MD3241026T2 - Metodă pentru cuantificarea absolută a peptidelor de cancer restricționate de HLA procesate natural - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la o metodă de cuantificare absolută a peptidelor de cancer restricţionate de HLA procesate natural, adică determinarea numărului de copii ale peptidelor prezentate per celulă. Prezenta invenţie nu poate fi utilizată numai pentru dezvoltarea de terapii cu anticorpi sau vaccinuri peptidice, însă este, de asemenea, extrem de valoroasă pentru o imunomonitorizare definită molecular şi este utilă în procesele de identificare a unor noi antigeni peptidici pentru strategii imunoterapeutice, cum ar fi vaccinurile respective, terapii bazate pe anticorpi sau abordări privind transferul adoptiv de celule T în cancer, boli infecţioase şi/sau boli autoimune.

Description

Prezenta invenţie se referă la o metodă de cuantificare absolută a peptidelor de cancer restricţionate de HLA procesate natural, adică determinarea numărului de copii ale peptidelor prezentate per celulă. Prezenta invenţie nu poate fi utilizată numai pentru dezvoltarea de terapii cu anticorpi sau vaccinuri peptidice, însă este, de asemenea, extrem de valoroasă pentru o imunomonitorizare definită molecular şi este utilă în procesele de identificare a unor noi antigeni peptidici pentru strategii imunoterapeutice, cum ar fi vaccinurile respective, terapii bazate pe anticorpi sau abordări privind transferul adoptiv de celule T în cancer, boli infecţioase şi/sau boli autoimune.

Domeniul invenţiei

Dezvoltarea imunoterapeuticii anticanceroase şi a imunoterapiilor pentru boli autoimune şi infecţioase care vizează inducerea braţului de celule T al sistemului imunitar pentru a lupta împotriva cancerului ar putea fi îmbunătăţită substanţial printr-o cunoaştere profundă a nivelurilor de prezentare ale peptidelor legate de antigenul leucocitar uman (HLA) pe ţesuturi bolnave primare. Aceste informaţii sunt relevante pentru terapii bazate pe anticorpi sau vaccinuri peptidice în special, precum şi pentru orice alt tip de vaccin cu celule T bazat pe entităţi moleculare precum proteine, ADN sau ARN. Acest tip de date cantitative nu a fost disponibil anterior pentru ţesut derivat de la pacient pe o copie absolută per scară celulară.

O metodă de identificare a peptidelor precum cea de mai sus, care evită problema asociată cu „imunologia inversă» a fost descrisă în EP1508047B1. După cum s-a descris mai sus, această metodă nu poate fi utilizată pentru cuantificarea peptidelor menţionate. O altă metodă care utilizează o strategie de marcare a fost descrisă în WO 2005/076009, care a permis o anumită cuantificare, însă nu la o scară absolută. Au fost descrişi alţi marcatori, de exemplu, în WO 03/025576 sau de către Martin et al. în Proteomics 2003, 3, 2208-2220.

O altă metodă a fost descrisă de Fortier et al. (The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome, JEM, Vol.205, No. 3, March 17, 2008, 595-610). Această metodă are dezavantajul că necesită disecţia peptidelor legate de MHC din peptidele care nu se leagă de MHC datorită eluţiei acide. Aceasta se realizează folosind linii celulare b2m-knockout: Astfel, această metodă nu poate fi utilizată pentru materialele primare tumorale de la pacient. În metodă, timocitele murine primare au fost comparate cu linia celulară murină EL4. Cantităţile iniţiale au fost ajustate prin măsurarea moleculelor MHC I. Acest lucru în sine este o restricţie puternică a metodei descrisă de Fortier et al. Mai mult, nu a fost aplicată o normalizare, aşa cum ar fi necesară pentru ţesuturi primare de diferite dimensiuni şi origine tisulară. În schimb, s-au folosit materiale de pornire echilibrate, normalizarea devenind depăşită. Cu toate acestea, normalizarea este absolut necesară pentru materialele primare (de la pacient).

WO2011/128448 descrie o metodă pentru identificarea cantitativă a antigenilor peptidici legaţi de HLA relevante din probe de ţesut primar la scară largă, fără abordări de marcare. Metoda cuprinde etapele de furnizare a cel puţin unui eşantion de ţesut primar bolnav şi a cel puţin unui eşantion de ţesut primar sănătos, de preferinţă corespunzător ţesutului bolnav, prin izolarea liganzilor peptidici MHC din eşantioanele menţionate, efectuarea unei analize HPLC-MS pe peptidele ligand MHC menţionate, extragerea (zonei) de intensitate a semnalului ionic precursor pentru fiecare semnal, aşa cum rezultă din analize, identificarea secvenţelor peptidelor ligand MHC menţionate şi a paşilor de normalizare şi paşilor de control al calităţii datelor pentru a cuantifica relativ liganzii peptidici MHC menţionaţi fără marcare.

Hassan et al. (în: Hassan C, et al, Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes, J Prot (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.07.009) descriu o abordare în care se prepară monomeri peptidă-MHC (hpMHC) marcaţi cu izotopi şi aceştia se adaugă direct după liza celulară, adică înainte de procesarea obişnuită a eşantionului. Folosindu-se această abordare, se pot lua în considerare toate pierderile din timpul procesării eşantionului şi se permite determinarea exactă a liganzilor specifici prezentaţi de MHC de clasă l. Studiul identifică precis etapa de imunopurificare ca fiind originea pierderilor destul de extreme în timpul pretratării eşantionului şi oferă o soluţie pentru luarea în considerare a acestor pierderi. Strategia prezentată poate fi utilizată pentru a obţine o imagine fiabilă a numărului de copii ale epitopului şi, deci, se consideră că permite îmbunătăţirea designului vaccinului şi a strategiilor pentru imunoterapie.

Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei.8 Descoperirea existenţei antigenilor asociaţi tumorilor şi bolilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent, imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de valorificare a ambelor componente, umorală şi celulară, ale sistemului imunitar.

Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T citotoxice (CTL) din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. Celule T CD8-positive (T-CD8+) în special, care recunosc peptide legate de molecule de clasă I ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Aceste peptide, de obicei de 8 până la 12 reziduuri aminoacidice, sunt derivate din proteine sau produse ribozomale defecte (DRIPS) localizate în citosol şi joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate, de asemenea, ca antigeni leucocitari umani (HLA).

Există două clase de molecule MHC: moleculele MHC de clasă I, care se pot găsi pe majoritatea celulelor care prezintă un nucleu. Moleculele MHC sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2 microglobuline (receptori MHC de clasă I) sau, respectiv, dintr-un lanţ alfa şi un lanţ beta (receptori MHC de clasă II). Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, DRIP şi peptide mai mari. Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC prin endocitoză şi care sunt procesate ulterior. Complexele de peptide şi moleculele MHC de clasă I sunt recunoscute de limfocitele T citotoxice CD8-pozitive purtătoare de TCR (receptor de celule T) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR adecvat. Este bine cunoscut faptul că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1.

Pentru ca o peptidă să declanşeze (inducă) un răspuns imun celular, trebuie să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu incizura de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un motiv de legare care controlează capacitatea peptidei de a se lega specific la incizura de legare.

În cazul reacţiile imune dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR).

Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T citotoxice specifice tumorii, adică epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt reglate pozitiv în celulele respectivei tumori.

Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii sau bolii cuprinde următoarele grupe principale:

Antigeni de cancer testicular: primii TAA [antigeni asociaţi tumorii; antigenii asociaţi bolii sunt abreviaţi DAA] identificaţi vreodată care pot fi recunoscuţi de către celulele T aparţin acestei clase şi au fost denumiţi iniţial antigeni de cancer testicular (CT), deoarece exprimarea membrilor clasei se face în diferite tumori umane diferite din punct de vedere histologic şi, la nivelul ţesuturilor naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, în placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic specifice tumorii. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE sau NY-ESO-1.

Antigeni de diferenţiere: aceste TAA sunt împărţite între tumori si ţesuturi normale din care provin tumorile; majoritatea sunt identificate în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine derivate din melanocite sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scală largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic.

TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu niveluri reduse de exprimare. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1.

Antigeni specifici tumorii: Aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori.

TAA-uri care apar prin modificări anormale post-translaţie: Aceste TAA pot apărea din proteine care nu sunt nici specifice, nici supraexprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii.

Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical.

Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T citotoxice ca antigeni specifici tumori sau asociaţi tumorii ori antigeni specifici bolii sau asociaţi bolii şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat în principal de celule tumorale sau celule infectate şi deloc sau numai în cantităţi comparativ mici de ţesuturi sănătoase normale, de exemplu mai puţin cu factorul 5, 10 sau mai mult.

În bolile infecţioase există două posibilităţi: în primul rând, celulele infectate exprimă un antigen care nu este exprimat de celule sănătoase - asociat direct cu infecţia - sau celulele infectate supraexprimă un antigen exprimat numai în cantităţi foarte mici de celule sănătoase - supraexprimarea a unui antigen găsit în mod normal în peptidomul unei celule sănătoase.

Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, infecţie sau tulpină şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii şi antigenii specifici bolii sau asociaţi bolii sunt adesea derivaţi din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorală/infectată datorită unei funcţii, de exemplu în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei.

În cazul cancerului, ţintele suplimentare din aval ale proteinelor care cauzează direct o transformare pot fi reglate în sens crescător şi, prin urmare, pot fi asociate indirect tumorii. Aceşti antigeni asociaţi indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer Immunol. Immunother. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). În ambele situaţii este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului, deoarece această peptidă („peptidă imunogenă») derivată din antigenul asociat tumorii sau asociat bolii trebuie să inducă un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T.

În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule cu TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop.

Prin urmare TAA şi DAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unui vaccin tumoral. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA şi DAA sunt bazate pe utilizarea de CTL care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri de transcripţie diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale.

Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Este prin urmare important să se selecţioneze numai acele peptide ale proteinelor supra-exprimate sau exprimate selectiv care sunt prezente in conexiune cu moleculele MHC împotriva cărora se pot identifica celule T funcţionale. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efectoare („celule T efectoare»).

Celulele T helper joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea anti-tumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8-pozitive, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel, epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, pot servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imun anti-tumoral.

Cunoaşterea numărului exact de copii ale liganzilor HLA de clasă I sau de clasă II prezentaţi este importantă în imunologia fundamentală şi clinică. În prezent, cele mai bune determinări ale numărului de copii se bazează pe spectrometria de masă, utilizând monitorizarea reacţiei unice (SRM) în combinaţie cu o cantitate cunoscută de peptidă marcată izotopic. Totuşi, aceste abordări nu sunt încă suficient de precise pentru a putea fi utilizate în mod eficient în abordările de mai sus.

Având în vedere cele de mai sus, prin urmare, obiectivul prezentei invenţii este de a furniza o metodă pentru determinarea absolută a numerelor de copii ale liganzilor HLA de clasă I sau de clasă II prezentaţi care să fie precisă, eficientă, uşor de manipulat şi, de asemenea, care poate fi efectuată la un nivel de „randament ridicat». Alte obiecte şi avantaje ale prezentei invenţii vor deveni cu uşurinţă evidente pentru specialist atunci când studiază următoarea descriere, aşa cum este furnizată.

Într-un prim aspect al prezentei invenţii, obiectul invenţiei este rezolvat printr-o metodă de cuantificare absolută a unui ligand peptidic MHC pe o celulă, respectiva metodă cuprinzând

a) prepararea de celule care prezintă ligandul peptidic MHC menţionat dintr-un eşantion biologic

selectat dintr-un eşantion de ţesut, un eşantion de sânge, un eşantion tumoral sau un eşantion de ţesut infectat care cuprinde celulele menţionate, cuprinzând digestia enzimatică a ţesuturilor şi/sau liza celulară,

b) determinarea numărului de celule al preparatului menţionat la pasul a) cuprinzând o metodă selectată din numărarea nucleilor celulari, determinarea fotometrică a ADN-ului, determinarea fluorimetrică a ADN-ului sau PCR-ul cantitativ, c) adăugarea unei cantităţi cunoscute de ligand peptidă-MHC şi/sau de complex peptidă-MHC pentru a fi cuantificată la preparatul menţionat la pasul a) direct după omogenizarea ţesutului („adiţionare I»), d) izolarea ligandului peptidic MHC din preparatul menţionat la pasul c) pentru a obţine un eluat peptidic, e) adăugarea unei cantităţi cunoscute de cel puţin un ligand peptidic MHC pentru a fi cuantificat la eluatul peptidic menţionat („adiţionare II») drept calibrant intern, f) efectuarea unei analize de spectrometrie de masă pe respectivul ligand peptidic MHC

pentru a genera

aa) un semnal pentru eficienţa izolării de la pasul d),

bb) un semnal pentru calibrantul intern de la pasul e),

şi

cc) semnalul pentru respectivul ligand peptidic MHC din respectivele celule preparate la pasul a) şi

g) cuantificarea ligandului peptidic MHC menţionat pe baza unei comparări a semnalelor obţinute la pasul f) cu

aa) numărul de celule obţinut,

bb) cantitatea cunoscută de ligand peptidă-MHC şi/sau complex de ligand peptidă-MHC menţionat pentru a fi cuantificată ca adăugată la pasul c) şi

cc) cantitatea cunoscută de cel puţin un ligand peptidic MHC care urmează să fie cuantificată ca adăugată la pasul e), în care cuantificarea cuprinde calcularea unui raport între semnalul calibrantului intern de la pasul e) şi semnalul ligandului peptidic MHC izolat şi compararea raportului cu o curbă de calibrare stabilită a ligandului peptidic MHC şi în care cuantificarea cuprinde în continuare generarea unei curbe de calibrare specifice peptidei bazate pe un raport cu calibrantul intern utilizat la aceeaşi cantitate şi determinarea celui mai scăzut nivel de cuantificare (LLOQ) pentru ca respectivul ligand peptidic MHC să fie cuantificat, prin care se realizează o cuantificare absolută a ligandului peptidic MHC pe o celulă pentru ligandul peptidic MHC dacă acea cantitate cuantificată este peste LLOQ, aşa cum a fost determinat.

Într-o metodă în conformitate cu prezenta invenţie, în care mai multe eşantioane sunt analizate în paralel, pasul c) de mai sus poate fi omis odată ce eficienţa de izolare a fost stabilită, deoarece eficienţa pentru un eşantion poate fi utilizată pentru a estima eficienţa izolării pentru un al doilea ligand peptidic MHC şi/sau complex de ligand peptidic MHC (adică poate fi utilizat ca valoare de referinţă încrucişată).

Metoda utilizează semnalul obţinut de la calibrarea internă (adiţionare II) în e) ca o referinţă (de control) constantă şi păstrată pentru semnalul obţinut de la cel puţin un ligand peptidic MHC prin calcularea unui raport între aceste două semnale. Acest raport este comparat cu curba de calibrare stabilită, care include, de asemenea, calibrantul intern în aceeaşi cantitate, de preferinţă utilizându-se o parte alicotă identică a unui astfel de calibrant intern. Curba de calibrare descrie apoi relaţia dintre aceste rapoarte şi cantităţile de peptidă. Vezi şi Figura 3 şi legenda acesteia.

În mod surprinzător, în contextul prezentei invenţii, inventatorii au constatat că, prin combinarea paşilor de analiză de mai sus, pentru prima dată devine posibilă cuantificarea absolută directă a nivelurilor de peptide restricţionate de MHC, de preferinţă restricţionate de HLA, pe cancer sau alte ţesuturi infectate, în comparaţie cu diferite ţesuturi necanceroase sau ţesuturi neinfectate şi organe neinfectate.

În contextul prezentei invenţii, „adiţionare» se referă la adăugarea unei cantităţi sau concentraţii cunoscute de cel puţin un ligand peptidic MHC cunoscut, de exemplu ligand peptidic MHC nelegat („liber»), pentru a fi cuantificat la un eşantion, cum ar fi, de exemplu , un preparat (denumit aici „adiţionare I») sau un eluat peptidic (denumit aici „adiţionare II»). Cantităţile/concentraţiile de peptidă (peptide) care trebuie adăugate pot fi uşor ajustate şi depind, cel puţin parţial, de eşantionul care trebuie adiţionat şi de metoda utilizată pentru analiză.

Este preferată o metodă în conformitate cu prezenta invenţie în care cel puţin un ligand peptidic MHC este selectat dintre o peptidă asociată tumorii (TAA) sau o peptidă asociată bolii (DAA).

În metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care respectivul eşantion biologic cuprinzând celule este selectat dintr-un eşantion de ţesut, un eşantion de sânge, un eşantion de tumoare sau un eşantion de ţesut infectat. În contextul prezentei invenţii, eşantioanele care sunt derivate direct de la subiecţi, de exemplu pacienţi, sunt denumite eşantioane „primare», cum ar fi eşantioanele primare de ţesut sau de tumoare, spre deosebire de eşantioanele de linii celulare, cum ar fi, de exemplu, liniile celulare tumorale stabilite. Probele pot fi proaspete sau conservate (de exemplu, congelate sau preparate), atât timp cât sunt adecvate pentru metoda în conformitate cu invenţia. De preferat este un eşantion biologic care nu include linii celulare permanente.

Ca exemplu preferat, seturile de peptide HLA din eşantioanele de ţesut (primar) congelat prin şoc pot fi obţinute prin precipitarea imună din ţesuturi solide utilizându-se, de exemplu, anticorpul HLA-A, -B, -C-specific w6/32 sau anticorpul HLA-A*02-specific BB7.2 cuplat cu sefaroză CNBr-activată, urmată de tratament acid şi ultrafiltrare. Pentru diferite alele HLA pot fi utilizaţi alţi anticorpi cunoscuţi în domeniu, deoarece există, de exemplu, GAP-A3 pentru A*03, B1.23.2 pentru alele B. Există metode corespunzătoare pentru a obţine peptide MHC de clasă I pentru alte mamifere care sunt bine cunoscute în domeniu.

Metoda în conformitate cu invenţia poate fi utilizată, de asemenea, în contextul bolilor infecţioase, cum ar fi infecţiile virale sau bacteriene, de exemplu febra dengue, Ebola, virusul Marburg, tuberculoza (TB), meningita sau sifilisul; de preferat, metoda este utilizată pe tulpini de organisme infecţioase rezistente la antibiotice, boli autoimune, cum ar fi artrita, infecţii parazitare, cum ar fi malaria şi alte boli, cum ar fi MS şi boala Parkinson, atât timp cât fragmentul vizat este o peptidă legată de MHC de clasă I.

Exemple pentru boli autoimune (inclusiv boli care nu sunt declarate oficial boli autoimune) sunt boala pulmonară obstructivă cronică, spondilita anchilozantă, boala Crohn (unul dintre cele două tipuri de boală intestinală inflamatorie („IBD») idiopatică), dermatomiozita, diabetul zaharat de tip 1, endometrioza, sindromul Goodpasture, boala Graves, sindromul Guillain-Barre (GBS), boala Hashimoto, hidradenita supurativă, boala Kawasaki, nefropatia IgA, purpura trombocitopenică idiopatică, cistita interstiţială, lupusul eritematos, boala mixtă a ţesutului conjunctiv, morfeea, miastenia gravă, narcolepsia, neuromiotonia, pemfigus vulgar, anemia pernicioasă, psoriazisul, artrita psoriazică, polimiozita, ciroza biliară primară, policondrita recidivantă, poliartrita reumatoidă, schizofrenia, sclerodermia, sindromul Sjogren, sindromul persoanei rigide, arterita temporală (arterita cu celule gigante), colita ulcerativă (unul dintre cele două tipuri de boală intestinală inflamatorie („IBD») idiopatică), vasculita, vitiligo şi granulomatoza Wegener.

Prezenta invenţie nu se limitează la bolile umane, ci poate fi utilizată pentru mamifere, de exemplu vaci, porci, cai, pisici, câini, rozătoare (şobolani, şoareci), capre şi alte animale domestice.

Metoda în conformitate cu prezenta invenţie cuprinde prepararea celulelor cu, cel puţin parţial, digestie enzimatică a ţesuturilor şi/sau liză celulară.

Numărul de celule se determină utilizându-se o metodă selectată din numărarea nucleilor celulari, determinarea fotometrică a ADN-ului, determinarea fluorimetrică a ADN-ului (cum ar fi, de exemplu, utilizându-se tehnologia Qubit®) şi PCR-ul cantitativ.

Preferată este şi o metodă în conformitate cu prezenta invenţie care cuprinde în plus determinarea cantităţii de cel puţin un tip de moleculă HLA în prepararea menţionată de la pasul a). Determinarea cantităţii se poate face utilizând metode comune în domeniu, cum ar fi metodele care implică anticorpi specifici, de exemplu într-un ELISA, geluri, sortare celulară şi/sau cromatografie.

Preferată este şi o metodă în conformitate cu prezenta invenţie în care cel puţin un complex peptidă-MHC ca adăugat şi/sau cel puţin un ligand peptidic MHC ca adăugat sunt marcate şi, de preferinţă, sunt marcate diferenţial. Marcatorii respectivi sunt cunoscuţi specialiştilor în domeniu şi includ marcatori izotopici, marcatori radioactivi şi neradioactivi, enzime şi alte grupuri de mase preferabil diferite. De preferinţă, marcarea este specifică pentru peptidele specifice care trebuie cuantificate. Cel mai preferat este un TAA/TUMAP dublu marcat, de exemplu în situaţii în care sunt necesare două adiţionări marcate diferenţial în acelaşi experiment (vezi exemplele de mai jos).

Este preferată o metodă în conformitate cu prezenta invenţie în care izolarea cuprinde cromatografie, cum ar fi cromatografia de afinitate. Astfel, liganzii MHC/HLA izolaţi pot fi separaţi în funcţie de hidrofobia lor prin cromatografie în fază inversă (de exemplu, sistemul nanoAcquity UPLC, Waters) urmată de detectarea într-un spectrometru de masă hibrid Orbitrap (ThermoElectron). Fiecare eşantion se analizează, de preferinţă, prin achiziţie de rulări LCMS replicate (de exemplu). Datele LCMS se procesează apoi prin analiza datelor Tandem-MS (MS/MS).

Spectrele tandem-MS înregistrate într-un mod ţintit, concentrându-se pe valorile m/z ale peptidelor care urmează a fi cuantificate, se evaluează, de preferinţă, de un software care extrage intensităţile ionilor fragmentari preselectaţi ai tranziţiilor predefinite. Un exemplu de astfel de software este Skyline (MacLean B et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 2010 Apr 1; 26(7):966-8., http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq054), o aplicaţie pentru analiza datelor de spectrometrie de masă ale experimentelor de achiziţie independentă de date (DIA) pentru monitorizarea reacţiilor paralele (MS/MS ţintit PRM). Acest software poate fi utilizat în ceea ce priveşte peptida marcată cu izotop coeluant în scopuri de specificitate, precum şi pentru a extrage intensităţile de tranziţie unice pentru procesare ulterioară.

Comparabilitatea grupelor peptidice restricţionate la aceeaşi alelă HLA între eşantioane diferite este posibilă pe baza unui anticorp alelă-specific comun utilizat pentru purificare, dacă este disponibil, sau, alternativ, pe baza atribuirii de secvenţe alelelor HLA comune prin intermediul modelelor de aminoacizi ancoră.

Din motive statistice, este preferată o metodă în conformitate cu prezenta invenţie în care se efectuează cel puţin două rulări de spectrometrie de masă replicate pentru fiecare cel puţin o peptidă ligand MHC.

Astfel, încă un alt aspect al prezentei invenţii se referă la o metodă în conformitate cu prezenta invenţie care cuprinde în plus selectarea de liganzi peptidici MHC suprareprezentaţi, supraexprimaţi şi/sau specifici tumorii pentru analiză.

Încă un alt aspect al prezentei invenţii se referă la o metodă în conformitate cu prezenta invenţie în care metoda menţionată este capabilă de a fi realizată sau este realizată pe o bază de randament ridicat, de preferinţă analizarea în paralel a 50 până la 100 de liganzi peptidici.

Într-o altă concretizare preferată a metodei în conformitate cu prezenta invenţie, paşii metodei menţionate se efectuează în ordinea indicată în revendicările anexate sau ca mai sus. Într-o altă concretizare preferată a metodei în conformitate cu prezenta invenţie, respectiva metodă constă din paşii indicaţi mai sus şi aici.

Într-o altă concretizare preferată a metodei în conformitate cu prezenta invenţie, respectiva metodă se referă la terapia şi diagnosticul personalizate. Pentru aceasta, eşantionul (eşantioanele) analizate este (sunt) derivat(e) de la un individ sau dintr-un grup de indivizi care suferă de aceeaşi afecţiune descrisă aici. De asemenea, se poate genera un profil de ligand MHC personalizat, de preferinţă un profil de ligand MHC cuantificat personalizat specific bolii, pe baza liganzilor peptidici MHC menţionaţi cuantificaţi pe baza metodei în conformitate cu prezenta invenţie, aşa cum este descrisă aici.

Cel mai preferabil, metoda în conformitate cu prezenta invenţii se realizează in vitro.

Este descrisă o metodă care cuprinde în plus etapa de sintetizare, de preferinţă sintetizare chimică, a respectivului ligand peptidic MHC cuantificat, prin metoda menţionată, pe un sintetizator sau manual. Este descrisă o metodă pentru prepararea unei peptide imunoreactive cu care o peptidă este cuantificată conform metodei descrise şi peptida menţionată este sintetizată chimic in vitro sau in vivo. Peptidele pot fi preparate prin legare chimică a aminoacizilor prin metode standard cunoscute în domeniu.

Peptidele pot fi preparate in vitro, de exemplu în sisteme fără celule, şi in vivo, utilizându-se celule. Peptidele pot fi formulate conform descrierii din, de exemplu, EP2111867 (Lewandrowski et al.).

Este descrisă o metodă în care se efectuează un pas suplimentar, în care se detectează prezenţa limfocitelor T. Folosind această metodă, este posibil să se detecteze în mod specific în ce măsură limfocitele T ţintite către peptidele izolate şi identificate sunt preexistente la pacienţi. Prin efectuarea acestui pas este posibil să se aplice sub formă de vaccin numai acele peptide împotriva cărora limfocitele T sunt deja preexistente la pacienţi. Peptidele pot fi apoi utilizate pentru a activa aceste limfocite T specifice.

Este descrisă o metodă în care detectarea limfocitelor T preexistente specifice se realizează prin marcarea leucocitelor cu complexe reconstituite de molecule prezentatoare de antigen şi peptida antigenică.

Este descrisă o metodă în care metoda menţionată exclude, în plus, utilizarea de celule, linii celulare sau celule animale knock-out.

Este descris un control automat al calităţii bazat pe molecule adiţionate în eşantioane în cantităţi definite.

Cu metoda descrisă, este posibil, de asemenea, să se identifice peptidele specifice pacientului, adică este posibil să se potrivească cu precizie peptidele care urmează a fi utilizate ca vaccin la pacient pentru a induce un răspuns imun specific.

În prezenta descriere, invenţia este descrisă folosindu-se ca exemplu cancerul. Cu toate acestea, metoda inventivă se poate aplica şi pentru boli infecţioase, boli autoimune şi infecţii parazitare, atât timp cât răspunsul imun respectiv implică MHC de clasă I.

Invenţia va fi descrisă în continuare în exemplele următoare, fără a se limita, totuşi, la acestea. În figurile însoţitoare şi lista de secvenţe,

Figura 1 prezintă o imagine de ansamblu schematică asupra abordării experimentale în conformitate cu prezenta invenţie.

Figura 2 arată o analiză MS comparativă a unui amestec TUMAP cu 10 fmol per TUMAP din Tabelul 1. Fiecare peptidă are ca rezultat un semnal MS diferit care arată detectabilitatea dependentă de peptidă. Peptida 5 nu este enumerată în Tabelul 1, adică secvenţele 1-4 din Tabelul 1 corespund cu numerele 1-4 din Figura 2, iar secvenţele 5-11 din Tabelul 1 corespund cu numerele 6-12 din Figura 2.

Mai mult, peptidele 19, 21 şi 22 din Figura 2 nu sunt enumerate în Tabelul 2, adică secvenţele 13-18 din Figura 2 corespund cu numerele 12-17 din Tabelul 2, secvenţa 20 din Figura 2 corespunde cu numărul 18 din Tabelul 2, iar secvenţele 23-28 din Figura 2 corespund cu numerele 19-24 din Tabelul 2.

Figura 3 arată principiul metodei standard interne. Este generată o curbă de calibrare prin titrarea unei versiuni marcate cu izotop (reprezentată cu gri deschis) a TUMAP. Pentru toate măsurătorile MS, o cantitate constantă de altă versiune marcată cu izotop a peptidei standard interne TUMAP (reprezentată cu gri închis) este adiţionată în eşantioanele MS. Este calculată o funcţie de curbă de calibrare din raportul semnalelor MS prin regresie logistică. LLOQ este definit prin examinare vizuală şi luând în considerare abaterea de la liniaritate. „Eşantioanele de cuantificare» (reprezentate cu verde) reprezintă intensităţile semnalului măsurate în eşantioane tumorale selectate pentru cuantificarea absolută a numerelor de TUMAP.

Figura 4 arată curbe de calibrare ale TUMAP-urilor HLA-A*02 selectate pentru cuantificare absolută. Rezultatele SM ale TUMAP-urilor respective în eşantioanele de ţesut tumoral utilizate pentru analiza numerelor absolute de TUMAP-uri per celulă („eşantioane de cuantificare») sunt incluse în fiecare diagramă.

Figura 5 arată curbe suplimentare de calibrare ale TUMAP-urilor HLA-A*02 selectate pentru cuantificare absolută. Rezultatele SM ale TUMAP-urilor respective în eşantioanele de ţesut tumoral utilizate pentru analiza numerelor absolute de TUMAP per celulă („eşantioane de cuantificare») sunt incluse în fiecare diagramă.

Figura 6 arată curbe de calibrare ale TUMAP-urilor HLA-A*24 selectate pentru cuantificare absolută. Rezultatele SM ale TUMAP-urilor respective în eşantioanele de ţesut tumoral utilizate pentru analiza numerelor absolute de TUMAP per celulă („eşantioane de cuantificare») sunt incluse în fiecare diagramă.

Figura 7 arată curbe suplimentare de calibrare ale TUMAP-urilor HLA-A*24 selectate pentru cuantificare absolută. Rezultatele SM ale TUMAP-urilor respective în eşantioanele de ţesut tumoral utilizate pentru analiza numerelor absolute de TUMAP per celulă („eşantioane de cuantificare») sunt incluse în fiecare diagramă.

Figura 8 arată variaţia estimată a măsurătorilor MS replicate pentru toate TUMAP-urile analizate. Fiecare punct reprezintă coeficientul de variaţie (CV în %) pentru măsurătorile MS replicate pentru un TUMAP individual într-un eşantion de ţesut specific. Mediana valorilor CV pentru toate TUMAP-urile este considerată o variaţie medie a măsurătorilor MS replicate.

Figura 9 arată eficienţa izolării pentru peptide-MHC. Eficienţa izolării pentru peptide-MHC a fost determinată în opt eşantioane A*02-pozitive pentru TUMAP-uri A*02 (A) şi în şase eşantioane A*24-pozitive pentru TUMAP-uri A*24 (B). Eficienţa izolării variază în medie cu 24% pentru TUMAP-urile A*02 şi, respectiv, cu 32% pentru TUMAP-urile A*24 (C).

Figura 10 prezintă metodele de evaluare a analizei conţinutului de ADN. A. Comparaţie a trei metode diferite pentru interpolarea unui număr de celule dintr-o anumită cantitate de ADN: folosind o curbă standard pregătită din linii celulare tumorale (gri închis), din PBMC de la donatori sănătoşi (gri) şi folosind greutatea teoretică a unui genom diploid uman (gri deschis). Replicile biologice, adică preparate de lizate tisulare independente din diferite părţi ale aceleiaşi tumori, sunt evidenţiate cu gri. B. Diagrama curbei standard PBMC, care a fost utilizată pentru a determina numărul total de celule ale eşantioanelor de ţesut analizate în cuantificarea absolută a TUMAP-urilor.

Figura 11 arată determinarea numărului de celule din eşantioane de ţesut solide, congelate. Analiza numărului de celule a eşantioanelor tumorale A*02-pozitive şi A*24-pozitive (A) şi variaţia estimată a analizei numărului de celule (B). Replicile biologice sunt evidenţiate cu gri.

Figura 12 arată rezultate pentru copii peptidice per celulă pentru TUMAP-uri HLA-A*02. Au fost analizate opt tumori de GC (cancer gastric) diferite, trei dintre ele în duplicate (duplicatele biologice sunt grupate şi evidenţiate cu gri). LLOQ se referă la intervalul de cuantificare într-un experiment MS şi este extrapolat la un LLOQ specific eşantionului şi specific TUMAP, adică cel mai mic număr de copii cuantificabil într-un eşantion specific pentru un TUMAP specific (descris cu gri).

Figura 13 arată rezultate suplimentare pentru copii peptidice per celulă pentru TUMAP-uri HLA-A*02. Au fost analizate opt tumori de cancer gastric diferite, trei dintre ele în duplicate (duplicatele biologice sunt grupate şi evidenţiate cu gri). LLOQ se referă la intervalul de cuantificare într-un experiment MS şi este extrapolat la un LLOQ specific eşantionului şi specific TUMAP, adică cel mai mic număr de copii cuantificabil într-un eşantion specific pentru un TUMAP specific (descris cu gri).

Figura 14 arată rezultate pentru copii peptidice per celulă pentru TUMAP-uri HLA-A*24. Au fost analizate şase tumori de cancer gastric diferite, trei dintre ele în duplicate (duplicatele biologice sunt grupate şi evidenţiate cu gri). LLOQ se referă la intervalul de cuantificare într-un experiment MS şi este extrapolat la un LLOQ specific eşantionului şi specific TUMAP, adică cel mai mic număr de copii cuantificabil într-un eşantion specific pentru un TUMAP specific (descris cu gri).

Figura 15 arată rezultate suplimentare pentru copii peptidice per celulă pentru TUMAP-uri HLA-A*24. Au fost analizate şase tumori de cancer gastric diferite, trei dintre ele în duplicate (duplicatele biologice sunt grupate şi evidenţiate cu gri). LLOQ se referă la intervalul de cuantificare într-un experiment MS şi este extrapolat la un LLOQ specific eşantionului şi specific TUMAP, adică cel mai mic număr de copii cuantificabil într-un eşantion specific pentru un TUMAP specific (descris cu gri).

Figura 16 arată testarea unei influenţe a adiţionării probelor folosindu-se 500 fmol de peptide libere în preparatul de monomer MHC/peptidă. Peptida liberă din analiză nu are o influenţă substanţială pentru peptidele indicate.

Figura 17 arată rezultatele testelor pentru reproductibilitatea izolării ADN-ului utilizându-se Qubit HS (fluorescenţă) în raport cu o curbă standard. Eşantioanele (eşantioane de cancer, cum ar fi NSCLC (cancer pulmonar non-microcelular)) arată omogenitate suficientă. ADN-ul a fost izolat din părţi alicote de 3 x 50 µl.

SEQ ID NO 1-24 prezintă peptidele din Tabelul 1 şi Tabelul 2 care au fost selectate pentru cuantificare absolută conform exemplelor.

Exemple:

Următoarele exemple descriu metoda inventivă în contextul TAA-uri/cancer. Invenţia nu se limitează la exemple, deoarece acestea sunt doar o variantă concretizată a invenţiei.

Tabelul 1: TUMAP-uri HLA-A*02 selectate pentru cuantificare absolută

Au fost selectate unsprezece peptide pentru cuantificare absolută.

Nr. Cod peptidă Secvenţă 1 IGF2BP3-001 KIQEILTQV 2 FAP-003 YVYQNNIYL 3 COL12A1-002 FLVDGSWSV 4 MXRA5-001 TLSSIKVEV 5 NCAPG-001 YLLSYIQSI 6 COL6A3-002 FLLDGSANV 7 WNT5A-001 AMSSKFFLV 8 F2R-001 TLDPRSFLL 9 HIF1A-001 ALDGFVMVL 10 MET-001 YVDPVITSI 11 CCNB1-002 ILIDWLVQV

Tabelul 2: TUMAP-uri HLA-A*24 selectate pentru cuantificare absolută

Au fost selectate paisprezece peptide pentru cuantificare absolută. Proprietăţile unei peptide (PLK4-001) s-au dovedit a fi inadecvate pentru alte experimente. Pentru restul de 13 peptide au fost finalizat experimente de cuantificare absolută.

Nr. Cod peptidă Secvenţă 12 ASPM-002 SYNPLWLRI 13 SLC6A6-001 VYPNWAIGL 14 MMP3-001 VFIFKGNQF 15 CDC2-001 LYQILQGIVF 16 PLK4-001 QYASRFVQL 17 ASPM-001 RYLWATVTI 18 ATAD2-002 KYLTVKDYL 19 KIF2C-001 IYNGKLFDLL 20 MET-006 SYIDVLPEF 21 AVL9-001 FYISPVNKL 22 PPAP2C-001 AYLVYTDRL 23 UCHL5-001 NYLPFIMEL 24 UQCRB-001 YYNAAGFNKL

Cuantificarea copiilor de TUMAP per celulă în eşantioane tumorale solide necesită (sub)cuantificarea

a) TUMAP-ului izolat, b) pierderea TUMAP-ului în timpul izolării şi c) numărul de celule din eşantionul de ţesut analizat. O imagine de ansamblu a abordării experimentale în conformitate cu prezenta invenţie este dată în Figura 1.

Cuantificarea peptidelor prin nanoLC-MS/MS

Pentru o cuantificare precisă a peptidelor prin spectrometrie de masă (MS), sunt necesare mai întâi cunoştinţele de bază despre corelaţia specifică peptidelor dintre cantitatea de peptide şi semnalul MS. De exemplu, măsurarea prin MS a unui amestec de peptide cu 10 fmol per peptidă arată că există diferenţe mari specifice peptidelor în semnalul MS (Figura 2). Acest lucru implică, de asemenea, că intervalul în care o peptidă poate fi cuantificată în mod fiabil prin MS depinde de caracteristicile individuale ale peptidei.

În plus, o corelaţie liniară între cantitatea unei peptide specifice şi semnalul MS poate fi de aşteptat numai într-un anumit interval. Prin urmare, inventatorii au decis să determine o curbă de calibrare individuală pentru fiecare peptidă. Intervalul fiecărei curbe de calibrare a fost selectat pentru a reflecta nu numai intervalul individual de cuantificare al peptidei, ci şi intervalul de semnale MS pentru fiecare peptidă din eşantioanele tumorale analizate anterior. Scopul a fost ca fiecare curbă de calibrare să cuprindă intervalul de semnal MS specific peptidei de cel puţin 80% din eşantioanele noastre de rutină.

Generarea curbelor de calibrare exacte necesită un standard sintetic, care trebuie cuantificat cu o metodă independentă şi are aceleaşi caracteristici ca şi TUMAP-ul natural. Inventatorii au folosit versiuni marcate dublu cu izotop ale TUMAP-ului, adică au fost incluşi doi aminoacizi marcaţi cu izotop în timpul sintezei TUMAP-ului. Versiunile marcate dublu pot fi distinse de TUMAP-ul natural printr-o diferenţă de masă de 12-18 Dalton în funcţie de aminoacidul marcat. În afară de masă, marcarea cu izotop nu modifică proprietăţile peptidei în MS, adică peptidele cu acelaşi rezultat de secvenţă, însă cu marcaje cu izotop diferite duc la aceleaşi intensităţi ale semnalului MS (Anderson et al., 2012). După sinteză, TUMAP-urile marcate dublu au fost cuantificate cu precizie prin analiza azotului pentru a permite o corelaţie exactă între cantitatea de peptide şi semnalul MS.

Curbele de calibrare au fost preparate în cel puţin trei matrice diferite, adică peptida HLA eluează din probe naturale similare cu probele pentru MS de rutină şi fiecare preparat a fost măsurat rulări de MS duplicate. Pentru a compensa eventualele variaţii tehnice între ciclurile de MS, a fost inclusă o peptidă standard internă în toate măsurătorile. Raportul semnalelor MS ale peptidei titrate la standardul intern fix a fost reprezentat grafic, iar curba de calibrare a fost calculată prin regresie logistică (Figura 3). Limita inferioară de cuantificare (LLOQ) a fost determinată vizual luându-se în considerare abaterea de la liniaritate. Dacă abaterea de la liniaritate nu a fost evidentă, cum ar fi pentru peptida FAP-003 (Figura 4), pentru calcularea LLOQ a fost utilizat raportul mediu al celei mai mici cantităţi de peptide. Limita superioară de cuantificare, adică abaterea de la liniaritate la concentraţii mai mari, nu a fost atinsă pentru nicio curbă de calibrare.

În experimentele de cuantificare propriu-zise, s-a adăugat aceeaşi cantitate din standardul intern la fiecare probă ca pentru generarea curbei de calibrare şi s-a calculat raportul dintre peptida naturală şi peptida standard internă. Această „metodă standard internă» este o metodă comună în cuantificarea proteinelor bazată pe MS, de exemplu pentru analiza biomarkerilor în eşantioane biologice (Sturm et al., 2012; Prasad şi Unadkat, 2014; Sato et al., 2012). Curbele de calibrare şi valorile măsurate în eşantioanele tumorale reale sunt arătate în Figura 4 şi Figura 5 pentru HLA-A*02 şi în Figura 6 şi Figura 7 pentru HLA-A*24 pentru toate TUMAP-urile selectate pentru cuantificare absolută.

Pentru a se estima variaţia măsurătorilor cantitative prin MS, a fost calculat coeficientul de variaţie (CV în %) al conţinutului de peptide pentru fiecare eşantion de MS. CV-urile per eşantion de MS au fost reprezentate grafic şi variaţia generală a măsurătorilor prin MS a fost estimată ca CV median (Figura 8).

Eficacitatea izolării peptidelor/MHC-urilor

În ceea ce priveşte orice proces de purificare a proteinelor, izolarea proteinelor din probele de ţesut este asociată cu o anumită pierdere a proteinei de interes. Pentru a determina eficienţa izolării TUMAP-urilor, complexele peptididă-MHC au fost generate pentru toate TUMAP-urile selectate pentru cuantificare absolută. Pentru a putea discrimina complexele peptidă-MHC naturale de cele adiţionate, s-au utilizat versiuni de TUMAP-uri marcate cu un singur izotop, adică în timpul sintezei TUMAP-urilor a fost introdus un aminoacid marcat cu izotop. Aceste complexe au fost adiţionate în lizate de ţesut proaspăt preparate, adică în cel mai timpuriu punct posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor, şi apoi au fost capturate precum complexele peptidă-MHC naturale în următoarea purificare de afinitate. Prin urmare, măsurarea recuperării TUMAP-urilor marcate cu un singur izotop permite concluzii cu privire la eficienţa izolării TUMAP-urilor naturale individuale.

Eficienţa izolării a fost determinată în 13 eşantioane care au fost selectate pentru cuantificarea absolută a TUMAP-urilor (7 HLA-A*02-pozitive, 5 HLA-A*24-pozitive şi 1 HLA-A*02/A*24 dublu-pozitiv). Pentru eficienţa izolării au fost analizate opt eşantioane A*02-pozitive pentru TUMAP-uri A*02 şi şase eşantioane A*24-pozitive pentru TUMAP-uri A*24 (Figura 9 A, B). Rezultatele sugerează că, pentru majoritatea peptidelor, eficienţa izolării este comparabilă între diferite eşantioane de ţesut. În schimb, eficienţa izolării diferă între peptidele individuale. Acest lucru sugerează că eficienţa izolării, deşi este determinată doar la un număr limitat de probe de ţesut, poate fi extrapolată la orice alt preparat tisular. Cu toate acestea, este necesar să se analizeze fiecare TUMAP individual, deoarece eficienţa izolării nu poate fi extrapolată de la o peptidă la altele.

În câteva cazuri, eficienţa izolării este nerealist de mare şi/sau variază puternic, de exemplu pentru peptida NCAPG-001 (Figura 9 A). În cazurile în care eficienţa nu a putut fi determinată, de exemplu din cauza dificultăţilor de cuantificare dependente de peptide (de exemplu, un nivel ridicat de LLOQ pentru peptidele CCNB1-002, ASPM-001) sau a fost calculată o eficienţă mai mare de 100%, inventatorii au presupus o eficienţă de izolare de 100%. Aceasta este o abordare conservatoare care, cel mai probabil, supraestimează eficienţa izolării şi, prin urmare, duce în cele din urmă la o subestimare a copiilor peptidice per celulă.

Pentru a estima variaţia eficienţei izolării TUMAP-urilor, a fost reprezentat grafic coeficientul de variaţie (CV în %) pentru izolarea TUMAP-urilor individuale din 6-8 eşantioane (Figura 9 C). În ansamblu, variaţia medie pentru TUMAP-urile A*02 este de 24%, iar pentru TUMAP-urile A*24 de 32%.

Determinarea numărului de celule în ţesut solid, congelat

Un alt factor critic pentru calcularea numărului de copii peptidice per celulă este estimarea numărului total de celule din eşantioanele de ţesut utilizate pentru izolarea TUMAP-urilor. Inventatorii au decis să utilizeze analiza conţinutului de ADN, deoarece această metodă este aplicabilă unei game largi de eşantioane de origine diferită şi, cel mai important, de eşantioane congelate (Forsey şi Chaudhuri, 2009; Alcoser et al., 2011; Alcoser et al., 2011; Silva et al., 2013).

Având în vedere eterogenitatea intratumorală, este necesar să se determine numărul de celule dintr-o fracţiune de ţesut care este reprezentativă pentru eşantionul complet de ţesut utilizat pentru izolarea TUMAP-urilor. Lizatul tisular preparat în timpul izolării TUMAP-urilor este un eşantion adecvat pentru analiza ADN-ului, deoarece este mai omogen în comparaţie cu o fracţiune din ţesutul solid. După izolarea ADN-ului, concentraţia totală de ADN a fost cuantificată într-un test pe bază de fluorescenţă (Life Technologies, Qubit HS DNA Assay) şi a fost calculat conţinutul total de ADN al eşantioanelor.

Pentru calcularea numerelor de celule dintr-o anumită cantitate de ADN, inventatorii au luat în considerare două metode diferite: În primul rând, numărul de celule poate fi calculat utilizându-se masa teoretică a unui genom uman, care a fost estimată a fi de aproximativ 6,67 pg de ADN per genom diploid. (Alcoser et al., 2011; Konigshoff et al., 2003). Alternativ, eşantioanele cu număr de celule cunoscut pot fi utilizate pentru pregătirea unei curbe standard de ADN cu aceleaşi metode ca cele utilizate pentru eşantioanele de ţesut. Această metodă compensează deja orice impact al procedurii de izolare şi cuantificare a ADN-ului, îmbunătăţind astfel precizia rezultatelor noastre. Inventatorii au pregătit două curbe standard diferite, una din şapte linii celulare tumorale diferite şi cealaltă din celule mononucleare din sânge periferic (PBMC) de la şase donatori sănătoşi.

Pentru a compara toate cele trei metode de evaluare (masa teoretică a ADN-ului şi două curbe standard bazate pe celule diferite), a fost calculat numărul de celule per 1 g de ţesut pentru mai multe eşantioane (Figura 10 A). Calculele folosind standardul liniei celulare au ca rezultat un număr de celule substanţial mai mic (subestimare de maxim 3,6 ori) în comparaţie cu utilizarea standardului PBMC. Acest lucru era de aşteptat având în vedere că liniile celulare tumorale tind să aibă porţiuni mai mari de celule aneuploide, cu un conţinut mai mare de ADN în comparaţie cu PBMC-urile diploide sănătoase. În literatura de specialitate, proporţia tumorilor gastrice diploide variază de la 25% la 67%, în funcţie de studiu (Hiyama et al., 1995; Tamura et al., 1991; Wiksten et al., 2008; Zhang et al., 2005; Sugai et al., 2005). Deoarece ploidia şi fracţiunea de celule aneuploide din eşantioanele de ţesut sunt necunoscute, ambele curbe standard pot furniza doar o estimare a numărului real de celule, însă nu iau în considerare toate proprietăţile unui eşantion individual de ţesut. O altă sursă de variaţie este starea de proliferare necunoscută a eşantionului de ţesut sau prezenţa celulelor necrotice. În special, dublarea conţinutului de ADN în celulele proliferante creşte cantitatea de ADN în raport cu numărul de celule şi, astfel, va influenţa calculul numărului de celule. În două eşantioane de ţesut gastric normal, inventatorii au calculat, cu toate cele trei abordări, un număr mai mic de celule per 1 g de ţesut în comparaţie cu probele tumorale.

Ca abordare conservatoare, inventatorii au decis să utilizeze curba standard PBMC (Figura 10 B), care poate duce la o supraestimare a numărului de celule din porţiunea de eşantioane de ţesut hiperdiploide, ducând la o subestimare a copiilor peptidice per celulă în astfel de eşantioane, însă nu ar trebui niciodată să supraestimeze copii peptidice per celulă din niciun eşantion.

Pentru analiza probelor de ţesut selectate pentru cuantificarea absolută a TUMAP-urilor, inventatorii au izolat ADN din 2-3 părţi alicote de lizat de ţesut şi fiecare preparat de ADN a fost cuantificat în 2-3 replici în testul pe bază de fluorescenţă. Numărul total de celule şi numărul de celule per 1 g de ţesut au fost calculate din conţinutul total de ADN utilizându-se curba standard PBMC (Figura 11 A). Pentru a obţine o estimare a variaţiei globale a analizei numărului de celule, coeficientul de variaţie (%) a fost determinat mai întâi la nivelul fiecărui eşantion sau, dacă a fost disponibilă, la nivelul fiecărei replici biologice (adică preparate de lizat tisular independente din diferite bucăţi ale aceleiaşi tumori). Acest calcul a luat în considerare variaţia dintre părţile alicote de lizat tisular, precum şi măsurătorile replicate în testul de fluorescenţă. Aceşti coeficienţi CV sunt arătaţi în Figura 11 B, iar variaţia generală a fost determinată ca mediană a coeficienţilor CV descrişi. Variabilitatea poate fi parţial explicată prin faptul că lizatele tisulare nu sunt complet omogenizate, adică particulele de ţesut rămase care conţin celule nedisociate conduc la un număr mai mare de celule pentru replicile individuale de izolare (vezi, de exemplu, GC816T în Figura 11 A).

Copii de peptide per celulă

Cu date pentru cuantificarea peptidelor în rulări nanoLC-MS/MS („peptidă totală»), eficienţa izolării TUMAP-urilor („% de eficienţă a izolării») şi numărul de celule din fiecare eşantion tumoral disponibil, este posibil să se calculeze numărul de copii TUMAP per celulă conform următoarei formule:

Cantitatea de peptidă totală se calculează din rezultatul a 2-4 experimente nanoLC-MS/MS („peptidă/rulare [fmol]») utilizându-se curbele de calibrare prezentate în Figurile 4-7.

total peptide peptidă totală peptide peptidă run rulare fmol fmol mol mol peptide eluate eluat peptidic µl µl MS sample per run eşantion MS per rulare % of lisate used for TUMAP isolation % de lizat utilizat pentru izolarea TUMAP-urilor

Doar măsurătorile MS peste LLOQ, definite prin utilizarea curbelor de calibrare, sunt utilizate pentru calcularea numerelor absolute de copii peptidice. Acest LLOQ se referă la cantitatea de TUMAP-uri într-un experiment nanoLC-MS/MS („LLOQ/rulare [fmol]»).

Numărul de copii per celulă pentru toate peptidele, care ar putea fi cuantificate, variază de la 50 la 30000 de copii per celulă (vezi Tabelul 3).

Tabelul 3: Privire de ansamblu asupra numerelor de copii per celulă pentru TUMAP-uri HLA-A*02 şi HLA-A*24

TUMAP-urile HLA-A*02 au fost analizate în opt eşantioane şi TUMAP-urile HLA-A*24 în şase eşantioane; nq = necuantificat deoarece cantitatea de peptide a fost sub LLOQ

HLA- Alelă Cod peptidă Cuantificat in n eşantioane (% de eşantioane analizate Copii per celulă (interval de eşantioane individuale şi replici biologice) A*02 IGF2BP3- 001 1 (13%) 350-450 A*02 FAP-003 1 (13%) 200-250 A*02 COL12A1- 002 0 (0%) nq A*02 MXRA5-001 1 (13%) 450 A*02 NCAPG-001 1 (13%) 1000 A*02 COL6A3-002 0 (0%) nq A*02 WNT5A-001 1 (13%) 400 A*02 F2R-001 5 (63%) 50-300 A*02 HIF1A-001 3 (38%) 9000-30000 A*02 MET-001 2 (25%) 200-250 A*02 CCNB1-002 0 (0%) nq A*24 ASPM-002 0 (0%) nq A*24 SLC6A6-001 2 (33%) 1000-5000 A*24 MMP3-001 2 (33%) 100-250 A*24 CDC2-001 0 (0%) nq A*24 ASPM-001 0 (0%) nq A*24 ATAD2-001 2 (33%) 1500-6000 A*24 KIF2C-001 1 (17%) 3500 A*24 MET-006 3 (50%) 2500-13500 A*24 AVL9-001 4 (67%) 1000-10000 A*24 PPAP2C-001 5 (83%) 200-1500 A*24 UCHL5-001 1 (17%) 2500 A*24 UQCRB-001 1 (17%) 900

Pentru a vizualiza LLOQ în contextul „copiilor peptidice per celulă», s-a calculat „LLOQ per celulă» pentru fiecare TUMAP din fiecare eşantion folosindu-se cele două formule prezentate mai sus. Deoarece eşantioanele diferă în numărul total de celule, LLOQ per celulă este diferit pentru fiecare eşantion (vezi Figura 12 şi Figura 13 pentru TUMAP-uri A*02 şi Figura 14 şi Figura 15 pentru TUMAP-uri A*24).

Estimarea erorii în cuantificarea absolută a TUMAP-urilor

Pentru a estima variaţia cuantificării absolute a TUMAP-urilor, inventatorii au luat în considerare variaţia relativă a celor trei rezultate experimentale majore, aşa cum s-a descris mai sus:

a) cantitatea de TUMAP-uri izolate: abatere relativă de 1,8% (A*02) şi de 2,1% (A*24) b) eficienţa izolării TUMAP-urilor: abatere relativă de 24% (A*02) şi de 32% (A*24) c) numărul de celule din eşantionul de ţesut: abatere relativă de 27% Presupunând distribuţia normală a valorilor variabilei, eroarea relativă (σ) a „copiilor per celulă» poate fi calculată ca rădăcina pătrată a sumei erorii relative pătratice a fiecărei variabile:

copies copii total cell count total celule total peptide peptidă totală isolation efficiency eficienţă izolare

Cu valorile date mai sus, coeficientul de variaţie pentru numărul absolut de copii peptidice per celulă este de aproximativ 36% pentru peptidele HLA-A*02 şi 42% pentru peptidele HLA-A*24. Pentru a da o impresie asupra variaţiei rezultatelor, s-a calculat eroarea absolută şi eroarea relativă a copiilor peptidice per celulă pentru o peptidă model şi un eşantion model (Tabelul 4).

Tabelul 4: Exemplu de calcul al erorii absolute şi al erorii relative în cuantificarea absolută a TUMAP-urilor pentru o peptidă model

valoare A*02 A*24 eroare rel. (%) eroare abs. eroare rel. (%) eroare abs. Total celule/eşantion 1x108 27% - 27% - Total peptide [fmol] 16,25 1,8% - 2,1% - Eficienţă a izolării pentru peptidăMHC 10% 24% 32% Copii de peptide per celulă 1000 36% 360 42% 420

Acest calcul model sugerează că, pentru analiza complexă în mai mulţi paşi a cuantificării absolute, variaţia rezultatelor este încă într-un interval acceptabil. Pentru TUMAP-uri individuale, eroarea relativă se poate abate de la eroarea medie calculată aici. Numerele de copii de TUMAP-uri per celulă pot fi comparate cantitativ între diferite TUMAP-uri, permiţând prioritizarea TUMAP-urilor pentru a alege anticorpii adecvaţi şi/sau ţintele solubile ale receptorilor de celule T.

Comparaţie între metoda de cuantificare a TUMAP-urilor şi metodele publicate cunoscute

abordare precisă pentru cuantificarea absolută a numerelor de copii peptidice asociate MHC per celulă nu a fost arătată anterior. Cel mai important, metodele publicate anterior pentru cuantificarea peptidelor legate de MHC utilizând analiza MS nu au luat în considerare pierderea antigenului în timpul pregătirii eşantionului (Tan et al., 2011; Hogan et al., 2005). Grupul lui Peter A. von Velen a publicat recent o metodă pentru „cuantificarea exactă a peptidelor legate de MHC» (Hassan et al., 2014). În această notă tehnică, a fost utilizată o abordare pentru a cuantifica doi antigeni de histocompatibilitate minoră, LB-NISCH-1A şi LB-SSR1-1S, pe celule EBV-LCL JYpp65. Cu toate acestea, paşii experimentali individuali diferă substanţial, ceea ce este rezumat în tabelul de mai jos:

Tabelul 5: Comparaţie a metodelor pentru cuantificarea TUMAP-urilor între Hassan et al. şi prezenta invenţie

Hassan et al. prezenta invenţie Curbe de calibrare pentru peptide Utilizată numai pentru a determina domeniul liniar, presupunând că toate peptidele au aceeaşi corelaţie a cantităţii de peptide cu semnalul MS (panta = 1) Pentru a determina domeniul liniar, LLOQ şi pentru a cuantifica peptidele; ia în considerare corelaţia, specifică peptidelor, a cantităţii şi semnalului MS pentru fiecare peptidă individuală Cuantificare a peptidelor Calibrare într-un punct: raport al semnalului cu peptida standard adiţionată Metoda standard internă, bazată pe curba de calibrare specifică peptidelor, cuantificare a probelor în apropierea LLOQ Eficienţă a izolării Complexe peptidă-MHC adiţionate în lizat după 2 ore de liză şi clearance prin centrifugare, ignorându-se pierderea de peptide în aceşti paşi Complexe peptidă-MHC adiţionate direct după omogenizarea ţesutului, adică cel mai timpuriu punct în izolarea peptidelor Eşantioane Linie celulară Ţesut tumoral solid Pregătire a eşantionului Pas suplimentar de cromatografie C18 înainte de nanoLC-MS/MS final, utilizat pentru a reduce complexitatea eşantionului Utilizare imediată a unui eşantion imunoprecipitat şi filtrat pentru nanoLC-MS/MS Determinare a numărului de celule Numărare a celulelor în timpul preparării peletelor celulare Analiză a conţinutului de ADN din lizat de ţesuturi solide Calculare a erorii Se ia în considerare numai variaţia replicărilor MS (CV 0,1%-7,1%), însă nu şi variaţia izolării complexelor peptidă-MHC (26% şi, respectiv, 91%) şi a numărului de celule. Se iau în considerare variaţiile în replicările MS (CV mediu de 1,8%-2,1%), eficienţa izolării complexelor peptidă-MHC (CV mediu de 24%-32%) şi determinarea numărului de celule (CV mediu de 27%).

Numerele de copii ale celor două peptide analizate de Hassan et al. a variat de la 800 la 5300 (abatere relativă 74%) şi, respectiv, de la 3000 la 12000 (abatere relativă 60%) de copii per celulă între replicile biologice. Motivul acestei variaţii nu a fost clar discutat, însă se poate datora utilizării unor instrumente de MS diferite.

În rezumat, se aşteaptă ca metoda mai rafinată din prezenta invenţie să contribuie la obţinerea de rezultate mai precise şi mai fiabile.

Cuantificarea peptidelor cu numere mici de copii

Pentru a arăta puterea metodei inventive, au fost generate datele prezentate în tabelul următor. Au fost identificate peptide care sunt prezente doar în numere foarte mici de copii, printre care se numără peptida PDE11-001. Se poate vedea că metoda permite determinarea a aproximativ 10 copii ale peptidei per celulă.

Tabelul 6: Cuantificarea peptidelor cu numere reduse de copii

PC - cancer de prostată - Secvenţa PDE11 -001 is ALLESRVNL (SEQ ID NO 25)

Cod peptidă Copii per celulă Număr de probe Sursă/HLA Min. Mediană Max. >LLOQ >LOD Evalua-bile Peptidă 1 20 20 20 1 5 16 NSCLC/A*02 Peptidă 2 10 30 300 13 16 17 NSCLC/A*02 Peptidă 3 10 30 50 4 10 18 NSCLC/A*02 Peptidă 4 10 30 100 17 17 19 NSCLC/A*02 Peptidă 5 20 20 90 7 8 11 NSCLC/A*02 Peptidă 6 10 20 50 6 6 10 NSCLC/A*02 Peptidă 7 <10 30 200 9 12 15 PC/A*02 PDE11-001 <10 10 30 8 9 10 PC/A*02

PDE11-001 este o peptidă de legare HLA-A*02 derivată din fosfodiesterază 11A (PDE11A), care catalizează hidroliza cAMP şi cGMP, reglând astfel căile de semnalizare respective. Mutaţiile din PDE11A au fost asociate cu hiperplazie adrenocorticală, precum şi cu tumori cu celule germinale testiculare cu istoric familial. Peptida a fost detectată pe eşantioane de cancer de prostată, precum şi în carcinom hepatocelular, pancreatic şi cu celule renale şi nu pe ţesuturi normale.

Referinţe citate

Alcoser SY, Kimmel DJ, Borgel SD, Carter JP, Dougherty KM, Hollingshead MG (2011). Real-time PCR-based assay to quantify the relative amount of human and mouse tissue present in tumor xenografts. BMC. Biotechnol. 11, 124.

Anderson NL, Razavi M, Pearson TW, Kruppa G, Paape R, Suckau D (2012). Precision of heavy-light peptide ratios measured by maldi-tof mass spectrometry. J Proteome. Res 11, 1868-1878.

Forsey RW, Chaudhuri JB (2009). Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol. Lett. 31, 819-823.

Hassan C, Kester MG, Oudgenoeg G, de Ru AH, Janssen GM, Drijfhout JW, Spaapen RM, Jimenez CR, Heemskerk MH, Falkenburg JH, van Veelen PA (2014). Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. J Proteomics.

Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, Hiyama K, Imamura Y, Murakami Y, Kodama T, Piatyszek MA, Shay JW, Matsuura Y (1995). Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res 55, 3258-3262.

Hogan KT, Sutton JN, Chu KU, Busby JA, Shabanowitz J, Hunt DF, Slingluff CL, Jr. (2005). Use of selected reaction monitoring mass spectrometry for the detection of specific MHC class I peptide antigens on A3 supertype family members. Cancer Immunol. Immunother. 54, 359-371.

Konigshoff M, Wilhelm J, Bohle RM, Pingoud A, Hahn M (2003). HER-2/neu gene copy number quantified by real-time PCR: comparison of gene amplification, heterozygosity, and immunohistochemical status in breast cancer tissue. Clin Chem. 49, 219-229.

Prasad B, Unadkat JD (2014). Comparison of Heavy Labeled (SIL) Peptide versus SILAC Protein Internal Standards for LC-MS/MS Quantification of Hepatic Drug Transporters. Int. J Proteomics. 2014, 451510.

Sato Y, Miyashita A, Iwatsubo T, Usui T (2012). Simultaneous absolute protein quantification of carboxylesterases 1 and 2 in human liver tissue fractions using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Drug Metab Dispos. 40, 1389-1396.

Silva AL, Rosalia RA, Sazak A, Carstens MG, Ossendorp F, Oostendorp J, Jiskoot W (2013). Optimization of encapsulation of a synthetic long peptide in PLGA nanoparticles: low-burst release is crucial for efficient CD8(+) T cell activation. Eur. J Pharm. Biopharm. 83, 338-345.

Sturm R, Sheynkman G, Booth C, Smith LM, Pedersen JA, Li L (2012). Absolute quantification of prion protein (90-231) using stable isotope-labeled chymotryptic peptide standards in a LC-MRM AQUA workflow. J Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 1522-1533.

Sugai T, Habano W, Jiao YF, Suzuki M, Takagane A, Nakamura S (2005). Analysis of genetic alterations associated with DNA diploidy, aneuploidy and multiploidy in gastric cancers. Oncology 68, 548-557.

Tamura G, Kihana T, Nomura K, Terada M, Sugimura T, Hirohashi S (1991). Detection of frequent p53 gene mutations in primary gastric cancer by cell sorting and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism analysis. Cancer Res 51, 3056-3058.

Tan CT, Croft NP, Dudek NL, Williamson NA, Purcell AW (2011). Direct quantitation of MHC-bound peptide epitopes by selected reaction monitoring. Proteomics. 11, 2336-2340.

Wiksten JP, Lundin J, Nordling S, Kokkola A, Haglund C (2008). Comparison of the prognostic value of a panel of tissue tumor markers and established clinicopathological factors in patients with gastric cancer. Anticancer Res 28, 2279-2287.

Zhang H, Yi EC, Li XJ, Mallick P, Kelly-Spratt KS, Masselon CD, Camp DG, Smith RD, Kemp CJ, Aebersold R (2005). High throughput quantitative analysis of serum proteins using glycopeptide capture and liquid chromatography mass spectrometry. Mol. Cell Proteomics. 4, 144-155.

Claims (10)

1. O metodă pentru cuantificarea absolută a unui ligand peptidic MHC pe o celulă, metoda menţionată cuprinzând a) pregătirea celulelor care prezintă ligandul peptidic MHC menţionat dintr-un eşantion biologic selectat dintr-un eşantion de ţesut, un eşantion de sânge, un eşantion tumoral sau un eşantion dintr-un ţesut infectat care cuprinde celulele menţionate, cuprinzând digestia enzimatică a ţesuturilor şi/sau liza celulară, b) determinarea numărului de celule al preparatului menţionat la pasul a) cuprinzând numărarea nucleilor celulari, determinarea fotometrică a ADN-ului, determinarea fluorimetrică a ADN-ului sau PCR-ul cantitativ, c) adăugarea unei cantităţi cunoscute de ligand peptidic MHC şi/sau de complex peptidă-MHC pentru a fi cuantificată la preparatul menţionat la pasul a) direct după omogenizarea ţesutului („adiţionare I»), d) izolarea ligandului peptidic MHC din preparatul menţionat la pasul c) pentru a obţine un eluat peptidic, e) adăugarea unei cantităţi cunoscute de ligand peptidic MHC pentru a fi cuantificat la eluatul peptidic menţionat („adiţionare II») drept calibrant intern, f) efectuarea unei analize de spectrometrie de masă pe respectivul ligand peptidic MHC pentru a genera aa) un semnal pentru eficienţa izolării în pasul d), bb) un semnal pentru calibrantul intern de la pasul e) şi cc) semnalul pentru respectivul ligand peptidic MHC din respectivele celule preparate la pasul a) şi

g) cuantificarea ligandului peptidic MHC menţionat pe baza unei comparări a semnalelor obţinute la pasul f) cu aa) numărul de celule obţinut, bb) cantitatea cunoscută din ligandul peptidic MHC şi/sau complexul peptidă-MHC menţionat pentru a fi cuantificată ca adăugată la pasul c) şi cc) cantitatea cunoscută de ligand peptidic MHC care trebuie cuantificată aşa cum este adăugată în pasul e), în care cuantificarea cuprinde calcularea unui raport între semnalele calibrantului intern din pasul e) şi cele ale ligandului peptidic MHC izolat şi compararea raportului cu o curbă de calibrare stabilită a ligandului peptidic MHC şi în care cuantificarea mai cuprinde generarea unei curbe de calibrare specifice peptidei pe baza unui raport cu calibrantul intern utilizat la aceeaşi cantitate şi determinarea celui mai scăzut nivel de cuantificare (LLOQ) pentru respectivul ligand peptidic MHC care trebuie cuantificat, prin care o cuantificare absolută a ligandul peptidic MHC pe o celulă este realizată pentru ligandul peptidic MHC în cazul în care cantitatea cuantificată este peste LLOQ, aşa cum a fost determinat.

2. Metoda în conformitate cu Revendicarea 1 în care ligandul peptidic MHC menţionat este o peptidă asociată tumorii (TAA) sau o peptidă asociată bolii (DAA).

3. Metoda în conformitate cu Revendicarea 1 sau 2 care mai cuprinde determinarea cantităţii de cel puţin un tip de moleculă HLA în pregătirea de la pasul a).

4. Metoda în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, în care complexul peptidă-MHC adăugat şi/sau ligandul peptidic MHC adăugat este/sunt marcat(e) şi, de preferinţă, este/sunt marcat(e) diferenţial prin izotopi.

5. Metoda în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-4, în care izolarea include cromatografie, cum ar fi cromatografia de afinitate.

6. Metoda în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-5, cuprinzând în plus selectarea liganzilor peptidici MHC supraprezentaţi, supraexprimaţi şi/sau specifici tumorii pentru analiză.

7. Metoda în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-6, în care respectiva metodă este realizată pe o bază de randament ridicat.

8. Metoda în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-7, în care respectiva metodă constă din paşii indicaţi.

9. Metoda în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-8, în care eşantionul (eşantioanele) biologic(e) este/sunt derivate de la un individ sau un grup de indivizi care suferă de aceeaşi boală.

10. Metoda în conformitate cu Revendicarea 9, cuprinzând în plus pasul de generare a unui profil de ligand MHC personalizat, de preferinţă un profil de ligand MHC personalizat, specific bolii, pe baza liganzilor peptidici MHC cuantificaţi menţionaţi.