparati tumor-asociranih peptida i odgovarajuća antikancerska vakcina za tretman glioblastoma (gbm) i drugih kancera |
| GB201004551D0 (en) * | 2010-03-19 | 2010-05-05 | Immatics Biotechnologies Gmbh | NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer |
| EP2697655A2 (en) | 2011-04-15 | 2014-02-19 | Micromass UK Limited | Method and apparatus for the analysis of biological samples |
| WO2012178030A2 (en) | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Applied Isotope Technologies, Inc. | Accurate measurement of glutathione for disease diagnosis and drug metabolite screening |
| US10077171B2 (en) * | 2012-10-17 | 2018-09-18 | Grant C. Chustz | Safety barrier for vehicles and cranes |
| GB201423361D0 (en) * | 2014-12-30 | 2015-02-11 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method for the absolute Quantification of naturally processed HLA-Restricted cancer peptides |
| DE102016115246C5 (de) * | 2016-08-17 | 2018-12-20 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Neue t-zellrezeptoren und deren verwendung in immuntherapie |
| KR20250052472A (ko) * | 2017-11-06 | 2025-04-18 | 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 | 신규 조작된 t 세포 수용체 및 이를 사용하는 면역 요법 |
-
2014
- 2014-12-30 GB GBGB1423361.3A patent/GB201423361D0/en not_active Ceased
-
2015
- 2015-12-15 MA MA41287A patent/MA41287B1/fr unknown
- 2015-12-15 KR KR1020177017911A patent/KR102336968B1/ko active Active
- 2015-12-15 MX MX2017008722A patent/MX383806B/es unknown
- 2015-12-15 PL PL15822924T patent/PL3241026T3/pl unknown
- 2015-12-15 HR HRP20210811TT patent/HRP20210811T1/hr unknown
- 2015-12-15 HU HUE15822924A patent/HUE054455T2/hu unknown
- 2015-12-15 SG SG11201703841VA patent/SG11201703841VA/en unknown
- 2015-12-15 PT PT158229245T patent/PT3241026T/pt unknown
- 2015-12-15 ES ES15822924T patent/ES2871035T3/es active Active
- 2015-12-15 CR CR20170297A patent/CR20170297A/es unknown
- 2015-12-15 AU AU2015373584A patent/AU2015373584B2/en active Active
- 2015-12-15 CN CN201580063711.6A patent/CN107003322B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2015-12-15 DK DK15822924.5T patent/DK3241026T3/da active
- 2015-12-15 US US14/969,423 patent/US10545154B2/en active Active
- 2015-12-15 LT LTEP15822924.5T patent/LT3241026T/lt unknown
- 2015-12-15 RS RS20210672A patent/RS61914B1/sr unknown
- 2015-12-15 JP JP2017521534A patent/JP6735741B2/ja active Active
- 2015-12-15 WO PCT/EP2015/079873 patent/WO2016107740A1/en not_active Ceased
- 2015-12-15 EP EP15822924.5A patent/EP3241026B1/en active Active
- 2015-12-15 BR BR112017008212-8A patent/BR112017008212B1/pt active IP Right Grant
- 2015-12-15 EA EA201791148A patent/EA036328B1/ru unknown
- 2015-12-15 CA CA2972306A patent/CA2972306C/en active Active
- 2015-12-15 PE PE2017000941A patent/PE20171136A1/es unknown
- 2015-12-15 MA MA40137A patent/MA40137B1/fr unknown
- 2015-12-15 TW TW104142137A patent/TWI632370B/zh not_active IP Right Cessation
- 2015-12-15 UA UAA201701977A patent/UA122774C2/uk unknown
- 2015-12-15 SG SG10201913988XA patent/SG10201913988XA/en unknown
- 2015-12-15 MY MYPI2017700825A patent/MY190199A/en unknown
- 2015-12-15 MD MDE20170252T patent/MD3241026T2/ro unknown
- 2015-12-15 SI SI201531612T patent/SI3241026T1/sl unknown
-
2017
- 2017-03-07 IL IL250982A patent/IL250982B/en active IP Right Grant
- 2017-03-07 ZA ZA2017/01646A patent/ZA201701646B/en unknown
- 2017-03-14 PH PH12017500483A patent/PH12017500483A1/en unknown
- 2017-04-28 CL CL2017001071A patent/CL2017001071A1/es unknown
- 2017-05-05 CO CONC2017/0004543A patent/CO2017004543A2/es unknown
-
2019
- 2019-11-15 US US16/685,765 patent/US11988669B2/en active Active
-
2021
- 2021-06-10 CY CY20211100514T patent/CY1124223T1/el unknown
-
2024
- 2024-04-18 US US18/638,970 patent/US20240280583A1/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011128448A1 (en) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Method for differentially quantifying naturally processed hla-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| & "Materials & Methods", 19 July 2014 (2014-07-19), XP055253353, Retrieved from the Internet: URL:http://www.sciencedirect.com/science/MiamiMultiMediaURL/1-s2.0-S1874391914003613/l-s2.0-S1874391914003613-mmcl.docx/276834/html/S1874391914003613/591921b7bebb581e48ldb9e08573089b/mmcl.docx [retrieved on 2016-02-26] cited in the application, page 6, line 92 - page 7, line 115, figures S2,S3 * |
| HASSAN CHOPIE; KESTER MICHEL G.D.; OUDGENOEG GIDEON; DE RU ARNOUD H.; JANSSEN GEORGE M.C.; DRIJFHOUT JAN W.; SPAAPEN ROBBERT M.; J: "Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes", JOURNAL OF PROTEOMICS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 109, 19 July 2014 (2014-07-19), AMSTERDAM, NL, pages 240 - 244, XP029080675, ISSN: 1874-3919, DOI: 10.1016/j.jprot.2014.07.009 * |
| SUSANN M�LLER, GERHARD NEBE-VON-CARON: "Functional single-cell analyses: flow cytometry and cell sorting of microbial populations and communities", FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS, vol. 34, no. 4, 1 July 2010 (2010-07-01), pages 554 - 587, XP055253409, DOI: 10.1111/j.1574-6976.2010.00214.x * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240280583A1 (en) | Method for the absolute quantification of naturally processed hla-restricted cancer peptides | |
| JP6010019B2 (ja) | がん、自己免疫および感染症の免疫療法開発用自然処理ｈｌａ制限ペプチドの特異的定量方法 | |
| Lhuillier et al. | Radiotherapy-exposed CD8+ and CD4+ neoantigens enhance tumor control | |
| Hilf et al. | Actively personalized vaccination trial for newly diagnosed glioblastoma | |
| Pritchard et al. | Exome sequencing to predict neoantigens in melanoma | |
| JP7668226B2 (ja) | Ｔ細胞組成物を調製するための組成物および方法、ならびにそれらの使用 | |
| JP2018530579A (ja) | ウイルス性癌ネオエピトープのための組成物および方法 | |
| US20230398218A1 (en) | Ras neoantigens and uses thereof | |
| HK1245889B (en) | Method for the absolute quantification of naturally processed hla-restricted cancer peptides | |
| HK1245889A1 (en) | Method for the absolute quantification of naturally processed hla-restricted cancer peptides | |
| WO2021046616A1 (en) | Methods of identifying mhc-bound peptides | |
| HK1180768A (en) | Method for differentially quantifying naturally processed hla-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development | |
| HK1180768B (en) | Method for differentially quantifying naturally processed hla-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development |