EP0444040A1 - Sequence nucleotidique complete de l'adn complementaire de l'arn genomique de potyvirus, genes codant pour la proteine de capside de potyvirus et applications de ces genes a la creation de plantes transgeniques resistantes aux potyvirus - Google Patents

Sequence nucleotidique complete de l'adn complementaire de l'arn genomique de potyvirus, genes codant pour la proteine de capside de potyvirus et applications de ces genes a la creation de plantes transgeniques resistantes aux potyvirus

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Publication number
EP0444040A1
EP0444040A1 EP19890907776 EP89907776A EP0444040A1 EP 0444040 A1 EP0444040 A1 EP 0444040A1 EP 19890907776 EP19890907776 EP 19890907776 EP 89907776 A EP89907776 A EP 89907776A EP 0444040 A1 EP0444040 A1 EP 0444040A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sequence
potyvirus
capsid protein
gene
rna
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19890907776
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe Robaglia
Mylène DURAND-TARDIF
Jean Masson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP0444040A1 publication Critical patent/EP0444040A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/34011—Potyviridae
    • C12N2770/34022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to the determination of the complete nucleotide sequence of the DNA complementary to the genomic RNA of potyvirus, including that of the potato virus Y, and to the use of this sequence to create genes capable to confer on plants a resistance to potyviruses, by the creation of transgenic plants resistant to phytopathogenic viruses and in particular to potyvirus.
  • Viral conditions are a problem for the pathologist; in fact, because of the dependence of the virus on host cells, it is difficult to destroy it without running the risk of damaging the organism which it parasites.
  • the means of control are therefore essentially preventive; vaccines are used in animals with immune systems and in plants, seed selection and resistance varieties.
  • Curative methods are based on the use of molecules that interfere with replication (analogs of bases such as azidothymidine) which are not without side effects for the host.
  • thermotherapy and the cultivation of meristems allow healthy plants to be regenerated from infected plants (Morel and Martin, 1952).
  • Potyviruses are the largest group of plant viruses, comprising more than 70 apparently distinct members. These viruses are defined by the filamentary structure of their particle, 600 to 900 nm long, containing approximately 5% of nucleic acid and 95% of proteins. Each particle contains a single molecule of simple RNA positive strand of molecular weight 3-3.5 ⁇ 10 6 , and the subunits of a single polypeptide of molecular weight 32-34 ⁇ 10 3 . They induce the formation of inclusions of characteristic forms which accumulate in the cytoplasm and sometimes in the nucleus. They are transmitted naturally by aphids in a non-persistent fashion and some are also transmitted by seed.
  • PVY Potato virus Y
  • the Y virus and the leaf curly virus are considered to be the two most important viruses affecting the potato in the world.
  • Early infection of tobacco with PVY can lead to a yield reduction of around 30%, and necrosis of the nerves from the nerves, caused by the N strain, can cause complete loss of the crop.
  • Viruses belonging to group O generally induce severe systemic symptoms of embossing, and leaf necrosis drooping in potatoes, systemic necrosis in Physalis floridana and systemic mottling in tobacco.
  • Group N strains of necrosis of the ribs of the tobacco
  • Group C viruses including the PVC virus which is not transmissible by aphids, produce hypersensitivity reactions in many potato cultivars.
  • These groups although very serologically related, show great intra-group variability. We can say that there are no reproducible serological differences between Yo, Yn and Yc. The reported inter-group cross-protection results are contradictory (De Bokx and Huttinga, 1981).
  • the capsid protein sequence of an Australian isolate revealed 92% identity with the capsid of the Pepper Mottle Virus (PeMV) and 62% with that of the Tobacco Etch Virus (TEV), the N- terminal of these proteins showing the greatest divergences (Shukla et al., 1986).
  • potyviruses The molecular study of potyviruses is relatively recent. These viruses are difficult to purify because of their particle instability and their tendency to form aggregates.
  • a protein (VPg) is covalently linked to the 5 'end of the viral RNA (Hari, 1981), which is polyadenylated at the 3' end (Hari, 1979).
  • Initial "in vitro" translation studies suggested that genomic RNA could be translated into a high molecular weight polyprotein, which would then be matured into smaller proteins (Yeh and Gonsalves, 1985. Hellman et al., 1983).
  • This hypothesis was confirmed by analysis of the nucleotide sequence of the tobacco etch virus (TEV) and tobacco vein mottling virus (TVMV) genomic RNAs (Allison et al., 1986. Domier et al., 1986), these RNAs would code for 345kD and 340kD polyproteins respectively. This mechanism is similar to that used by animal picornaviruses (Nicklin et al, 1986) and by
  • the proteolytic cleavages in these viruses are mainly made at the Gln-Gly (Picornavirus) and Gln-Gly, Gln-Ser and Gln-Met (Comovirus) sites.
  • Domier et al, 1986 proposed a proteolytic cleavage map of the TVMV polyprotein.
  • the same group (Domier et al, 1987) subsequently published an analysis of the sequence homologies of the proteins thus defined, with those of the Picorna-, Como-, and Caulimoviruses.
  • Carrington and Dougherty (1987) demonstrated that one of the two nuclear inclusions of TEV was a protease, which enabled these researchers to propose a partial genetic map of the Potyvirus genome by comparison with genomic RNAs of picornaviruses ( poliovirus), comovirus (CPMV), romancevirus (TBRV) and potyvirus (TVMV).
  • nucleotide sequences derived from the pathogen can be used to modify the host genetically in order to that it becomes resistant to the pathogen. This is possible because the life cycle of a parasite, like that of any organism, results from a sum of molecular events regulated at various levels. Resistance therefore comes from an interruption in the development of the parasite by one of its genes expressing itself at the wrong time, in the wrong place, in too large a quantity or in a modified counter-functional form.
  • the presence of the capsid protein in the cell prevents the entry of the virus or its decapidation: in fact the inoculation of viral RNA can overcome the protection observed in transgenic plants (Nelson et al., 1987 VIROLOGY, 158, 126-132).
  • This protection results in a delay in the appearance of lesions on the inoculated leaves, suggests an inhibitory effect at later stages of the infection, such as a reduction in the rate of multiplication or a blockage of the transport of the virus. cell to cell.
  • the capsid protein of the alfalfa mosaic virus would play a role in the binding of the polymerase to the 3 'end of the RNA, and therefore an activator of the synthesis of the negative strand, and in the late stages it would repress it, making the overall synthesis of RNA not symmetrical, in favor of the production of the positive strand (Houwing and Jaspars, 1987).
  • the bacteriophage QB capsid protein would have a double negative regulatory role, by suppressing viral replication, while promoting the translation of its own gene, and by suppressing the translation of the gene coding for the polymerase, by binding to its domain. initiation (Bernardi, 1972; Robertson, 1975). Using this latest data, Grumet, Sanford and Johnston, (1987, MOLECULAR STRATEGIES FOR CROP
  • î R. LISS INC pp. 3-12 demonstrated the validity of the concept of resistance derived from the pathogen, by obtaining high levels of resistance to this bacteriophage in E. coli strains expressing its capsid protein, even at multiplicities of infection important.
  • Tomato aspermy virus TMV
  • the object of the present invention is to construct a gene coding for the capsid protein of potyvirus and in particular of PVY, under conditions such that its function cannot be altered, by adding an ATG sequence. at the 5 'end of the coding sequence for the potyvirus capsid.
  • Potyviruses have the particularity of having as translation product, a single polyprotein which gives functional proteins only after proteolytic cleavage in precise places of the polyprotein, by a specific protease precisely coded by the viral genome; as a result, the present invention also aims to provide a system capable of blocking the action of the protease in order to prevent the appearance of viral proteins and, consequently, symptoms of l viral infection of the plants concerned.
  • the subject of the present invention is transgenic plants resistant to infection by potyviruses, characterized in that they are obtained from plant cell lines, in particular from plant species liable to be infected by potyviruses, modified by introduction of a gene coding for the potyvirus capsid protein.
  • said transgenic plants are characterized in that the gene introduced is a gene coding for the capsid protein of potyvirus, resulting from the addition of an ATG sequence to the 5 'end of the cDNA sequence encoding for said potyvirus capsid protein, provided with signals for regulating gene expression in a plant cell.
  • the ATG initiation codon of the introduced gene is included in a consensus sequence, of the type AX 1 X 2 ATGG in which X or Y are identical or different and each represents one nucleotides A, T, G or C.
  • X or Y are identical or different and each represents one nucleotides A, T, G or C.
  • the seeds derived from these transgenic plants and used for the reproduction of these fall within the scope of the present invention.
  • the present invention also relates to a gene coding for the capsid protein of potyvirus, characterized in that it results from the addition of an ATG sequence to the 5 'end of the cDNA sequence coding for said protein. of capsid of potyvirus.
  • its ATG initiation codon is included in a sequence of type AX 1 X 2 ATGG, where X 1 and X 2 are as defined above.
  • this gene comprises the DNA sequence complementary to the following nucleotide sequence (I):
  • the present invention further relates to a DNA sequence constituted by a gene coding for the capsid protein of potyvirus as defined above, provided with signals for regulating genetic expression in a plant cell.
  • the present invention further relates to a process for obtaining a gene coding for the capsid protein of potyvirus, characterized in that a fragment of a synthetic DNA comprising an ATG codon is inserted at a chosen point of the cDNA sequence coding for the capsid protein, the plasmids containing the desired junction then being isolated by hybridization with a synthetic oligonucleotide covering half the sequence of the synthetic DNA fragment and half the sequence of the 5 'end of the sequence of the gene coding for the potyvirus capsid protein.
  • the present invention further relates to a process for obtaining cDNA from potyvirus genomic RNA, which is characterized in that the first strand of cDNA is synthesized by the action of reverse transcriptase on RNA genome of potyvirus using random hexamers as initiators of the first strand, the RNA / DNA hybrid obtained is converted into double-stranded DNA by the joint action of three enzymes, RnaseH. of E.
  • the DNA fragments thus created are joined by the ligase of E. coli, the double-stranded cDNA is then treated with Sl-nuclease, the repair of its ends is carried out using T 4 -DNA-polymerase and the cDNA is separated according to its size on gel. low melting agarose, then ligated into a Smal cleavage site of an appropriate vector and the recombinant plasmids are introduced into E. coli, collected and sequenced by an appropriate sequencing method.
  • Clones, obtained by insertion of double-stranded cDNA in an appropriate plasmid, are partially sequenced by the deletion method or by subcloning of restriction fragments in an appropriate vector, the selection of said clones being carried out by hybridization with a mixture synthetic oligonucleotides of 20 mothers deduced from the amino acid sequence of the N-terminus of the capsid protein.
  • the present invention further relates to the complete nucleotide sequence of the PVY genomic RNA, which is characterized in that it comprises 9704 bases followed by a poly-A end, in that a non-coding region with the 5 'end, which comprises 185 bases, precedes the single and long open reading phase, in that said phase codes for a polyprotein of 3063 amino acids and in that it is followed by a non-region 331 base coding at the 3 'end.
  • said complete sequence of potyvirus genomic RNA this is represented by the following nucleotide and amino acid (II) sequence:
  • the position of the sequence of the capsid protein in the above-mentioned RNA sequence is such that its N-terminal end is located at position 2796 of the polyprotein.
  • the present invention further relates to the DNA sequence complementary to the sequence (II) defined above.
  • the present invention also encompasses any nucleotide sequence specific for the PVY genome, included in the sequence (II) or in the DNA sequence complementary to said sequence II.
  • EXAMPLE 1 Cloning and sequencing of the DNA complementary to the potyvirus Y genomic RNA of the potato (PVY): 1. Development of the conditions for obtaining the cDNA of the PVY RNA.
  • the cDNA was synthesized by the method of
  • the first strand is synthesized in a conventional manner by the action of reverse transcriptase, and the RNA / DNA hybrid obtained is converted into double-stranded DNA by the joint action of 3 enzymes: RNaseH from E. coli partially degrades the RNA part of the hybrid, creating primers for DNA polymerase I which displaces the cleavage by synthesizing DNA by its 3 '->5' activity while degrading the RNA by its 5 'activity -> 3 ', the DNA fragments thus created are joined by the ligase of E. coli chosen because of its inability to join DNA with free ends.
  • the optimal concentration of KCl for obtaining long retrotranscripts of viral RNA is 140 mM.
  • RNase A treatment was included at the end of second strand synthesis; in order to obtain perfectly blunt ends, the repair step has takes place for a very short time in the absence of nucleotides allowing the DNA polymerase of phage T4 to resect the 3 'ends of the DNA; the nucleotides are added and the incubation then continues normally. 2. Cloning and sequencing of the cDNA.
  • plasmids pY139 (1kb), pY118 (1.8kb) and pY117 (3.6kb) were chosen to be sequenced.
  • the partial sequence of plasmids pY139 and pY118 was carried out by a sequential deletion method based on the cleavage properties of DNAse I in the presence of Mn 2+ ions (LIN et al., 1985) and that of plasmid pY117 by sub -cloning of restriction fragments generated by the enzymes Rsal, Ddel, Hinfl and Taql in the vector
  • Bluescript KS + (Stratagene).
  • the insertion contained in the plasmid pY139 was found to originate from a cDNA initiated on a sequence of 5 adenines corresponding to two lysines at positions 176 and 177 of the protein sequence previously published (SHUKLA et al. 1986).
  • the cDNA can be cloned by adding homopolymeric extensions ("tailing").
  • the two successive precipitations eliminate 99% of the non-incorporated radioactivity, check the presence of a cDNA pellet with moni tor at this stage (and at the others).
  • the percentage of conversion of RNA into cDNA can range from 15 to 50% depending on the quality of the RNA, the percentage of synthesis of the second strand is 80 to 100%.
  • the optimal size of the extensions is 15 to 25 nucleotides, the reaction being approximately linear, it is therefore possible to reincubate at 25 ° C. for a time defined by the first incubation.
  • 5M ammonium acetate take up to 20ng / ⁇ l in TE.
  • A50 which has the advantage of separating DNA according to size.
  • the columns are poured into a 1 ml pipette, with the smallest possible internal diameter.
  • EXAMPLE 4 Obtaining clones by priming the cDNA on the viral RNA using random hexamers.
  • the method described below makes it possible to obtain, in a single step, all the clones necessary for obtaining the gene coding for the capsid protein, then to sequence them and to order the data obtained by computer processing.
  • This plasmid contains the origin of replication of phage M13 and makes it possible to obtain single-stranded DNA after superinfection of the strain with a phage such as M13K07.
  • a phage such as M13K07.
  • the method chosen is derived from that described by KALYAN et Al (GENE-1986, 42, 331-337) which makes it possible to add a fragment of synthetic DNA to a chosen point of a sequence, the splice being able to be checked at the base, thanks to the use of a very sensitive screen based on the characteristics of the molecular hybridization of an oligonucleotide probe.
  • KALYAN et Al GENE-1986, 42, 331-337
  • deletions were created in the plasmid, from a unique HindIII site located approximately 400 base pairs 5 'from the sequence GCAAATGACACA, corresponding to the first acids capsid protein amines.
  • the deleted fragments were then ligated with a synthetic sequence adapter (VA) (VB):
  • Hybridization temperature nb of bases, ie 55oC for this oligonucleotide probe, the washings being carried out in 0.9M Na at room temperature, then for 5 minutes at hybridization temperature - 3 ° C.
  • Hybridization temperature 4 (G + C) +2 (A + T) -5 at 10 ° C 0.9M Na but seem to be more discriminating. A first positive clone was obtained, its insertion could not be released by digestion with the enzymes BamHI (the site created by addition of the adapters) and Hpall (sine placed at 16 base pairs downstream of the coder.
  • pMARCEL 70 and pMRKE70 vectors were created from the pMARCEL19 and pMRKE35 vectors respectively, and contain a promoter constructed from that of 35 S RNA by duplicating a transcriptional activation region located from -343 to -90 relative to at the transcription initiation site (KAY et al., 1987), which promoter has the advantage of producing 10 fcis more transcripts than the one from which it originates.
  • the cell colonies obtained are resistant to kanamycin.

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Abstract

Gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, en particulier du virus de la pomme de terre. Procédé d'obtention dudit gène codant, qui consiste à insérer un fragement d'un ADN synthétique comportant un codon ATG, en un point choisi de la séquence d'ADN complémentaire codant pour la protéine de capside. Applications à l'obtention de plantes transgénique résistantes à l'infection par des potyvirus.

Description

SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE COMPLETE DE L'ADN
COMPLEMENTAIRE DE L'ARN GENOMIQUE DE POTYVIRUS, GENES CODANT POUR LA PROTEINE DE CAPSIDE DE POTYVIRUS ET
APPLICATIONS DE CES GENES A LA CREATION DE PLANTES
TRANSGENIQUES RESISTANTES AUX POTYVIRUS.
La présente invention est relative à la détermination de la séquence nucléotidique complète de l'ADN complémentaire de l'ARN génomique de potyvirus, dont celui du virus Y de la pomme de terre, et à l'utilisation de cette séquence pour créer des gènes aptes à conférer aux plantes une résistance aux potyvirus, par la création de plantes transgéniques résistantes aux virus phytopathogènes et notamment au potyvirus.
Les affections virales posent un problème au pathologiste ; en effet, du fait de la dépendance du virus vis à vis des cellules-hôtes, il est difficile de le détruire sans courir le risque d'endommager l'organisme qu'il parasite. Les moyens de lutte sont donc essentiellement préventifs ; on a recours aux vaccins chez les animaux dotés d'un système immunitaire et chez les végétaux, à la sélection sanitaire des semences et à la sélection de variétés résistantes. Les méthodes curatives reposent sur l'utilisation de molécules interférant avec la réplication (analogues de bases tels que l'azidothymidine) lesquelles ne sont pas sans effets secondaires pour l'hôte. Chez les plantes la thermothérapie et la culture de méristèmes permettent de régénérer des plantes saines à partir de plantes infectées (Morel et Martin, 1952).
Les potyvirus forment le groupe le plus important de virus végétaux, comprenant plus de 70 membres apparemment distincts. Ces virus sont définis par la structure filamenteuse de leur particule, de 600 à 900 nm de long, contenant environ 5% d'acide nucléique et 95% de protéines. Chaque particule contient une molécule unique d'ARN simple brin positif de poids moléculaire 3-3.5×106 , et les sousunités d'un seul polypeptide de poids moléculaire 32-34×103. Ils induisent la formation d'inclusions de formes caractéristiques s'accumulant dans le cytoplasme et parfois dans le noyau. Ils sont transmis naturellement par les aphides sur le mode non-persistant et certains sont également transmissibles par la graine. La transmission des potyvirus par les aphides est dépendante de la présence d'une protéine assistante, codée par le génome viral, dans la plante infectée (Pirone and Thornbury, 1983). Ces virus sont souvent interreliés sérologiquement. La plupart présentent un spectre d'hôte relativement étroit. Ils infectent un grand nombre d'espèces végétales appartenant aux monocotylédones aussi bien qu'aux dicotylédones. Le virus Y de la pomme de terre (PVY) est le membre-type de ce groupe. Il est pathogène pour diverses solanacées d'intérêt agronomique comme le tabac, le poivron, la tomate et diverses variétés de pomme de terre. Chez cette dernière espèce, les rendements peuvent être diminués de 10 à 80% selon la souche de virus, le cultivar et le moment de l'infection. Le virus Y et le virus de l'enroulement (PLRV, appartenant au groupe des lutéovirus), sont considérés comme les deux plus importants virus affectant la pomme de terre dans le monde. Une infection précoce du tabac par la PVY peut induire une baisse de rendement d'environ 30%, et la maladie des nécroses des nervures, causée par la souche N peut causer une perte complète devla récolte de cette plante. On distingue trois souches principales, caractérisées par les symptômes causés sur des plantes témoins : les groupes O, N, et C. Les virus appartenant au groupe O (souches communes), induisent généralement de sévères symptômes systémiques de gaufrure, et de nécrose à feuilles tombantes chez la pomme de terre, une nécrose systémique chez Physalis floridana et une marbrure systémique chez le tabac. Le groupe N (souches de la nécrose des nervures du tabac), produit une sévère nécrose systémique des nervures chez le tabac, une marbrure systémique chez Physalis floridana et une marbrure peu accentuée chez la majorité des cultivars de pomme de terre. Les virus du groupe C, dont le virus PVC qui n'est pas transmiεsible par les aphides, produisent des réactions d'hypersensibilité chez de nombreux cultivars de pomme de terre. Ces groupes quoique très apparentés sérologiquement présentent une grande variabilité intra-groupe. On peut dire qu'il n'y a pas de différences sérologiques reproductibles entre Yo, Yn et Yc. Les résultats de protection croisée inter-groupes qui ont été reportés sont contradictoires (De Bokx et Huttinga, 1981). La séquence de la protéine de capside d'un isolât australien (PVYd), a révélé 92% d'identité avec la capside du Pepper Mottle Virus (PeMV) et 62% avec celle du Tobacco Etch Virus (TEV), les régions N-terminales de ces protéines présentant les plus grandes divergences (Shukla et al., 1986).
L'étude moléculaire des potyvirus est relativement récente. Ces virus sont difficiles à purifier à cause de l'instabilité de leur particule et de leur tendance à former des agrégats.
Une protéine (VPg) est liée de façon covalente à l'extrémité 5' de l'ARN viral (Hari, 1981), qui est polyadénylé à l'extrémité 3' (Hari, 1979). Des études initiales de traduction "in vitro" ont suggéré que l'ARN génomique pouvait être traduit en une polyprotéine de haut poids moléculaire, qui serait ensuite maturée en protéines plus petites (Yeh et Gonsalves, 1985. Hellman et al., 1983). Cette hypothèse a été confirmée par l'analyse de la séquence nucléotidique des ARNs génomiques du tobacco etch virus (TEV) et du tobacco vein mottling virus (TVMV) (Allison et al., 1986. Domier et al., 1986), ces ARNs coderaient respectivement pour des polyprotéines de 345kD et de 340kD. Ce mécanisme est similaire à celui employé par les picornavirus animaux (Nicklin et al, 1986) et par les
Comovirus (Goldbach, 1987). Les clivages protéolytiques chez ces virus se font principalement aux sites Gln-Gly (Picornavirus) et Gln-Gly, Gln-Ser et Gln-Met (Comovirus).
En combinant ces données, la taille approximative des cistrons et le site de clivage de la protéine de capside,
Domier et al, 1986, ont proposé une carte de clivage protéolytique de la polyprotéine du TVMV. Le même groupe (Domier et al, 1987) a ultérieurement publié une analyse des homologies de séquences des protéines ainsi définies, avec celles des Picorna-, Como-, et Caulimovirus. Enfin, Carrington et Dougherty (1987) ont démontré que l'une des deux inclusions nucléaires du TEV était une protéase, ce qui a permis à ces Chercheurs de proposer une carte génétique partielle du génome des Potyvirus par comparaison avec des ARNs génomiques des picornavirus (poliovirus), comovirus (CPMV), nepovirus (TBRV) et potyvirus (TVMV).
En 1985, Sanford et Johnston (J. THEOR. BIOL. 395-40) ont proposé le concept de résistance dérivée du pathogène, qui peut s'énoncer ainsi : des séquences nucléotidiques issues du pathogène peuvent être utilisées pour modifier l'hôte génétiquement afin qu'il devienne résistant au pathogène. Ceci est possible car le cycle vital d'un parasite, comme celui de tout organisme, résulte d'une somme d'événements moléculaires régulés à divers niveaux. La résistance provient donc d'une interruption du développement du parasite par un de ses gènes s 'exprimant au mauvais moment, au mauvais endroit, en trop grande quantité ou sous une forme modifiée contre-fonctionnelle.
En 1986, Powell-Abel et al. (SCIENCE, 212,738-743) ont démontré l'existence d'une protection partielle vis-à-vis du virus de la mosaïque du tabac (TMV) chez des plantes exprimant un gène codant pour la protéine de capside de ce virus. Des résultats similaires ont été obtenus avec le virus de la mosaïque de la luzerne (AlMV) (Loesch Fries et al., 1987), puis avec le virus X de la pomme de terre (PVX) et le virus de la mosaïque du concombre (CMV) (Tumer et al., 1987, EMBO J.,6, 1181-1188 et 1987, NATO ASI Séries A Life Science Plénum Press NY & LONDON, pp 351- 356). Il semblerait que la présence de la protéine de capside dans la cellule prévienne l'entrée du virus ou sa décapεidation : en effet l'inoculation d'ARN viral peut surmonter la protection observée dans les plantes transgéniques (Nelson et al., 1987 VIROLOGY, 158 , 126-132). Le fait que cette protection se traduise par un retard dans l'apparition des lésions sur les feuilles inoculées, suggère un effet inhibiteur à des stages plus tardifs de l'infection, comme une réduction du taux de multiplication ou un blocage du transport du virus de cellule à cellule. Les Auteurs de ces travaux établissent un parallèle avec le phénomène de la protection croisée où l'infection d'une plante par une souche peu virulente d'un virus la protège contre les effets d'une infection ultérieure par une autre souche du même virus (Fulton, 1980, ANN. REV. PHYTOPATH., 24 , PP. 67). Les raisons de ces observations pourraient être multiples. Il a été montré, pour plusieurs virus, que la protéine de capside, outre son rôle structural, possède une fonction régulatrice. Dans les étapes précoces de l'infection, la protéine de capside du virus de la mosaïque de la luzerne aurait un rôle dans la fixation de la polymérase sur l'extrémité 3' de l'ARN, et donc une action activatrice de la synthèse du brin négatif, et dans les étapes tardives elle la réprimerait, rendant la synthèse globale d'ARN non symétrique, en faveur de la production du brin positif (Houwing et Jaspars, 1987). Similairement la protéine capsidiaire du bactériophage QB aurait un double rôle régulateur négatif, en réprimant la réplication virale, tout en favorisant la traduction de son propre gène, et en supprimant la traduction du gène codant pour la polymérase, en se fixant sur son domaine d'initiation (Bernardi, 1972 ; Robertson, 1975). Exploitant ces dernières données, Grumet, Sanford et Johnston, (1987, MOLECULAR STRATEGIES FOR CROP
PROTECTION, ALA|î R. LISS INC pp. 3-12) ont démontré la validité du concept de résistance dérivée du pathogène, en obtenant de forts niveaux de résistance à ce bactériophage chez des souches d'E.coli exprimant sa protéine de capside, et ce, même à des multiplicités d'infection importantes.
L'inhibition du cycle viral semblerait donc se situer au moins lors d'une étape précoce : décapsidation ou entrée du virus dans les cellules ; ceci est suggéré par le fait que l'ARN nu conserve son pouvoir infectieux. Dans les plantes transgéniques, le virus ne pourrait donc débuter son cycle de réplication. Ceci diffère des expériences de protection faisant appel aux propriétés de l'ARN satelllite du CMV, dans lesquelles un virus apparenté le "Tomato aspermy virus" (TAV), quoique ne produisant pas de symptômes sur les plantes transformées, est parfaitement capable de s'y répliquer. Cette observation peut faire craindre le risque de créer des plantes qui seraient des réservoirs d'un virus, inoffensif pour elles et indétectable, mais pouvant se propager à d'autres espèces.
Ce risque paraît exclu dans l'hypothèse où une telle inhibition pourrait être obtenue en utilisant un gène codant pour la capside.
Le problème majeur posé par la construction d'un gène codant pour la protéine de capside du PVY était l'absence de codon d'initiation de la traduction permettant la synthèse de la protéine par la machinerie cellulaire. Il aurait été possible d'utiliser un codon AUG en phase situé en amont du gène. Le premier se trouvant à 57 nucléotides du premier codon, il y aurait production d'une protéine rallongée de 19 acides aminés par rapport à la protéine de capside maturée du virus et sa fonction pourrait en être altérée. De plus, ce codon ne se trouvait pas dans un contexte optimal de tradμction du type A--AUGG (Kozak, 1986). A ce propos, il faut noter que les Articles relatant l'expression d'un tel gène dans les plantes et l'établissement d'un phénotype de résistance font éta d'une forte accumulation de la protéine, de 0,1 à 0,8% de protéines solubles. Pour obtenir cette accumulation, a moins deux facteurs relativement prédictibles doivent êtr optimisés lors de l'assemblage du gène : la force du promoteur utilisé et la nature des séquences précédant et entourant le codon d'initiation.
En conséquence, la présente invention s'est donné pour but de construire un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus et en particulier de PVY, dans des conditions telles que sa fonction ne puisse pas être altérée, par adjonction d'une séquence ATG à l'extrémité 5' de la séquence codant pour la capside de potyvirus. Les potyvirus ont la particularité d'avoir comme produit de traduction, une polyprotéine unique qui ne donne des protéines fonctionnelles qu'après clivage protéolytique en des endroits précis de la polyprotéine, par une protéase spécifique précisément codée par le génome viral ; par suite, la présente invention s'est également donné pour but de pourvoir à un système propre à bloquer l'action de la protéase dans le but d'empêcher l'apparition des protéines virales et, par voie de conséquence, des symptômes de l'infection virale des végétaux concernés. La présente invention a pour objet des plantes transgéniques résistantes à l'infection par des potyvirus, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues à partir de lignées cellulaires végétales, notamment d'espèces végétales susceptibles d'être infectées par des potyvirus, modifiées par introduction d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdites plantes transgéniques sont caractérisées en ce que le gène introduit est un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, résultant de l'adjonction d'une séquence ATG à l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvirus, pourvu de signaux de régulation de l'expression génétique dans une cellule végétale.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le codon d'initiation ATG du gène introduit est inclus dans une séquence consensus, du type AX1X2ATGG dans laquelle X ou Y sont identiques ou différents et représentent chacun l'un des nucléotides A, T, G ou C. Bien entendu, les semences issues de ces plantes transgéniques et utilisées pour la reproduction de celles-ci entrent dans le cadre de la présente invention.
La présente invention a également pour objet un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérisé en ce qu'il résulte de l'adjonction d'une séquence ATG à l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvirus.
Selon un mode de réalisation de ce gène, son codon d'initiation ATG est inclus dans une séquence de type AX1X2ATGG, où X1 et X2 sont tels que définis plus haut.
Selon un autre mode de réalisation de ce gène, il comprend la séquence d'ADN complémentaire de la séquence en nucléotides (I) suivante :
La présente invention a en outre pour objet une séquence d'ADN constituée par un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus tel que défini plus haut, pourvu de signaux de régulation de l'expression génétique dans une cellule végétale.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé d'obtention d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérisé en ce qu'un fragment d'un ADN synthétique comportant un codon ATG est inséré en un point choisi de la séquence d'ADNc codant pour la protéine de capside, les plasmides contenant la jonction voulue étant alors isolés par hybridation avec un oligonucléotide synthétique couvrant pour moitié la séquence du fragment d'ADN synthétique et pour moitié la séquence de l'extrémité 5' de la séquence du gène codant pour la protéine de capside de potyvirus.
La présente invention a en outre pour objet un procédé d'obtention de l'ADNc de l'ARN génomique de potyvirus, qui est caractérisé en ce que le premier brin d'ADNc est synthétisé par action de la transcriptase-reverse sur l'ARN génomique de potyvirus en utilisant des hexamères aléatoires comme amorceurs du premier brin, l'hybride ARN/ADN obtenu est converti en ADN double-brin par l'action conjointe de trois enzymes, la RnaseH. d'E.coli, qui dégrade partiellement la partie ARN de l'hybride, créant des amorces sur lesquelles agit la DNA-polymérase, qui déplace la coupure en synthétisant de l'ADN par son activité 3'-> 5' et en dégradant l'ARN par son activité 5'-> 3', les fragments d'ADN ainsi créés sont joints par la ligase d'E. coli, l'ADNc double-brin est alors traité par la Sl-nucléase, la réparation de ses extrémités est réalisée à l'aide de la T4-DNA-polymérase et l'ADNc est séparé suivant sa taille sur du gel d'agarose à bas point de fusion, puis ligaturé dans un site de coupure Smal d' un vecteur approprié et les plasmides recombinants sont introduits dans E. coli, recueillis et séquences par une méthode de séquençage appropriée.
Des clones, obtenus par insertion d'ADNc double-brin dans un plasmide approprié, sont partiellement séquences par la méthode des délétions ou par sous-clonage de fragments de restriction dans un vecteur approprié, la sélection desdits clones étant réalisée par hybridation avec un mélange d'oligonucléotides synthétiques de 20 mères déduits de la séquence en amino-acides de l'extrémité N- terminale de la protéine de capside.
La présente invention a en outre pour objet la séquence nucléotidique complète de l'ARN génomique de PVY, qui est caractérisée en ce qu'elle comprend 9704 bases suivies d'une extrémité poly-A, en ce qu'une région non-codante à l'extrémité 5', qui comprend 185 bases, précède l'unique et longue phase de lecture ouverte, en ce que ladite phase code pour une polyprotéine de 3063 amino-acides et en ce qu'elle est suivie d'une région non-codante de 331 bases à l'extrémité 3'. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence complète de l'ARN génomique de potyvirus, celle-ci est représentée par la séquence en nucléotides et en amino-acides (II) suivante :
Conformément à l'invention, la position de la séquence de la protéine de capside dans la séquence d'ARN susdite est telle que son extrémité N-terminale se situe en position 2796 de la polyprotéine. La présente invention a en outre pour objet la séquence d'ADN complémentaire de la séquence (II) définie plus haut.
La présente invention englobe également toute séquence nucléotidique spécifique du génome de PVY, comprise dans la séquence (II) ou dans la séquence d'ADN complémentaire de ladite séquence II.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention,- dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Clonage et séquençage de l'ADN complémentaire de l'ARN génomique du potyvirus Y de la pomme de terre (PVY) : 1. Mise au point des conditions d'obtention de l'ADNc de l'ARN du PVY.
La synthèse d'ADN complémentaire est traditionnellement considérée comme un processus délicat faisantappel à de nombreuses étapes enzymatiques successives. L'ARN du PVY étant une molécule unique de grande taille
(9.8kb) constitue un matériel de choix pour l'optimisation de cette technique.
L'ADNc a été synthétisé par la méthode de
GUBLER et HOFFMAN (1984). Dans cette méthode le premier brin est synthétisé de façon classique par action de la transcriptase-reverse, et l'hybride ARN/ADN obtenu est converti en ADN double-brin par l'action conjointe de 3 enzymes : la RNaseH d'E. coli dégrade partiellement la partie ARN de l'hybride, créant des amorces pour la DNA-polymérase I qui déplace la coupure en synthétisant de l'ADN par son activité 3'->5' tout en dégradant l'ARN par son activité 5'->3', les fragments d'ADN ainsi créés sont joints par la ligase d'E. coli choisie à cause de son incapacité à joindre des ADNs à bouts francs. La concentration optimale en KCl pour obtenir de longs rétrotranscrits d'ARN viraux est de 140mM.
Grâce à l'excellente qualité de l'ARN disponible et sans doute aussi à l'absence de fortes structures secondaires, il a été possible de synthétiser un ADNc premier brin complet (environ 10kb) en utilisant de la transcriptase-reverse du virus du myéloplastome aviaire (Genofit et Life Science).
Afin d'augmenter la masse d'ADNc synthétisé, on a ajouté un deuxième aliquot d'enzyme (25-30 unités pour 2μg d'ARN dans un volume réactionnel de 20μl) ainsi que 10 unités de RNasin après 30' de réaction à 43ºC et on a poursuivi l'incubation pendant 30'. L ' utilisation d'amorces aléatoires à la place de l'oligodT a permis d'augmenter le rendement d'un facteur 5 à 10 mais au détriment de la taille des produits synthétisés. La réaction de synthèse du deuxième brin a lieu dans le même tube que la synthèse du premier brin, après augmentation de volume. Cette augmentation de volume est apparue critique pour obtenir une conversion reproductible de 80 à 100 % ; elle doit être d'au moins 10 fois. Il a été montré que l'ajout de la DNA-ligase de E. coli n'est pas nécessaire pour la conversion complète en ADN double-brin d'un ARN de petite taille tel que le messager codant pour la globine (GUBLER et HOFFMAN, 1984).
Un traitement à la RNase A a été inclus à la fin de la synthèse du deuxième brin ; afin d'obtenir des extrémités parfaitement franches, l'étape de réparation a lieu pendant un temps très court en l'absence de nucléotides permettant à la DNA-polymérase du phage T4 une résection des extrémités 3' de l'ADN ; les nucléotides sont ajoutés et l'incubation se poursuit alors normalement. 2. Clonage et séquençage de l'ADNc.
Initialement, deux librairies d'ADNc de l'ARN génomique du PVY ont été construites, par la méthode d'addition d'extensions homopolymériques dans le vecteur pTZ 19 (Pharmacia), chacune d'elles contenant environ 150 clones, l'une par amorçage du premier brin avec des amorces aléatoires et l'autre par amorçage avec de l'oligodT. Le criblage de cette dernière librairie avec un mélange d'oligonucléotides synthétiques de séquence GC(A/G)AATGATAC(A/T)AT(C/T/A)GA(T/C)GC, déduite de celle des premiers acides aminés de la protéine de capside du PVYn, ANDTIDA, a permis de sélectionner une vingtaine de clones. En se basant sur la taille de l'insertion qu'ils contenaient, les plasmides pY139 (1kb), pY118 (1.8kb) et pY117 (3.6kb) ont été choisis pour être séquences. La séquence partielle des plasmides pY139 et pY118 a été réalisée par une méthode de délétions séquentielles basée sur les propriétés de coupure de la DNAse I en présence d'ions Mn2+ (LIN et al., 1985) et celle du plasmide pY117 par sous-clonage de fragments de restriction engendrés par les enzymes Rsal, Ddel, Hinfl et Taql dans le vecteur
Bluescript KS+ (Stratagene). L'insertion contenue dans le plasmide pY139 s'est avérée provenir d'un ADNc initié sur une séquence de 5 adénines correspondant à deux lysines en positions 176 et 177 de la séquence protéique auparavant publiée (SHUKLA et al. 1986).
EXEMPLE 2 : Synthèse d'ADN complémentaire.
PREMIER BRIN , Mélanger ARN PolγA+ et H20, incuber l' à 80° C, refroidir dans la glace, - ARN 2-3μg
- H2 O pour un volume f inal de 19μ l Ajouter dans l ' ordre :
- RNAsin 1 μl Biotec 10μ/μl
- oligo pdT 1 μl 2μg/μl ou amorces aléatoires 4μg/μl
- tampon RT 5× 4 μl
- dNTPs 2 μl 10mM AGT, 5mM C
- alpha-32P-dCTP 1 μl 800Cie/mmole
- NaPPi 80mM 1 μl TOTAL 19 μl
Mélanger (sans bulles) préincuber 2' à 43°C
- Reverse-Transcriptase 1 μl (Genofit 25-30μ/μl)
- 43ºC 30'
- Reverse-Transcriptase 1 μl
- RNasin 1 μl
- 43ºC 30'
Mettre dans la glace et prélever 2×1μl pour calculer la masse d'ADNc synthétisé et pour un gel alcalin.
DEUXIEME BRIN Au mélange 1er brin 18 μl ajouter :
- H2O qsp 200 μl volume final
- tampon 5× 40 μl
- DNAPolymérase 50 μ Amersham
- DNAligase (E. coli) 2 μ Biolabs
- B-NAD 10mM 2 μl 3.3mg/500μl
- préparé extemporanément
- RNaseH 1.5 μ BRL
- 16ºC 2 h.
- 22ºC 30' température ambiante
- CDTA 0,5M 10 μl
- RNaseA (2μg/μl) 2 μl
- 37ºC 15'
- Phénol 100 μl Vortex
- Chloroforme 100 μl "
- centrifuger 5' 10000rpm
Prélever la phase aqueuse, laver la phase organique avec 50μl TC, combiner les deux phases aqueuses (250 μl) - extraire deux fois avec 500μl d'éther - NH-Ac 8M 125 μl
- ETOH 95 % 850 μl mélanger
- -80ºC 5' Réchauffer à température ambiante - centrifuger 30' 10000rpm
Prélever le surnageant, vérifier la RA dans le culot au moniteur.
Resuspendre dans 50 μl de TC en vortexant pour récupérer l'ADN collé à la paroi du tube. Ajouter :
- NH4AC 25 μl
- ETOH 95 % 200 μl mélanger
- glace 10'
- centrifuger 15' 10000rpm Prélever le surnageant, compter (normalement presque plus de RA)
- ETOH 70 % 800 μl
- centrifuger 5'
Prélever le surnageant, vérifier la RA dans le culot et le sécher modérément.
A ce stade l'ADNc peut être clone par addition d'extensions homopolymériques ("tailing").
REPARATION DES EXTREMITES
Resuspendre l'ADN dans 42 μl d'eau en incubant 5' à 55°C. - Ajouter :
- tampon T4Pol lOx 5 μl
- RNaseH 0.5 μ
- RNaseA (2μg/μl) 1 μl - T4DNApolγmérase 4 μ (Amersham) - 37°C 1' exonucléase 3'->5
- dNTPs 2 μl (lOmM AGT, 5mM C)
- 37°C 30'
- Klenow Polymérase 2 μ
- température ambiante 10' - glace 10'
- CDTA 2 μl 0.5M - phénol 25 μl
- chloroforme 25 μl Vortex
- centrifuger 5' 10000rpm
Prélever le surnageant, réextraire la phase organique avec 50 μl de TC, combiner les deux phases aqueuses.
- extraire deux fois avec 200 μl d' éther
- NH.AC 8M 50.μl
- ETOH 95 % 400 μl mélanger
- -80ºC 5' réchauffer à temp. ambiante - centrifuger 15' 10000rpm
Prélever le surnageant, vérifier RA dans le culot, le rincer à l'ETOH 70 %, sécher modérément. L'ADNc est prêt pour un clonage à bouts francs ou l'addition de linkers/adapteurs. TAMPONS
1er BRIN 5× : 250mM Tris-HCl pH 8.3 à 43 °C (8.9 à 22ºC)
750mM KCl 50mM MgCl2 50mM DTT 2ème BRIN 5× : 250mM Tris-HCl pH 7.5
500mM KCl 25mM MgCl2 25mM DTT 250μg/μl BSA T4DNAPolymérase 10× of. Maniatis et al. (1982)
- Toutes les solutions servant à la synthèse du premier brin doivent être dépourvues de traces de RNase, c'est-à-dire faites avec de l'eau traitée au diéthylpyrocarbonate (100ml d'eau stérile + 1ml de DEPC 10 % dans l'éthanol, laisser agir 1 heure, rrestériliser).
- ne pas trop sécher les culots d'ADNc car ils peuvent devenir insolubles, sécher moins de l' dans un "Speedvac" ou rincer à l'éthanol 95 % et laisser évaporer.
- à la fin de la synthèse du 2ème brin, les deux précipitations successives éliminent 99 % de la radioactivité non-incorporée, vérifier la présence d'un culot d'ADNc au moni teur à cette étape (et aux autres).
- pour observer la taille de l'ADNc premier brin : ajouter 5μg de glycogène (ou tRNA) à 1μl du mélange réactionnel, précipiter deux fois en présence d'acétate d'ammonium 2.5M, reprendre dans un tampon de gel alcalin (of. MANIATIS et al. 1982).
- dans ces conditions, les deux brins sont marqués ; on peut ne marquer que le deuxième brin en ne rajoutant le 32P-dCTP qu'au début de sa synthèse. - Calcul des quantités d'ADN synthétisé :
A 1μl de mélange réactionnel, ajouter 4μl d'eau, déposer 2μl sur deux filtres Whatman GF/C, sécher, laver l'un d'eux trois fois dans 10ml de TCA 10 %, rincer à l'acétone, sécher. Déposer dans deux fioles à scintillation, ajouter 5ml d'eau et compter la radioactivité sur le canal 32P ou 3H, calculer le pourcentage d'incorporation X. dCTP 0.5mM => 10nmoles/20μl 10 × X = Ynmoles de dCTP incorporées 4 × Y = quantité totale de nmoles incorporées (ACGT)
Poids moléculaire moyen d'un dNTP = 350g donc : 4 × Y × 350 = poids d'ADN synthétisé.
- Le pourcentage de conversion d'ARN en ADNc peut aller de 15 à 50 % suivant la qualité de l'ARN, le pourcentage de synthèse du deuxième brin est de 80 à 100 %.
EXEMPLE 3 : Clonage d'ADNc par addition d'extensions homopolymériques.
1. Préparation du vecteur : Digérer 40μg de vecteur (pUC, pT2, Bluescript) par Pst1, faire deux digestions succesives, ou mieux, purifier le plasmide linéaire sur gel.
- Resuspendre à 1μg/μl dans de l'eau.
- Pour allonger 10μg de vecteur (environ lOpmoles d'extrémités pour ces plasmides) : Mélanger :
- tampon TdT 10× 5 μl
- Tris-HCl 1M pH 6.8 1.5 μl
- BSA 1mg/ml 5 μl
- dGTP ImM 5 μl
- H2O 20.5 μl
- alpha-32PdGTP 800Cie/mmole 1 μl
Préincuber 5' à 37ºC, mettre dans la glace. Ajouter :
- ADN 1 μg/μl 10 μl - Terminal-transférase 2 μl Pharmacia 27μ/μl TOTAL 50 μl
Prélever aussitôt 2 × 1 μl et déposer sur deux filtres GF/C pour évaluer le bruit de fond (il vaut mieux faire les mesures de RA en double). - incuber 5' à 25°C, stopper dans la glace
- prélever 2 × 1 μl pour mesurer la RA totale
2 × 1 μl pour mesurer la RA incorporée (RA incorporée-bruit de fond)
- % incorporation = × 100 RA totale
100μmoles dGTP = 100pmoles/μl => 5000pmoles/50μl
% incorporation × 5000 = pmoles incorporées pmoles incorporées
= nombre de nucléotides ajoutés pmoles d'extrémités
- la taille optimale des extensions est de 15 à 25 nucléotides, la réaction étant à peu près linéaire on peut donc réincuber à 25ºC pendant un temps défini par la première incubation. - inactiver l'enzyme 5' à 65°C, extraire au phénol/chloroforme, deux fois à l'éther, précipiter à l'éthanol en 2 . 5M acétate d ' ammonium , reprendre à 20ng/μl dans du TE .
2. Préparation de l'ADNc. - l'ADNc doit être séparé des amorces de synthèse qui présentent, du fait de leur petite taille, un très grand nombre d'extrémités. Cette séparation peut se faire soit sur colonne de Séphadex G100, soit sur colonne de Biogel
A50 qui présente l'avantage de séparer l'ADN suivant la taille. Les colonnes sont coulées dans une pipette de 1ml, de diamètre interne le plus faible possible.
- L'ADN est repris dans du tampon de colonne (TC + 0.4M
LiCl), dissous 5' à 65ºC, centrifugé 5' pour éliminer tout débris insoluble, ajusté à 5 % en glycérol et chargé sur la colonne. - L'élution est suivie au moniteur et les fractions contenant de l'ADN sont mélangées et précipitées à l'éthanol (dans le cas d'une colonne Biogel A50, seules les fractions de la partie ascendante du pic de RA sont conservées, ce qui correspond à des molécules de plus de 800pdb). - Il est assez difficile d'estimer le nombre d'extrémités que représente l'ADNc du fait de son hétérogénéité de taille et des imprécisions sur la mesure de son poids ; il est donc avantageux d'effectuer une gamme d'allongement sur une partie de l'échantillon.
- Mélanger : Tampon Tdt 10 × 4 μl
Tris HCl 1M pH 6.8 1.2 μl
BSA lmg/lml 4 μl dCTP ImM 4 μl
H2O qsp 40 μl
- Incuber 5 ' à 25°C
- Ajouter : ADNc × μl 50-100ng
Terminal-transférase 1 1.5 μl
- Prélever des aliquots de 5 μl toutes les 30 secoi stopper dans la glace et inactiver l'enzyme 5' à 65ºC. - Utiliser 2.5 μl de chaque aliquot pour une hybridation avec 20ng de vecteur dans 50 μl de TE + 0,15M NaCl, incuber 90' à 58°C, 10' à température ambiante, conserver dans la glace ou congeler. Ne pas oublier le témoin vecteur sans ADNc. - Transformer 200 μl de bactéries compétentes avec 25 μl de chaque mélange d'hybridation. - Compter les clones recombinants par différence avec le contrôle et/ou sélection bleu/blanc et/ou hybridation sur colonies avec 10-20ng d'ADNc marqué par amorçage aléatoire.
- une fois déterminé le meilleur temps d'allongement, retraiter dans ces conditions la même quantité d'ADNc : on peut encore optimiser l'efficacité de clonage en hybridant des quantités variables d'ADNc avec 20ng de vecteur.
EXEMPLE 4 - Obtention de clones par amorçage de l'ADNc sur l'ARN viral à l'aide d'hexamères aléatoires.
La méthode décrite ci-après permet d'obtenir en une seule étape tous les clones nécessaires à l'obtention du gène codant pour la protéine de capside, puis de les séquencer et d'ordonner les données obtenues par un traitement informatique.
Ce type de technique de séquençage est couramment employé pour l'analyse de fragments définis d'ADN clones, mais n'avait pas été employé, de façon systématique, pour obtenir la séquence nucléotidique de grands ARNs. Une méthode analogue mais comportant l'insertion de l'ADNc, après digestion par des enzymes de restriction, a été décrite par Goelet et al. (1984) pour obtenir des portions de la séquence de l'ARN du TMV.
Une librairie d'ADNc initié avec des amorces aléatoires, traité à la nuclease S1, réparé et ligaturé dans le site Smal du vecteur polyvalent Bluescript, a été construite. Ce plasmide contient l'origine de réplication du phage M13 et permet d'obtenir de l'ADN simple brin après superinfection de la souche par un phage tel que M13K07. - Environ 150 clones de cette librairie ont été séquences, certains d'entre eux ont également été séquences directement sur l'ADN plasmidique (Chen and Seeburg, 1985). Ces données ont été analysées grâce au programme de séquençage "shotgun" implanté sur l'ordinateur du Centre Interuniversitaire de Traitement de l'Information (CITI II). En combinant les séquences venant de ces clones et celles (partielles) de pY139, pY118 et pY117, près de 90% de l'information génétique totale ont été obtenus. Les 10% restants ont été séquences de façon plus rationnelle à l'aide d'oligonucléotides synthétiques, en séquençant des plasmides sur le brin complémentaire ou en lisant des séquences plus loin de l'amorce à l'aide de l'ADN-polymérase du phage T7 (Sequenase, USB). La séquence de l'extrémité 5' du génome a été réalisée directement sur l'Arn viral avec une amorce synthétique.
Un intérêt de la méthode ainsi expérimentée est que la séquence obtenue provenant de plusieurs ADNc clones indépendamment, permet d'analyser la variabilité du génome viral. En effet, à cause de l'infidélité des ARN polymérases virales et de l'absence de système de correction, les génomes des virus à ARN présentent souvent une certaine microhétérogenéité. Ceci a été proposé comme étant une cause de leur évolution rapide (Steinhauer and Holland, 1987). Le protocole suivi est celui décrit à l'Exemple 2.
EXEMPLE 5 : Construction d'un gène codant pour la protéine de capside de PVY
La méthode retenue est dérivée de celle décrite par KALYAN et Al (GENE-1986, 42 , 331-337) qui permet d'ajouter un fragment d'ADN synthétique dans un point choisi d'une séquence, l'épissure pouvant être contrôlée à la base près, grâce à l'emploi d'un crible très sensible basé sur les caractéristiques de l'hybridation moléculaire d'une sonde oligonucléotidique. On part d'un plasmide pY-118 dans lequel on veut insérer un ADNc de 1 , 8kbcorrespondant à l'extrémité 3' du génome du PVY.
A l'aide de l' exonucléase Bal31, des délétions ont été créées dans le plasmide, à partir d'un site unique HindIII situé à environ 400 paires de bases en 5' de la séquence GCAAATGACACA, correspondant aux premiers acides aminés de la protéine de capside. Les fragments délétés ont alors été ligaturés avec un adapteur synthétique de séquence (VA) (VB) :
5' GATCCGAAGGAGAAACCATG 3' 20mere (VA) 3' GCTTCCTCTTTGGTACp 5' lômere (VB) dont seul le 16mere est phosphorylé, puis l'excès d'adapteurs a été éliminé, les extrémités 5' phosphorylées, et les plasmides recircularisés et introduits dans E.coli. le choix de la séquence de ces adapteurs a été fait en tenant compte de la séquence consensus définie par Joshi (1987), qui a comparé les régions 5' de 79 gènes végétaux, consensus : 5' TAAACAAIGGCT 3'
Des altérations ont été introduites par rapport à ce consensus afin de créer un site de restriction Ncol englobant la jonction avec le gène de capside et de placer une séquence Shine-Dalgarno pour permettre une éventuelle expression dans E. coli.
Environ 3000 colonies ont été criblées par hybridation avec un oligonucléotide marqué au 32P de séquence (VI) ci-après lômere 5' TTTGGTAGCGTTTACT 3' (VI) comprenant 8 bases homologues à l'adapteur et 8 bases homologues au début du gène de la capside. ce qui a permis de mettre en évidence par hybridation la présence de la jonction voulue. Les conditions d'hybridation ont été celles de Sartoris et coli (1987) :
(4x(G+C)+2x(A+T)) × 20 0.9M Na Température d'hybridation = nb de bases soit 55ºC pour cette sonde oligonucléotidique, les lavages étant effectués en 0.9M Na à température ambiante, puis pendant 5 minutes à la température d'hybridation - 3°C. Température d'Hybridation = 4(G+C)+2(A+T)-5 à 10°C 0 , 9M Na mais semblent plus discriminantes . Un premier clone positif a été obtenu, son insertion n'a pu être libérée par une digestion avec les enzymes BamHl 'site créé par addition des adapteurs) et Hpall (sine placé à 16 paires de bases en aval du coder. d'arrêt de traduction naturel du gène; car la procédure n'a pas créé le site BamHI escompte, l'insertion a donc été isolée grâce a la présence du site Ncol englobant la séquence ATG, ses extrémités remplies a l'aide de la polymérase de Klenow, et transférée dans le plasmide pUC1318 linéaire au site Xbal aux extrémités comtless de ia même facen. Ceci a permis de reconstituer la séquence A-- ATGG, ce qui a été vérifié par séquençage. Le fragment a alors été excisé du plasmide en utilisant les sites BamHI dupliques de ce dernier et transféré dans les vecteurs d'expression pMarcel70 et pMRKE70.
Par la suite deux nouveaux clones positifs ont été isolés possédant bien le site BamHI, ce qui permet de préserver le consensus introduit dans l'adapteur. La séquence codante a été isolée en digérant par les enzymes BamHI et Hpall, ses extrémités comblées et elle a été clonée dans le même plasmide pUC1318 afin d'ajouter des sites BamHI aux deux extrémités. Le fragment a alors été excisé et inséré dans les mêmes vecteurs d'expression (of:figures la et lb en annexe )
A noter que ces vecteurs d'expression ne possèdent qu'un seul site de restriction permettant l'insertion de la séquence susdite, qui sera ensuite transcrite.
Ces vecteurs pMARCEL 70 et pMRKE70 ont été créés à partir des vecteurs pMARCEL19 et pMRKE35 respectivement, et contiennent un promoteur construit à partir de celui de l'ARN 35 S en dupliquant une région d'activation transcriptionnelle située de -343 à -90 par rapport au site d'initiation de la transcription (KAY et Al., 1987), lequel promoteur a pour avantage de produire 10 fcis plus de transcripts que celui dont il est issu. EXEMPLE 6 : expression dans des plantes du gène codant conforme à l'invention
La séquence insérée dans les vecteurs d'expression pMARCEL 70 et pMRKE 70, obtenue à l'Exemple 5 a été introduite par électroporation dans des protoplastes de tabac et de pomme de terre.
Les colonies cellulaires obtenues sont résistantes à la kanamycine.
Le même gène a également été introduit dans des protoplastes de laitue, dans les mêmes conditions, dans le but d'obtenir une protection contre le virus de la mosaïque de la laitue, pour vérifier l'hypothèse selon laquelle en raison des similarités de séquences entre les protéines de capside des potyvirus, la protéine de capside de l'un d'eux est en mesure de protéger des plantes contre un autre potyvirus.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS l1) Plantes transgéniques résistantes à l'infection par des potyvirus, caractérisées en ce qu'elles sont obtenues à partir de lignées cellulaires végétales, notamment d'espèces végétales susceptibles d'être infectées par des potyvirus, modifiées par introduction d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus.
2 º ) Plantes transgéniques selon la Revendication 1, caractérisées en ce que le gène introduit est un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, résultant de l'adjonction d'une séquence ATG à l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvirus.
3°) Plantes transgéniques selon l'une quelconque des Revendications 1 ou 2, caractérisées en ce que le codon d'initiation ATG du gène introduit est inclus dans la séquence AX1X2ATGG, dans laquelle X1 et X2 sont identiques ou différents et représentent chacun l'un des nucléotides A, T, G ou C. 4°) Semences pour la reproduction de plantes transgéniques, caractérisées en ce qu'elles sont issues de plantes transgéniques selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3.
5°) Gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérisé en ce qu'il résulte de l'adjonction d'une séquence ATG à l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine de capside de potyvirus.
6°) Gène selon la Revendication 5, caractérisé en ce que son codon d'initiation ATG est inclus dans une séquence de type AX.LX2ATGG, dans laquelle X1 et X2 sont identiques ou différents et représentent chacun l'un des nucléotides A, T, G ou C.
7°) Gène selon l'une quelconque des Revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'ADN complémentaire de la séquence en nucléotides (I) suivante :
8°) Séquence d'ADN caractérisée en ce qu'ell est constituée par un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, selon l'une quelconque des Revendications 4 à 7, pourvue de signaux de régulation de l'expression génétique dans une cellule végétale.
9°) Procédé d'obtention d'un gène codant pour la protéine de capside de potyvirus, caractérisé en ce qu'un fragment d'un ADN synthétique comportant un codon ATG est inséré en un point choisi de la séquence d'ADNc codant pour la protéine de capside, les plasmides contenant la jonction voulue étant alors isolés par hybridation avec un oligonucléotide synthétique couvrant pour moitié la séquence du fragment d'ADN synthétique et pour moitié la séquence de l'extrémité 5' de la séquence du gène codant pour la protéine de capside de potyvirus.
10°) Procédé d'obtention de l'ADNc de l'ARN génomique de potyvirus, caractérisé en ce que le premier brin d'ADNc est synthétisé par action de la transcriptase-reverse sur l'ARN génomique de potyvirus en utilisant des hexamères aléatoires comme amorceurs du premier brin.
11°) Séquence nucléotidique complète de l'ARN génomique de PVY, caractérisée en ce qu'elle comprend 9704 bases suivies d'une extrémité poly-A, en ce qu'une région non-codante à l'extrémité 5', qui comprend 185 bases, précède l'unique et longue phase de lecture ouverte, en ce que ladite phase code pour une polyprotéine de 3063 aminoacides et en ce qu'elle est suivie d'une région non-codante de 331 bases à l'extrémité 3'. 12°) Séquence selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle est représentée par la séquence en nucléotides et en amino-acides (II) suivante :
13º) Séquence selon l'une quelconque des Revendications 11 et 12, caractérisée en ce que la position de la séquence de la protéine de capside dans la séquence d'acides aminés dérivés de la séquence d'ARN susdite est telle que son extrémité N-terminale se situe en position 2796 de la polyprotéine.
14°) Fragments d'ARN, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence de nucléotides spécifiques du PVY, qui constitue une partie de la séquence de nucléotides selon la Revendication 12.
15º) Fragments d'ADN, caractérisés en ce qu'ils contiennent tout ou partie d'une séquence d'ADN complémentaire d'une séquence d'ARN spécifique du PVY, et dérivée de la séquence d'ARN selon la Revendication 12.
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