EP0411096A1 - Pth-varianten kodierende dna-sequenzen, pth-varianten, expressionsvektor, bakterieller wirt, verwendung und therapeutische zusammensetzung - Google Patents

Pth-varianten kodierende dna-sequenzen, pth-varianten, expressionsvektor, bakterieller wirt, verwendung und therapeutische zusammensetzung

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EP0411096A1
EP0411096A1 EP90903352A EP90903352A EP0411096A1 EP 0411096 A1 EP0411096 A1 EP 0411096A1 EP 90903352 A EP90903352 A EP 90903352A EP 90903352 A EP90903352 A EP 90903352A EP 0411096 A1 EP0411096 A1 EP 0411096A1
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EP
European Patent Office
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amino acids
terminal
dna sequence
variant
pth
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EP90903352A
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Edgar Wingender
Heiko Mielke
Gisela Bercz
Klaus-Dieter Schlüter
Hubert Mayer
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Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
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Publication date
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Publication of EP0411096A1 publication Critical patent/EP0411096A1/de
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • Parathyroid hormone regulates the calcium level of the blood plasma by u. a. Develops and dismantles effects on the skeleton, but also increases calcium reabsorption by the kidney. There are indications that the bone-building effect of PTH can be used for the clinical treatment of osteoporosis; see. J. Bone Minera l Res., 1 (1987) 377-382.
  • a DNA sequence which encodes a variant of PTH (1-84) in which
  • Amino acids is shortened, the totality of the amino acids encoded by the DNA sequence not being arranged in an order that occurs in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH or hPTH.
  • a DNA sequence which encodes a variant of PTH (1-84) in which
  • Amino acids are exchanged for another amino acid, where
  • the N-terminal (position +1) is extended by one to two amino acids and, if necessary, the C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids or
  • N-terminal (position +1) and / or C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids, the totality of the amino acids coded by the DNA sequence not being arranged in an order which is shown in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH or hPTH occurs.
  • a DNA sequence which encodes a variant of PTH (1-84) in which
  • Amino acids are exchanged for another amino acid, except for tyrosine at position 34 and further
  • the N-terminal (position +1) is extended by one to two amino acids and, if necessary, the C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids or
  • N-terminal (position +1) and / or C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids, the totality of the amino acids coded by the DNA sequence not being arranged in an order which is shown in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH or hPTH occurs.
  • a DNA sequence is provided which encodes a variant of PTH (1-84) in which
  • Amino acids are exchanged for another amino acid, where
  • N-terminal (position +1) is extended by one or two amino acids and, if necessary, the C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids or
  • N-terminal (position +1) and / or C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids, the totality of the amino acids coded by the DNA sequence not being arranged in an order which is shown in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH or hPTH occurs.
  • a DNA sequence which encodes a variant of PTH (1-84) in which
  • the N-terminal (position +1) is extended by one to two amino acids and, if necessary, the C-terminal (position +84) is shortened by one or more amino acids or
  • - N-terminal (position +1) and / or C-terminal (position +84) is possibly shortened by one or more amino acids, where
  • the entirety of the amino acids encoded by the DNA sequence is not arranged in an order that occurs in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH or hPTH.
  • the DNA sequence preferably encodes a PTH variant whose N-terminus is extended by proline. Also preferred are hPTH, bPTH, pPTH, rPTH or cPTH variants.
  • 1 denotes the first nucleotide of the first PTH codon, so that the numbers to be taken from the following Table 1 each indicate the position of the first nucleotide shown in relation to the first nucleotide of the first PTH codon.
  • the invention also relates to PTH variants which are encoded by one of the DNA sequences described above, and in particular to variants of PTH from human (h), from bovine (b), from
  • the PTH variants according to the invention can be formally divided into the following four groups.
  • Group 1 conservative amino acid changes in positions 27 and 29, which stimulate both adenylate cyclase and DNA synthesis ("functional PTH equivalents"); Examples: Q29N; K27R.
  • Group 2 non-conservative amino acid exchanges (variations under charge reversal or charge deletion, change in hydrogen bonds, reversal of hydrophobicity) in the ranges 29 to 31 or 33 to 34 as well as exchanges in position 32, which lead to a significant reduction in the stimulation of the DNA Synthesis and largely maintain the effect on adenylate cyclase; Examples: Q29A, H32L, H32K, H32R.
  • Group 3 non-conservative amino acid exchanges (as defined above) in the range 1 to 27, which lead to a significant reduction in adenylate cyclase stimulation and partially increase or leave the DNA synthesis unaffected.
  • Group 4 non-conservative amino acid exchanges in the range 1 to 27, which receive stimulation of adenylate cyclase but reduce DNA synthesis; Example: L11K.
  • the invention relates to hybrid peptides which comprise a PTH variant according to the invention, expression vectors for the expression of the proteins according to the invention, bacterial hosts such as E. coli for the expression vectors, the use of the DNA sequences for the production of the peptides according to the invention and therapeutic compositions which use them Contain peptides.
  • Relevant prior art are DE-A-37 25 319.0 and DE-A-37 25 320.4.
  • the expression plasmid pEX-pPTH from DE-A-37 25 319.0 was used. A 123 base pair BamHI / SstI fragment of this plasmid was cloned into the phage vector Ml3mpl8. The mutants listed in Table 1 were thus produced with the aid of synthetic oligonucleotides according to the gapped duplex method (Methods Enzymol., 100 (1983) 468-500).
  • the PTH variants thus obtained were tested for their ability in an in vitro test according to Mohr and Hesch (Biochem. J., 188 (1980) 649-656) to stimulate adenylate cyclase in isolated membranes of adrenal cortex of the pig.
  • the PTH genes mentioned can be produced using peptide synthesis machines.
  • the underlined bases are different from the recombinant wild type.
  • Amino acids refer to the first amino acid of human parathyroid hormone (Ser (1)).
  • Tab. 2 Relative activity of the PTH variants on renal

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Description

PTH-Varianten kodierende DNA-Sequenzen, PTH-Varianten,
Expressionsvektor, bakterieller Wirt, Verwendung und therapeutische Zusammensetzung
Parathormon (PTH) reguliert den Calciumspiegel des Blutplasmas, indem es u. a. auf- und abbauende Wirkungen auf das Skelett entfaltet, aber auch die Calciumrückresorption durch die Niere verstärkt. Es gibt Anhaltspunkte dafür, daß der knochenaufbauende Effekt des PTH zur klinischen Behandlung von Osteoporose ausgenutzt werden kann; vgl. J. Bone Minera l Res., 1 (1987) 377-382.
Es gibt zudem Hinweise, daß die multiplen Funktionen des PTH von verschiedenen Regionen des Hormonmoleküls ausgeübt werden. So wurde beispielsweise gefunden, daß die N-terminalen 34 Aminosäuren die Bindung des Hormons an seinen Nierenzellen-Rezeptor mit nachfolgender Stimulierung der Adenylatoyclase vermitteln (vgl. Adv. Prot. Chem., 32 (1982) 323-395), daß jedoch ein mitogener Effekt von der mitt-regionalen Sequenz 28-48 ausgeht (vgl. DE-A-37 25 319.0), der nicht über die Adenylatcyclase, sondern möglicherweise über Proteinkinase C vermittelt wird. Es erscheint somit reizvoll, durch gezielte Variation der Aminosäuresequenz des PTH oder von PTH-Fragmenten einzelne Hormoneffekte zu modulieren und so eventuell die katabole Wirkung des Hormons zu reduzieren oder seine anabole Wirkung zu verstärken.
Zum Stand der Technik sei auch verwiesen auf US-PSen
4 086 196 und 4 423 037 sowie John et al. in Adv. Prot.
Chem., 32 (1982) 323.
Dazu wird erfindungsgemäß eine DNA-Sequenz vorgesehen, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 1 bis 27 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei - ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere
Aminosäuren verkürzt ist, wobei die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz vorgesehen, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 28 bis 31 eine oder zwei
Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei
- ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz vorgesehen, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 32 bis 34 eine oder zwei
Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei an der Position 34 Tyrosin ausgenommen ist und ferner
- ggf. N-terminal (Position +1 ) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz vorgesehen, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 30 bis 34 eine oder zwei
Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei
- ggf. N-terminal (Position +1) um eins bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz vorgesehen, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
(a) der Bereich der Positionen 28 bis 34 und insbesondere 30 bis 34 unverändert ist oder
(b) im Bereich der Positionen 28 bis 34 und insbesondere 30 bis 34 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind und
zusätzlich zu (a) oder (b) außerhalb des Bereichs der
Positionen 28 bis 34 bzw. 30 bis 34 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind und
- ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminsäuren verkürzt ist, wobei
die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
Vorzugsweise kodiert die DNA-Sequenz eine PTH-Variante, deren N-Terminus um Prolin verlängert ist. Bevorzugt sind außerdem hPTH-, bPTH-, pPTH-, rPTH- oder cPTH-Varianten. Für die Numerierung der DNA-Sequenzen gilt, daß 1 das erste Nukleotid des ersten PTH-Kodons bezeichnet, so daß die der folgenden Tabelle 1 zu entnehmenden Zahlen jeweils die Position des ersten gezeigten Nukleotids in Bezug zum ersten Nukleotid des ersten PTH-Kodons bezeichnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung außerdem PTH-Varianten, die von einer der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen kodiert werden, und insbesondere Varianten des PTH vom Menschen (h), vom Rind (b), vom
Schwein (p), von der Ratte (r) und vom Huhn (c).
Die erfindungsgemäßen PTH-Varianten lassen sich formal in folgende vier Gruppen einteilen.
Gruppe 1: konservative Aminosäureaustausche in den Positionen 27 und 29, die die Stimulierung sowohl der Adenylatcyclase als auch der DNA-Synthese erhalten ("funktionelle PTH-Äquivalente"); Beispiele: Q29N; K27R.
Gruppe 2: nicht-konservative Aminosäureaustausche (Variationen unter Ladungsumkehrung oder -löschung, Veränderung von Wasserstoffbrücken, Umkehrung der Hydrophobizität) in den Bereichen 29 bis 31 bzw. 33 bis 34 sowie Austausche in Position 32, die zu einer signifikanten Reduktion der Stimulierung der DNA-Synthese und zu einem weitgehenden Erhalt des Effekts auf die Adenylatcyclase führen; Beispiele: Q29A, H32L, H32K, H32R.
Gruppe 3: nicht-konservative Aminosäureaustausche (wie vorstehend definiert) im Bereich 1 bis 27, die zu einer signifikanten Reduktion der Adenylatcyclase-Stimulation führen und die DNA-Synthese zum Teil steigern oder unbeeinflußt lassen. Beispiele für DNA-Synthesesteigerung: E4R, E4R/R20E, K13P, K27L; Beispiel für unbeeinflußte DNA-Synthese: R20E. Gruppe 4: nicht-konservative Aminosäureaustausche im Bereich 1 bis 27, die die Stimulierung der Adenylatcyclase erhalten, die der DNA-Synthese jedoch reduzieren; Beispiel: L11K.
Schließlich betrifft die Erfindung Hybridpeptide, die eine erfindungsgemäße PTH-Variante umfassen, Expressionsvektoren zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine, bakterielle Wirte, wie E. coli, für die Expressionsvektoren, die Verwendung der DNA-Sequenzen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide sowie therapeutische Zusammensetzungen, die diese Peptide enthalten. Relevanter Stand der Technik sind DE-A-37 25 319.0 und DE-A-37 25 320.4.
Nachstehend wird die Erfindung durch ein Beispiel und zwei Tabellen näher erläutert.
Beispiel
Es wurde von dem Expressionsplasmid pEX-pPTH der DE-A-37 25 319.0 ausgegangen. Ein 123 Basenpaare langes BamHI/SstI-Fragment dieses Plasmids wurde in den Phagenvektor Ml3mpl8 umkloniert. Damit wurden mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide nach der Gapped-Duplex-Methode (Methods Enzymol., 100 (1983) 468-500) die in Tabelle 1 aufgelisteten Mutanten hergestel lt.
Nach Rückklonieren der mutierten PTH-Teilgene in den Expressionsvektor wurden die entsprechenden Varianten Cro-ß-Galaktosidase-hPTH-Fusionsproteine exprimiert, gereinigt und gespalten; die auf diese Weise freigesetzten PTH-Varianten wurden gemäß der DE-A-37 25 319.0 und DE-A-37 25 320.4 gereinigt. Die Reinigung über Carboxymethylcellulose wurde batchweise durchgeführt. Eine nachfolgende Reinigung über Umkehrphasen-HPLC ergab homogenes Material.
Die so erhaltenen PTH-Varianten wurden auf ihre Fähigkeit getestet, in einem In-Vitro-Test nach Mohr und Hesch (Biochem. J., 188 (1980) 649-656) die Adenylatcyclase in isolierten Membranen von Nebennierenrinden des Schweins zu stimulieren.
Ferner wurden sie auf ihre Fähigkeit untersucht, gemäß der DE-A-37 25 319.0 und DE-A-37 25 320.4 die DNA-Synthese embryonaler Hühner-Chondrocyten zu steigern.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Materialien pEX Genofit Heidelberg
M13mp18 GIBCO BRL
hPTH-Gen P 33 12 928.2
bPTH-Gen PNAS, 78 (1981) 7365 pPTH-Gen Nucleic Acids Res., 15
(1987) 6740
rPTH-Gen Nucleic Acids Res., 15
(1987) 6740
cPTH-Gen J. Bone Mineral. Res., 3
(Suppl. 1) (1988) Poster No. 309
Die genannten PTH-Gene können mit Peptid-Synthesemaschinen hergestellt werden.
Tab. 1: Mutationen im hPTH-Gen und resultierende PTH-VariantenBenennung DNA- Sequenz AS-Austausch
E4R AGT AGA ATT Glu(4) -> Arg(4)
28
L11K AAC AAG GGA Leu(ll) -> Lys(11)
31
G12A CTC GCG AAA Gly(12) -> Ala(12)
G12P CTC GCG AAA -> Pro(12)
34
K13P GGC CCA CAT Lys(13) -> Pro(13)
K13S GGC TCC CAT -> Ser(13)
K13L GGC CTG CAT -> Leu(13)
G12N,K13S AAT TCG CAT Gly(12) ,Lys(13) -> Asn(12), Ser(13)
55
R20E GAG GAA GTA Arg(20) -> Glu(20)
7 55
E4R,R20E AGT AGA ATT..GAG GAA GTA Glu(4),Arg(20) -> Arg(4), Glu(20)
76
K27L AAG CTT CTG Lys(27) -> Leu(27)
K27R AAG CGT CTG " -> Arg(27)
82
Q29A CTG GCA GAT Gln(29) -> Ala(29)
Q29N CTG AAC GAT " -> Asn(29)
91
H32L GTA CTC AAT His(32) -> Leu(32)
H32R GTG CGC AAT " -> Arg(32)
H32K GTG AAG AAT " -> Lys(32)
H32S GTT TCG AAT " -> Ser(32)
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Die Numerierung an den DNA-Sequenzen gibt die Position des ersten gezeigten Nukleotids in Bezug zu dem ersten Nukleotid des ersten PTH- Kodons (= 1) an. Die unterstrichenen Basen sind gegenüber dem rekombinanten Wildtyp verändert. Die Positionsnummern der ausgetauschten
Aminosäuren beziehen sich auf die erste Aminosäure des humanen Parathormons (Ser(1)). Tab. 2: Relative Aktivität der PTH-Varianten auf renale
Adenylatcyclase und DNA-Synthese in Chondrocyten
PTH-Variante Adenylatcyclase DNA- -Synthese
(%) (%)
rec-hPTH 100 100
Q29N 99 95
K27R 90 81
Q29A 104 8
H32L 93 11
H32R 87 36
H32K 85 22
L11K 89 21
E4R 47 88
K27L 35 70
E4R,R20E 20 58
K13P 6 88
R20E 0 0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Alle PTH-Varianten sind, wie der Wildtyp, N-terminal um einen Prolinrest verlängert. Die Aktivitäten beziehen sich ausnahmslos auf dieses rekombinante hPTH und geben die Fähigkeit der betreffenden Variante zur Stimulation entweder der Cyclase oder der DNA-Synthese über das Grundniveau an.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 1 bis 27 eine oder zwei Aminosäure gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei
- ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei
- die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
2. DNA-Sequenz, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 28 bis 31 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei
- ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei
- die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH , pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
3. DNA-Sequenz, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 32 bis 34 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei an der Position 34 Tyrosin ausgenommen ist und ferner
- ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei
- die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
4. DNA-Sequenz, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
- im Bereich der Positionen 30 bis 34 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind, wobei
- ggf. N-terminal (Position +1) um eins bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist, wobei
- die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
5. DNA-Sequenz, die eine Variante von PTH(1-84) kodiert, bei der
(a) der Bereich der Positionen 28 bis 34 und insbesondere 30 bis 34 unverändert ist oder
(b) im Bereich der Positionen 28 bis 34 und insbesondere 30 bis 34 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind und
zusätzlich zu (a) oder (b) außerhalb des Bereichs der Positionen 28 bis 34 bzw. 30 bis 34 eine oder zwei Aminosäuren gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht sind und - ggf. N-terminal (Position +1) um eine bis zwei Aminosäuren verlängert ist und ggf. zusätzlich C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminosäuren verkürzt ist oder
- ggf. N-terminal (Position +1) und/oder C-terminal (Position +84) um eine oder mehrere Aminsäuren verkürzt ist, wobei
- die Gesamtheit der von der DNA-Sequenz kodierten Aminosäuren nicht in einer Reihenfolge angeordnet ist, die in bPTH, pPTH, rPTH, cPTH oder hPTH auftritt.
6. DNA-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine PTH-Variante kodiert, die N-terminal um Prolin verlängert ist.
7. DNA-Sequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine hPTH-Variante, bPTH-Variante, pPTH-Variante, rPTH-Variante oder cPTH-Variante kodiert.
8. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert wird.
9. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es als Hybridpeptid die Aminosäuresequenz eines Peptids gemäß Anspruch 8 umfaßt.
10. Expressionsvektoren mit den DNA-Sequenzen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Expression eines Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9 in einem bakteriellen Wirt wie Escherichia coli.
11. Bakterieller Wirt, insbesondere Escherichia coli, mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 10.
12. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, gegebenenfalls in Form eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 10 oder eines bakteriellen Wirts wie Escherichia coli gemäß Anspruch 11 zur Herstellung eines Peptids gemäß Anspruch 8 oder 9.
13. Therapeutische Zusammensetzung, bestehend aus oder mit einem Gehalt an einem Peptid gemäß Anspruch 9 oder einem Peptid gemäß Anspruch 9, wobei Tyrosin an der Position 34 nicht ausgenommen ist, ggf. neben übl ichen Trägern und Hilfsmitteln.
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