JPH03504201A

JPH03504201A - Ｐｔｈ変種をコードするｄｎａ配列、ｐｔｈ変種、発現ベクター、細菌宿主、利用と治療用組成物

Info

Publication number: JPH03504201A
Application number: JP2503486A
Authority: JP
Inventors: ヴィンゲンダー，エトガル; ミールケ，ハイコ; ベルクツ，ギゼラ; シュリューター，クラウス・ディーター; マイエル，フーベルト
Original assignee: ゲゼルシャフト・フュア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング　（ゲー・ベー・エフ）
Priority date: 1989-02-23
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1991-09-19
Also published as: US5455329A; EP0411096A1; WO1990010067A1; US5457047A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＴＨ変種をコードするＤＮＡ配列、ＰＴＨ変種、発現ベクター、細菌宿主、利用と治療用組成物。

副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は血漿中のカルシウムの量を調節しそれによって中でも骨格に対して形成、分解作用を発揮するが、又カルシウムの再吸収も腎臓によって強化される。これがこのＰＴＨの骨形成効果を骨粗髭症の臨床治療に利用できるという根拠である（Ｊ、　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ＋ＬＩ　Ｒｅｓ、、　１　（１９８７）　３７７−３８２参照）。

これに就いて、ＰＴＨの種々の機能はホルモン分子の種々の領域の作用であると指摘されており、例えばＮ末端から部位３４迄のアミノ酸が、該ホルモンとその腎細胞の受容体との結合とそれに続くアデニル酸シクラーゼの刺激とを仲介する（Ａｄｖ−Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｔｎ、、　３２（１９Ｂ２）　３２３−３９５参照）が、一方マイトジエン効果は中間領域の配列２８〜４８に由来しく西独特許公報３７２５３１９．０参照）、これはアデニル酸シクラーゼではなく、恐らくプロティンキナーゼＣを介して仲介される。従って、ＰＴＨ又はＰＴＨフラグメントのアミノ酸配列を目的に応じて変更して個々のホルモン効果を調節し、場合によってはホルモンの異化作用を抑えてその同化作用を強化することは充分検討に値する課題のように思われる。

公知の技術としては、米国特許４０８６１９６．４４２３０３７．並びにＪｏｈｎ等のＡｄｖ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｗ、、　３２　（１９８２）　３２３がある。

これに対して本発明は、一部位１〜１７の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミン酸と置換されており、その際一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が−個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは一場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だ（す短縮され、その際ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ，ｐＰＴＨＳｒＰＴＨ，ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列を提供する。

もう一つの実施態様は、一部位２８〜３１の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が−個乃至二個のアミノ酸だ（す延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際ＤＮＡ配列にょってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ，ｐＰＴＨ，ｒＰＴＨ，ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列を提供する。

更にもう一つの実施態様は、一部位３２〜３４の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際部位３４でチロシンが取り出され、更−場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が−個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは一場合によっては、Ｎ末端（部位÷１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が− 個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ，ｐＰＴＨ，ｒＰＴＨ，ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列を提供する。

更に又もう一つの実施態様は、一部位３０〜３４の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が−個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位÷８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨＳｐＰＴＨＳ　ｒＰＴＨ，ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列を提供する。

或いは又もう一つの実施態様は、（８１部位２８〜３４の範囲、特に３０〜３４の範囲は変更されないか、又は（ｂｌ　　部位２８〜３４の範囲、特に３０〜３４の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、且つｔａｌ又は（ｂｌに加えて、部位２８〜３４、もしくは３０〜３４の範囲外で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、且つ一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が−個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは一場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が−個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ。

ｐＰＴＨＳ　ｒＰＴＨＳｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないよ・うな一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列を提供する。

好ましくはＤＮＡ配列は、Ｎ末端がプロリンだけ延長された一個のＰＴＨ変種をコードする。更にｈＰＴＨ変種、ｂＰＴＨ変種、ｐＰＴＨ変種、ｒＰＴＨ変種又はｃＰＴＨ変種が好ましい。

ＤＮＡ配列の番号に就いては、第一のＰＴＨコドンの第一のヌクレオチドの番号を１としており、第１表に示した番号は第一のＰＴＨコドンの第一のヌクレオチドから数えたそれぞれの最初に示したヌクレオチドの部位の番号である。

もう一つの実施態様によれば、本発明は、前記請求項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列によってコードされたＰＴＨ変種、特にヒト（ｈ）、ウシ（ｂ）、ブタ（ｐ）、ネズミ（ｒ）又はトリ（ｈ）のＰＴＨ変種に関する。

本発明によるＰＴＨ変種は形態上次の四つのグループに分類できる。

グループ１：部位２７及び２９の類似のアミノ酸置換で、アデニル酸シクラーゼ及びＤＮＡ合成の両方の刺激が得られる（「機能的ＰＴＨ相当」）、例えば０２９Ｎ、　Ｋ２７Ｒ。

グループ２：部位２９〜３１もしくは３３〜３４の範囲での別種のアミノ酸置換（電荷反転又は消滅、水素結合の変更、疎水性の転化を伴う変更）並びに部位３２の置換で、これはＤＮＡ合成の刺激を著しく抑え、且つアデニル酸シクラーゼに対する効果が更に得られる、例えばＱ２９Ａ、　Ｈ３２Ｌ、　Ｈ３２に、　Ｈ３２Ｒ０グループ３：部位１〜２７の範囲での別種のアミノ酸置換（前記の進の例：Ｅ４Ｒ，Ｅ４Ｒ／Ｒ２０Ｅ、　Ｋ１３Ｐ、に２７Ｌ、ＤＮＡ合成に影響しない例：Ｒ２０Ｅ。

グループ４：部位１〜２７の範囲での別種のアミノ酸置換で、アデニル酸シクラーゼの刺激が得られるが、ＤＮＡ合成の刺激は減少する、例えばＬＬＩＫ。

最後に本発明は、本発明のＰＴＨ変種を有するハイブリッドペプチド、本発明のタンパク質を発現するための発現ベクター、発現ベクターのための細菌宿主、例えば大腸菌、本発明のペプチドを産生ずるためのＤＮＡ配列の利用並びにこれらのペプチドを含有する治療用組成物に関する。関係のある公知の技術としては西独特許公報３７２５３１９．０及び西独特許公報３７２５３２０．４がある。

次に本発明を実施例並びに二つの表により詳細に臣明する。

１遣史上西独特許公報３７２５３１９．０の発現プラスミドｐＥＸ−ｐＰＴＨを出発点とし、このプラスミドの塩基１２３対の長さのＢａｍＨＩ／Ｓｓｔ　ＩフラグメントをファージベクターＭ１３ｍｐ１８にクローニングした。こうして、合成オリゴヌクレオチドを用いて、Ｇａｐｐｅｄ−Ｄｕｐｌｅｘ−Ｍｅｔｈｏｄ　（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、　１００　（１９８３）　４６８−５００）により第１表に挙げた変異体を度合タンパクを発現し精製し分割した。このようにして遊離したＰＴＨ変種を西独特許公報３７２５３１９．０及び西独特許公報３７２５３２０．４に準じて精製した。このカルボキシメチルセルローズによる精製はバッチ式で行った。続いて逆相高性能液体クロマトグラフィーを用いて精製して、均質な物質を得た。

内試験（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１８８　（１９８０）　６４９−６５６）により、ブタの副腎皮質の分離した膜の中のアデニル酸シクラーゼを刺激する能力を試験した。

更に西独特許公報３７２５３１９．０及び西独特許公報３７２５３２０．４に準じてトリの胎児の軟骨細胞のＤＮＡ合成を促進する能力を検討した。

得られた結果を第２表に示す。

蔗ｊ目本呼ｐεＸ　　　　　　　　　　Ｇｅｎｏｆｉｔ　ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＭ１３ｍｐ１８　　　　　　　ＧＩＢＣＯ８ＲＬｈＰＴ）ｌ遺伝子　　　Ｐ　３３１２９２８．２ｂＰ’ＴＨ遺伝子　　　ＰＮＡＳ、　７８　（１９８１）　７３６５ｐＰＴＨ遺伝子　　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５　（１９８７）　６７４０ｒＰＴＨ遺伝子　　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５　（１９８７）　６７４０ｃＰＴ）ｌ遺伝子　　　Ｊ、　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒａｌ、　Ｒｅｓ、、　３　（Ｓｕｐｐｌ、ｌ）　（１９８８）Ｐｏｓｔｅｒ　Ｎｏ、３０９上述のＰＴＨ遺伝子はペプチド合成機を用いて産生ずることができる。

以下余白ｌ上ｉ　　ｈＰＴＨ遺伝子での変異と生成したＰＴ）Ｌ変種主−血　　旦凡人り五　　　　　　　　　Ｉ工り並ｌ及Ｅ４ＲＡＧＴ　ＡｆＪ、＾ＡＴＴ　　　　　　　　　Ｇｌｕ（４）　−”Ａｒｇ（４）ＬＩＩＫ　　　　　ＡＡＣＡＡＧ　ＧＧＡ　’　　　　　　　　Ｌｅｕ（１１）＝Ｌｙｓ（１１）Ｇ１２Ｐ　　　　　ＣＴＣＣＣＧ　ＡＡＡ　　　　　　　　　Ｇｌｙ（１２）→Ｐｒｏ（１２）に１３Ｐ　　　　　ＧＧＣＣＣＡ　ＣＡＴ　　　　　　　　　Ｌｙｓ（１３）　→Ｐｒｏ（１３）Ｋ１３Ｓ　　　　　ＧＧＣＴＣＣＣＡＴ　　　　　　　　　Ｌｙｓ（１３）　−３ｅｔ（１３）に１３Ｌ　　　　　ＧＧＣＣＴＧ　ＣＡＴ　　　　　　　　　Ｌｙｓ（１３）　−Ｌｅｕ（１３）Ｇ１２Ｎ、Ｋ１３Ｓ　　ＡＡＴ　ＴＣＣＣＡＴ　　　　　　　　　Ｇｌｙ（１２）、Ｌｙｓ（１３）−Ａｓｎ（１２）、５ｅｔ（１３）Ｒ２０ＲＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＴＡ　　　　　　　　　Ａｒｇ（２０）　→Ｇｌｕ（２０）に２７Ｌ　　　　　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　　　　　　　　　Ｌｙｓ（２７）　−Ｌｅｕ（２７）Ｋ２７ＲＡＡＧ　ＣＧＴ　ＣＴＧ　　　　　　　　　Ｌｙｓ（２７）　−Ａｒｇ（２７）Ｑ２９＾　　　　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　　　　　　　　　Ｇｉｎ（２９）−Ａｌｔ（２９）Ｇ２９Ｎ　　　　　ＣＴＧ　ＡＡＣＧＡＴ　　　　　　　　　ＧＩｎ（２９）−Ａｓｎ（２９）Ｈ３２Ｌ　　　　　　　　ＧＴＡ　　ＣＴＣＡＡＴ　　　　　　　　　　　　　　　）＋１ｓ（３２）−”Ｌｅｕ（３２）Ｒ３２ＲＧＴＧ　ＣＧＣＡＡＴ　　　　　　　　　Ｈｉｓ（３２）→Ａｒｇ（３２）Ｒ３２ＲＧＴＧ＾＾Ｇ　ＡＡＴ　　　　　　　　）ｌｉｓ（３２）→Ｌｙｓ（３２））１３２ｓ　　　　　ＧＴＴ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　　　　　　　　　Ｈ４５（３２）−”５ｅｔ（３２）国際調査報告ｍ　Ａ−ｍ−”＠ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００３１２国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．−部位１〜１７の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際 −場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が一個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは−場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際 −ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ、ｐＰＴＨ、ｒＰＴＨ、ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列。２．−部位２８〜３１の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際 −場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が一個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは−場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際−ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ、ｐＰＴＨ、ｒＰＴＨ、ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような −個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列。３．−部位３２〜３４の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際部位３４でチロシンが取り出され、更に −場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が一個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは−場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際−ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ、ｐＰＴＨ、ｒＰＴＨ、ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列。４．−部位３０〜３４の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、その際 −場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が一個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは−場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際−ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ、ｐＰＴＨ、ｒＰＴＨ、ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列。５．（ａ）部位２８〜３４の範囲、特に３０〜３４の範囲は変更されないか又は（ｂ）部位２８〜３４の範囲、特に３０〜３４の範囲内で一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、且つ（ａ）又は（ｂ）に加えて、部位２８〜３４、もしくは３０〜３４の範囲外で、一個又は二個のアミノ酸が他の一個のアミノ酸と置換されており、且つ −場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）が一個乃至二個のアミノ酸だけ延長され、更に場合によっては、Ｃ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮されており、或いは−場合によっては、Ｎ末端（部位＋１）及び／又はＣ末端（部位＋８４）が一個又は複数のアミノ酸だけ短縮され、その際−ＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸が全体としてｂＰＴＨ、ｐＰＴＨ、ｒＰＴＨ、ｃＰＴＨ又はｈＰＴＨに出現する順序に配列されていないような一個のＰＴＨ（１〜８４）の変種をコードするＤＮＡ配列。６．Ｎ末端がプロリンだけ延長された一個のＰＴＨ変種をコードすることを特徴とする、前記請求項の何れか１項に記載のＤＮＡ配列。７．一個のｈＰＴＨ変種、ｂＰＴＨ変種、ｐＰＴＨ変種、ｒＰＴＨ変種又はｃＰＴＨ変種をコードすることを特徴とする、前記請求項の何れか１項に記載のＤＮＡ配列。８．前記請求項の何れか１項に記載のＤＮＡ配列によりコードされていることを特徴とするペプチド。９．ハイブリッドペプチドとして請求項８記載の一個のペプチドのアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。ｌ０．大腸菌のような一個の細菌宿主中で請求項８又は９記載の一個のペプチドを発現するための、前記請求項のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクター。１１．請求項１０記載の発現ベクターを有する細菌宿主、特に大腸菌。１２．前記請求項の何れか１項に記載のＤＮＡ配列、場合によっては請求項１０項記載の発現ベクター或いは請求項１１記載の細菌宿主例えば大腸菌の形でのＤＮＡ配列の、請求項８又は９記載の一個のペプチドを産生するための利用。１３．部位３４のチロシンが取り出されていない、請求項８記載の一個のペプチド又は請求項９記載の一個のペプチドから成り或いはこれを含み，場合によってはこれに通常の担体と助剤とを加えて成る治療用組成物。