EP0425549A1 - Nouvelles proteins, adn les codant et leur usage - Google Patents

Nouvelles proteins, adn les codant et leur usage

Info

Publication number
EP0425549A1
EP0425549A1 EP19890908192 EP89908192A EP0425549A1 EP 0425549 A1 EP0425549 A1 EP 0425549A1 EP 19890908192 EP19890908192 EP 19890908192 EP 89908192 A EP89908192 A EP 89908192A EP 0425549 A1 EP0425549 A1 EP 0425549A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cag
gaa
aag
amino acid
aaa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
EP19890908192
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Armand Tavitian
Véronique PIZON
Pierre Chardin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of EP0425549A1 publication Critical patent/EP0425549A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes

Definitions

  • the subject of the invention is new amino acid sequences, the nucleic acids coding for these amino acid sequences and their applications, in particular for diagnosis, in. in vitro, pathologies linked to the action of oncogenic factors.
  • Protooncogenes such as H-ras, K-ras and N-ras are known (De Feo et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3328-3332; Ellis et al., ( 1981), Nature, 292, 506-511; Shimizu et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 383-387) and new genes have been identified in a wide variety of organisms on the basis of their homology with the mammalian ras gene.
  • the proteins encoded by these genes close to the ras genes have 50 to 30% homology with the ras proteins (Chardin et al., (1986) EMBO J., 5, 2203-2208; Madaule et al., (1985) Cell, 41, 31-40; Touchot et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8210-8214).
  • Ras proteins and proteins close to ras proteins have molecular weights of about 21,000 to 24,000 d. Ras proteins are active when associated with GTP (Guanosine 5'-triphosphate) and are inactive when associated with GDP (Guanosine 5'-diphosphate) and the hydrolysis of GTP takes place by the action of their low activity.
  • GTP GTP
  • GDP GTP
  • intrinsic GTPase Paperageorge et al., (1982) J. Virol., 44, 509-519; Mcgrath et al., (1984) Nature, 310, 644-649).
  • the transforming ras proteins detected in human tumors very frequently exhibit a substitution of the amino acids located in the GTP binding domain, in position 12, 13 or 61 (Barbacid (1987) Annual Review of Biochemistry, 56, 779-827).
  • This domain plays an essential role in the regulation of the biological properties of ras proteins.
  • the GTP binding site consists of four non-contiguous regions which belong to all ras proteins.
  • One aspect of the invention is to propose new amino acid sequences, having the ability to fix GTP and GDP and having GTPase activity.
  • One of the other aspects of the invention is to propose new nucleic acids coding for amino acid sequences exhibiting interesting biological properties.
  • One of the other aspects of the invention is to propose screening means, in . in vitro, certain pathologies linked either to protein contents located outside the range of values that they generally have in a healthy individual, or to mutations in these proteins.
  • the subject of the invention is new amino acid sequences characterized in that they contain at least one of the following amino acid sequences: MREYKLWL (I)
  • amino acid sequences are written in such a way that the leftmost end corresponds to the N-terminal end of the first amino acid delimiting the above sequences and i _ the rightmost end corresponds to the end C-terminal of the last amino acid delimiting the above-mentioned sequences.
  • amino acid sequences of the invention contain at least one of the sequences (I), (II), (III), (IV) or (V) defined above.
  • the invention contains at least one of the sequences (VII), (VIII), (IX) or (X) defined above.
  • the invention contains at least one of the sequences (XI), (XII), (XIII), (XIV) or (XV) defined above.
  • amino acid sequences of the invention comprise a threonine in position 61.
  • the amino acid sequences of the invention are such that the fourth amino acid from the last C-terminal amino acid is a cysteine.
  • amino acid sequences contain the 5 sequences (I), (II), (III), (IV) and (V) defined above.
  • amino acid sequences according to the invention comprise the 5 sequences indicated above, these are advantageously located, from left to right, in the order (I) - (II) - (III) - (IV ) - (V), these sequences also being advantageously non-contiguous.
  • amino acid sequences contain the 5 sequences (VII), (VIII), (IX) and (X) defined above.
  • amino acid sequences according to the invention comprise the 5 sequences indicated above, these are advantageously located, from left to right, in the order (VII) - (VIII) - (IX) - (X ), these sequences being also advantageously non-contiguous.
  • amino acid sequences contain the 5 sequences (XI), (XII), (XIII), (XIV) and (XV) defined above.
  • amino acid sequences according to the invention comprise the 5 sequences indicated above, these are advantageously located, from left to right, in the order (XI) - (XII) - (XIII) - (XIV) - (X), these sequences being also advantageously non-contiguous.
  • Particularly advantageous amino acid sequences according to the invention contain the chain of amino acids XVI, shown in FIG. 1.
  • Particularly advantageous amino acid sequences according to the invention consist of the chain of amino acids XVI, shown in FIG. 1.
  • Particularly advantageous amino acid sequences according to the invention contain the chain of amino acids XVII, shown in FIG. 2.
  • Particularly advantageous amino acid sequences according to the invention consist of the chain of amino acids XVII, shown in FIG. 2.
  • Particularly advantageous amino acid sequences according to the invention contain the chain of amino acids XVIII, shown in FIG. 3.
  • Particularly advantageous amino acid sequences according to the invention consist of the chain of amino acids XVIII, shown in FIG. 3.
  • amino acid sequences XVI, XVII and XVIII will also be designated respectively by RAP1A, RAP1B and RAP2 in the remainder of the text.
  • amino acid sequences have a threonine at position 61 and a cysteine 4 amino acids from the last C-terminal amino acid.
  • the position of a determined amino acid is identified with respect to the first amino acid of the sequence whereas for the nucleotide sequences (also appearing in FIGS. 1, 2 and 3) the position of a determined nucleotide is identified with respect to the first nucleotide.
  • amino acid sequences have interesting biochemical and biological properties: they have the capacity to fix GTP and GDP and exhibit GTPase activity.
  • amino acid sequences are also likely to bind to the intracellular membrane.
  • amino acid sequences can be modified as long as they retain the biochemical and biological properties of the amino acid sequences (XVI), (XVII) and (XVIII) defined above.
  • amino acid sequences falling within the scope of the invention can be distinguished from the amino acid sequences defined above:
  • amino acid sequences (XVI), (XVII) and (XVIII) having mutations in position 12 (that is to say replacement of glutamine in 12 by any what other amino acid).
  • amino acid sequences (XVI), (XVII) and (XVIII) having mutations at position 61 (that is to say replacement of threonine at 61 with any which other amino acid and in particular by glutamine and valine).
  • the invention also relates to the amino acid sequences containing at least one of the amino acid sequences encoded by the following nucleotide sequences:
  • nucleic acids containing at least one of the sequences of nucleotides coding for the amino acid sequences defined above.
  • the nucleic acids belong to the human genome.
  • nucleic acids of the invention code for the sequences of amino acids I to XVIII defined above. According to yet another advantageous embodiment, the nucleic acid sequences of the invention code for the amino acid sequences containing the sequences XVI, XVII and XVIII defined above. According to another advantageous embodiment of the invention, the nucleic acid sequences of the invention code for the sequences of amino acids XVI, XVII and XVIII defined above.
  • GTT GAA GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7) CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA
  • the nucleic acids of the invention contain the five sequences of nucleotides (1), (2), (3), (4) and (5), defined above.
  • the nucleic acids of the invention contain the five sequences of nucleotides (6), (7), (8), (9) and (10), defined above.
  • the nucleic acids of the invention contain the five sequences of nucleotides (11), (12), (13), (14) and (15), defined above.
  • the nucleic acids of the invention contain the sequence of nucleotides (16), delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 43 and 594 in FIG. 1.
  • the nucleic acids of the invention consist of the sequence of nucleotides (16), delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 43 and 594 in FIG. 1.
  • the nucleic acids of the invention contain the sequence of nucleotides (19) delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located in positions 1 and 605 of FIG. 1.
  • the nucleic acids of the invention consist of the sequence of nucleotides (19) delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located in positions 1 and 605 of FIG. 1.
  • the nucleic acids of the invention contain the sequence of nucleotides (17), delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 54 and 605 in FIG. 2.
  • nucleic acids of the invention consist of the sequence of nucleotides (17), delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 54 and 605 in FIG. 2.
  • the nucleic acids of the invention contain the sequence of nucleotides (20) delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 1 and 838 in FIG. 2.
  • nucleic acids of the invention consist of the sequence of nucleotides (20) delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located in positions 1 and 838 of FIG. 2.
  • the nucleic acids of the invention contain the sequence of nucleotides (18), delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 4 and 552 in FIG. 3.
  • nucleic acids of the invention consist of the sequence of nucleotides (18), delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 4 and 552 in Figure 3.
  • the nucleic acids of the invention contain the sequence of nucleotides (21) delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 1 and 558 in FIG. 3.
  • nucleic acids of the invention consist of the sequence of nucleotides (21) delimited by the end nucleotides corresponding to the nucleotides located in positions 1 and 558 of FIG. 3.
  • the nucleic acids (16), (17), (18), (19), (20) and (21) of the invention all have the particularity of hybridizing with the Dras-3 gene of Drosophila as shown in FIG. 5, under the weakly stringent conditions defined below: hybridization at 60 ° C. in 5X SSC, 5X Denhardt, 0.1% SDS and 100 ⁇ g / ml of DNA from salmon sperm, last washing in 2X SSC and 0.1% SDS, at 60 ° C for about 15 min.
  • nucleic acids (16), (17), (18), (19), (20) and (21) can be modified as soon as the amino acid sequences which they encode retain their biochemical and biological properties.
  • nucleic acids - by addition and / or - deletion of one or more nucleotides and / or modification of one or more nucleotides, provided that the sequence thus formed is capable of hybridizing with the same RNA or DNA sequence as the corresponding sequence unmodified, and that the amino acid sequences, encoded by these nucleic acids, retain the biochemical and biological properties indicated above.
  • nucleic acids (16) and (19) can also be characterized by the restriction map which is the subject of FIG. 7.
  • nucleic acids (17) and (20) can also be characterized by the restriction map which is the subject of FIG. 8.
  • the nucleic acids (18) and (21) can also be characterized by the restriction map which is the subject of FIG. 9.
  • restriction maps should not be interpreted as having a limiting character in order to identify the nucleic acids comprising respectively the sequence indicated above.
  • Equivalent nucleic acids could also be defined by a restriction map having a community with the previously defined restriction maps of at least 50% of the restriction sites, located in the same order.
  • the invention also relates to the probes used to characterize the nucleic acids described above.
  • probes are defined by their ability to hybridize with the above nucleic acids or their complementary sequences under the following hybridization conditions:
  • the hybridization conditions are as follows: actual hybridization: 60 ° C, 5X SSC , 5X Denhardt, 0.1% SDS, 100 ⁇ g / ml of DNA 'of salmon sperm; washing: 60 ° C, 2X SSC, 0.1% SDS, 30 min;
  • the hybridization conditions are as follows: actual hybridization: 45 ° C, 5X SSC, 5X Denhardt , 0.1% SDS, 100 ⁇ g / ml DNA " of salmon sperm;
  • 2nd wash 45 ° C, 2X SSC, 0.1% SDS, 30mn.
  • oligonucleotide probe for identifying the nucleic acid sequences of the invention it is possible, for example, to use the probe constituted by the following oligonucleotide sequence: GAA ATC CTG GAT ACT GCA GGG ACA GAG CAA TTT or the corresponding complementary sequence.
  • nucleic acids (18) and (21) of the invention it is possible, for example, to use as a probe the sequence of oligonucleotides delimited by the nucleotides corresponding to the nucleotides located at positions 451 and 558 of FIG. 3, or the corresponding complementary sequence.
  • the invention also relates to a recombinant nucleic acid characterized in that it contains a nucleic acid as described above, inserted into a heterologous nucleic acid with respect to the above fragment.
  • the above heterologous nucleic acid may consist of a nucleic acid or a nucleic acid fragment belonging to a bacterium or even to a eukaryotic cell, said bacterium or said eukaryotic cell being chosen as the expression system of a DNA fragments described above.
  • heterologous nucleic acid suitable for carrying out the invention may also consist of a plasmid or a phage.
  • the invention further relates to a recombinant vector, in particular for the cloning and / or expression of a nucleic acid according to the invention, said vector being in particular of the plasmid or phage type, characterized in that it contains an acid recombinant nucleic acid as defined above, containing the above nucleic acid at one of the sites not essential for its replication.
  • This recombinant vector can thus be formed by the preceding heterologous DNA insofar as this constitutes an autonomous replication system.
  • the above recombinant vector is an expression vector containing, in one of its sites which are not essential for its replication, elements necessary to promote expression, in a cellular host , a nucleic acid coding for an amino acid sequence of the invention, a promoter compatible with said cellular host, in particular an inducible promoter, and optionally a signal sequence and / or an anchoring sequence.
  • Another recombinant vector is characterized in that it contains the elements making it possible to insert a nucleic acid, described above, in a yeast and the expression of this nucleic acid in this yeast.
  • Other eukaryotic cells may be chosen to insert the recombinant vector containing the nucleic acid of the invention, this choice being oriented by the capacity of said eukaryotic cell to organize the expression of said nucleic acid.
  • the invention also relates to cellular hosts transformed by a recombinant vector such as those described above, which vector is capable of replicating in said microorganism.
  • a first preferred cellular host is constituted by E.coli transformed by a recombinant vector as described previously.
  • yeast transformed with a recombinant vector is Saccharo yces Cere% 'isiae.
  • cellular hosts can also be used.
  • the invention naturally relates to the expression product of each of the microorganisms transformed by one of the recombinant vectors described in the preceding pages.
  • the invention also relates to a process for the preparation of the new peptides mentioned above by synthesis which comprises either the step-by-step addition of the chosen peptide residues, with the addition or the removal of any protective groups from the amino and carboxyl functions, or addition of selected peptide residues in order to produce fragments followed by condensation of said fragments into an appropriate amino acid sequence, with addition or elimination of the protective groups chosen.
  • the invention also relates to a process for the preparation of an amino acid sequence in accordance with the description above, characterized in that: a cell host cultivated beforehand with a suitable vector containing is cultivated in an appropriate culture medium a previously defined nucleic acid,
  • the process for preparing a determined amino acid sequence can be characterized in particular by culturing E.coli transformed with a recombinant vector described above and by stopping the culture at the end of the exponential growth phase of said E.coli, and recovery of the amino acid sequence determined from the culture medium free of other proteins and exocellular enzymes capable of being secreted by E.coli.
  • the process for the preparation of a determined amino acid sequence can also be applied to a yeast transformed by a recombinant vector as described above, this yeast being placed in culture in an appropriate medium and said culture being stopped at the end of the exponential phase. growth of the yeast used.
  • the invention also relates to antibodies directed against the above amino acid sequences.
  • the invention relates to monoclonal antibodies.
  • Such monoclonal antibodies can be produced by the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below.
  • one of the above amino acid sequences is inoculated into a chosen animal, the B lymphocytes of which are then capable of producing antibodies against this amino acid sequence. These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" yelomatous cells to give rise to hybridomas. From the heterogeneous mixture of cells thus obtained, a selection is then made of the cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely. Each hybridoma is multiplied in the form of an olone, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties with respect to the amino acid sequences of the invention can be tested, for example on an affinity column.
  • the invention also relates to a method of in vitro screening of the above-mentioned amino acid sequences, from a biological sample capable of containing them.
  • a screening method according to the invention can be carried out either using the above-mentioned monoclonal antibodies, or using the oligonucleotide probes described above.
  • the abovementioned biological sample is taken either from fluid tissues, such as blood, or from organs, the latter type of sample making it possible in particular to obtain fine sections of tissue on which the above-mentioned antibodies are subsequently fixed.
  • the screening method according to the invention proceeding by means of the abovementioned antibodies notably comprises the following steps:
  • the antibodies used for the implementation of such a method are labeled in particular in an enzymatic or radioactive manner.
  • Such a method according to the invention can in particular be carried out according to the ELISA method (enzyme linked sorbent assay) which comprises the following steps:
  • the above-mentioned antibodies are not labeled and the detection of the immunological complexes formed between the amino acid sequences and said antibodies is carried out using a labeled immunoglobulin recognizing said complexes.
  • the screening method according to the invention can also be carried out by an immunoenzymatic technique according to a mechanism of competition between the amino acid sequences likely to be contained in the biological sample, and predetermined quantities of these same sequences of amino acids, vis-à-vis the above-mentioned antibodies.
  • the amino acid sequences of the invention in a predetermined amount are advantageously labeled using an enzymatic marker.
  • the invention is in no way limited to the embodiments described above for the in vitro screening of the amino acid sequences of the invention, this screening can be carried out using any other immunological method, in particular immunoenzymatic currently known. .
  • the invention also relates to a method of in vitro screening of the amino acid sequences of the invention carried out from a biological sample capable of containing nucleic acids coding for said amino acid sequences, characterized in that it includes: - contacting at least one of the oligonucleotide probes described above with the above-mentioned biological sample; - Detection using any appropriate means of any hybridization complexes formed between the probes and the abovementioned nucleic acids.
  • the abovementioned biological sample is, prior to the implementation of the screening, treated so that the cells which it contains are lysed, and in that the genomic material contained in said cells is fragmented using restriction enzymes such as EcoRI, Ba HI etc.
  • the oligonucleotide probes are labeled using an enzymatic or radioactive marker. These probes are placed on an appropriate support, in particular on a nitrocellulose or other filter, for example nylon, on which is then added the biological sample treated as indicated above.
  • the subject of the invention is also a method of in vitro diagnosis of diseases correlated with amino acid sequence contents of the invention situated outside the domain delimited by the extreme values generally corresponding to the physiological state of a healthy individual, by implementing one of the screening methods in . vitro mentioned above.
  • a subject of the invention is also kits or kits for implementing the above-mentioned in vitro screening methods.
  • kits include in particular: a determined quantity of at least one of the above-mentioned monoclonal antibodies capable of giving rise to a specific immunological reaction with one of the amino acid sequences of the invention;
  • a medium suitable for the formation of an immunological reaction between the amino acid sequences and the abovementioned antibodies advantageously reagents allowing the detection of the immunological complexes produced during the abovementioned immunological reaction.
  • kits used include, for example:
  • a medium suitable for the formation of a hybridization reaction between the nucleic acids and the above-mentioned probes advantageously, reagents allowing the detection of the hybridization complexes produced during the above-mentioned hybridization reaction.
  • amino acid sequences according to the invention have interesting reverting properties.
  • one of the normal and mutated RAPIA, RAPIB or RAP2 nucleotide sequences is inserted into a eukaryotic expression vector with a strong promoter such as LTR,
  • transfections are carried out using the above vector on cells which have been previously transformed by the RAS gene,
  • these cells are co-transfected with the RAPIA or RAPIB or RAP2 gene and a gene for resistance to an antibiotic, for example neomycin, as a selection marker,
  • RAPIA or RAPIB or RAP2 gene on the one hand in RNA and on the other hand in proteins directly responsible for reversion is observed.
  • the cDNAs corresponding to the RAPIA and RAP2 genes were inserted into eukaryotic expression vectors and transferred by transfection into different cell lines, for example fibroblastic cells in culture of murine origin N.IH3T3 in the case of RAPIA and RATl in the case of RAP2.
  • the RAP2 gene cDNA does not seem to confer any particular phenotype when it is expressed in normal fibroblasts.
  • its overexpression in lines transformed by the oncogenes li ⁇ ras and Ki-ras is correlated with a phenotypic reversion of these cells towards an untransformed phenotype;
  • - rabbit polyclonal antibodies have been generated against the proteins RAPIA and RAP2 or peptides derived from their sequence.
  • the antibodies obtained specifically recognize the RAPIA or RAP2 proteins and show no cross-reaction with the H-ras protein; the use of these antibodies to immunoprecipitate the RAP2 protein in cell lines overexpressing the has shown that c "is a membrane protein. It is synthesized as a precursor that is rapidly modified to give birth to the form mature of the protein; it is relatively stable in vivo with a metabolic half-life of around 12-24 h.
  • amino acid sequences of the invention having the reversion properties indicated above are capable of being used for the therapeutic treatment of diseases linked to the RAS genes or of diseases in which the RAP gene could be involved, either by mutation, or by bad expression in certain cells.
  • the gene which codes for one of the amino acid sequences of the invention is introduced into an expression vector, which must be compatible with the cells to which it is intended to direct them and whose promoters must also be compatible with said cells.
  • the vector is then targeted so that it goes to be fixed in the targeted cells, so that they phagocytize it and that it is released and expressed in said cells.
  • a cDNA library constructed in phage A gt10 is used from AR.m of human B lymphocyte cells (Raji line) and screened under weakly stringent hybridization conditions (defined below in the paragraph entitled " Materials and methods ”) with the complete insert of Drosophila Dras-3 DNA.
  • phages are isolated from 100,000 recombinant phages.
  • the EcoRI inserts are purified, subjected to cross-hybridization reactions with one another under strongly stringent conditions (defined below in the section entitled "Materials and methods") and are partially sequenced. We can thus identify two categories of clones, 14 deriving from the same gene and a fifteenth deriving from another neighboring gene.
  • the first family clone is designated by RAPIA and the second family clone by RAP2.
  • Figure 4 shows the hybridization profile of the cellular genes RAPIA (1) and RAP2 (2).
  • the size of the fragments determined by the HindIII marker is shown on the left in kilo base pairs.
  • Nucleotide sequence of the cDNAs of RAPIA and RAP2 The nucleotide sequence of the inserts of 1450 base pairs and 980 base pairs of the cDNAs of RAPIA and RAP2 is determined.
  • FIGS. 1 and 3 also show the nucleic acid sequences coding for RAPIA and RAP2 respectively.
  • the RAPIA and RAP2 proteins consist respectively of peptide sequences of 184 and 183 amino acids, including the initial methionine, and have a calculated molecular weight of 20,900 and 20,700d, respectively.
  • the percentages are 78.5% for the Dras-3 protein of Drosophila, 59.5% for K-ras, 56 % for ral and 63% for R-ras.
  • RAP2 protein A global cellular comparison for the RAP2 protein leads to a 48% homology with Dras-3 of Drosophila, 46% with K-ras, 38% with ral and 37% with R-ras.
  • FIG. 5 shows the alignments of the RAPIA and RAP2 proteins with the human protein K-ras (exon 4B) and the Dras-3 protein of Drosophila.
  • the reference numbering is that of the K-ras protein.
  • the attachment regions of the GTP are framed.
  • the region of the effector is underlined by 1 solid line and the region of attachment to the intracellular membrane is underlined in dotted lines.
  • ras proteins Four domains involved in the binding site to the guanine nucleotides of ras proteins (Barbacid, M. (1987) Annual Review of Biochemistry, 56, 779-827) and corresponding to the amino acid sequences 10 to 17, 57 to 63, 113 to 120 and 143 to 147 are highly conserved among the proteins RAP, K-ras and Dras-3.
  • the RAPIA and RAP2 proteins like the Dras-3 protein, have a threonine in position 61 in place of a glutamine present in all ras proteins and the proteins close to the non-oncogenic ras proteins known to date.
  • the domain of residues 32 to 42, for the ras proteins - which corresponds to the domain involved in the interaction with an effector - is identical in the protein RAPIA and ras, and differs from an amino acid in the protein RAP2 compared to the ras protein.
  • the C-Terminal region of ras proteins is characterized by the sequence Cys-AAX, in which A is an amino aliphatic acid and X has the ino acid C-Terminal (Powers et al., (1984) Cell, 36, 607- 612). This sequence is necessary for post-translational lipid binding and anchoring in the plasma membrane (Fujiyama et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1266-1270). 5) Transcription of the RAPIA and RAP2 genes:
  • RNA transfer of RNA to the membrane after gel electrorophoresis according to the technique designated by "Northern Blot".
  • Northern Blot The conditions used for the "Northern Blot” are recalled below in the paragraph entitled “Materials and methods”.
  • RNA sequences that is to say three transcripts
  • 1.600, 2.700 and 5.400 nucleotides are highlighted.
  • the probe originating from RAPIA is a polynucleotide delimited by the Pstl-BglII fragment of the sequence (19) and the first end of which, corresponding to the restriction by PstI, is shown in FIG. 7, and the second end of which corresponds to the restriction by BglII, is 520 base pairs to the right of the first end.
  • the probe originating from RAP2 is a polynucleotide delimited by the HindII-PstI fragment of the sequence 21 and the first end of which corresponds to the restriction by HindII is shown in FIG. 9 and the second end, corresponding to the restriction by PstI, is located 340 base pairs to the right of the first end.
  • FIG. 6 shows the study of the transcripts of RAPIA (column 1) and of RAP2 (column 2) after electrophoresis and transfer of polyA + mRNA extracted from human lymphocytes. The size of the different RNAs is mentioned on the left in kilobase.
  • a human library constructed in the phage Agt10, was screened with an EcoRI insert of 700 base pairs from the Drosophila cDNA clone Dras-3 (Schetjer et al., (1985 ) EMBO J., 4, 407-412).
  • the hybridization was carried out under weakly stringent conditions: namely hybridization at 60 ° C. in 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0.1% SDS, 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA. The last wash is done in 2 x SSC and 0.1% SDS at 60 ° C for about 15 min.
  • the highly stringent conditions used for the cross-hybridization of the EcoRI inserts are as follows: the hybridization is carried out under the following conditions: 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0.1% SDS and 100 ⁇ g / ml of sperm DNA salmon at 65 C C.
  • the washing is carried out with 0.1% SSC and 0.1% SDS at 65 ° C for 30 min.
  • the nucleotide sequence of the complete EcoRI insert of the RAPIA and RAP2 clones is determined using the M13 vectors by the dideoxy nucleotide chain termination method (Messing, J. (1983) Methods Enzymol., 101, 20-78 ). 7) Northern and Southern Blot analysis:
  • Hybridization is carried out under the following conditions: 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0.1% SDS and 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA at 65 ° C.
  • the washing is carried out using 0.1% SSC and 0.1% SDS at 65 ° C for 30 min.
  • cytoplasmic RNAs are prepared from peripheral blood lymphocytes (Perry et al.,
  • polyA * DNA 5 ⁇ g are fractionated on 1% formaldehyde and agarose gels, before transfer on nylon membranes (marketed under the name Pall), and the filters are hybridized with the probes originating from RAPIA and RAP2, defined above.
  • the RAPIA cDNA insert is used to screen a human cDNA library prepared in the phage ⁇ gtlO.
  • the RAPIA insert is marked with 32 P and makes it possible to identify a phage whose insert (of 2100 bp), after subcloning, is sequenced.
  • nucleic acid sequence and the amino acid sequence encoded by this nucleic acid are shown in Figure 2.
  • This amino acid sequence will subsequently be designated by RAPIB. It has a calculated molecular weight of 20,800 d.
  • EXAMPLE 3 PRODUCTION OF THE RAPIA PROTEIN IN A BACTERIAL EXPRESSION VECTOR: a) The RAPIA cDNA is subcloned for the purpose of its amplification, in the vector PUC8, at the EcoRI site. After culture, the cDNA is extracted and subjected to the restriction enzyme Bgl2, then to EcoRI, and a DNA fragment is thus recovered which corresponds to the complete region coding for the protein RAPIA.
  • the EcoRI / Bgl2 fragment is cloned into the phage M13Mpl1 at the BamHI and EcoRI sites, which makes it possible, after culturing the phage, to recover the single-stranded DNA.
  • Site-directed mutagenesis is carried out using a synthetic oligonucleotide of the following sequence: 5 'CAGATCACATATGCGTGAGTAC 3', this oligonucleotide being previously phosphorylated by the polynucleotide kinase.
  • An NDE1 site is thus introduced upstream of the ATG corresponding to the initiation of the RAPIA protein.
  • Recombinant M13Mpl1 is then prepared. To do this, the double-stranded DNA of M13Mpl1 is cut with the restriction enzyme NDE1 ' and the NDE1 site is repaired using the enzyme of Kleno.
  • Site-directed mutagenesis is carried out using the synthetic oligonucleotide of following sequence phosphorylated by the polynucleotide kinase: 5 'CCAGTGAATTCTATGCGTGAG 3'
  • This oligonucleotide makes it possible to insert a C at the ligation site of M13Mpl1 and of RAPIA and thus reconstitute an EcoRI site.
  • the phage M13Mpl1 containing the sequence RAPIA is thus obtained.
  • the RAPIA insert can be isolated by cutting the phage at the EcoRI and HindIII sites.
  • double-stranded DNA of Ml3Mpl1 is prepared. Cut with EcoRI and HindIII to prepare the RAPIA insert for cloning into a bacterial expression vector.
  • the vector used is the vector ptac-cHras.
  • the vector ptac-Hcras can be obtained from the vector pKM-tael according to the construction described in the above-mentioned article by Tucker.
  • the vector pKM-tael it can be obtained according to the construction described in the article by Hermann A. De Boer et al., PNAS, vol. 80, p. 21-25, January 1983.
  • the ptac-Hcras vector is subjected to the restriction enzyme HindIII, then to EcoRI, in a partial manner in order to keep a fragment of approximately 300 base pairs EcoRI-EcoRI which contains the inducible tac promoter.
  • the EcoRI-HindIII fragment of RAPIA is inserted into the vector thus prepared and a ligation is carried out.
  • a strain of E. coli, such as those known under the designation PRI & M15, or HB101 - PDMI vector is then transformed.
  • the RAPIA protein is then expressed in the following manner.
  • the RAPIA protein expressed by the E. coli strain is then recovered according to conventional techniques. This protein is in soluble form.
  • Example 3 The procedure is carried out as indicated in paragraph a) of Example 3, that is to say until obtaining a phage M13Mpl1 containing the sequence RAPIA cloned at the EcoRI and HindIII sites.
  • the single-stranded DNA of the phage M13Mpl1 is prepared by site-directed mutagenesis using the following synthetic oligonucleotides phosphorylated by the polynucleotide kinase:
  • a glutamine is introduced in place of threonine in the context of the oligonucleotide (A) and a valine in place of threonine in the context of the oligonucleotide (B).
  • the procedure is as indicated in Example 4.
  • the site-directed mutagenesis is carried out using the following synthetic oligonucleotide phosphorylated by the polynucleotide kinase:
  • the EcoRI-KpNI fragment of the RAPIB fragment is cloned into phage M13Mpl1 at the EcoRI and BamHI sites.
  • Directed mutagenesis is carried out using a synthetic oligonucleotide following phosphorylated by the polynucleotide kinase: 10 5 ′ AAG CTT GCA TAT GCG TGA GT 3 ′ and thus an NDE1 site is introduced upstream of the ATG corresponding to the initiation of the RAPIB protein.
  • Recombinant M13Mpl1 is then prepared. To do this, is cut by the restriction enzyme NdeI 15, the double-stranded DNA M13Mpll and repairs the site NdeI using Klenow enzyme.
  • Site-directed mutagenesis is then performed to introduce a C to the ligation site of M13Mpl1 and RAPIB.
  • the EcoRI site is thus reconstituted.
  • This ⁇ site-directed mutagenesis is carried out using the synthetic oligonucleotide of following sequence phosphorylated by the polynucleotide kinase: 5 'CCA GTG AAT TCT ATG CGT GAG 3'
  • Example 3 The procedure is carried out as indicated in paragraph a) of Example 3, that is to say until the phage M13Mpl1 containing the sequence RAP2 cloned at the EcoRI and HindIII sites is obtained.
  • the following synthetic oligonucleotide phosphorylated by the polynucleotide kinase 5 'CGG AGG GCA TAT GCG CGA GTA 3' is used to introduce an NDE1 site, and the oligonucleotide of following sequence phosphorylated by the polynucleotide kinase: 5 'CCA GTG AAT TCT ATG CGC GAG 3 'is used to insert a C at the ligation site of M13Mpl1 and RAPIA and thus reconstitute an EcoRI site.
  • the single-stranded DNA of the phage M13Mpl1 is prepared by site-directed mutagenesis using the following synthetic oligonucleotides phosphorylated by the polynucleotide kinase: 5 'GCT GGG CTC GGT CGG GGTA GGC A 3 * to transform the glycine "12" into valine.
  • the double stranded DNA of the modified RAP2 sequence as indicated above is prepared, then cut with the enzymes EcoRI and HindIII, then cloned into the expression vector ptac32 described in "Biochemical Properties of Ha-ras Encoded p21 Mutants and Mechanism of the Autophosphorylation Reaction "(The Journal of Biological Chemistry, vol. 263, No. 24, p. 11792-11799, 1988), as indicated in paragraph b) of Example 3.
  • the single-stranded DNA of the phage M13Mpl1 is prepared by site-directed mutagenesis using the following synthetic oligonucleotides
  • EXAMPLE 12 EXPRESSION OF THE RAPIA GENE OR OF THE RAP2 GENE IN THE VETR-RAP A AND VETR-RAP2 VECTOR:
  • RAPIA gene and the RAP2 gene were respectively expressed in a retrovirus-type expression vector constructed as follows:
  • Vector A * is a modification of vector A, in which the EcoRI site of PBR322 has been destroyed.
  • This vector was obtained by ligation of the
  • the initial vector A * is represented by a circle in Figures 12a), 12b) and 12c).
  • SacII / EcoRI fragment of the initial vector A * is represented by a strong line opposite which a dotted arc of circle has been drawn (inside the vector).
  • the initial vector A * is cut by EcoRI and the Klenow enzyme is made to act to obtain blunt ends.
  • the EcoRI site is thus destroyed and is represented below by EcoRI crossed out with a cross
  • the initial vector A * is cut with PstI and SacII to recover the 3736 bp Pstl / SacII fragment.
  • the initial vector A * is cut with HindIII; Klenow's enzyme is acted on to obtain blunt ends, then cut with PstI.
  • the HindIII site is thus destroyed and is represented in the rest of the text by Hip_ClII.
  • the Pstl / Hip-élI fragment of 5626 bp is recovered. 4) The following fragments obtained in 1), 2) and 3) above are then ligated:
  • the fragment between HindIII on the one hand and Ecj_? FI / Hip-II on the other hand contains a sequence designated by "enhancer”, or stimulating sequence, represented by "E” in FIG. 12d).
  • the above fragment is represented by a strong line, in FIG. 12e), opposite which points (inside the vector) have been drawn according to an arc of a circle.
  • J ′ Another vector, designated by J ′, is used. This vector J ′ is obtained from the vector A * and differs from the vector A * by the following two elements:
  • the SacII site present in the Harvey virus at position 940 has been replaced by an EcoRI site.
  • the fragment containing the LTR5' is isolated.
  • the vector J ′ is cut by Pstl / EcoRI and the Pstl / EcoRI fragment of 2305 bp is isolated, represented by a line in FIG. 12f), opposite which one has drawn (inside the vector) small solid triangles, in an arc.
  • the expression vectors described above and containing RAPIA and RAP2 respectively were made to express in different normal or transformed cell lines, in particular by RAS or by other oncogenes.
  • cloning into the vector PJ3 ⁇ is done from the EcoRI / Bgl2 insert obtained from the complete cDNA of RAPIA cloned directly into the vector PJ3Q at the EcoRI / Bgl2 sites of this vector.
  • RAP2 As there is no Bgl2 site, the insert from the RAP2 cDNA cut at the EcoRI / PstI sites, cloned in the plasmid pUC8, is used. From this construction, the EcoRI / HindIII fragment, having 670 bp, emerges.
  • the above-mentioned plasmid pUC8 containing RAP2 is cut with HindIII and repaired with the Klenow enzyme to obtain blunt ends, then cut with EcoRI.
  • the EcoRI / Hi ⁇ II insert (repaired by Klenow) is isolated on agarose gel.
  • the vector PJ3 ⁇ is cut at the Bgl2 site repaired by Klenow to obtain blunt ends, then cut by EcoRI.
  • the Bgl2 site is destroyed and will be designated below by B ⁇ _ ⁇ .
  • RAPIA and RAP2 clones are made to express in the PJ3 ⁇ vector as described above respectively in different normal or transformed cell lines, in particular by RAS or by other oncogenes.
  • RAPIA the EcoRI / HindIII insert obtained from the subcloning of RAPIA into pUC8 is linked to the PJ3 ⁇ vector cut at the HindIII / EcoRI sites.
  • RAPIA and RAP2 in the vector PJ3 ⁇ allows the production of antisense messenger RNA which, by hybridization with the messenger RNA endogenous RAPIA and RAP2 genes can inhibit protein synthesis.
  • This vector can allow the expression of the RAP proteins either after transfection or by infection, the vector having previously been packaged using an "associated” virus ("helper").
  • helper EXAMPLE 14 EXPRESSION OF THE RAPIA GENE, THE RAPIB GENE AND THE RAP2 GENE IN THE PEX V3 VECTOR:
  • the vector PEX V3 is cut by the enzyme EcoRI.
  • the EcoRI inserts of the complete cDNAs of RAPIA, RAPIB and RAP2 respectively are directly cloned into the PEX V3 vector cut at the EcoRI site.
  • the insert is 1.4 kb, for RAPIB, the insert is 2.1 kb, and for RAP2, the insert is 950 bp.
  • the correct orientation in the vector was determined by carrying out different enzymatic degradations (for example BamHI and pstl) and by the sequencing of restriction fragments including the site. Cloning EcoRI.
  • RAPIA, RAPIB and RAP2 are expressed respectively in different normal or transformed cell lines.
  • RAPIA and RAP2 are cloned at the BamHI site of the above vector, which was previously cut by BamHI and repaired by Klenow to obtain blunt ends.
  • the BamHI site is destroyed and will be designated below by Bah ⁇ I.
  • RAPIA As regards RAPIA, it is previously subcloned into the plasmid pUC8.
  • the cDNA is cut by EcoRI / HindIII repaired by the Klenow (to obtain blunt ends) and will be
  • the RAPIA insert is linked by a ligase making it possible to constitute the vector Zip Neo of RAPIA.
  • the vector is oriented (in the direction allowing expression of the protein) by carrying out different enzymatic degradations and by carrying out sequencing at the cloning sites.
  • RAPIA and RAP2 clones are made to express in P Zip Neo respectively in different normal or transformed cell lines.
  • EXAMPLE 16 EXPRESSION OF THE RAPIA GENE OR OF THE RAP2 GENE IN THE YEAST VECTOR YEP51:
  • Cloning is carried out as follows: The vector YEP51 is cut by Sali repaired by Klenow, then cut by HindIII.
  • the Sali site is destroyed and is designated below by S l.
  • the large fragment Sa ⁇ ⁇ / HindIII is purified on gel and is used for cloning.
  • the insert used comes from subcloning of the RAPIA cDNA (EcoRI / Bgl2 fragment) into the vector pUC8.
  • This insert is obtained by cutting RAPIA subclone in the vector pUC8 by EcoRI, followed by repair with the enzyme Klenow, then by cutting with HindIII. The EcoRI site is destroyed and
  • RAPIA and RAP2 clones are made to express in the vector YEP51 in different yeast strains.
  • the PD2 E2 vector is described in the literature. This vector already contains a cloned gene which is got rid of by cutting with HindIII, then by purifying on an agarose gel to isolate the vector from the insert. The vector is then repaired by the Klenow enzyme to obtain blunt ends. HindIII sites are destroyed.
  • the insert from the subcloning of the cDNA of RAPIA in pUC8 (EcoRI / Bgl2 fragment) is used. This insert is obtained by cutting pUC8 RAPIA at the HindIII and EcoRI sites and is treated with the Klenow enzyme to obtain blunt ends.
  • RAP2 the same type of construction is used as for RAPIA.
  • RAPIA and RAP2 clones are made to express in the vector PD2E2 respectively in different strains of yeast.
  • EXAMPLE 18 DETERMINATION OF THE LOCATION
  • the RAP cDNAs are cloned into the plasmid pUC8. Two different fragments are used for the respective localization of each gene (cf. FIG. 10).
  • the two probes used for RAPIB are either the complete cDNA (2, 1kb) or the 5 'part (0.73kb).
  • the two RAP2 gene probes are either the full 0.95kb cDNA or the 0.66kb fragment in the 5 'part.
  • High resolution chromosome preparations are obtained from the culture of phytohemagglutinin stimulated blood cells of two healthy men after synchronization with methothrexate according to Yunis et al.
  • the probes are labeled according to the method of • random DNA primers (Kit A ersham, U.K.) 'introduced by Feinberg and Vogelstein (Feinberg, A.P., Vogelstein, B.A .: technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high
  • These labeled probes are used at concentrations of 20 to 80 ng / l.
  • the plates coated with Kodak NTB2 emulsion are exposed for one and two weeks for autoradiography: G bands are then obtained with the Wright dye.
  • chromosome Ipl2-pl3 no specific deletion is associated with a particular neoplasia. Some translocations of this region are described in elanomas and various blood disorders (Bloomfield, CD., Trent, JM, Van Den Berghe, H .: Report of the committee on structural chromosome changes in neoplasia (HGM10), Cytogenet. Cell. Genet 46, 344-366, 1987).

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Abstract

L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés contenant l'un au moins des enchaînements d'acides aminés suivants: MREYKLVVL (I), ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDCQQCMLEIL (II), QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTEDVPM (III), EDERVVGKEQGQNLARQWCNCAFL (IV), SKINVNEIEYDLVRQINRKTPVEKKKPKKKSCLLL (V), ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDAQQCMLEIL (VII), QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTDDVPMI (VIII), EDERVVGKEQGQNLARQWNNCAFL (IX), SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVPGKARKKSSCQLL (X), MREYKVVVL (XI), ALTVQFVTGTFIEKYDPTIEDFYRKEIEVDSSPSVLEIL (XII), QFASMRDLYIKNGQGFILVYSLVNQQSFQDIKPMRDQIIRVKRYEKVPVI (XIII), ESEREVSSSEGRALAEEWGCPFM (XIV), SKTMVDELFAEIVRQMNYAAQPDKDDPCCSACNIQ (XV). Ces séquences d'acides aminés peuvent être utilisées pour le diagnostic in vitro de pathologies liées à des facteurs oncogènes.

Description

NOUVELLES PROTEINES, ADN LES CODANT ET LEUR USAGE
L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés, les acides nucléiques codant pour ces séquences d'acides aminés et leurs applications, notamment pour le diagnostic, in. vitro, de pathologies liées à l'action de facteurs oncogènes.
On connaît des protooncogènes tels que H-ras, K-ras et N-ras (De Feo et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3328-3332; Ellis et al., (1981), Nature, 292, 506-511 ; Shimizu et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 383-387) et on a identifié de nouveaux gènes dans une grande variété d'organismes sur la base de leur homologie avec le gène ras des mammifères. Dans les mammifères, les protéines codées par ces gènes voisins des gènes ras (rai, R-ras, rho et rab) présentent 50 à 30 % d'homologie avec les protéines ras (Chardin et al., (1986) EMBO J., 5, 2203-2208 ; Madaule et al., (1985) Cell, 41, 31-40 ; Touchot et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8210-8214).
Les protéines ras et les protéines voisines des protéines ras présentent des poids moléculaires d'environ 21 000 à 24 000 d. Les protéines ras sont actives lorsqu'elles sont associées au GTP (Guanosine 5'-triphosphate) et sont inactives lorsqu'elles sont associées au GDP (Guanosine 5'-diphosphate) et l'hydrolyse du GTP a lieu par action de leur faible activité intrinsèque GTPase (Papageorge et al., (1982) J. Virol., 44, 509-519 ; Mcgrath et al., (1984) Nature, 310, 644-649) .
Les protéines ras transformantes détectées dans les tumeurs humaines présentent très fréquemment une substitution des amino acides localisés dans le domaine de liaison du GTP, en position 12, 13 ou 61 (Barbacid (1987) Annual Review of Biochemistry, 56, 779-827) .
Ce domaine joue un rôle essentiel dans la régulation des propriétés biologiques des protéines ras.
Le site de liaison du GTP consiste en quatre régions non contiguës qui appartiennent à toutes les protéines ras.
Parmi ces régions, six amino acides : DTGAQE en position 57 à 62 de la protéine K-ras, semblent être une caractéristique de la protéine ras et de toutes les protéines ras voisines (Chardin et al., (1986) EMBO J., 5, 2203-2208 ; Touchot et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8210-8214). Ces six résidus sont strictement conservés dans les protéines ras, rai et rab.
Dans les protéines H-ras, on a trouvé (Der et al., (1986) Cell, 44, 167-176) que pratiquement chaque mutation du résidu en position 61 de la protéine ras est corrélé à l'acquisition du potentiel transformant.
Or, la Demanderesse a trouvé de nouvelles séquences d'acides aminés, parmi lesquelles la position 61 est une threonine, et qui cependant ont des propriétés non transformantes.
L'un des aspects de l'invention est de proposer de nouvelles séquences d'acides aminés, ayant la capacité de fixer le GTP et le GDP et ayant une activité GTPase.
L'un des autres aspects de l'invention est de proposer de nouveaux acides nucléiques codant pour des séquences d'acides aminés présentant des propriétés biologiques intéressantes.
L'un des autres aspects de l'invention est de proposer des moyens de dépistage, in. vitro, de certaines pathologies liées soit à des teneurs en protéines situées en dehors du domaine des valeurs qu'elles ont généralement chez un individu sain, soit à des mutations dans ces protéines.
L'invention a pour objet de nouvelles séquences d'acides aminés caractérisée en ce qu'elle contiennent l'un au moins des enchaînements d'acides aminés suivants : MREYKLWL (I)
ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDCQQCMLEIL (II)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTEDVPM (III)
EDERVVGKEQGQ LARQ CNCAFL (IV)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVEKKKPKKKSCLLL (V)
ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDAQQCMLEIL {VII)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTDDVPMI (VIII) ,
EDERVVGKEQGQNLARQWNNCAFL (I )
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVPGKARKKSSCQLL (X)
MREYKVWL (XI) ALTVQFVTGTFIEKYDPTIEDFYRKEIEVDSSPSVLEIL (XII)
QFASMRDLYIKNGQGFILVYSLVNQQSFQDIKPMRDQIIRVKRYEKVPVI(XIII)
ESEREVSSSEGRALAEEWGCPFM (XIV)
5 .
SKTMVDELFAEIVRQMNYAAQPDKDDPCCSACNIQ (XV)
Dans ce qui précède et ce qui suit, les acides aminés sont représentés par une lettre unique, conformément à la nomenclature classiquement utilisée dans ce domaine.
Les séquences d'acides aminés sont écrites de telle façon que l'extrémité la plus à gauche correspond à l'extrémité N-terminale du premier amino acide délimitant les susdites séquences et i _ l'extrémité la plus à droite correspond à l'extrémité C-terminale du dernier amino acide délimitant les susdites séquences.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de on l'invention contiennent au moins l'un des enchaînements (I) , (II) , (III) , (IV) ou (V) définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de
--- 1'invention contiennent au moins 1'un des enchaînements (VII) , (VIII) , (IX) ou (X) définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de
30 l'invention contiennent au moins l'un des enchaînements (XI) , (XII) , (XIII) , (XIV) ou (XV) définis ci-dessus.
35 Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention comportent une threonine en position 61.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides aminés de l'invention sont telles que le quatrième amino acide à partir du dernier amino acide C-terminal est une cystéine.
Selon un autre mode de réalisation selon l'invention, les séquences d'acides aminés contiennent les 5 enchaînements (I) , (II) , (III) , (IV) et (V) définis ci-dessus.
Lorsque les séquences d'acides aminés selon l'invention comportent les 5 enchaînements indiqués ci-dessus, ceux-ci sont avantageusement situés, de gauche à droite, dans l'ordre (I)-(II)-(III) -(IV)- (V) , ces enchaînements étant en outre avantageusement non contigus.
Selon un autre mode' de réalisation selon l'invention, les séquences d'acides aminés contiennent les 5 enchaînements (VII) , (VIII) , (IX) et (X) définis ci-dessus.
Lorsque les séquences d'acides aminés selon l'invention comportent les 5 enchaînements indiqués ci-dessus, ceux-ci sont avantageusement situés, de gauche à droite, dans l'ordre (VII)-(VIII)-(IX)-(X) , ces enchaînements étant en outre avantageusement non contigus.
Selon un autre mode de réalisation selon l'invention, les séquences d'acides aminés contiennent les 5 enchaînements (XI) , (XII) , (XIII) , (XIV) et (XV) définis ci-dessus.
Lorsque les séquences d'acides aminés selon l'invention comportent les 5 enchaînements indiqués ci-dessus, ceux-ci sont avantageusement situés, de gauche à droite, dans l'ordre (XI)-(XII)-(XIII)-(XIV)-(X) , ces enchaînements étant en outre avantageusement non contigus.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses contiennent l'enchaînement d'acides aminés XVI, représenté sur la figure 1.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses sont constituées par l'enchaînement d'acides aminés XVI, représenté sur la figure 1.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses contiennent l'enchaînement d'acides aminés XVII, représenté sur la figure 2.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses sont constituées par l'enchaînement d'acides aminés XVII, représenté sur la figure 2.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses contiennent l'enchaînement d'acides aminés XVIII, représenté sur la figure 3.
Des séquences d'acides aminés selon l'invention particulièrement avantageuses sont constituées par l'enchaînement d'acides aminés XVIII, représenté sur la figure 3.
Les séquences d'acides aminés XVI, XVII et XVIII seront également respectivement désignées par RAP1A, RAP1B et RAP2 dans la suite du texte.
Ces séquences d'acides aminés présentent une threonine en position 61 et une cystéine 4 acides aminés à partir du dernier amino acide C-terminal. A cet égard, pour les séquences d'acides aminés représentées respectivement sur la figure 1, 2 et 3, la position d'un acide aminé déterminé est repérée par rapport au premier acide aminé de la séquence alors que pour les séquences nucléotidiques (figurant également sur les figures 1, 2 et 3) la position d'un nucléotide déterminé est repérée par rapport au premier nucléotide.
Ces séquences d'acides aminés présentent d'intéressantes propriétés biochimiques et biologiques : elles ont la capacité de fixer le GTP et le GDP et présentent une activité GTPase.
Elles sont par ailleurs non transformantes, c'est-à-dire notamment ne modifient pas les propriétés morphologiques et cinétiques de la cellule et n'altèrent pas la propriété d'inhibition de contact des cellules.
Ceci étant, leur absence, leur surexpression (c'est-à-dire leur expression en des quantités supérieures à celles généralement contenues chez un individu sain) , ainsi que certaines de leurs mutations peuvent correspondre à un état pathologique.
Ces séquences d'acides aminés sont également susceptibles de se lier à la membrane intracellulaire.
Les séquences d'acides aminés précédentes peuvent être modifiées dès lors qu'elles conservent les propriétés biochimiques et biologiques des séquences d'acides aminés (XVI), (XVII) et (XVIII) définies précédemment.
Par exemple, et de façon non limitative, des séquences d'acides aminés entrant dans le cadre de l'invention peuvent se distinguer des séquences d'acides aminés définies ci-dessus :
- par addition et/ou suppression d'un ou de plusieurs acides aminés et/ou
- modification d'un ou de plusieurs acides aminés, sous réserve que les propriétés biochimiques et biologiques comme indiqué ci-dessus soient conservées.
Entrent également dans le cadre de 1'invention les séquences d'acides aminés (XVI), (XVII) et (XVIII) présentant des mutations en position 12 (c'est-à-dire remplacement de la glutamine en 12 par n'importe quel autre acide aminé).
Entrent également dans le cadre de 1'invention les séquences d'acides aminés (XVI), (XVII) et (XVIII) présentant des mutations en position 61 (c'est-à-dire remplacement de la threonine en 61 par n'importe quel autre acide aminé et notamment par la glutamine et la valine) .
L'invention vise également les séquences d'acides aminés contenant l'un au moins des enchaînements 'acides aminés codés par les enchaînements nucléotidiques suivants :
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA
AAA TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2) CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC
CAA GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC
ACG TTT AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA
CGG GTT AAG GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC
AGA CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG
CCT AAA AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA
AAA TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA
GTT GAA GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA GAC ACT GAT GAT • GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG
CGG CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT
CGC AAA AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11) GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG
AAA TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG
ATC GAG GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC
CAG GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG
AGC TTC CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC
CGC GTG AAG CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG
AGG CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC
CCA TGC TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
Entrent également dans le cadre de l'invention les acides nucléiques contenant l'un au moins des enchaînements de nucléotides codant pour les séquences d'acides aminés définies précédemment.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les acides nucléiques appartiennent au génome humain.
Selon un mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention codent pour les enchaînements d'acides aminés I à XVIII définis ci- dessus. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, les séquences d'acides nucléiques de l'invention codent pour les séquences d'acides aminés contenant les enchaînements XVI, XVII et XVIII définis ci-dessus. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, les séquences d'acides nucléiques de l'invention codent pour les enchaînements d'acides aminés XVI, XVII et XVIII définis ci-dessus.
Des acides nucléiques avantageux de l'invention sont ceux contenant l'un au moins des enchaînements de nucléotides suivants:
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA
GTT GAA GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC
CAA GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC
ACG TTT AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA
CGG GTT AAG GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC
AGA CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG
CCT AAA AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA
AAA TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA
GTT GAA GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7) CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA
CAA GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC
ACA TTT AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT
(8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG
CGG CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT
CGC AAA AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG
AAA TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG
ATC GAG GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC
CAG GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG
AGC TTC CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC
CGC GTG AAG CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (1), (2), (3), (4) et (5), définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (6), (7), (8), (9) et (10) , définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent les cinq enchaînements de nucléotides (11) , (12) , (13) , (14) et (15), définis ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (16) , délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 43 et 594 de la figure 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (16), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 43 et 594 de la figure 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de- l'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (19) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 605 de la figure 1.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (19) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 605 de la figure 1. Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de 1'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (17), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 54 et 605 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (17), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 54 et 605 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (20) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 838 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (20) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 838 de la figure 2.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de 1'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (18), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 4 et 552 de la figure 3.
Selon encore un autre mode de réalisation, les les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (18), délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 4 et 552 de la figure 3.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention contiennent l'enchaînement de nucléotides (21) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 558 de la figure 3.
Selon encore un autre mode de réalisation, les acides nucléiques de l'invention sont constitués par l'enchaînement de nucléotides (21) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 558 de la figure 3.
Les acides nucléiques (16), (17), (18), (19), (20) et (21) de l'invention présentent tous la particularité d'hybrider avec le gène Dras-3 de la drosophile tel que représenté sur la figure 5, dans les conditions faiblement stringentes définies ci- après : hybridation à 60°C dans 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon, dernier lavage dans 2X SSC et 0,1 % de SDS, à 60°C pendant environ 15 mn.
Les acides nucléiques (16) , (17) , (18) , (19) , (20) et (21) peuvent être modifiés dès lors que les séquences d'acides aminés qu'ils codent conservent leurs propriétés biochimiques et biologiques.
De telles modifications non limitatives conduisent par exemple à des acides nucléiques variants qui se distinguent des acides nucléiques ci-dessus :
- par addition et/ou - suppression d'un ou de plusieurs nucléotides et/ou modification d'un ou de plusieurs nucléotides, sous réserve que l'enchaînement ainsi formé soit capable d'hybrider avec la même séquence d'ARN ou d'ADN que l'enchaînement correspondant non modifié, et que les séquences d'acides aminés, codées par ces acides nucléiques, conservent les propriétés biochimiques et biologiques indiquées ci-dess'us.
Les acides nucléiques (16) et (19) peuvent également être caractérisés par la carte de restriction qui fait l'objet de la figure 7.
Les acides nucléiques (17) et (20) peuvent également être caractérisés par la carte de restriction qui fait l'objet de la figure 8.
Les acides nucléiques (18) et (21) peuvent également être caractérisés par la carte de restriction qui fait l'objet de la figure 9.
Ces cartes de restriction ne sauraient être interprétées comme ayant un caractère limitatif pour identifier les acides nucléiques comportant respectivement l'enchaînement indiqué précédemment.
Des acides nucléiques équivalents pourraient également être définis par une carte de restriction ayant une communauté avec les cartes de restriction définies précédemment d'au moins 50 % des sites de restriction, situés dans le même ordre.
L'invention vise également les sondes utilisées pour caractériser les acides nucléiques décrits précédemment.
Ces sondes sont définies par leur capacité à s'hybrider avec les susdits acides nucléiques ou leurs séquences complémentaires dans les conditions d'hybridation suivantes :
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques (2) , (3) , (4) , (5) , (7) ,
(8), (9), (10), (12), (13), (14) et (15) ou leurs séquences complémentaires les conditions d'hybridation sont les suivantes : hybridation proprement dite : 60°C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1% SDS, 100 μg/ml d'ADN' de sperme de saumon ; lavage : 60°C, 2X SSC, 0,1% SDS, 30 mn ;
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques ou les séquences complémentaires (1), (6) et (11) les conditions d'hybridation sont les suivantes : hybridation proprement dite : 45°C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1% SDS, 100 μg/ml d'ADN" de sperme de saumon ;
1° lavage : température ambiante, 2X SSC, 0,1% SDS, 30mn,
2° lavage : 45°C, 2X SSC, 0,1% SDS, 30mn.
Comme sonde oligonucléotidique pour identifier les séquences d'acides nucléiques de l'invention, on peut par exemple utiliser la sonde constituée par la séquence oligonucléotidique suivante : GAA ATC CTG GAT ACT GCA GGG ACA GAG CAA TTT ou la séquence complémentaire correspondante.
Pour identifier les acides nucléiques (16) et
(19) de l'invention, on peut, par exemple, utiliser comme sonde la séquence d'oligonucléotides délimitée par les nucléotides correspondant aux nucléotides situés aux positions 493 et 605 de la figure 1, ou la séquence complémentaire correspondante.
Pour identifier les acides nucléiques (17) et
(20) de l'invention, on peut, par exemple, utiliser comme sonde la séquence dOligonucléotides délimitée par les nucléotides correspondant aux nucléotides situés aux positions 504 et 838 de la figure 2, ou la séquence complémentaire correspondante.
Pour identifier les acides nucléiques (18) et (21) de l'invention, on peut, par exemple, utiliser comme sonde la séquence d'oligonucléotides délimitée par les nucléotides correspondant aux nucléotides situés aux positions 451 et 558 de la figure 3, ou la séquence complémentaire correspondante.
L'invention se rapporte également à un acide nucléique recombinant caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique tel que décrit plus haut, inséré dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis du susdit fragment.
L'acide nucléique hétérologue ci-dessus peut consister en un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique appartenant à une bactérie ou encore à une cellule eucaryote, ladite bactérie ou ladite cellule eucaryote étant choisie en tant que système d'expression d'un des fragments d'ADN décrit précédemment.
Un autre acide nucléique hétérologue convenable pour la réalisation de l'invention peut également consister en un plasmide ou un phage.
L'invention concerne en outre un vecteur recombinant, en particulier pour le clonage et/ou l'expression d'un acide nucléique selon l'invention, ledit vecteur étant notamment du type plasmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant comme défini ci-dessus, contenant le susdit acide nucléique en l'un des sites non essentiels pour sa réplication. Ce vecteur recombinant peut ainsi être formé par 1'ADN hétérologue précédent dans la mesure où celui-ci constitue un système autonome de réplication.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le vecteur recombinant ci-dessus est un vecteur d'expression contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression, dans un hôte cellulaire, d'un acide nucléique codant pour une séquence d'acides aminés de l'invention, un promoteur compatible avec ledit hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible, et éventuellement une séquence signal et/ou une séquence d'ancrage.
Le choix du promoteur, de la séquence signal et de la séquence d'ancrage est déterminé en fonction de la nature du système d'expression choisi. Un vecteur recombinant particulier approprié à l'expression des séquences d'acides aminés selon l'invention dans E. Coli, qui comprend, en un site non essentiel pour sa réplication :
- les éléments permettant son insertion dans E.Coli, les éléments permettant l'expression de l'acide nucléique inséré dans le vecteur par E.Coli, et éventuellement les éléments permettant l'exportation du produit résultant de l'expression du susdit acide nucléique.
Un autre vecteur recombinant est caractérisé en ce qu'il contient les éléments permettant d'insérer un acide nucléique, décrit plus haut, dans une levure et l'expression de cet acide nucléique dans cette levure. D'autres cellules eucaryotes pourront être choisies pour insérer le vecteur recombinant contenant l'acide nucléique de l'invention, ce choix étant orienté par la capacité de ladite cellule eucaryote à organiser l'expression dudit acide nucléique.
L'invention se rapporte encore aux hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant tels que ceux décrits plus haut, lequel vecteur est capable de se répliquer dans ledit microorganisme.
Un premier hôte cellulaire préféré est constitué par E.coli transformé par un vecteur recombinant tel que décrit précédemment.
Un autre hôte cellulaire préféré est une levure transformée par un vecteur recombinant. La levure généralement utilisée est Saccharo yces Cere%'isiae.
D'autres hôtes cellulaires peuvent encore être mis en oeuvre.
L'invention vise naturellement le produit d'expression de chacun des -microorganismes transformés par l'un des vecteurs recombinants décrits dans les pages précédentes.
L'invention vise également un procédé de préparation des nouveaux peptides sus-mentionnés par synthèse qui comprend soit l'addition étape par étape des résidus peptidiques choisis, avec l'addition ou l'élimination de groupes protecteurs quelconques des fonctions amino et carboxyles, ou addition de résidus peptidiques choisis afin de produire des fragments suivis d'une condensation desdits fragments en une séquence en acides aminés appropriée, avec addition ou élimination des groupes protecteurs choisis. L'invention vise également un procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés conforme à la description ci-dessus, caractérisé en ce que : on cultive, dans un milieu de culture approprié, un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique précédemment défini,
- on récupère à partir du susdit milieu de culture la séquence d'acides aminés produite par ledit microorganisme transformé, après lyse de la membrane cellulaire de ce dernier.
Le procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés déterminée peut être en particulier caractérisé par la mise en culture de E.coli transformée par un vecteur recombinant décrit plus haut et par l'arrêt de la culture en fin de phase exponentielle de croissance dudit E.coli, et récupération de la séquence d'acides aminés déterminée à partir du milieu de culture exempt des autres protéines et enzymes exocellulaires susceptibles d'être sécrétées par E.coli.
Le procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés déterminée peut encore être appliqué à une levure transformée par un vecteur recombinant tel que décrit plus haut cette levure étant placée en culture dans un milieu approprié et ladite culture étant arrêtée en fin de phase exponentielle de croissance de la levure utilisée.
L'invention se rapporte également à des anticorps dirigés contre les séquences d'acides aminés ci-dessus. En particulier, l'invention vise des anticorps monoclonaux. De tels anticorps monoclonaux peuvent être produits par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.
Dans un premier temps, on inocule une des séquences d'acides aminés ci-dessus à un animal choisi, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre cette séquence en acides aminés. ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules yélomateuses "immortelles" pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène de cellules ainsi obtenu, on réalise alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous forme de ôlone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis des séquences d'acides aminés de l'invention pourront être testées par exemple sur colonne d'affinité.
L'invention concerne également une méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés sus- entionnées, à partir d'un prélèvement biologique susceptible de les contenir. Une telle méthode de dépistage selon l'invention, peut être réalisée soit à l'aide des anticorps monoclonaux sus-mentionnés, soit à l'aide des sondes oligonucléotidiques décrites ci-dessus.
Le prélèvement biologique sus-mentionné est effectué soit dans des tissus fluides, tels que le sang, soit dans des organes, ce dernier type de prélèvement permettant notamment d'obtenir des coupes fines de tissus sur lesquelles les anticorps sus-mentionnés sont ultérieurement fixés. La méthode de dépistage selon l'invention, procédant par l'intermédiaire des anticorps sus¬ mentionnés comprend notamment les étapes suivantes:
- la mise en contact d'au moins un des anticorps reconnaissant spécifiquement une séquence d'acides aminés de l'invention, avec le susdit prélèvement biologique ;
- la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes i munologiques formés entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus¬ mentionnées.
Avantageusement, les anticorps utilisés pour la mise en oeuvre d'un tel procédé sont marqués notamment de manière enzymatique ou radio-active.
Une telle méthode selon l'invention peut notamment être réalisée suivant la méthode ELISA (enzyme linked sorbent assay) qui comprend les étapes suivantes :
- fixation' d'une quantité prédéterminée d'anticorps marqués à l'aide d'un marqueur enzymatique sur un support solide, tel qu'un puits d'une microplaque ;
- addition du prélèvement biologique (sous forme liquide) sur ledit support ; incubation pendant un temps suffisant pour permettre la réaction immunologique entre lesdits anticorps et les séquences en acides aminés sus¬ mentionnées ;
- addition d'un substrat spécifique de l'activité enzymatique libérée lors de la réaction immunologique précédente;
- détection, à l'aide de tout moyen approprié, de la dégradation du substrat par l'enzyme ; et
- corrélation de la quantité d'enzymes libérées à la quantité de séquences d'acides aminés présentes. Selon un autre mode de réalisation de la méthode de dépistage de l'invention, les anticorps sus-mentionnés ne sont pas marqués et la détection des complexes immunologiques formés entre les séquences en acides aminés et lesdits anticorps est réalisée à l'aide d'une immunoglobuline marquée reconnaissant lesdits complexes. la méthode de dépistage selon l'invention peut également être réalisée par une technique immuno- enzymatique suivant un mécanisme de compétition entre les séquences d'acides aminés susceptibles d'être contenues dans le prélèvement biologique, et des quantités prédéterminées de ces mêmes séquences d'acides aminés, vis-à-vis des anticorps sus¬ mentionnés. Dans ce dernier cas, les séquences d'acides aminés de l'invention en quantité prédéterminée sont avantageusement marquées à l'aide d'un marqueur enzymatique.
L'invention ne se limite nullement aux modes de réalisation décrits ci-dessus pour le dépistage in vitro des séquences d'acides aminés de l'invention, ce dépistage pouvant être réalisé à l'aide de toute autre méthode immunologique, notamment immunoenzymatique actuellement connue.
L'invention concerne également une méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés de l'invention réalisée à partir d'un prélèvement biologique susceptible de contenir des acides nucléiques codant pour lesdites séquences d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend: - la mise en contact d'au moins une des sondes oligonucléotidiques décrites ci-dessus avec, le susdit prélèvement biologique ; - la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes d'hybridation formés entre les sondes et les acides nucléiques sus-mentionnés.
Le prélèvement biologique sus-mentionné est, préalablement à la mise en oeuvre du dépistage, traité de manière à ce que les cellules qu'il contient soient lysées, et en ce que le matériel génomique contenu dans lesdites cellules soit fragmenté à l'aide d'enzymes de restriction du type EcoRI, Ba HI etc.
Avantageusement, les sondes oligonucléotidiques sont marquées à l'aide d'un marqueur enzymatique ou radio-actif. Ces sondes sont placées sur un support approprié, notamment sur un filtre de nitrocellulose ou autre, par exemple nylon, sur lequel est ensuite additionné le prélèvement biologique traité comme il l'a été indiqué ci-dessus.
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in vitro de maladies corrélées à des teneurs en séquences d'acides aminés de l'invention situées à l'extérieur du domaine délimité par les valeurs extrêmes correspondant généralement à l'état physiologique d'un individu sain, par mise en oeuvre d'une des méthodes de dépistage in. vitro sus¬ mentionnées.
La présence de faibles quantités, voire l'absence totale, des séquences d'acides aminés de l'invention dans les prélèvements biologiques testés, ou au contraire la surexpression desdites séquences dans les cellules du prélèvement, témoigne d'un déséquilibre probable entre les facteurs anti- oncogéniques et oncogéniques de ces cellules, et ce en faveur de ces derniers, risquant de déclencher une pathologie cancéreuse, notamment par perte d'inhibition de contact entre les cellules du tissu ou de l'organe à partir duquel le prélèvement a été effectué.
L'invention a également pour objet des nécessaires ou kits pour la mise en oeuvre des méthodes de dépistage in vitro sus-mentionnées.
A titre d'exemple, de tels kits comprennent notamment : une quantité déterminée d'au moins un des anticorps monoclonaux sus-mentionnés susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique spécifique avec une des séquences d'acides aminés de l'invention ;
- avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus¬ mentionnés, avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques produits lors de la réaction immunologique sus-mentionnée.
Dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro utilisant des sondes oligonucléotidiques, les kits utilisés comprennent par exemple :
- une quantité déterminée d'au moins une des sondes oligonucléotidiques sus-mentionnées susceptibles de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un des acides nucléiques sus-mentionnés codant pour les séquences d'acides aminés de l'invention,
- avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre les acides nucléiques et les sondes sus-mentionnées ; avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation produits lors de la réaction d'hybridation sus-mentionnée.
Les séquences d'acides aminés selon l'invention présentent d'intéressantes propriétés revertantes.
Pour mettre en évidence ces propriétés, on procède de la façon suivante :
- on insère une des séquences nucléotidiques RAPIA, RAPIB ou RAP2 normale et mutée dans un vecteur d'expression eucaryote avec un promoteur fort tel que LTR,
- on effectue des transfections à l'aide du susdit vecteur sur des cellules qui ont été préalablement transformées par le gène RAS,
- on co-transfecte ces cellules avec le gène RAPIA ou RAPIB ou RAP2 et un gène de résistance à un antibiotique, par exemple la néomycine, comme marqueur de sélection,
- on fait exprimer RAPIA ou RAPIB ou RAP2 dans ces cellules et on peut observer une réversion phénotypique,
- on isole les cellules qui ont un phénotype normal revertant, on les analyse et on constate l'expression du gène RAPIA ou RAPIB ou RAP2 (d'une part en ARN et d'autre part en protéines) directement responsables de la réversion.
Plus précisément, afin d'aborder l'étude fonctionnelle des protéines produits des gènes RAPIA et RAP2, ont été développés deux types d'outils, anticorps et lignées cellulaires surproductrices;
- les cDNAs correspondant aux gènes RAPIA et RAP2 ont été insérés dans des vecteurs d'expression eucaryotes et transférés par transfection dans différentes lignées cellulaires, par exemple des cellules fibroblastiques en culture d'origine murine N.IH3T3 dans le cas de RAPIA et RATl dans le cas de RAP2. L'ADNc du gène RAP2 ne semble conférer aucun phénotype particulier lorsqu'il est exprimé dans des fibroblastes normaux. Par contre, sa surexpression dans des lignées transformées par les oncogènes li¬ ras et Ki-ras est corrélée à une réversion phénotypique de ces cellules vers un phénotype non transformé;
- des anticorps polyclonaux de lapin ont été générés contre les protéines RAPIA et RAP2 ou des peptides dérivés de leur séquence. Les anticorps obtenus reconnaissent de façon spécifique la protéines RAPIA ou RAP2 et ne présentent pas de réaction croisée avec la protéine H-ras; l'utilisation de ces anticorps pour immunoprécipiter la protéine RAP2 dans les lignées cellulaires la surexprimant a permis de montrer que c'"est une protéine membranaire. Elle est synthétisée sous la forme d'un précurseur qui est rapidement modifié pour donner naissance à la forme mature de la protéine; celle-ci est relativement stable in vivo avec un temps de demi-vie métabolique de l'ordre de 12-24 h.
Les séquences d'acides aminés de l'invention présentant les propriétés de réversion indiquées ci-dessus sont susceptibles d'être utilisées pour le traitement thérapeutique de maladies liées aux gènes RAS ou de maladies dans lesquelles le gène RAP pourrait être mis en cause, soit par mutation, soit par mauvaise expression dans certaines cellules.
Pour ce faire, on introduit le gène qui code pour l'une des séquences d'acides aminés de l'invention dans un vecteur d'expression, lequel doit être compatible avec les cellules vers lesquelles on veut les diriger et dont les promoteurs doivent être également compatibles avec lesdites cellules.
On cible ensuite le vecteur pour qu'il aille se fixer dans les cellules visées, afin que celles-ci le phagocytent et qu'il soit libéré et exprimé dans lesdites cellules.
EXEMPLE 1: CLONAGE ET SEQUENCAGE DES ACIDES
NUCLEIQUES RAPIA ET RAP2:
1) Isolement des clones humains d'ADNc homologues au gène Dras-3 de la drosophile :
On utilise une banque d'ADNc construite dans le phage A gtlO à partir d'AR.m de cellules de lymphocytes B humains (lignée Raji) et criblée sous des conditions d'hybridation faiblement stringentes (définies ci-après dans le paragraphe intitulé "Matériels et méthodes") avec 1'insert complet d'ADN Dras-3 de la drosophile.
On isole 15 phages à partir de 100 000 phages recombinants. Les inserts EcoRI sont purifiés, soumis à des réactions d'hybridation croisée les uns vis-à-vis des autres sous des conditions fortement stringentes (définies ci-après dans la paragraphe intitulé "Matériels et méthodes") et sont partiellement séquences. On peut ainsi identifier deux catégories de clones, 14 dérivant d'un même gène et un quinzième dérivant d'un autre gène voisin.
On désigne par RAPIA le clone de la première famille et par RAP2 l'unique clone de la seconde famille.
De l'ADN génomique humain originaire de placenta a été hydrolyse par les enzymes de restriction suivantes BamHI, EcorI et HindIII, et les colonnes A,B,C,D,E et F correspondent respectivement à : colonne A BamHI colonne B Ba HI + EcoRI colonne C BamHI + HindIII colonne D HindIII colonne E HindIII + EcoRI colonne F EcoRI puis hybride avec les inserts EcoRI respectivement de l'ADNc des clones RAPIA et RAP2.
La figure 4 montre le profil d'hybridation des gènes cellulaires RAPIA (1) et RAP2 (2) .
La taille des fragments déterminés par le marqueur d'HindIII est porté à gauche en kilo paires de base.
2) Séquence nucléotidique des ADNc de RAPIA et RAP2: On détermine la séquence nucléotidique des inserts de 1 450 paires de base et 980 paires de base des ADNc respectivement de RAPIA et RAP2.
Les séquences d'amino acides codées par ces clones sont respectivement représentées sur les figures 1 et 3.
Sur les figures 1 et 3, on a également représenté les séquences d'acides nucléiques codant respectivement pour RAPIA et RAP2.
Les protéines RAPIA et RAP2 consistent respectivement en des séquences peptidiques de 184 et 183 amino acides, y compris la methionine initiale, et ont un poids moléculaire calculé respectif de 20.900 et 20.700d.
3) Ho ologies entre les protéines RAPIA et RAP2 et les protéines Dras-3, K-ras, ral et R-ras : Les homologies entre d'une part la protéine RAP1 et, d'autre part, la protéine Dras-3 de la drosophile et les protéines K-ras, ral et R-ras sont respectivement de 66,5%, 53%, 44% et 41%.
En ce qui concerne la région la plus conservée des protéines ras, de 1'amino acide 1 à 84, les pourcentages sont de 78,5% pour la protéine Dras-3 de la drosophile, 59,5% pour K-ras, 56% pour ral et 63% pour R-ras.
Une comparaison globale cellulaire pour la protéine RAP2 conduit à une homologie de 48% avec Dras-3 de la drosophile, 46% avec K-ras, 38% avec ral et 37% avec R-ras.
Lorsqu'on ne considère que les 84 premiers amino acides ces pourcentages sont de 63 pour Dra's-3, 52 K-ras et ral, 56% pour R-ras.
On a représenté sur la figure 5 les alignements des- protéines RAPIA et RAP2 avec la protéine humaine K-ras (exon 4B) et la protéine Dras-3 de la drosophile. La numérotation de référence est celle de la protéine K-ras.
Sur cette figure 5 les régions de fixation du GTP sont encadrées. La région de l'effecteur est soulignée par 1 trait continu et la région d'attachement à la membrane intracellulaire est soulignée en pointillés.
Quatre domaines impliqués dans le site de liaison aux nucléotides à guanine des protéines ras (Barbacid, M. (1987) Annual Review of Biochemistry, 56, 779-827) et correspondant aux séquences d'amino acides 10 à 17, 57 à 63, 113 à 120 et 143 à 147 sont hautement conservés parmi les protéines RAP, K-ras et Dras-3. Les protéines RAPIA et RAP2 comme la protéine Dras-3 ont une threonine en position 61 à la place d'une glutamine présente dans toutes les protéines ras et les protéines voisines des protéines ras, non oncogènes, connues à ce jour.
Le domaine des résidus 32 à 42, pour les protéines ras - qui correspond au domaine impliqué dans l'interaction avec un effecteur - est identique dans la protéine RAPIA et ras, et diffère d'un amino acide dans la protéine RAP2 par rapport à la protéine ras.
La région C-Terminale des protéines ras est caractérisée par la séquence Cys-A-A-X, dans laquelle A est un amino acide aliphatique et X l'a ino acide C-Terminal (Powers et al., (1984) Cell, 36, 607-612). Cette séquence est nécessaire pour la liaison lipidique posttraductionnelle et l'ancrage dans la membrane du plasma (Fujiyama et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1266-1270) . 5) Transcription des gènes RAPIA et RAP2 :
La transcription des gènes RAPIA et RAP2 est effectuée par transfert d'ARN sur membrane après électrorophorèse sur gel selon la technique désignée par "Northern Blot". Les conditions utilisées pour le "Northern Blot" sont rappelées ci-après dans le paragraphe intitulé "Matériels et méthodes".
Avec une sonde provenant de RAPIA, on met en évidence trois séquences d'ARN (c'est-à-dire trois transcripts) respectivement de 1.600, 2.700 et 5.400 nucléotides.
Avec une sonde provenant de RAP2, on met en évidence trois séquences d'ARN, respectivement de 2.200, 2.500 et 4.600 nucléotides. La sonde provenant de RAPIA est un polynucléotide délimité par le fragment Pstl-BglII de la séquence (19) et dont la première extrémité, correspondant à la restriction par PstI, est représentée sur la figure 7, et la deuxième extrémité correspondant à la restriction par BglII, se trouve 520 paires de base à droite de la première extrémité.
La sonde provenant de RAP2 est un polynucléotide délimité par le fragment HindII-PstI de la séquence 21 et dont la première extrémité correspondant à la restriction par HindII est représentée sur la figure 9 et la deuxième extrémité, correspondant à la restriction par PstI, est située 340 paires de base à droite de la première extrémité.
On a représenté sur la figure 6, l'étude des transcripts de RAPIA (colonne 1) et de RAP2 (colonne 2) après électrophorèse et transfert d'ARNm polyA+ extrait de lymphocytes humains. La taille des différents ARN est mentionnée sur la gauche en kilobase.
6) Matériels et méthodes : clonage et séquençage des ADNc de RAPIA et RAP2 :
Pour identifier les ADNc de RAP, on a criblé une banque humaine, construite dans le phage AgtlO, avec un insert d'EcoRI de 700 paires de base du clone d'ADNc Dras-3 de la drosophile (Schetjer et al., (1985) EMBO J., 4, 407-412). On a effectué l'hybridation dans des conditions faiblement stringentes : à savoir hybridation à 60°C dans 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1% SDS, 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon. Le dernier lavage est effectué dans 2 x SSC et 0,1% SDS à 60°C pendant environ 15 mn.
Les conditions fortement stringentes utilisées pour l'hybridation croisée des inserts EcoRI sont les suivantes : on effectue l'hybridation dans les conditions suivantes : 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1% SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65CC.
Le lavage est effectué de 0,1% SSC et 0,1% SDS à 65°C pendant 30 mn.
La séquence nucléotidique de l'insert complet d'EcoRI des clones RAPIA et RAP2 est déterminée en utilisant les vecteurs M13 par la méthode de terminaison de chaîne par dideoxy nucléotide (Messing, J. (1983) Methods Enzymol., 101, 20-78). 7) Analyse Northern et Southern Blot :
La technique désignée par "Southern Blot" est effectuée comme décrit dans l'article de Southern, E. (1975) J. Mol. Biol., 98, 503. 10 μg d'ADN placentaire humain digéré avec des endonucléases de restriction sont soumis à une electrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8%, transférés sur filtre de nitrocellulose et hybrides avec 1'insert de EcoRI de chacun des clones RAPIA et RAP2.
On effectue l'hybridation dans les conditions suivantes : 5 x SSC, 5 x Denhardt, 0,1% SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65°C.
Le lavage est effectué à l'aide de 0,1% SSC et 0,1% SDS à 65°C pendant 30 mn.
En ce qui concerne la technique désignée par
"Northern Blot" pour déterminer les séquences d'ARN, on prépare des ARN cytoplasmiques à partir de lymphocytes périphériques du sang (Perry et al.,
(1972) BBA, 262, 220-226).
On fractionne 5 μg d'ADN polyA* sur des gels de formaldéhyde et d'agarose à 1%, avant le transfert sur des membranes de nylon (commercialisées sous le nom de Pall) , et on hybride les filtres avec les sondes provenant de RAPIA et de RAP2, définies précédemment.
Toutes les sondes sont marquées avec 32P par la technique d'initiation au hasard (A ersham) pour obtenir une activité d'environ 3 x 108 CPM/μg. On effectue les hybridations dans de la formamide à 50% à 42°C selon la méthode décrite dans l'article de Maniatis et al., (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory. EXEMPLE 2_ CLONAGE ET SEQUENC GE DE RAPIB:
On utilise l'insert du cDNA de RAPIA pour cribler une banque de cDNA humaine préparée dans le phage ΛgtlO.
L'insert RAPIA est marqué au 32P et permet d'identifier un phage dont l'insert (de 2100 pb) , après sous-clonage, est séquence.
La séquence d'acides nucléiques et la séquence d'acides aminés codée par cet acide nucléique sont représentées sur la figure 2.
La recherche d'homologie d'une part entre cette séquence d'acides aminés et les protéines RAPIA et RAP2, montre que cette séquence d'acides aminés a une homologie de 95% par rapport à RAPIA et 61% par rapport à RAP2.
Cette séquence d'acides aminés sera par la suite désignée par RAPIB. Elle présente un poids moléculaire calculé de 20 800 d.
EXEMPLE 3. PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIA DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION BACTERIEN: a) On sous-clone l'ADNc de RAPIA en vue de son amplification, dans le vecteur PUC8, au site EcoRI. Après culture, on extrait l'ADNc et on le soumet à l'enzyme de restriction Bgl2, puis à EcoRI, et on récupère ainsi un fragment d'ADN qui correspond à la région complète codant pour la protéine RAPIA.
Le fragment EcoRI/Bgl2 est clone dans le phage M13Mpll aux sites BamHI et EcoRI, ce qui permet, après culture du phage, de récupérer l'ADN simple brin.
On effectue une mutagénèse dirigée en utilisant un oligonucléotide de synthèse de séquence suivante: 5' CAGATCACATATGCGTGAGTAC 3' , cet oligonucléotide étant préalablement phosphorylé par la polynucléotide kinase.
On introduit ainsi un site NDEl en amont de l'ATG correspondant à l'initiation de la protéine RAPIA.
On prépare ensuite des recombinants de M13Mpll. Pour ce faire, on coupe par l'enzyme de restriction NDEl' l'ADN double brin de M13Mpll et on répare le site NDEl à l'aide de l'enzyme de Kleno .
On coupe ensuite par l'enzyme de restriction HindIII. Le fragment ainsi obtenu est alors lié au vecteur M13Mpll coupé par EcoRI-HindIII, le site EcoRI du susdit vecteur ayant été réparé par l'enzyme de Klenow avant ligation.
On effectue une mutagénèse dirigée en utilisant l'oligonucléotide de synthèse de séquence suivante phosphorylé par la polynucléotide kinase: 5' CCAGTGAATTCTATGCGTGAG 3'
Cet oligonucléotide permet d'insérer un C au site de ligation de M13Mpll et de RAPIA et reconstituer ainsi un site EcoRI. On obtient ainsi le phage M13Mpll contenant la séquence RAPIA. L'insert RAPIA pourra être isolé en coupant le phage aux sites EcoRI et HindIII. b) On prépare ensuite de l'ADN double brin de Ml3Mpll. On coupe par EcoRI et HindIII pour préparer 1'insert RAPIA en vue du clonage dans un vecteur d'expression bactérien.
On utilise par exemple comme vecteur d'expression celui qui est décrit dans l'article Tucker et al., EMBO J., vol. 5, 6, p. 1351-1358 (1986). Plus précisément, le vecteur utilisé est le vecteur ptac-cHras.
Le vecteur ptac-Hcras peut être obtenu à partir du vecteur pKM-tael selon la construction décrite dans le susdit article de Tucker. Quant au vecteur pKM-tael, il peut être obtenu selon la construction décrite dans l'article de Hermann A. De Boer et al., PNAS, vol. 80, p. 21-25, janvier 1983.
Le vecteur ptac-Hcras est soumis à l'enzyme de restriction HindIII, puis à EcoRI, de façon partielle afin de garder un fragment d'environ 300 paires de base EcoRI-EcoRI qui contient le promoteur tac inductible.
On insère dans le vecteur ainsi préparé, le fragment EcoRI-HindIII de RAPIA et on effectue une ligation. A l'aide du vecteur obtenu, on transforme ensuite une souche de E. coli, telles que celles connues sous la désignation de PRI&M15, ou HB101 - vecteur PDMI. c) On procède ensuite à l'expression de la protéine RAPIA de la façon suivante.
A partir d'une culture qui dure environ 12 heures, on fait un ensemencement avec l/100e du milieu de culture et on laisse pousser environ 3 heures en induisant ultérieurement environ 12 heures avec de l'IPTG, à une concentration de 50 μM.
On récupère ensuite la protéine RAPIA exprimée par la souche de E. coli selon des techniques classiques. Cette protéine se présente sous forme soluble.
EXEMPLE 4: PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIA MUTEE EN POSITION 61 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION:
On procède comme indiqué au paragraphe a) de l'exemple 3 c'est-à-dire jusqu'à l'obtention d'un phage M13Mpll contenant la séquence RAPIA clonées aux sites EcoRI et HindIII.
L'ADN simple brin du phage M13Mpll est préparé par mutagénèse dirigée en utilisant les oligonucléotides de synthèse suivants phosphorylés par la polynucléotide kinase:
5' GAT-ACT-GCA-GGG-CAA-GAG 3' (A) (pour transformer la threonine "61" en glutamine)
5' GAT-ACT-GCA-GGG-GTA-GAG 3' (B) (pour transformer la threonine "61" en valine)
On introduit ainsi en position 61, une glutamine à la place de la threonine dans le cadre de 1'oligonucléotide (A) et une valine à la place de la threonine dans le cadre de 1'oligonucléotide (B) .
Les ADN double brin respectifs de chacune des deux séquences RAPIA modifiées comme indiqué ci- dessus sont alors préparés, puis coupés par les enzymes EcoRI et HindIII, puis clone dans le vecteur d'expression comme indiqué au paragraphe .b) de l'exemple 3.
L'obtention des deux protéines modifiées est effectuée suivant le paragraphe c) de l'exemple 3. EXEMPLE 5: PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIA MUTEE EN
POSITION 35 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION:
On procède comme indiqué à l'exemple 4. La mutagénèse dirigée est effectuée en utilisant
1'oligonucléotide de synthèse suivant phosphorylé par la polynucléotide kinase:
5' TAT GAC CCA GCG ATA GAA GAT 3' pour transformer la threonine "35" en alanine. EXEMPLE 6: PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIA MUTEE EN
POSITION 12 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION:
On procède comme indiqué à l'exemple 4. La mutagénèse dirigée est effectuée en utilisant
1Oligonucléotide de synthèse suivant phosphorylé par la polynucléotide kinase:
5' CTT GGT TCA GTA GGC GTT 3' pour transformer la glycine "12" en valine.
EXEMPLE 7: PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIA MUTEE EN
POSITION 17 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION: On procède comme indiqué à l'exemple 4. La mutagénèse dirigée est effectuée en utilisant
1 'oligonucléotide de synthèse suivant phosphorylé par la polynucléotide kinase:
5' CGT TGG GAA GAA TGC TCT GAC A 3' pour transformer la serine "17" en asparagine.
EXEMPLE 8: PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIA MUTEE EN
POSITION 168 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION:
On procède comme indiqué à l'exemple 4. La mutagénèse dirigée est effectuée en utilisant 1'oligonucléotide de synthèse suivant phosphorylé par la polynucléotide kinase:
5' GAT AAA TAG GTA AAC ACC AGT 3' pour introduire un codon stop à la place de la lysine 168. EXEMPLE 9:PRODUCTION DE LA PROTEINE RAPIB DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION:
On clone le fragment EcoRI-KpNI du fragment 5 RAPIB dans le phage M13Mpll aux sites EcoRI et BamHI.
On effectue une mutagénèse dirigée en utilisant un oligonucléotide de synthèse suivant phosphorylé par la polynucléotide kinase: 10 5' AAG CTT GCA TAT GCG TGA GT 3' et on introduit ainsi un site NDEl en amont de l'ATG correspondant à l'initiation de la protéine RAPIB.
On prépare ensuite des recombinants de M13Mpll. Pour ce faire, on coupe par l'enzyme de restriction 15 NDEl, l'ADN double brin de M13Mpll et on répare le site de NDEl à l'aide de l'enzyme de Klenow.
On coupe ensuite par l'enzyme de restriction
HindIII. On effectue ensuite une ligation du fragment obtenu au vecteur M13Mpll coupé par EcoRI-
2° HindIII, le site EcoRI du susdit vecteur ayant é.té reparé par l'enzyme de Klenow avant ligation.
On effectue ensuite une mutagénèse dirigée pour introduire un C au site de ligation de M13Mpll et de RAPIB. Le site EcoRI est ainsi reconstitué. Cette ~~ mutagénèse dirigée est effectuée à l'aide de l'oligonucléotide de synthèse de séquence suivante phosphorylé par la polynucléotide kinase: 5' CCA GTG AAT TCT ATG CGT GAG 3'
On obtient ainsi le phage M13Mpll contenant la 30 séquence RAPIB. L'insert RAPIB peut être isolé en coupant le phage aux sites EcoRI et HindIII et inséré dans un vecteur d'expression tel que le vecteur ptac. L'obtention de la protéine RAPIB est effectuée comme indiqué au paragraphe c) de 35 l'exemple 3. EXEMPLE 10;PRODUCTION DE LA PROTEINE RAP2 MUTEE EN POSITION 12 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION BACTERIEN:
On procède comme indiqué au paragraphe a) de l'exemple 3, c'est-à-dire jusqu'à l'obtention du phage M13Mpll contenant la séquence RAP2 clonée aux sites EcoRI et HindIII.
L'oligonucléotide de synthèse suivante phosphorylé par la polynucléotide kinase: 5' CGG AGG GCA TAT GCG CGA GTA 3' est utilisé pour introduire un site NDEl, et 1Oligonucléotide de séquence suivante phosphorylé par la polynucléotide kinase: 5' CCA GTG AAT TCT ATG CGC GAG 3' est utilisé pour insérer un C au site de ligation de M13Mpll et de RAPIA et reconstituer ainsi un site EcoRI.
L'ADN simple brin du phage M13Mpll est préparé par mutagénèse dirigée en utilisant les oligonucléotides de synthèse suivant phosphorylé par la polynucléotide kinase: 5' GCT GGG CTC GGT CGG GGTA GGC A 3* pour transformer la glycine "12" en valine.
L'ADN double brin de la séquence RAP2 modifiée comme indiqué ci-dessus est préparé, puis coupé par les enzymes EcoRI et HindIII, puis clone dans le vecteur d'expression ptac32 décrit dans "Biochemical Properties of Ha-ras Encoded p21 Mutants and Mechanism of the Autophosphorylation Reaction" (The Journal of Biological Chemistry, vol. 263, N° 24, p. 11792-11799, 1988), comme indiqué au paragraphe b) de l'exemple 3.
L'obtention de la protéine modifiée dans une souche de E. coli, telles que celles connues sous la désignation de PRIΔM15 OU HB101 + PDMI, est effectuée suivant le paragraphe c) de l'exemple 3. EXEMPLE 11:PRODUCTION DE LA PROTEINE RAP2 MUTEE EN
POSITION 35 DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION BACTERIEN:
,5 A partir du phage M13Mpll contenant la séquence RAP2 clonée aux sites EcoRI et HindIII, obtenu comme indiqué à l'exemple précédent, l'ADN simple brin du phage M13Mpll est préparé par mutagénèse dirigée en utilisant les oligonucléotides de synthèse suivant
10 phosphorylé par la polynucléotide kinase: 5' TAC GAC CCC GCC ATC GAG GAC 3" pour transformer la threonine "35" en alanine.
L'obtention de la protéine modifiée est effectuée comme indiqué à l'exemple précédent.
15 EXEMPLE 12: EXPRESSION DU GENE RAPIA OU DU GENE RAP2 DANS LE VECTEUR VETR-RAP A ET VETR-RAP2:
1) On a fait exprimer respectivement le gène RAPIA et le gène RAP2 dans un vecteur d'expression de type rétrovirus construit de la façon suivante à
20 partir du vecteur initial A*.
Le vecteur A* est une modification du vecteur A, dans lequel le site EcoRI de PBR322 a été détruit.
Ce vecteur A été obtenu par ligation du
25 fragment de 4,5 Kb HindIII-EcoRI du virus de Harvey (nucléotides 3495-2540) (Soeda, E. et Yasuda, S. (1985) , RNA Tumor Viruses: Molecular Biology of Tu or Viruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , Second édition, pp.
30 928-939), au fragment de 3,3 Kb EcoRI-Ba HI de ce même virus (nucléotides 2540-378) . Après ligation, le fragment viral a été inséré entre les sites HindIII et BamHI de pBR 322.
35 Le vecteur initial A* est représenté par un cercle sur les Figures 12a) , 12b) et 12c) .
Sur la Figure 12a) on a représenté le fragment SacII/EcoRI du vecteur initial A* par un trait fort en regard duquel on a dessiné (à l'intérieur du vecteur) un arc de cercle en pointillés.
On coupe le vecteur initial A* par EcoRI et on fait agir l'enzyme de Klenow pour obtenir des bouts francs. Le site EcoRI est ainsi détruit et est représenté dans la suite par EcoRI barré d'une croix
On coupe ensuite par SacII et on récupère le fragment SacII/Ec^I de 1600 pb.
2) Sur la Figure 12b) , on a représenté le fragment Pstl/SacII du vecteur A* par un trait fort, en regard duquel on a dessiné (à l'intérieur du vecteur) un arc de cercle en traits pleins.
On coupe le vecteur initial A* par PstI et SacII pour récupérer le 'fragment Pstl/SacII de 3736 pb.
3) Sur la Figure 12c) , on a représenté le fragment Pstl/HindIII du vecteur A* par un trait fort, en regard duquel on a dessiné (à l'intérieur du vecteur) un arc de cercle en pointillés : traits pleins-points.
On coupe le vecteur initial A* par HindIII; on fait agir l'enzyme de Klenow pour obtenir des bouts francs, puis on coupe par PstI. Le site HindIII est ainsi détruit et est représenté dans la suite du texte par Hip_ClII.
On récupère le fragment Pstl/Hip-élI de 5626 pb. 4) On effectue ensuite la ligation des fragments suivants obtenus respectivement en 1) , 2) et 3) ci- dessus:
- SacII/Ec^I
- Pstl/SacII pour obtenir la construction intermédiaire représentée sur la figure 12d) .
Dans cette construction intermédiaire, le fragment compris entre HindIII d'une part et Ecj_?fI/Hip- II d'autre part contient une séquence désignée par "enhancer", ou séquence stimulatrice, représentée par "E" sur la figure 12d) .
5) On coupe la construction intermédiaire par Pstl/HindlII. On récupère le fragment Pstl/HindlII de 6345 pb contenant d'une part la LTR3 ' (qui servira pour le site de polyadenylation de l'ARN) et d'autre part la région de 1 ' "enhancer" .
Le susdit fragment est représenté par un trait fort, sur la figure 12e) , en regard duquel on a dessiné (à l'intérieur du vecteur) des points selon un arc de cercle.
6) On utilise un autre vecteur, désigné par J' .- Ce vecteur J' est obtenu à partir du vecteur A* et diffère du vecteur A* par les deux éléments suivants:
- la mutation en position 12 n'existe plus; le fragment viral de 51bp HindIII/Pvull (nucléotide 1088-1139) a' été remplacé par le fragment correspondant du gène cellulaire Ha-ras de souris (Lacal et al. (1984): Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 5305-5309) .
- le site SacII présent dans le virus de Harvey à la position 940 a été remplacé par un site EcoRI. A partir du vecteur J', on isole le fragment contenant la LTR5'. Pour ce faire, le vecteur J' est coupé par Pstl/EcoRI et on isole le fragment Pstl/EcoRI de 2305 pb représenté par un trait sur la figure 12f) , en regard duquel on a dessiné (à l'intérieur du vecteur) de petits triangles pleins, selon un arc de cercle.
7) les inserts EcoRI/HindIII de RAPIA sous- clonés dans pUC8 ou de RAP2 sous-clonés dans pUC8 sont ensuite liés aux fragments HindIII/PstI de 6345 pb obtenu (comme indiqué au paragraphe 5 ci-dessus) et provenant du vecteur appelé "construction intermédiaire" et Pstl/EcoRI provenant du vecteur J' (cf. paragraphe 6 ci-dessus) de 2305 pb. Résultats:
On a fait exprimer les vecteurs d'expression décrits ci-dessus et contenant respectivement RAPIA et RAP2 dans différentes lignées cellulaires normales ou transformées, notamment par RAS ou par d'autres oncogènes.
EXEMPLE 13: EXPRESSION DU GENE RAPIA OU DU GENE RAP2 DANS LE VECTEUR PJ3Q:
Ce vecteur est décrit dans Land, H.A., Chen, C, Morgenstern, J.P., Parada, L.F., et Weinberg, R.A., Mol. Cell Biol. 6:1917-1925, 1986.
Pour RAPIA, le clonage dans le vecteur PJ3Ω se fait à partir de l'insert EcoRI/Bgl2 obtenu à partir de l'ADNc complet de RAPIA clone directement dans le vecteur PJ3Q aux sites EcoRI/Bgl2 de ce vecteur. Pour RAP2, comme il n'existe pas de site Bgl2, on utilise l'insert provenant de l'ADNc de RAP2 coupé aux sites EcoRI/PstI, clone dans le plasmide pUC8. A partir de cette construction on ressort le fragment EcoRI/HindIII , ayant 670 pb. On coupe le susdit plasmide pUC8 contenant RAP2 par HindIII et on répare par l'enzyme de Klenow pour obtenir des bouts francs, puis on coupe par EcoRI.
Le site HindIII est détruit et sera dans la suite désigné par Hindi J.
L'insert EcoRI/Hi ^II (réparé par la Klenow) est isolé sur gel d'agarose.
Le vecteur PJ3Ω est coupé au site Bgl2 réparé par la Klenow pour obtenir des bouts francs, puis coupé par EcoRI.
Le site Bgl2 est détruit et sera désigné dans la suite par Bα_<È.
L'insert RAP2 et le vecteur PJ3Ω coupé aux sites ensuite soumis à une ligation. Résultats:
On fait exprimer RAPIA et RAP2 clones dans le vecteur PJ3Ω comme décrit ci-dessus respectivement dans différentes lignées cellulaires normales ou transformées, notamment par RAS ou par d'autres oncogènes.
On a également effectué le clonage inversé respectivement de RAPIA et RAP2 dans le vecteur PJ3Ω, aux sites HindIII/EcoRI.
Pour RAPIA, 1'insert EcoRI/HindIII obtenu à partir du sous-clonage de RAPIA dans pUC8 est lié au vecteur PJ3Ω coupé aux sites HindIII/EcoRI.
Pour RAP2, 1*insert EcoRI/HindIII obtenu à partir du sous-clonage de RAP2 dans pUC8 est lié au vecteur PJ3Ω coupé aux sites HindIII/EcoRI.
Le clonage inversé de RAPIA et RAP2 dans le vecteur PJ3Ω permet l'obtention d'ARN messager antisens qui, par hybridation avec les ARN messagers des gènes RAPIA et RAP2 endogènes, peuvent inhiber la synthèse protéique.
Ce vecteur peut permettre l'expression des protéines RAP soit après transfection, soit par infection, le vecteur ayant préalablement été encapsidé à l'aide d'un virus "associé" ("helper"). EXEMPLE 14: EXPRESSION DU GENE RAPIA, DU GENE RAPIB ET DU GENE RAP2 DANS LE VECTEUR PEX V3:
Ce vecteur est décrit dans Miller, J., et Germain, R.N. , J. Exp. Med. 164:1478-1489, 1986.
Pour le clonage de RAPIA, ainsi que celui de RAPIB et RAP2, le vecteur PEX V3 est coupé par 1'enzyme EcoRI.
Les inserts EcoRI des ADNc complets respectivement de RAPIA, RAPIB et RAP2 sont directement clones dans le vecteur PEX V3 coupé au site EcoRI.
Pour RAPIA, l'insert est de 1,4 kb, pour RAPIB, l'insert est de 2,1 kb, et pour RAP2, 1'insert est de 950 pb.
La bonne orientation dans le vecteur, c'est-à- dire celle compatible avec l'expression de la protéine, a été déterminée en effectuant différentes dégradations enzymatiques (par exemple BamHI et pstl) et par le séquençage de fragments de restriction incluant le site EcoRI de clonage.
On fait exprimer RAPIA, RAPIB et RAP2 respectivement dans différentes lignées cellulaires normales ou transformées.
On a également effectué le clonage selon l'orientation inverse à celle indiquée ci-dessus. Ceci permet d'obtenir un ARN trancript comme indiqué à la fin de l'exemple 13. EXEMPLE 15: EXPRESSION DU GENE RAPIA OU DU GENE RAP2 DANS LE VECTEUR P ZIP NEO:
Ce vecteur est décrit dans Constance, L. Cepho, Bryan, E. Roberts, et Richard, C. Mulligan. Cell, vol. 37: 1053-1062, 1984.
On clone RAPIA et RAP2 au site BamHI du susdit vecteur, lequel a été préalablement coupé par BamHI et réparé par la Klenow pour obtenir des bouts francs. Le site BamHI est détruit et sera dans la suite désigné par Bah^I.
En ce qui concerne RAPIA, il est préalablement sous-clonê dans le plasmide pUC8.
L'ADNc est coupé par EcoRI/HindIII réparé par la Klenow (pour obtenir des extrémités à bouts francs) ruits et seront L'insert RAPIA est lié par une ligase permettant de constituer le vecteur p Zip Neo de RAPIA. On oriente le vecteur (dans le sens permettant l'expression de la protéine) en effectuant différentes dégradations enzymatiques et en effectuant le séquençage aux sites de clonage.
Pour le clonage de RAP2, on procède comme indiqué à propos de RAPIA.
L'insert Ec^I Hjjj_t!k^II de RAP2, réparé par la Klenow est lié au vecteur P Zip Neo coupé en BamHI réparé par l'enzyme de Klenow.
On fait exprimer RAPIA et RAP2 clones dans P Zip Neo respectivement dans différentes lignées cellulaires normales ou transformées. EXEMPLE 16: EXPRESSION DU GENE RAPIA OU DU GENE RAP2 DANS LE VECTEUR DE LEVURE YEP51:
Ce vecteur est décrit dans Broach et al. (1983) , Vectors for high - level inducible expression of cloned gènes in veast. In Expérimental
Manipulation of gène expression, M. Inouye, éd. (New
York: Académie Press) pp. 83-177.
Le clonage est effectué de la façon suivante: Le vecteur YEP51 est coupé par Sali réparé par la Klenow, puis coupé ensuite par HindIII.
Le site Sali est détruit et est désigné dans la suite par S l .
Le grand fragment Sa^Œ/HindlII est purifié sur gel et sert au clonage.
En ce qui concerne RAPIA, l'insert utilisé provient de sous-clonage de l'ADNc de RAPIA (fragment EcoRI/Bgl2) dans le vecteur pUC8.
Cet insert est obtenu en coupant RAPIA sous- clone dans le vecteur pUC8 par EcoRI, suivi d'une réparation par l'enzyme de Klenow, puis d'une coupure par HindIII. Le site EcoRI est détruit et
est purifié puis lié au
Pour RAP2, on procède comme indiqué à propos de RAPIA.
On fait exprimer RAPIA et RAP2 clones dans le vecteur YEP51 dans différentes souches de levure.
EXEMPLE 17: EXPRESSION DU GENE RAPIA OU DU GENE RAP2 DANS LE VECTEUR DE LEVURE PD2 E2
Le vecteur PD2 E2 est décrit dans la littérature. Ce vecteur contient déjà un gène clone dont on se débarrasse en coupant par HindIII, puis en purifiant sur un gel d'agarose pour isoler le vecteur de l'insert. Le vecteur est ensuite réparé par l'enzyme de Klenow pour obtenir des bouts francs. Les sites HindIII sont détruits.
Pour le clonage de RAPIA, on utilise l'insert provenant du sous-clonage du cDNA de RAPIA dans pUC8 (fragment EcoRI/Bgl2) . Cet insert est obtenu en coupant pUC8 RAPIA aux sites HindIII et EcoRI et est traité par l'enzyme de Klenow pour obtenir des bouts francs.
Les sites HindIII et EcoRI sont détruits et désignés dans la suite par Ecj_HQ[./Hi_ u.II.
On réalise ensuite la ligation de l'insert Ec^l/Hi __^II de RAPIA avec le susdit vecteur de levure.
Pour RAP2, on utilisé le même type de construction que pour RAPIA.
On fait exprimer RAPIA et RAP2 clones dans le vecteur PD2E2 respectivement dans différentes souches de levure. EXEMPLE 18 : DETERMINATION DE LA LOCALISATION
CHROMOSOMIQUE CHEZ L'HOMME DES GENES RAPIA, RAPIB ET
RAP
1) Pour ce faire, on procède de la façon suivante:
- préparation des sondes d'ADNc.
Les ADNc RAP sont clones dans le plasmide pUC8. Deux fragments différents sont utilisés pour la localisation respective de chaque gène (cf. figure 10) .
Pour la localisation du gène RAPIA, on a utilisé deux sondes comprenant l'ADNc complet (l,4kb) ou sa partie 5' comprenant la région codante (0,7kb). Les deux sondes utilisées pour RAPIB sont soit l'ADNc complet (2,lkb) soit la partie 5' (0,73kb) . Les deux sondes du gène RAP2 sont soit l'ADNc complet de 0,95kb soit le fragment de 0,66kb dans la partie 5' .
2) préparation des chromosomes :
Des préparations de chromosomes à haute 0 résolution sont obtenus à partir de culture de cellules de sang stimulées par la phytohemagglutinine de deux hommes sains après synchronisation au methothrexate selon Yunis et al.
(Yunis, J.J., Sawyer, J.R., Bail, D. .:
15 Characterization of banding patterns of etaphase- prophase G-banded chromosomes and their use in gène apping. Cytogenet. Cell Genêt., 22, 679-683,
(1978) .
3) Hybridation in situ:
20 Les sondes sont marquées selon le procédé • d'amorces d'ADN aléatoires (Kit A ersham, U.K.) ' introduites par Feinberg et Vogelstein (Feinberg, A.P., Vogelstein, B.A.: technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high
2 spécifie activity. Anal. Biochem. , 132, 6-13, 1983). En utilisant 20 μCi[H3]dCTP pour 50ng d'ADNc, l'activité obtenue est de 0,5 à 2xl08 cpm/μg.
Ces sondes marquées sont utilisées à des concentrations de 20 à 80 ng/ l.
30 La technique d'hybridation décrite par Harper et Saunders (Harper, M.E. , Saunders, G.F.: Localization of single copy DNA séquences on G banded human chromosomes by in situ hybridization. Chromosoma, 83, 431-439, 1981) est légèrement
~ ~ modifiée selon la méthode de Caubet et al. (Caubet, J.F., et al., Hu an proto-oncogene c-mos maps to 8qll. Embo J., 4, 2245-2248, 1985) .
Les plaques recouvertes d'émulsion Kodak NTB2 sont exposées pendant une et deux semaines pour 1 ' autoradiographie: des bandes G sont ensuite obtenues avec le colorant de Wright.
4) Résultats:
Deux inserts diffférents de chacun des gène RAPIA , RAPIB et RAP2 sont utilisés respectivement pour l'hybridation in situ vis-à-vis des chromosomes humains pour confirmer les résultats de la figure 10. Seules les métaphases ne présentant pas plus de trois grains d'argent sur les chromosomes sont photographiées et analysées.
5) Localisation de RAPIA:
L'expérience faite soit avec la sonde de 1, 4kb soit avec celle de 0,7kb révèle un amas unique de grains sur le chromosome Ipl2-pl3 (6% et 5,5% du nombre total) (tableau 1) .
TABLEAU 1
HYBRIDATION IN SITU DE RAPIA, RAPIB ET RAP2 SUR CHROMOSOMES HUMAINS
SONDE TAILLE N° DES N° DES AMAS DE GRAINES
MITOSES GRAINES
sur chrom. 1 sur chrom. Ipl2pl3
Bβpl A 1.4Kb 143 246 44 (17.8%) 15 (6%)
0.7Kb 120 163 26 (15.9%) 9 (5.5%)
sur chrom. 12 sur chrom. 12ql4
raplB 2.1Kb 195 292 43 (14.7%) 21 (7.2%)
0.73Kb 131 177 30(16.9%) 17(9.6%)
sur chrom. 13 sur chrom. 13q34
rapl 0.950Kb 138 200 26 (13%) 13 (6.5%)
0.660Kb 60 82 24 (29.2%) 11 (13.4%) Aucun signal secondaire signifiant n'est observé sur d'autres chromosomes (cf. figure lia) .
6) Localisation de RAPIB: L'hybridation in situ avec la sonde de 2,lkb ou de 0,7kb montre une claire accumulation de grains (7,2% and 9,6% du total) sur le chromosome 12ql4 (tableau 1) .
Aucun autre amas de grains significatif n'est présent sur d'autres chromosomes (fig. 11b).
7) Localisation de RAP2:
Les deux sondes de 0,950kb et 0,660kb utilisés dans cette localisation montrent dans chaque cas le même amas de grains sur le chromosome 13q34 (6,5% et 13,4% du total (tableau 1) .
Aucun autre signal mineur n'est visible sur d'autres chromosomes (figure lie) . Conclusion:
On n'a constaté ni hybridation, ni signal secondaire sur les autres chromosomes.
En ce qui concerne le chromosome Ipl2-pl3, aucun délétion spécifique n'est associée à une néoplasie particulière. Quelques translocations de cette région sont décrites dans les élanomes et divers désordres sanguins (Bloomfield, CD., trent, J.M. , Van Den Berghe, H.: Report of the committee on structural chromosome changes in neoplasia (HGM10) , Cytogenet. Cell. Genêt. 46, 344-366, 1987) .
On peut constater une proximité voisine apparente Ipl2pl3 du gène N-ras, situé également sur le chromosome.
En ce qui concerne la localisation du gène RAPIB sur le chromosome 12ql4, des ruptures sont décrites à la fois dans les néoplasmes bénins et malins suivants: lipomes (Heim et al., Reciprocal translocation t (3;12) (q27;ql3) in lipoma. Cancer Genêt. Cytogenet., 23, 301-304, 1986); liposarcomes myxoides (Turc-Carel et al., Cytogenetic studies of adipose tissue tumors. II. Récurrent reciprocal translocation t(12;16) (ql3;pll) ; in myxoid liposarcomas, Cancer Genêt. Cytogenet. 23, 291-299, 1986);
- adénomes pleomorphiques (Bullerdiek et al., Rearrangements of chromosome région 12ql3-ql5 in pleomorphic adenomas of the human salivary gland (PSA) . Cytogenet. Cell Genêt., 45, 187-190, 1987 et Mark et al., Cytogenetical observations in 100 human benign pleomorphic adenomas: specificity of the chromosomal aberrations and their relationship to sites of localized oncogenes. Anticancer Res. , 6, 299-308, 1986) et leio yomes (Heim et al., A rearrangement between chromosomal régions 12ql3-ql5 and 14q22.24, t(12;14) (ql3-15;q22-24) , may be found in lyomyomas of the utérus (HGM9, Abstracts) . Cytogenet. Cell Genêt. , 46, 628, 1987) .
En ce qui concerne la localisation du gène RAP2, sur le chromosome 13q34, aucune délétion spécifique n'est associée à des néoplasies et quelques délétions dans cette région sont décrites dans le cancer sporadique du sein.

Claims

REVENDICATIONS 1. Séquence d'acides aminés caractérisée en ce qu'elle contient l'un au moins des enchaînements d'acides aminés suivants:
MREYKLWL (I)
ALTVQFVQG I F VEKYD PTI ED S YRKQVE VDC QQCMLE I L (II)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTEDVPM
(III)
EDERVVGKEQGQNLARQWCNCAFL (IV)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVEKKKPKKKSCLLL (V)
ALTVQFVQGIFVEKYDPTIEDSYRKQVEVDAQQCMLEIL
(VII)
QFTAMRDLYMKNGQGFALVYSITAQSTFNDLQDLREQILRVKDTDDVPMI(VIII)
EDERVVGKEQGQNLARQWNNCAFL (IX)
SKINVNEIFYDLVRQINRKTPVPGKARKKSSCQLL (X)
MREYKVWL (XI)
ALTVQFVTGTFIEKYDPTIEDFYRKEIEVDSSPSVLEIL
(XII)
QFASMRDLYIKNGQGFILVYSLVNQQSFQDIKPMRDQIIRVKRYEKVPVI (XIII )
ESEREVSSSEGRALAEEWGCPFM (XIV)
SKTMVDELFAEIVRQMNYAAQPDKDDPCCSACNIQ (XV)
2. Séquence d'acides aminés selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient les cinq enchaînements d'acides aminés I, II, III, IV, et V, définis à la revendication 1.
3. Séquence d'acides aminés selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient les cinq enchaînements d'acides aminés VII, VIII, IX, et X, définis à la revendication 1.
4. Séquence d'acides aminés selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient les cinq enchaînements d'acides aminés XI, XII, XIII, XIV, et XV, définis à la revendication 1.
5. Séquence d'acides aminés, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'enchaînement d'acides aminés XVI, représenté sur la figure 1 ou est constituée par cet enchaînement d'acides aminés.
6. Séquence d'acides aminés, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'enchaînement d'acides aminés XVI représenté sur la figure 2, ou est constituée par cet enchaînement d'acides aminés.
7. Séquence d'acides aminés, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient l'enchaînement d'acides aminés XVIII représenté sur la figure 3, ou est constituée par cet enchaînement d'acides aminés.
8. Séquence d'acides aminés caractérisée en ce qu'elle contient l'un au moins des enchaînements d'acides aminés codés par les enchaînements nucléotidiques suivants :
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA AAA TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA GTT GAA GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC CAA GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC
ACG TTT AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA
CGG GTT AAG GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT
(3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC
AGA CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG
CCT AAA AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA
AAA TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA
GTT GAA GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA
CAA GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT
CGA GTT AAA GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT
(8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT l101 ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11)
GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG
AAA TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG
~ ATC GAG GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG
(12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC
CAG GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG
!0 AGC TTC CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC 'CAG ATC ATC
CGC GTG AAG CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
15
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG
AGG CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC
CCA TGC TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
20
9. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il contient l'un au moins des enchaînements de nucléotides codant pour les séquences d'acides aminés selon les revendications 1 à 7.
.
10. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il contient l'un au moins des enchaînements de nucléotides suivants :
ATG CGT GAG TAC AAG CTA GTG GTC CTT (1)
30 GCT CTG ACA GTT CAG TTT GTT CAG GGA ATT TTT GTT GAA
AAA TAT GAC CCA ACG ATA GAA GAT TCC TAC AGA AAG CAA
GTT GAA GTC GAT TGC CAA CAG TGT ATG CTC GAA ATC CTG (2)
35 CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTG TAT ATG AAG AAC GGC
CAA GGT TTT GCA CTA GTA TAT TCT ATT ACA GCT CAG TCC
ACG TTT AAC GAC TTA CAG GAC CTG AGG GAA CAG ATT TTA
CGG GTT AAG GAC ACG GAA GAT GTT CCA ATG ATT (3)
GAA GAT GAG CGA GTA GTT GGC AAA GAG CAG GGC CAG AAT TTA GCA AGA CAG TGG TGT AAC TGT GCC TTT TTA (4)
TCA AAG ATC AAT GTT AAT GAG ATA TTT TAT GAC CTG GTC
AGA CAG ATA AAT AGG AAA ACA CCA GTG GAA AAG AAG AAG
CCT AAA AAG AAA TCA TGT CTG CTG CTC (5)
ATG CGT GAG TAT AAG CTA GTC GTT CTT (6)
GCT TTG ACT GTA CAA TTT GTT CAA GGA ATT TTT GTA GAA
AAA TAC GAT CCT ACG ATA GAA GAT TCT TAT AGA AAG CAA
GTT GAA GTA GAT GCA CAA CAG TGT ATG CTT GAA ATC TTG (7)
CAA TTT ACA GCA ATG AGG GAT TTA TAC ATG AAA AAT GGA CAA GGA TTT GCA TTA GTT TAT TCC ATC ACA GCA CAG TCC ACA TTT AAC GAT TTA CAA GAC CTG AGA GAA CAG ATT CTT CGA GTT AAA GAC ACT GAT GAT GTT CCA ATG ATT (8)
GAA GAT GAA AGA GTT GTA GGG AAG GAA CAA GGT CAA AAT CTA GCA AGA CAA TGG AAC AAC TGT GCA TTC TTA (9)
TCA AAA ATA AAT GTT AAT GAG ATC TTT TAT GAC CTA GTG CGG CAA ATT AAC AGA AAA ACT CCA GTG CCT GGG AAG GCT CGC AAA AAG TCA TCA TGT CAG CTG CTT (10)
ATG CGC GAG TAC AAA GTG GTG GTG CTG (11) GCC CTG ACC GTG CAG TTC GTG ACC GGC ACC TTC ATC GAG
AAA TAC GAC CCC ACC ATC GAG GAC TTC TAC CGC AAG GAG
ATC GAG GTG GAT TCG TCG CCG TCG GTG CTG GAG ATC CTG (12)
CAG TTC GCG TCC ATG CGG GAC CTG TAC ATC AAG AAC GGC
CAG GGC TTC ATC CTC GTC TAC AGC CTC GTC AAC CAG CAG
AGC TTC CAG GAC ATC AAG CCC ATG CGG GAC CAG ATC ATC
CGC GTG AAG CGG TAT GAG AAA GTG CCA GTC ATC (13)
GAA AGT GAG AGA GAA GTA TCG TCC AGC GAA GGC AGA GCC CTT GCT GAA GAG TGG GGC TGC CCC TTT ATG (14)
AGT AAA ACA ATG GTG GAC GAA CTC TTT GCA GAA ATT GTG AGG CAG ATG AAC TAT GCT GCT CAG CCT GAC AAA GAT GAC CCA TGC TGT TCT GCA TGT AAC ATA CAA (15)
11. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient les cinq enchaînements de nucléotides (1) , (2) , (3) , (4) et (5) , définis à la revendication 10.
12. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient les cinq enchaînements de nucléotides (6) , (7) , (8) , (9) et (10) , définis à la revendication 10.
13. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient les cinq enchaînements de nucléotides (11) , (12) , (13) , (14) et (15) , définis à la revendication 10.
14. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient l'enchaînement de nucléotides (16) , délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 43 et 594 de la figure 1, ou contient l'enchaînement de nucléotides (19) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 605 de la figure 1.
15. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient l'enchaînement de nucléotides (17) , délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 54 et 605 de la figure 2, ou contient l'enchaînement de nucléotides (20) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 838 de la figure 2.
16. Acide nucléique selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient l'enchaînement de nucléotides (18) , délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 4 et 552 de la figure 3, ou comprend l'enchaînement de nucléotides (21) délimité par les nucléotides d'extrémité correspondant aux nucléotides situés aux positions 1 et 558 de la figure 3.
17. Acide nucléique recombinant caractérisé en ce qu'il contient l'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, inséré dans un acide nucléique hétérologue vis-à-vis du susdit fragment.
18. Vecteur recombinant en particulier pour le clonage et/ou l'expression particulièrement du plasmide, cosmide ou phage, caractérisé en ce qu'il contient un acide nucléique recombinant selon la revendication 17 contenant le susdit acide nucléique en un des sites non essentiels pour sa réplication.
19. Vecteur recombinant selon la revendication
18, caractérisé en ce qu'il contient en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication des éléments nécessaires pour promouvoir l'expression d'une séquence d'acides aminés selon les revendications l à 8, dans un hôte cellulaire, et éventuellement un promoteur compatible avec ledit hôte cellulaire, en particulier un promoteur inductible, et éventuellement une séquence signal et/ou une séquence d'ancrage.
20. Vecteur recombinant selon la revendication
19, en ce qu'il contient :
- les éléments permettant son insertion dans E. Coli,
- les éléments permettant l'expression par E. Coli de cet acide nucléique selon les revendications 9 à 17, inséré dans le vecteur, et les éléments permettant l'exportation du produit résultant de l'expression du susdit acide nucléique.
21. Hôte cellulaire transformé par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendicationions 18 à 20, capable de se répliquer dans ledit hôte cellulaire.
22. Hôte cellulaire selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit de E. Coli transformé par le vecteur selon la revendication 20.
23. Anticorps, notamment monoclonal, caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une séquence d'acides aminés selon l'une quelconques des revendications 1 à 8.
24. Sonde nucléotidique caractérisée en ce qu'elle hybride avec l'un des acides nucléiques selon les revendications 9 à 17, ou avec leurs séquences complémentaires dans les conditions d'hybridation suivantes :
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques (2) , (3) , (4) , (5) , (7) , (8), (9), (10), fl2) , (13), (14) et (15) ou leurs séquences complémentaires les conditions d'hybridation sont les suivantes : hybridation proprement dite : 60°C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1% SDS, 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon ; lavage : 60°C, 2X SSC, 0,1% SDS, 30 mn ;
- pour les sondes susceptibles de s'hybrider avec les acides nucléiques ou les séquences complémentaires (1) , (6) et (11) les conditions d'hybridation sont les suivantes : hybridation proprement dite : 45°C, 5X SSC, 5X Denhardt, 0,1% SDS, 100 μg/ml d'ADN de sperme* de saumon ;
1° lavage : température ambiante, 2X SSC, 0,1% SDS, 30mn,
2° lavage : 45°C, 2X SSC, 0,1% SDS, 30 mn.
25. Méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans un prélèvement biologique susceptible de les contenir, caractérisé en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'au moins un des anticorps selon la revendication 23, avec le susdit prélèvement biologique ;
- la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes immunologiques formés entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus¬ mentionnés.
26. Méthode de dépistage in vitro des séquences d'acides aminés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans un prélèvement biologique susceptible de contenir des acides nucléiques codant pour lesdites séquences d'acides aminés, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'au moins une des sondes oligonucléotidiques selon la revendication 24, avec le susdit prélèvement biologique préalablement traité ;
- la détection à l'aide de tout moyen approprié des éventuels complexes d'hybridation formés entre les sondes et les acides nucléiques sus-mentionnés.
27. Méthode de dépistage in vitro selon la revendication 25 ou 26, appliquée au diagnostic in vitro de maladies corrélées à des teneurs en séquences d'acides aminés, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, situées à l'extérieur du domaine délimité par les valeurs extrêmes correspondant généralement à l'état physiologique d'un individu-sain.
28. Nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro selon les revendicatations 25 et 27 comprenant : une quantité déterminée d'au moins un des anticorps selon la revendication 23 susceptibles de donner lieu à une réaction immunologique avec une des séquences d'acides aminés à détecter selon les revendications 1 à 8 ; avantageusement, un milieu approprié à la formation d'une réaction immunologique entre les séquences d'acides aminés et les anticorps sus¬ mentionnés ; avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes immunologiques entre les séquences d'acides aminés et les anticorps produits lors de la susdite réaction immunologique.
29. Nécesssaire ou kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de dépistage in vitro selon la revendication 26 et 27 comprenant:
- une quantité déterminée d'au moins une des sondes oligonucléotidiques selon la revendication 24, susceptibles de donner lieu à une réaction d'hybridation avec un des acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés à détecter selon les revendications 1 à 8 ;
- avantageusement un milieu approprié à la formation d'une réaction d'hybridation entre les acides nucléiques et les sondes sus-mentionnés ;
- avantageusement, des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation produits de la susdite réaction d'hybridation.
30. Procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés selon l'une quelconque des revendicationions 1 à 8, caractérisé en ce que : on cultive dans un milieu de culture approprié un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 17,
- et on récupère à partir du susdit milieu de culture la séquence d'acides aminés produite par ledit hôte cellulaire transformé, après lyse de la membrane cellulaire de cet hôte cellulaire.
31. Procédé de préparation d'une séquence d'acides aminés déterminée caractérisé par la mise en culture de E. Coli contenant un vecteur recombinant selon la revendication 20 et par l'arrêt de la culture en fin de phase exponentielle de croissance dudit E. Coli, et récupération de la séquence d'acides aminés déterminée à partir du milieu de culture exempt des autres protéines et enzymes exocellulaires susceptibles d'être sécrétés par E. Coli.
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